Kordicepsas sinensis apsaugo nuo kepenų ir širdies sužalojimų lėtinės inkstų ligos žiurkių modelyje: metabolominė analizė acta pharmaologica sinica

Kordicepsas sinensis apsaugo nuo kepenų ir širdies sužalojimų lėtinės inkstų ligos žiurkių modelyje: metabolominė analizė acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Norėdami patikrinti hipotezę, kad tradicinė kinų medicina Cordyceps sinensis galėtų pagerinti ekstrarenalinių organų metabolinę funkciją, kad būtų pasiektas anti-lėtinės inkstų ligos (CKD) poveikis.

Metodai:

Patinai SD žiurkės buvo padalyti į CKD žiurkes (su 5/6-nefrektomija), CKD-žiurkes, gydytas Cordyceps sinensis (4 mg • kg-1 • d-1, po ), ir fiktyviai operuotas žiurkes. Po 8 savaičių gydymo metabolitai buvo išgaunami iš žiurkių širdies ir kepenų, o po to jiems buvo atlikta 1H-BMR pagrįsta metabolominė analizė.

Rezultatai:

Oksidacinis stresas, energijos apykaita, aminorūgščių ir baltymų apykaita ir cholino metabolizmas buvo laikomi ryšiais tarp LŠD ir nežemiškų organų disfunkcijos. Per 8 savaičių eksperimentinį laikotarpį metaboliniai sutrikimai kepenyse buvo ryškesni nei širdyje, o tai rodo, kad su CKD susiję ekstrarenalinių organų funkcijos sutrikimai įvyko nuosekliai, o ne vienu metu. Peroralinis Cordyceps sinensis vartojimas turėjo statistiškai reikšmingą gelbstintąjį poveikį kepenims ir širdžiai, atvirkščiai reguliuodamas metabolitų, kuriems paprastai sutrikusi CKD, lygį.

Išvada:

Išgertas Cordyceps sinensis vartojimas reikšmingai palengvina kepenų ir širdies sužalojimus CKD žiurkėms. 1H BMR metodu pagrįstas metabolizmo metodas pateikė sistemingą vaizdą, kaip suprasti LKS ir gydymą vaistais, kurie taip pat gali būti naudojami išaiškinti kitų tradicinių Kinijos vaistų veikimo mechanizmus.

Įvadas

Lėtinė inkstų liga (LŠL) yra būklė, kai inkstas palaipsniui praranda savo funkciją, ir šis procesas gali greitai sukelti žalingą poveikį tolimiems organams. Klinikiniai ir eksperimentiniai duomenys rodo, kad dauguma ŠKL formų prisideda prie tolimų organų disfunkcijos, tokios kaip širdies nepakankamumas 1, 2 ir kepenų nepakankamumas, išsivystymo ir pasunkėjimo 3 . Fiziologiniai ir molekuliniai mechanizmai, siejantys LŠD su ekstrarenalinių organų disfunkcija, yra sudėtingi. Sisteminiai medžiagų apykaitos sutrikimai, įskaitant glomerulinę hipertenziją, oksidacinį stresą, progresuojančią azotemiją, glikemiją, anemiją, dislipidemiją ir kt. 4, gali vaidinti svarbų vaidmenį plėtojant su CKD susijusius organų disfunkcijas. Tačiau molekulinis mechanizmas, tarpininkaujantis kryžminiam inkstų ligos ir extrarenal sutrikimui, išlieka blogai suprantamas.

Kadangi CKD kelia rimtą pavojų žmonių sveikatai, ligai gydyti buvo sukurti keli terapiniai vaistai. Pastaraisiais metais, be įprastinių gydymo būdų, tradiciniai kinų vaistai (TCM) pradėjo vaidinti svarbų vaidmenį gydant LKS. Tiek klinikiniai įrodymai, tiek eksperimentiniai tyrimai parodė TCM veiksmingumą sulėtinant 5, 6, 7, 8 CKD progresavimą. Tarp visų TCM, turinčių anti-CKD poveikį, Cordyceps sinensis ( C sinensis ) yra vienas geriausiai žinomų. Kaip jau pranešėme anksčiau, C apsauginio audinio renoprotekcinį veiksmingumą patvirtino jo gerinantys metaboliniai anomalijos žiurkių, sergančių CKD 9, inkstais. Be to, nustatyta, kad C sinensis vaidina svarbų vaidmenį saugant kepenų 10 ir širdies 11, 12 audinius nuo patologinių pažeidimų; Taigi, mes hipoteze, kad C sinensis taip pat gali pagerinti nepartinių organų, tokių kaip širdis ir kepenys, metabolinę funkciją, kad būtų pasiektas jo terapinis poveikis inkstams.

