Suderintas žiurkių medialinės priekinės smegenų žievės mrnos ir mikrorizmų disreguliavimas atsižvelgiant į priklausomybę nuo alkoholio | farmakogenomikos žurnalas

Suderintas žiurkių medialinės priekinės smegenų žievės mrnos ir mikrorizmų disreguliavimas atsižvelgiant į priklausomybę nuo alkoholio | farmakogenomikos žurnalas

Anonim

Dalykai

  • Nervų sistemos genetika
  • miRNR
  • Prefrontalinė žievė

Anotacija

Nustatyti ilgalaikiai smegenų genų ekspresijos pokyčiai priklausomybei nuo alkoholio, tačiau pagrindiniai mechanizmai vis dar nežinomi. Čia mes ištyrėme galimą mikroRNR (miRNR) vaidmenį atliekant nuolatinius genų ekspresijos pokyčius žiurkės medialinėje prefrontalinėje žievėje (mPFC) po priklausomybės nuo alkoholio istorijos. Dviejų butelių laisvai pasirenkamo alkoholio vartojimas padidėjo po 7 savaičių trukmės apsvaigimo nuo alkoholio. Bioinformatinis metodas, naudojant mikrotraumos analizę, kiekybinę PGR (qPCR), bioinformatinę analizę ir integruotą mikroRNR-pasiuntinio RNR (mRNR) analizę, nustatė ekspresijos modelius, rodančius sinapsinių procesų sutrikimą ir neuroplastiškumą. Apie 41 žiurkės miRNR ir 165 mRNR mPFC reikšmingai pakito po lėtinio alkoholio poveikio. MiRNR ir mRNR pogrupis buvo patvirtintas qPCR. Genų ontologijos diferencialinės raiškos kategorijos nurodė funkcinius procesus, paprastai susijusius su neurotransmisija, neuroadaptacija ir sinapsiniu plastiškumu. mikroRNR-mRNR raiškos pora nustatė 33 miRNR, spėjamai nukreipiančias į 89 mRNR, siūlančias transkripcijos tinklus, susijusius su aksonų nukreipimu ir neurotransmiterių signalizavimu. Mūsų rezultatai rodo reikšmingą mikroRNR raiškos pokyčių pokyčius mPFC po priklausomybės istorijos. MiRNR, atsižvelgiant į jų globalų daugelio vartotojų tikslinių nuorašų reguliavimą, gali atlikti pagrindinį vaidmenį pertvarkant sinapsinius ryšius ir ilgalaikius neuroadaptacijas priklausomybės nuo alkoholio srityje. MikroRNR sukeliami transkripcijos tinklų pokyčiai gali būti susiję su sutrikdyta priešpriešine alkoholio vartojimo kontrole, stebima alkoholikams sergantiems pacientams.

Įvadas

Priklausomybė nuo alkoholio sukelia ilgalaikius ląstelių pakitimus smegenyse, ir tai iš dalies greičiausiai sukelia nuolatiniai genų ekspresijos pokyčiai. 1 Transkriptologiniai žmonių ir graužikų profiliavimo tyrimai nustatė alkoholio sukeltus genų ekspresijos pokyčius, susijusius su daugialypėmis biologinėmis ir ląstelinėmis funkcijomis, įskaitant reakcijas į stresą, G-baltymų sujungtų receptorių signalizavimą, neurotransmiterių išsiskyrimą ir signalizavimą bei prekybą baltymais. 2, 3, 4, 5, 6 Medialinė priešfrontalinė žievė (mPFC) yra pagrindinė smegenų sritis kognityvinėje alkoholio vartojimo būklės kontrolėje ir yra jautri ilgalaikiam lėtinio alkoholio poveikio poveikiui. 7, 8, 9 Mes ir kiti anksčiau nustatėme ilgalaikio mPFC genų ekspresijos pokyčių, kuriuos sukelia lėtinis alkoholio poveikis, vartojimas ir priklausomybė, modelius, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13, tačiau mechanizmus, kurie skatina ir palaiko nuolatinį genų ekspresijos pokyčiai po alkoholio poveikio lieka nežinomi.

Čia mes pradėjome tyrinėti galimą mikroRNR (miRNR), kaip alkoholio sukeltų smegenų genų ekspresijos pokyčių tarpininkų, vaidmenį. miRNR yra mažos (~ 22–30 nukleotidų ilgio), labai konservuotos, nekoduojančios RNR molekulės, moduliuojančios genų ekspresiją post-transkripcijos lygiu. Po „Dicer“ apdorojimo, netobula 20–25 bp ilgio dvipusė miRNR atsipalaiduoja į subrendusią ir keleivio giją („miR-star“). Subrendusios miRNR jungiasi prie miRNR atpažinimo elementų, esančių jų tikslinių pasiuntinių RNR (mRNR) 3′-UTR, sukeldamos transliacijos degradaciją ar represijas. Keleivių grandinė paprastai būna žemesniuose kameros lygiuose. Iš pradžių manyta, kad keleivių grandinė greitai suyra kaip nefunkcinis šalutinis produktas15, tačiau neseniai įrodyta, kad keleivių grandinė gali būti visiškai funkcionali, prisijungti prie savo miRNR atpažinimo elementų ir slopinti savo paties rinkinio ekspresiją. mRNR. Manoma, kad 16, 17, 18, 19 atskiros miRNR nukreipia ir reguliuoja daugybę mRNR. Dėl savo galimybių daryti suderintus raiškos pokyčius visuose nuorašų rinkiniuose, miRNR siūlo įdomų kandidato mechanizmą alkoholio sukeltiems genų ekspresijos pokyčiams.

miRNR yra labai ekspresuojamos smegenyse ir vaidina svarbų vaidmenį atliekant įvairius biologinius procesus, įskaitant neuronų diferenciaciją, 20 sinapsių formavimąsi ir plastiškumą, 21 homeostatinį sinapsinį plastiškumą 22 ir neuronų degeneraciją. Vis daugiau įrodymų rodo, kad miRNR gali turėti lemiamą reikšmę neuroadaptyviniams procesams, kuriuos sukelia lėtinis vaistų poveikis. 24 Naujausi duomenys rodo, kad miRNR gali turėti didelę reikšmę elgesyje su priklausomybėmis, tokiose kaip kokaino vartojimas, priklausomybė nuo nikotino, tolerancija morfinui ir alkoholio toleravimas. 25, 26, 27, 28 Lewohl ir kt. Neseniai 11 nustatė 48 miRNR, kurios buvo sureguliuotos atliekant pomirtinę žmonių alkoholikų priekinės žievės analizę. Alkoholizmu sergančių asmenų smegenų audinio post-mortem analizė suteikia neįkainojamą langą apie šio sutrikimo genų ekspresijos reguliavimo sutrikimą, tačiau siūlo ribotas galimybes atskirti smegenų alkoholio poveikio pasekmes nuo jau egzistuojančių pažeidžiamumo veiksnių arba aplinkos poveikio, susijusio su alkoholiu. alkoholizmas, pavyzdžiui, galvos trauma ar mitybos nepakankamumas.

Kontroliuojamų gyvūnų modelių naudojimas šiuo atžvilgiu papildo žmonių pomirtinių tyrimų duomenis. Tyrimo tikslas buvo nustatyti miRNR raiškos pokyčius ir jų potencialius genų taikinius mPFC po gyvulinės priklausomybės nuo alkoholio anamnezės. Čia mes panaudojome nusistovėjusį žiurkių priklausomybės nuo alkoholio modelį, kuris, kaip įrodyta, lemia nuolatinį tolesnio savanoriško alkoholio vartojimo eskalavimą, lydimą lygiaverčių ilgalaikių genų ekspresijos pokyčių. 2, 29, 30 Mes panaudojome Affymetrix mRNR ir miRNR matricas, nustatėme miRNR ir mRNR ekspresijos pokyčius žiurkės mPFC po priklausomybės nuo alkoholio istorijos ir patvirtinome juos naudodami kiekybinę realaus laiko PGR (qRT-PCR). Genų ontologijos (GO) analizė suskirstė tikslines mRNR į kategorijas, susijusias su sinapsių perdavimu, jonų kanalais, prekyba, imuniniu atsaku, aksonų orientavimu ir transkripcijos reguliavimu. Išraiškos poravimas pasiūlė kelių miRNR visuotinį reguliavimo poveikį jų tikslinėms mRNR mPFC. Šie rezultatai identifikuoja miRNR-mRNR tinklus, kurie gali prisidėti prie mPFC stebimos priklausomybės nuo alkoholio slopinamosios elgesio kontrolės funkcijos.

Metodai

Dalykai

Suaugę Wistar žiurkės patinai, sveriantys 300–500 g eksperimento pradžioje, buvo laikomi poromis temperatūros (21 ° C) ir drėgmės kontroliuojamoje aplinkoje, keičiant 12 valandų dienos – nakties ciklus. Viso eksperimento metu žiurkėms buvo suteikta nemokama prieiga prie čiuptuvo ir vandens iš čiaupo. Tyrimai buvo atlikti vadovaujantis NIH laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovu. Buvo naudojamos dvi gyvūnų partijos, kurios buvo vienodai apdorojamos arba su pertraukiamais alkoholio garais, arba su oru. Norint patvirtinti padidėjusio savanoriško alkoholio vartojimo indukciją neapsunkinant sekančios ekspresijos analizės, iš kiekvienos partijos atsitiktine tvarka buvo paimtos dvi grupės, viena - elgesio patvirtinimui, kita - ekspresijos analizei (miRNR arba mRNR). Iš 1 partijos miRNR masyvo išraiškos profiliavimui ir kiekybiniam PGR (qPCR) patvirtinimui buvo naudojami n = 4 kiekvienoje grupėje, o n = 10 kiekvienoje grupėje - norint įvertinti alkoholio vartojimą. Iš 2 partijos mRNR raiškos profiliavimui ir qPCR patvirtinimui buvo naudojami n = 8 kiekvienoje grupėje, o n = 8–10 kiekvienoje grupėje. Jau buvo pranešta apie 2-osios partijos gėrimo duomenis (Sommer ir kt. , 2008).

Etanolio poveikis

Žiurkės buvo veikiamos arba pertraukiamais alkoholio garais, arba normaliu oru, naudojant inhaliacijos sistemą, kaip aprašyta anksčiau. 2 Trumpai tariant, žiurkėms buvo leista 1 savaitę įpratinti prie kamerų, po to vieną savaitę veikiamos mažos alkoholio koncentracijos ir galiausiai 7 savaites veikiamos kasdienio alkoholio intoksikacijos ir vartojimo ciklų. Kiekvieną savaitę buvo pasveriamos žiurkės, paimtas kraujas iš šoninės uodegos venos, o serumas ekstrahuotas ir ištirtas etanolio kiekiu, naudojant nikotinamido adenino dinukleotido fosfato dehidrogenazės / spektrofotometrinio tyrimo rinkinį (Sigma Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Kaip anksčiau skelbta, dėl 29 alkoholio garų ekspozicijos dienos alkoholio koncentracija kraujyje buvo nuo 0 iki 200–380 mg dl −1 . Po ekspozicijos laikotarpio pabaigos alkoholio pašalinimo fazės pabaigoje buvo matomi pašalinimo požymiai kaip uodegos standumas ir piloerection. Pasitraukimas nebuvo toks sunkus, kaip ir pasitraukimo traukuliai.

Etanolio vartojimas

Priklausomų ir kontrolinių gyvūnų pogrupiui (1 partija: n = 10 kiekvienoje grupėje) buvo taikoma dviejų butelių pasirinkimo paradigma, kad būtų patvirtinta priklausomybė nuo alkoholio. Praėjus 1 savaitei po to, kai žiurkės buvo pašalintos iš garų, jos buvo mokomos gerti 8% alkoholio (m / t) 0, 2% sacharino per 2 savaites, o vartojimas buvo matuojamas 10 dienų iš eilės per 24 valandas prieinamą dviejų butelių nemokamą - pasirinkimo paradigma su 8% alkoholio (masės / tūrio) 0, 2% sacharino tirpale arba tik 0, 2% sacharino tirpalu, kaip aprašyta. 2 Dienos alkoholio suvartojimas buvo vidutinis per 2 savaites ir buvo lyginamas pagal t- testą.

Smegenų nusiurbimas

Ekspresijos analizei atsitiktinai atrinkti žiurkės buvo nužudytos praėjus 3 savaitėms po ekspozicijos. Po priklausomos žiurkės ir kontrolinės grupės (1 serija: n = 4 kiekvienoje grupėje; 2 serija: n = 8 kiekvienoje grupėje) buvo pašalintos nuo 1000 iki 1500 valandų. Smegenys buvo pašalintos, užšaldytos –40 ° C izopentane ir laikomos –80 ° C temperatūroje. Dvišaliai mėginiai iš mPFC (įskaitant Cg1 + 2, PL ir IL pagal Paxonis ir Watson 31 ) buvo išpjaustomi skalpeliu iš 2 mm vainikinės pjūvio po didinamuoju lęšiu, naudojant anatominius orientyrus, kaip aprašyta. 32 mėginiai buvo pasveriami ir laikomi –80 ° C temperatūroje, kol bus paruošta RNR.

miRNR išskyrimas ir miRNR raiškos profiliavimas

miRNR buvo išskirti iš 1 partijos mėginių, naudojant „mirVana“ miRNR išskyrimo rinkinį („Ambion Life Technologies“, Foster City, CA, JAV). Bendras RNR kiekis buvo matuojamas „NanoDrop“ („ThermoSc Scientific“, Wilmington, DE, JAV). Hibridizacijos procedūrai buvo panaudota apie 200 ng visos RNR. „MiRNR“ buvo sujungtos į biotinilintą signalo molekulę, naudojant „FlashTag Biotin HSR RNA Labelling Kit“ (Genisphere, Hatfield, PA, JAV). „MiRNAs“ buvo hibridizuotos 16 valandų 48 ° C temperatūroje su „Affymetrix“ miRNR matricomis („Affymetrix“, Santa Clara, CA, JAV) „Affymetrix“ hibridizacijos krosnyje 645. „Affymetrix“ miRNR matricos buvo plaunamos „Fluidics Station 450“ naudojant fluidų scenarijų FS450_0003 ir nuskaitytos „GeneChip Scanner 3000 7G“ sistema („Affymetrix“). Aštuoni lustai išlaikė kokybės kontrolę. Po nuskaitymo duomenys buvo modifikuoti žurnalo 2 bazėje, normalizuoti ir patikrinti kokybės kontrolei naudojant „miRNA QC Tool“ programinę įrangą (Affymetrix). Statistiniai skirtumai tarp grupių buvo atlikti naudojant „Partek Genomics Suite“ (Partekas, Sent Luisas, MO, JAV). Tvirtos daugialypės raiškos vidutinės išraiškos vertės buvo gautos ir patikrintos pagal diferencijuotą genų ekspresiją, naudojant Welch dviejų imčių t- testą, darant prielaidą, kad nelygios dispersijos, esant P <0, 05 slenksčiui. Klaidingo atradimo dažnis (FDR) buvo įvertintas visuose zondo rinkiniuose, naudojant Benjamini ir Hochberg metodus. 33 „Affymetrix“ miRNR mikrotraumoje buvo zondai, nukreipti į miRNR iš daugiau nei 45 skirtingų rūšių, įskaitant Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster , Danio rerio , pelę, žiurkę ir žmogų. Atskirų mėginių dispersijai nustatyti buvo naudojama „Partek Genomics Suite“ („Partek“) principinė komponentų analizė (PCA). PCA vykdoma kaip R analizė, kurioje kintamieji ( p ) sudedami į kintamųjų pikselių dispersijos matricą (kovarianciją), kur kiekvienas transformuotas stebėjimas vaizduojamas jo pagrindiniais komponentais.

miRNR kiekybinis realaus laiko PGR

Iš to paties mėginių rinkinio (1 serija), miRNR ekspresijos lygių realiojo laiko PGR analizė buvo atlikta naudojant TaqMan miRNA atvirkštinės transkripcijos rinkinį (Ambion Life Technologies) ir tiriama trimis egzemplioriais. Visoms reakcijoms miRNR analizei buvo naudojama 10 ng visos RNR. Reakcijos buvo normalizuotos pagal U6 endogeninę kontrolę ir palygintos tarp grupių, naudojant 2-ΔΔCt metodą, kuriame slenksčio ciklas (Ct) yra ciklas, kuriame pastebimas pastebimas fluorescencijos padidėjimas; ΔCt vertė apskaičiuojama atimant endogeninės kontrolės Ct vertę iš dominančios miRNR Ct vertės. ΔΔCt vertė apskaičiuojama atimant kontrolinio mėginio ΔCt vertę iš eksperimento ΔCt. Grafiniam aiškinimui ΔΔCt reikšmės buvo transformuotos (-x), taigi žemyn sureguliuoti genai rodo ΔΔCt0. ΔΔCt reikšmės buvo palygintos su nesuporuotu kiekvieno geno ar mikroRNR t- testu ( P <0, 05 = reikšmingumas; P <0, 07 = tendencija).

mRNR išskyrimas ir mRNR raiškos profiliavimas

Bendra RNR buvo išgauta iš 2 partijos mėginių naudojant „Trizol“ reagentą („Gibco BRL Life Technologies“, Baltimorė, MD, JAV), po kurio atliktas RNeasy (Qiagen, Hilden, Vokietija) kolonų valymo etapas pagal gamintojo instrukcijas. Visi RNR mėginiai rodė A260 / 280 santykį tarp 1, 9 ir 2, 1. RNR vientisumas buvo nustatytas naudojant „Agilent 2100 Bioanalyzer“ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV), ir buvo naudojama tik medžiaga, neturinti skilimo požymių. Tikslinis paruošimas buvo atliekamas pagal atskirus mėginius, o hibridizavimas su RAE230A matricomis, drožyba, plovimas ir skenavimas buvo atlikti pagal gamintojo techninį vadovą (Affymetrix). „Microarray Analysis Suite 5.0“ (MAS5) sukūrė ląstelių intensyvumo rinkmenas, kurios buvo patikrintos, kaip aprašyta regioninės hibridizacijos paklaidos ir kokybės kontrolės parametrai. 34 Šešiolika žetonų išlaikė kokybės kontrolę. MAS5 atpažino samples 60% iš 15 800 zondo rinkinių, esančių RAE230A masyve, kaip mūsų pavyzdžiuose. CEL failai buvo importuoti į „Partek Genomics Suite“. Duomenys buvo normalizuoti log2. RNR ekspresijos vertės buvo gautos ir patikrintos dėl diferencijuotos genų ekspresijos, naudojant Welch dviejų mėginių t- testą, darant prielaidą, kad nevienodos dispersijos, esant P <0, 05 slenksčiui. Remdamiesi ankstesniais mikrotraumų tyrimais, tiriančiais mRNR pokyčius po ilgo alkoholio poveikio, mes netaikėme FDR skaičiavimo, o pasirinkome ribinę kartų keitimo vertę 1, 2. 35

mRNR kiekybinis realaus laiko PGR

Iš to paties mėginių rinkinio (2 serija) 100 ng visos RNR buvo atvirkščiai perrašytos naudojant didelės talpos RNR į cDNR pagrindinį mišinį (Applied Biosystems (ABI), Darmštatas, Vokietija) pagal gamintojo protokolą. Mėginiai buvo tiriami trimis egzemplioriais 20 μl visos reakcijos tūriu, naudojant „Power SYBR®Green PCR Master Mix“ (ABI), naudojant ABI 7900 HT RT-PCR sistemą (40 ciklų 95 ° C 15 s ir 60 ° C 1 minutę). ). Kiekvieno PGR pabaigoje buvo užregistruotas lydymosi profilis, siekiant patikrinti, ar nėra abejotinų fragmentų amplifikacijų. Kiekvieno taikinio pradmenys buvo suprojektuoti kodavimo sekos 3′-galo link, atsižvelgiant į egzono ir egzono jungtis, jei įmanoma, remiantis Nacionalinio biotechnologijų informacijos centro (NCBI) atskaitos sekų duomenų baze. Amplikonai buvo suprojektuoti 95–110 bp ilgio ir lydymosi temperatūros> 75 ° C, kad lydymosi analizėje būtų galima atskirti amplikonus ir pradmenis-dimerinius darinius. Dėl pradmenų sekų žiūrėkite 1 papildomą lentelę. ABI SDS 2.2.2 programinė įranga buvo naudojama SYBR žaliosios fluorescencijos intensyvumui analizuoti ir teoriniam ciklo skaičiui apskaičiuoti, kai buvo peržengta apibrėžta fluorescencijos riba (Ct vertės). Santykinis kiekybinis įvertinimas buvo atliktas aukščiau aprašytu ΔΔCT metodu, kai kaip vidinė kontrolė buvo naudojamas beta-aktinas (Actb). Actb Ct vertės grupėse nesiskyrė. Dėl sudėtingo sujungimo variantų, smegenų išvestas neurotrofinis faktorius (BDNF) buvo ištirtas naudojant TaqMan tyrimą, kaip aprašyta anksčiau. 36 Zondų sekos, pažymėtos reporteriniu dažikliu 6-karoksiflourescinu, buvo: 5′-CTTCCCGGGTGATGCTCAGCAGT-3 ′ BDNF ir 5′ – ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-3 ′ Actx. Statistiniai bandymai ir grafinis atvaizdavimas buvo atlikti naudojant −ΔΔCT reikšmes, kaip aprašyta aukščiau.

Aukštesnės eilės bioinforminė analizė

Kandidatinės miRNR ir mRNR buvo toliau tiriamos naudojant bioinformatikos analizę. Išradingumo kelio analizė yra internetinė bioinformatikos priemonė, kuri pateikia miRNR ir mRNR kandidatus į kanoninius kelius, genų tinklus ir tiria genų ir genų bei miRNR-genų sąveiką, naudodama statistinius kriterijus. Vėliau visos reikšmingos biologinės temos, susijusios su genų ir miRNR tinklais, kanoniniais keliais ir biologinėmis funkcijomis, buvo patikrintos kryžminiu būdu, naudojant Kioto genų ir genomų enciklopediją (KEGG; www.genome.jp/kegg), GO Consortium (www.geneontology.org) ir Anotacijų, vizualizacijos ir integruotų atradimų duomenų bazė (DAVID; //david.abcc.ncifcrf.gov). GAV kategorijoms nustatyti buvo naudojamas DAVID. Reikšmingumo ir filtrų kriterijai buvo nustatyti P <0, 05, naudojant Benjamini – Hochberg metodą, o FDR - 20%. DAVID foniniai parametrai buvo tokie: Rūšies fonu buvo pasirinktas Rattus Norvegicus , o Affymetrix 3′-IVT fonui buvo pasirinktas Rat Genome RAE230A masyvas.

Integruota miRNR ir mRNR mikrotraumų duomenų analizė

„miRNA“ taikinio analizė buvo atlikta naudojant „microRNA.org“ svetainę. 38 Naujausios prognozės apie tikslinę vietą buvo gautos žiurkėms, įskaitant konservuotas ir nekonservuotas miRNR. Šios prognozės buvo suderintos, jei įmanoma, su 165 skirtingai reguliuojamomis mRNR ir 41 skirtingai išreikšta miRNR, nustatyta ankstesnėje išraiškos profiliavimo analizėje. Numatytai miRNR – mRNR sąveikai nustatyti buvo naudojami geri „miRSVR“ ir „PhastCon“ balai, pagrįsti „microRNA.org“ algoritmais. Taškai nustatė tinkamą miRNR raiškos modelių ryšį su mūsų eksperimentiškai stebimais mRNR raiškos rezultatais. Tikslai buvo suskirstyti į prioritetus, remiantis informacija, pateikta Davido Go ontologijos analizėje, taip pat miRNR – mRNR ekspresijos pora, kur miRNR ir mRNR raiška buvo pakeista priešinga kryptimi.

Rezultatai

Padidėjęs alkoholio vartojimas atsižvelgiant į priklausomybės istoriją

Priklausomi gyvūnai 7 savaites buvo veikiami alkoholio garų, palaikant alkoholio koncentraciją kraujyje 150–400 mg dl –1 (2 papildoma lentelė). Nors yra keletas partijų kintamumų, vėlesnis savanoriškas alkoholio vartojimas pasirinkus dviejų butelių pasirinkimo paradigmą (atitinkamai 2 ar 3 savaites po veikimo garais, atitinkamai 1 ir 2 partijos) buvo panašiai ir reikšmingai padidėjo, maždaug 2 kartus. -nepriklausomi gyvūnai, palyginti su jų atitinkamomis kontrolėmis (1 serija (miRNR kohorta): 1, 75 ± 0, 26 vs 0, 9175 ± 0, 207; ( t = 2, 446, df = 18) P = 0, 024; 2 partija (mRNR kohorta): 3, 8 + 0, 35 vs 1, 44 +) 0, 28; F (2, 30) = 17, 5, P <0, 001, kaip aprašyta Sommer et al., 29

MiRNR ir mRNR raiškos profilių PCA

Išanalizavome duomenis apie visuotinio gydymo poveikį, taikydami PCA visiems duomenų taškams (1 pav.) PCA yra naudingas nustatant pagrindinius grupės efektus ir pašalinius duomenis duomenų rinkinyje. Ši analizė aiškiai nustatė, kad gydymas yra didžiausias miRNR duomenų variacijos šaltinis (1 paveikslas, kairioji plokštė), tuo tarpu bendrasis gydymo poveikis mRNR duomenims nebuvo toks stiprus (1 paveikslas, dešinė panelė). Atitinkamai, bendras miRNR duomenų rinkinyje paaiškintas dispersijos kiekis buvo 62, 8% (PC # 1 = 28, 7%, PC # 2 = 20, 4% ir PC # 3 = 13, 7%). Bendras mRNR duomenų rinkinyje paaiškintas dispersijos dydis buvo 35, 4% (PC # 1 = 14, 8%, PC # 2 = 10, 8% ir PC # 3 = 9, 8%). Pasauliniu lygmeniu šie duomenys rodo, kad priklausomybės nuo alkoholio istorija lemia didesnius miRNR raiškos pokyčius nei mRNR.

Image

Atskirų gyvūnų pagrindinė komponentinė analizė, skirta mikrRNR (miRNR) ir pasiuntinio RNR (mRNR) matricai. Po to priklausomi gyvūnai žymimi mėlynais apskritimais, o kontroliniai gyvūnai - raudonais apskritimais. Elipsė, supanti dvi gydomąsias grupes, nustato mRNR ir miRNR raiškos pokyčius skirtinguose mėginiuose ne daugiau kaip 2 sd atstumu nuo vidurkio. Linijos jungiasi prie centroido (žymimo mėlynu arba raudonu rutuliu, apskritimu geltona), kad sujungtų panašias grupes. X , y ir z ašys žymi pirmuosius tris didžiausius kintamojo principo komponentus (PC # 1, PC # 2 ir PC # 3), sudarančius didžiąją dalį duomenų rinkinio dispersijos. Kairysis skydelis rodo miRNR pagrindinio komponento analizę (PCA), o dešinysis skydelis - mRNR (geno) PCA analizę.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Priklausomybė nuo alkoholio keičia mRNR raiškos profilius mPFC

Mes nustatėme 41 žiurkės (rno) -miRNR, reikšmingai pakitusį mPFC po priklausomybės nuo alkoholio anamnezėje ( P <0, 05, kartų pokytis ± 1, 2, FDR <5%). Tarp šių skirtingai išreikštų miRNR 17 buvo reikšmingai padidinta, o 24 - reikšmingai sumažinta. Visų 41 reikšmingai pakitusių atskirų gyvūnų miRNR išraiškos vertės buvo sugrupuotos, o šilumos žemėlapis buvo sudarytas naudojant k- priemonių grupavimą (2 paveikslas, kairysis skydelis). Kaip ir tikėtasi, išraiškos duomenys suskirstyti į dvi pagrindines grupes, priklausančias atitinkamai nuo kontrolinės ir nuo priklausomos grupės narių. 3 papildomoje lentelėje pateiktas visas reikšmingai pakeistų miRNR sąrašas.

Image

Hierarchiškai suskirstytos diferencijuotai išreikštos mikroRNR (miRNR) ir pasiuntinio RNR (mRNR) grupės iš priklausomų žiurkių ir kontrolinės grupės. Eilutės: atskiros miRNR arba mRNR; stulpeliai: atskiri pavyzdžiai. Mėlynos spalvos dėžutės, pažymėtos PD, pažymėtos šilumos žemėlapio viršuje, reiškia gyvūnus, priklausomus nuo priklausomybės; Raudoni langeliai, esantys šilumos žemėlapiu pažymėtos kontrolės (Ctrl) viršuje, rodo kontrolinius gyvūnus. Dėžutės po PD ir Ctrl etiketėmis žymi atskirus žiurkių skaičius. Raudona šilumos žemėlapyje žymi geno arba miRNR padidėjusį reguliavimą, o mėlyna šilumos žemėlapyje žymi geno arba miRNR žemyn reguliavimą. Kairysis skydelis: šilumos žemėlapyje yra 41 miRNR su reikšminga skirtinga išraiška ( P <0, 05). Dešinysis skydelis: šilumos schemoje yra 165 mRNR, turinčių reikšmingą skirtingą išraišką ( P <0, 05). Žr. 3 ir 4 papildomas lenteles, kuriose pateikiamos P vertės ir kiekvienos čia pavaizduotos miRNR ir mRNR kartos pokyčiai.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Priklausomybė nuo alkoholio keičia mRNR raišką mPFC

mRNR ekspresijos profiliavimas nustatė 165 genus, kurių reikšminga pakitusi ekspresija mPFC po priklausomybės nuo alkoholio istorijos ( P <0, 05, kartų pokytis ± 1, 2). Tarp jų 105 genai buvo reikšmingai sureguliuojami, o 60 genų buvo reikšmingai sureguliuoti. 4 papildomoje lentelėje pateiktas visas reikšmingai pakitusių genų sąrašas. Kartotiniai genų ekspresijos pokyčiai buvo santykinai maži (± 1, 2–1, 7), o tai atitinka tai, kas paprastai nustatyta smegenų ekspresijos pokyčiams esant psichiniams sutrikimams, įskaitant priklausomybę nuo alkoholio. 34 Visų 165 reikšmingai pakitusių atskirų gyvūnų nuorašų išraiškos vertės buvo sugrupuotos, o šilumos žemėlapis buvo sudarytas naudojant „K“ priemonių grupavimą (2 paveikslas, dešinysis skydelis). Nors ši procedūra nėra tokia aiški kaip miRNR klasterizacijos analizė, ši procedūra genų ekspresijos duomenis paprastai suskirstė į dvi pagrindines grupes, remiantis gydymu (kontrolė ar po priklausomybės). Svarbu tai, kad 37 iš 165 genų anksčiau buvo siejami su alkoholio vartojimu, piktnaudžiavimu ja ir priklausomybe (nuorodos pateiktos 4 papildomoje lentelėje) - tai patvirtina mūsų masyvo duomenų biologinę reikšmę. Naudodamiesi GO analize, mes nustatėme svarbiausias kategorijas, susijusias su mielinacija, jonų kanalais, sinapsiniu pralaidumu ir plastiškumu. Apskritai 90 iš 165 skirtingai reguliuojamų genų priklausė žymiai daugiau atstovaujamų GO kategorijų. 15 svarbiausių nereikšmingų kategorijų parodyta 1 lentelėje, o visas reikšmingų kategorijų sąrašas pateiktas 5 papildomoje lentelėje. MRNR taip pat buvo tiriamos naudojant išradingumo kelio analizę, siekiant nustatyti galimus eksperimentinių rezultatų ryšius su žinomomis biologinėmis funkcijomis, ligomis. ir kanoniniai keliai. Dešimt kanoninių takų ir biologinių funkcijų buvo nustatyti kaip reikšmingi, naudojant dešiniarankį Fišerio Tikslųjį testą. Keturi iš šių būdų rodo su neuroadaptacija susijusius procesus: kortikotropinus atpalaiduojančio hormono signalizavimas, neurotropinų / TRK signalizavimas, aksonų orientacinis signalizavimas ir G-baltymų sujungtų receptorių signalizavimas. Trys svarbiausios biologinės funkcijos buvo neurologinės ligos, psichologiniai sutrikimai, nervų sistemos vystymasis ir funkcijos. Reikšmingų biologinių funkcijų (reikšmingas slenkstis = P <0, 05) ir kanoninių kelių (reikšmingas slenkstis = −log ( P reikšmė)> 1, 3) sąrašas pateiktas 6 papildomoje lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Integruota miRNR ir mRNR analizė

Šiuo metu manoma, kad miRNR raiškos lygiai paprastai yra atvirkščiai koreliuojami su jų atitinkamų mRNR taikinių lygiais. Norėdami nustatyti suderintus priklausomybės nuo alkoholio sukeliamus miRNR ir mRNR raiškos pokyčių modelius, atlikome miRNR – mRNR raiškos porų analizę, tai yra, nustatėme atvejus, kai miRNR rūšys ir jų numanomos tikslinės mRNR buvo keičiamos priešinga kryptimi. Duomenų rinkiniuose radome 33 miRNR, nukreipiančius į 89 mRNR (2 lentelė), kurie atitiko šią sąlygą. Išraiškos porų analizės detalės pateiktos 7 papildomoje lentelėje. Šių 89 mRNR buvo atlikta GO analizė, siekiant ištirti jų funkcinius ryšius. Ženkliai praturtintos GO kategorijos ( P <0, 05; Benjamini – Hochberg metodas ir FDR 20%) yra pažymėtos spalvomis šalia mRNR (2 lentelė) ir yra susijusios su funkciniais procesais, paprastai susijusiais su neurotransmisija, neuroadaptacija ir sinapsiniu plastiškumu. Išsami GO analizės informacija pateikta 5 papildomoje lentelėje. Kiekvienai mRNR buvo sudarytas sudėtingas balas, remiantis iš anksto apskaičiuotu „mirSVR“ balais pagal jų taikomą miRNR, rastą „miRanda“ duomenų bazėje (7 papildoma lentelė, AQ stulpelis). „mirSVR“ vertinimas yra regresijos metodas, skirtas numatyti mRNR sumažėjusio reguliavimo tikimybę iš sekos ir struktūros ypatybių mikroRNR / mRNR numatomose tikslinėse vietose. 39 Sudėtinis kiekvieno geno balas rodo visų sukauptų „mirSVR“ balų, gautų stebint miRNR, sumą ir galimą slopinimo faktorių, kurį vienas genas galėjo turėti iš kelių miRNR. 39

Pilno dydžio lentelė

89 transkriptai, kuriuos galimai reguliavo miRNR, buvo išradingumo būdo analizė, siekiant ištirti galimus reguliavimo tinklus, pagrįstus literatūroje aprašytomis genų ir genų bei mRNR ir miRNR sąveikomis. 3 paveiksle parodytas tinklas, sukurtas pagal išradingumo algoritmą. Maždaug 15 iš 25 šio tinklo nuorašų yra arba reguliuojami (4), arba sumažinami (11) mPFC po priklausomybių turinčioms žiurkėms. Pagrindinės šio tinklo funkcijos apima DNR replikaciją, rekombinaciją ir remontą, ląstelių ciklą ir genų ekspresijos reguliavimą. Šis ypatingas tinklas yra įdomus, nes jame yra daugybė genų, kurie, kaip manoma, gali būti susiję su neuropsichiatriniais sutrikimais ir priklausomybe, įskaitant BDNF, 40 Fos, 30, 41, 42 Per2, 43 ir lanką, 44 Nr4a1, 45 Nr4a3. 46 Be to, 15 skirtingai išreikštų mRNR šiame tinkle yra nukreiptos į 26 iš miRNR, rastų miRNR mikro matricos eksperimente. Daugelis šių miRNR yra nukreipti į tas pačias mRNR. Tai svarbu, nes miRNR gali veikti sinergiškai arba konkurencingai moduliuodami mRNR raišką. 47, 48

Image

Reguliuojamas genų, pakeistų nuo alkoholio priklausomų pasiuntinių RNR (mRNR) ir jų taikomų mikroRNR (miRNR), tinklas. a ) Genų reguliavimo tinklas, sukonstruotas iš nuo alkoholio priklausomų mRNR rinkinių briaunų (linijų). Jungiamieji mazgai (genai) atspindi reguliavimo sąveiką, tokią kaip genų ekspresijos reguliavimas, baltymų ir baltymų sąveika, baltymų ir nukleorūgščių sąveika bei baltymų ir hormonų sąveika. Nereguliuojami genai žymimi raudona spalva, nepakitę pilka spalva, o žemyn - mėlyna spalva. Paryškintos raidės reiškia PGR patvirtintus genus arba miRNR. ( b ) Trylika genų, nurodytų ( a ) punkte, nukreipti į miRNR matricos duomenų rinkinyje. * „ miRNA“ keleivių kryptis: Žvaigždžių kompoziciniai balai buvo sudaryti iš 7 papildomos lentelės. Paryškintos raidės rodo PGR patvirtintus genus arba miRNR. Žr. 3 ir 4 papildomas lenteles, kuriose pateikiamos P vertės ir kiekvienos čia pavaizduotos miRNR ir mRNR kartos pokyčiai.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

MRNR ir miRNR mikrotraumos išraiškos duomenų patvirtinimas naudojant qRT-PGR

Remdamiesi aukščiau pateiktomis analizėmis, parinkome diferencijuotai ekspresuotų miRNR ir mRNR pogrupius diferencialinės ekspresijos patikrinimui kiekybine qRT-PGR. Atrenkant kandidatus buvo atsižvelgiama į mikrotraumų išvadų patikimumą ir siūlomą vaidmenį aukščiau aprašytame tinkle. Kandidatinės miRNR ir mRNR buvo pasirinktos patvirtinti qRT-PGR, atsižvelgiant į jų dalyvavimą keliuose, kuriuos anksčiau įrodė reguliuojantis narkotikų vartojimas ir priklausomybė. Kandidatinės mRNR taip pat buvo pasirinktos atsižvelgiant į numatomą jų prisijungimą prie reikšmingai pakitusių miRNR. MiRNR qRT-PGR rezultatai iš esmės atitiko mikrotraumos duomenis (4 paveikslas). Norint patvirtinti mRNR, rezultatas buvo įvairesnis. Tiksliau, „Per2“ PGR tyrime nepasiekė reikšmingumo slenksčio ( P <0, 05), nors jis parodė tendenciją tikėtina linkme.

Image

rtPCR rezultatai: mikroRNR (miRNR) (viršutinė plokštė) ir pasiunčiamosios RNR (mRNR) (apatinė plokštė). Pasirinktos miRNR ir mRNR patvirtinimas realaus laiko PGR. ( a, b ) Neigiamo delta-delta ciklo slenksčio (ΔΔCT) vaizdavimas iš atrinktų ( a ) miRNR arba ( b ) mRNR pusių, išreiškiantis ciklo slenksčių pokyčius nuo gydymo iki kontrolinės, palyginti su endogenine kontrole. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001. Žemiau sureguliuoti genai rodo 0 vertę. Norėdami palyginti palyginamus mikro matricų P dydžius ir kiekvienos čia rodomos miRNR ir mRNR raido pokyčius, žiūrėkite 3 ir 4 papildomas lenteles.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Ryškiausias šio tyrimo radinys buvo ryškus globalus miRNR raiškos pokytis žiurkių mPFC, atsižvelgiant į priklausomybę nuo alkoholio. Be to, mūsų analizė rodo, kad miRNR-mRNR tinklai gali būti įtraukti į neuroadaptacijas, kurios yra susijusios su po to priklausoma būsena, ir tai galiausiai daro įtaką elgesiui. Šie radiniai siūlo kandidatus būsimiems in vitro ir in vivo tyrimams, kuriais siekiama nustatyti miRNR – mRNR tinklų funkcinį vaidmenį neuronų funkcijose ir su priklausomybe susijusiame elgesiu.

Mūsų žiniomis, tai yra pirmasis tyrimas, tiriantis smegenų miRNR raišką užsitęsus abstinencijai 49 nuo priklausomybės nuo alkoholio - stadija, kuri priklausomiems nuo alkoholio žmonėms yra susijusi su potraukiu alkoholiui ir didele atkryčio rizika. Pabrėžtina, kad miRNR profiliai iš gyvulių, priklausomų nuo priklausomybės ir kontrolinės, yra atskirti į aiškiai atskirtas grupes. Šis pastebėjimas buvo netikėtas, atsižvelgiant į ankstesnę priklausomybės nuo alkoholio modelių, atliktų atlikus transkriptų tyrimus, patirtį, kuri paprastai parodė didelę persigydymą tarp priklausomų nuo alkoholio ir kontrolinių gyvūnų. 3, 4, 50, 51 Gydymo poveikio išraiškos profiliams nustatymas diferenciacijos dispersijos metodais, tokiais kaip PCA, paprastai buvo iššūkis neuropsichiatrinėse būklėse ir atitinkamuose gyvūnų modeliuose, įskaitant su alkoholizmu susijusius fenotipus. 34, 52 Tikimasi, kad mažesnis mikroRNR fondo sudėtingumas, palyginti su transkriptu, palengvins ekspresijos profilių atskyrimą pagal šį metodą. Tačiau, be to, mūsų duomenys gali parodyti, kad didesnė miRNR grupių suderinta išraiška yra jautresnė alkoholio poveikiui nei koduojančių nuorašų išraiška.

miRNR buvo įtrauktos į kokaino vartojimą ir jo padidėjimą, 27, 53 nikotino stimuliaciją 54 ir alkoholio toleravimą 25, ir neseniai taip pat buvo aprašytos žmonių alkoholikų pomirtinių smegenų audiniuose. 11 Palyginus su pastaruoju tyrimu, mes nustatėme 9 miRNR, kurių išraiška pasikeitė dėl priklausomybės nuo alkoholio tiek žiurkėms, tiek žmonėms, sutapimą: miR-18a, miR-339-5p, miR-7, let-7f, miR-101, miR-376c, miR-152, miR-374b ir miR-380. Nors svarbu pažymėti, kad radome sutampančias miRNR, tai nebūtinai reiškia, kad tikslinės mRNR mūsų duomenų rinkinyje yra identiškos. Taip yra dėl to, kad 3′-UTR RNR sekos nėra labai konservuotos tarp žiurkių ir žmonių, tai rodo, kad miRNR gali jungtis prie skirtingų žiurkės ir žmogaus 3′-UTR sričių ir slopinti skirtingus baltymus koduojančius nuorašus.

„miR-9“, kuris mūsų tyrime buvo nereglamentuotas priklausomų žiurkių mPFC, yra ypač įdomus atsižvelgiant į naujausius in vitro tyrimus, kurie rodo jo dalyvavimą tarpininkaujant reaguojant į ūminį ir lėtinį alkoholio poveikį. Nustatyta, kad ūmus organotipinių neuronų kultūrų gydymas 20 mM alkoholiu (ties legalaus apsvaigimo riba) iki 24 h reikšmingai padidina miR-9 lygį ir prisideda prie alkoholio toleravimo keičiant didelio laidumo kalcio subvienetų sudėtį. ir iš įtampos suaktyvinamas kalio kanalas. 25 Tačiau 5 dienų ekspozicija didesnei alkoholio koncentracijai, lygiavertei alkoholikams (70 mM), taip pat mūsų žiurkėms, slopino miR-9 raišką, 48, kuri sutinka su mūsų ex vivo išvadomis. Potencialūs „miR-9“ taikiniai mūsų duomenų rinkinyje yra Cdr2, Gpnmb, Kcna1, Mettl7a, Mobp, Myo1d, Nefm, P2rx6, Pmp22 ir Vamp1, kurie visi yra funkciškai svarbūs (2 lentelė). Tai rodo, kad miR-9 galėtų sugebėti sureguliuoti viso genų tinklo, dalyvaujančio priklausomybės nuo alkoholio, raišką. Ateities tyrimai yra būtini norint išsiaiškinti, kaip priklausomybė nuo alkoholio keičia miR-9 ekspresiją neuronų populiacijose in vivo ir kaip tai gali paveikti pasrovės tinklus ir funkcinę išeigą.

Mes nustatėme keletą mRNR su pakitusia ekspresija mPFC po priklausomybių turinčioms žiurkėms. Įrodyta, kad maždaug 62 iš šių 165 mRNR turi įtakos neuropsichiatriniams sutrikimams ar narkotikų vartojimui bei priklausomybei. Be to, 37 iš 165 mRNR anksčiau buvo siejami su alkoholio vartojimu, piktnaudžiavimu ar priklausomybe (žr. Nuorodą 4 papildomoje lentelėje). Lėtinio alkoholio vartojime dalyvaujantys molekuliniai mechanizmai veikia įvairias neuromediatorių sistemas. Lėtinis alkoholio vartojimas greičiausiai reiškia sinapsinių jungčių pertvarkymą šiose neurotransmiterių sistemose - procesą, kuris priklauso nuo genų ekspresijos pokyčių. 56 Be to, prisitaikymas prie alkoholio gali būti panašus į smegenų plastiškumą, atsirandantį dėl lėtinio kitų narkotikų, įskaitant heroiną ir kokainą, veikimo. 57, 58 mPFC, priklausomų nuo žiurkių, nustatėme skirtingą genų, dalyvaujančių dopamino (Drd1a, Qdpr, Gpr88 ir Prkc), serotonino (Htr2c ir Qdpr) ir glutamato (Homer1, Slc17a6 ir Rgs12) signalizacijos keliuose, ekspresiją. Įdomu tai, kad čia aptinkami genai ir neseniai identifikuotas bendras genų tinklas, kuris yra sureguliuotas pelių smegenyse, yra sureguliuotas po ilgo kelių narkotikų, įskaitant morfiną, nikotiną, tetrahidrokanabinolį ir alkoholį, susilaikymo. 59 Be to, GO ir kelio analizė nepriklausomai ir tvirtai atkreipė dėmesį į daugelį su neuroadaptacija susijusių funkcijų, susijusių su mielinacija, aksonų nukreipimu ir neurotransmiterių signalizacijos procesais, įtraukiant genus, tokius kaip Arc , CamkIIA , Gna12 , Homer1 , Ngdn , Prkcg , Syn2 , Syngr2 , Syt17. , „ Unc5b“ ir „ Vamp1“ . Šie tyrimai kartu rodo, kad atliekant chronišką smegenų alkoholio poveikį šiose neurocheminėse sistemose atsiranda neuroadaptacijos ir jos išlieka toliau.

Visuotinis miRNR reguliavimas ir jų visur esantis pobūdis gali pasiūlyti mechanizmą, užtikrinantį platų genų ekspresijos pokyčių, stebimų po priklausomybės nuo alkoholio, mechanizmą. Daugelis miRNR yra ekspresuojami neuronuose arba glia tam tikru regionu, todėl jie yra patikimi kandidatai, reguliuojantys daugybę mRNR skirtingose ​​smegenų grandinėse. Čia nustatyta daugybė miRNR (miR-485, miR-206, miR-106b žvaigždė, miR-101 ir miR-186; 3 papildoma lentelė) reguliuoja mRNR, dalyvaujančius sinapsiniame plastiškume ir neurotransmisijoje, o tai gali prisidėti prie sinapsių pertvarkymo. indėliai ir ilgalaikiai neuroadaptacijos, pagrindžiantys priklausomybę nuo alkoholio. Naudodamiesi ekspresijos pora, pagrįsta atvirkštiniu ryšiu tarp miRNR ir jų taikinių, nustatėme nemažą skaičių numanomų miRNR-mRNR porų (2 lentelė). Ši analizė atkreipė dėmesį į norminį transkripcijos tinklą, apimantį BDNF signalizaciją.

BDNF yra aktyvumo reguliuojamas neurotrofinas, plačiai paplitęs smegenyse ir, manoma, kad jis gali dalyvauti depresijos patogenezėje. 36, 60 Mūsų tyrimas nustatė BDNF kaip numanomą miR-206 taikinį. Analizė naudojant „microRNA.org“ atskleidė dvi konservuotas miR-206 tikslines vietas BDNF nuorašo 3′-UTR, 200 ir 378 padėtyse. Funkcinį šio stebėjimo svarbą patvirtina ankstesni pastebėjimai, kad BDNF raišką slopino miR-206. 3′-UTR reporterio tyrime ir kad miR-206 inhibitorius sugebėjo panaikinti miR-206 BDNF ekspresijos slopinimą. 61 Be to, atlikus tyrimus, kuriuose dalyvavo heterozigotinės BDNF mutantinės pelės 62 arba BDNF receptoriaus TrkB slopinimas, buvo pasiūlytas nuo BDNF priklausomas gyvulių alkoholio vartojimo reguliavimo mechanizmas. Dėl šių manipuliacijų padidėjo alkoholio vartojimas ir pirmenybė 63, 64, taip pat padidėjo reakcija į nerimą. 65

BDNF yra stiprus žievės neuronų sinapsinio perdavimo ir plastiškumo moduliatorius. 66 Kadangi BDNF signalizacija iš dalies perduodama per MAP-kinazės aktyvumą, slopinamas mPFC BDNF lygis gali sąveikauti su nereguliuojamu MAP-kinazės signalo perdavimu, kurį šiame tyrime parodė sumažinta dvigubai specifinės fosfatazės šeima (Dusp1 ir Dusp6). Iš tiesų, mes jau anksčiau pateikėme įrodymų apie pakitusią MAP kinazės funkciją žiurkių, priklausomų nuo mPFC, mPFC. 30 Kaip galimą pakitusios MAP-kinazės signalizacijos pasekmę, nustatėme kelių neuronų transkripcijos veiksnių, įskaitant Egr, Fos ir Nr4a šeimų narius, reguliavimą. Dėl šių pokyčių galiausiai gali būti sutrikdyta daugelio genų ekspresija ir atsirasti neuronų disfunkcija, prisidedanti prie elgesio pokyčių, pastebimų po priklausomybės būsenos. Svarbu tai, kad buvo pateikta įrodymų, jog kai kurie aukščiau aprašyti molekuliniai įvykiai jau yra pajudinami alkoholio poveikio metu. Pelėms, paveiktoms lėtiniu protarpiniu alkoholio poveikiu, panašiu į čia naudojamą procedūrą, ryškiai sumažėjo BDNF ir Egr1 reguliavimas PFC. 50

Mes taip pat nustatėme atvejus, susijusius su ekspresijos pora, kai miRNR ir jų numanomi taikinių nuorašai buvo reguliuojami ta pačia kryptimi (7 papildoma lentelė). Keli šio akivaizdaus prieštaravimo Guo ir kt. Hipotezei paaiškinimai . 14 reikia apsvarstyti. Pirma, miRNR yra ne tik potencialūs transkripcijos reguliatoriai, bet ir patys transkripcijos kontroliuojami daugelio transkripcijos veiksnių, naudojant sudėtingas grįžtamojo ryšio kilpas. Šios miRNR – mRNR grįžtamojo ryšio kilpos atrodo svarbios homeostatiniuose mechanizmuose, tokiuose kaip sinapsinio plastiškumo reguliavimas. 22 Antra, miRNR genai dažnai yra numanomų taikinių induose, todėl juos kontroliuoja priimančiojo geno transkripcija. Galiausiai negalime atmesti galimybės, kad kai kurie mūsų pastebėjimai yra atsitiktiniai. Tačiau, atrodo, kad genai, turintys aukščiausią miRSVR rezultatą, tokie kaip Bdnf , Nr4a3 ir Fos , rodo stipriausius skirtumus, susijusius su patvirtinamuoju tyrimu (qPCR Bdnf ir Nr4a3 , in situ hibridizavimas c- Fos 30 ). paremdami mūsų bendras išvadas.

Galimas šio tyrimo apribojimas yra tas, kad miRNR ir mRNR profiliai atsirado iš skirtingų gyvūnų. Dėl atsitiktinių individualių variacijų tai gali sumažinti jautrumą aptikti suderintus miRNR ir mRNR raiškos pokyčius. Vis dėlto pokyčiai, kurie vis dėlto buvo nustatyti, gali būti labiau susiję su padidėjusiu gėrimu, priklausomu nuo priklausomybės, kuris buvo patvirtintas abiejose gyvūnų partijose. Šis svarbus elgesio rezultatas ir su tuo susijęs padidėjęs jautrumas stresui, atsirandantis dėl lėtinio protarpinio etanolio poveikio, dabar buvo rasti daugelyje laboratorijų, esant skirtingoms alkoholio vartojimo sąlygoms, ir žiurkėms, ir pelėms. 6 Kitas apribojimas, vertinant miRNR – mRNR raiškos porų funkcinį tinkamumą remiantis smegenų audinio homogenato analize, yra tas, kad jis neleidžia išsiskirti ląstelėms. Taigi miRNR ir mRNR raiškos pokyčiai iš tikrųjų gali atsirasti skirtingose ​​ląstelių populiacijose. Ląstelių lygiu norint priežastiniu būdu susieti atskirų miRNR raiškos pokyčius su tikslinių nuorašų reguliavimu, reikės atlikti bandymus ląstelėmis. Sistemos lygiu, norint priežastiniu būdu susieti mPFC miRNR išraiškos pokyčius su elgesiu, reikės lokalios kandidatų miRNR ekspresijos arba jų slopinimo. Šiame tyrime nustatomi galimi šių būsimų tyrimų tikslai.

In conclusion, we have identified persistent, coordinated changes in the expression of miRNAs and their target mRNAs in the rat mPFC following alcohol dependence. The miRNAs identified target multiple mRNAs that are associated with mechanisms involved in reward pathways, neurotransmission and synaptic plasticity. The ability of miRNAs to regulate ensembles of mRNAs that control complex cellular processes in the brain in a coordinated manner suggests a possible role for miRNAs in the pathophysiology of alcohol dependence. The coordinated and long-lasting shift in microRNA and mRNA expression may restructure the function of neural circuits involved in the cognitive control that the mPFC exerts over alcohol drinking and relapse, ultimately contributing to alcohol dependence.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildoma S1 lentelė

  2. 2.

    Papildoma S2 lentelė

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildoma S3 lentelė

  2. 2.

    Papildoma S4 lentelė

  3. 3.

    Papildoma S5 lentelė

  4. 4.

    Supplementary Table S6

  5. 5.

    Supplementary Table S7

    Supplementary Information accompanies the paper on the The Pharmacogenomics Journal website (//www.nature.com/tpj)