Norint patikrinti šią hipotezę ir išsiaiškinti galimus molekulinius ryšius, susijusius su inkstų sužalojimų ir extrarenalinių sutrikimų tarpusavio ryšiu, buvo naudojama sisteminė metodika, apimanti metaboliką. Metabolomika apibrėžiama kaip išsami ir kiekybinė daugybės endogeninių, mažos molekulinės masės metabolitų metabolinė analizė. Pastarąjį dešimtmetį plačiai paplitęs šio analitinio metodo taikymas stebint daugybinius medžiagų apykaitos sutrikimus gyvosiose sistemose patologinių procesų metu 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, įskaitant CKD 17, ir atsaką į tokius išorinius dirgiklius kaip vaistas. buvo parodytas gydymas 20, 21 . Be to, šis metodas dabar taikomas TCM 22, 23, 24, 25, 26 srityje, nes jis galėtų apibūdinti subtilias metabolines intervencijas, kurias sukelia TCM, gydant ligas, ir nustatyti galimą TCM poveikį. Todėl šiame tyrime buvo naudojamas 1H BMR metodu pagrįstas metabolizmo tyrimas, tiriant ekstrarenalinį C sinensis poveikį 5/6 nefrektomizuotoms (5 / 6Nx) žiurkėms (standartinis gyvūnų modelis su CKD 27, 28 ). Pirmiausia, tyrime buvo nustatyta C sinensis dozuota 5 / 6Nx žiurkių grupė, 5 / 6Nx modelių grupė ir fiktyviai operuota grupė. Tuomet buvo ištirti kepenų ir širdies metabolinio fenotipo pokyčiai, naudojant pagrindinio komponento analizę (PCA) ir dalinę mažiausiai kvadratinę diskriminaciją (PLS-DA) 1H NMR duomenis. Ortogonalioji projekcija į latentinių struktūrų diferencialinę analizę (OPLS-DA) taip pat buvo naudojama nustatant sutrikusius metabolitus modelio grupėje ir metabolizmo pokyčių atstatymą C sinensis dozuotose 5 / 6Nx žiurkėse. Galiausiai, remiantis pirmiau minėtomis analizėmis, buvo išaiškintas galimas C sinensis apsauginis mechanizmas nuo CKD dėl jo terapinio poveikio extrarenaliniams organams. Be to, mūsų rezultatai taip pat parodė, kad eksperimento metu (8 savaitės) pasireiškė daug sunkesni kepenų, bet ne širdies, metaboliniai sutrikimai. Šis rezultatas leidžia manyti, kad su CKD susiję ekstrarenalinių organų funkcijos sutrikimai atsiranda nuosekliai, o ne vienu metu.

medžiagos ir metodai

Medžiagos

NaH 2 PO 4 · 2H 2 O ir Na 2 HPO 4 · 12H 2 O (abu analitiniai) buvo tiekiami iš Sinopharm Chemical Reagent Co Ltd (Šanchajus, Kinija) prekybininkų. D 2 O (99, 9% D) buvo nupirktas iš „Cambridge Isotope Laboratories Inc“ (Majamis, FL, JAV). C sinensis buvo gautas iš Jiminkexin Co Ltd (Jiangxi, Kinija). Pagal Kinijos farmakopėjos 2005 m. Reglamentą, C sinensis buvo kontroliuojamas pagal ZGPR-NMR. Dviejų parašų komponentų, esančių BMR pirštų atspaudų profilyje (S1 pav.), Kiekis buvo 3, 49 mg / g adenozinui ir 4, 78 mg / g uridinui.

Eksperimentai su gyvūnais

Gyvūnų naudojimo protokolus, kurie buvo parengti vadovaujantis laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovu, patvirtino ir prižiūrėjo Kinijos mokslų akademijos, Kinijos, Šanchajaus Materia Medica Šanchajaus instituto gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas (IACUC). Patinų „Sprague-Dawley“ žiurkės (svorio 130–150 g) buvo įsigytos iš Kinijos mokslų akademijos Šanchajaus eksperimentinių gyvūnų centro (Šanchajus, Kinija). Eksperimentams visiems gyvūnams buvo suteikta sertifikuota standartinė dieta ir ad libitum vandentiekio vanduo. Jie buvo laikomi 25 ± 2 ° C temperatūroje, esant 40–60% drėgnumui ir 12/12-val. Šviesos / tamsos ciklui. Visi gyvūnai prieš eksperimentą buvo aklimatizuoti 7 dienas.

Eksperimentiniai gyvūnai atsitiktine tvarka buvo suskirstyti į tris grupes: (A) peroraliai suleista C sinensis (4 mg · kg -1 · d -1 ) nefrektomizuota grupė (CS grupė, n = 7); (B) neapdorota nefrektomizuota grupė (OP grupė, n = 7); (C) fiktyvios grupės (SO grupė, n = 7). 5 / 6Nx buvo atliktas dviejų etapų metodu, kaip aprašyta anksčiau 29, 30 . SO kontrolinei grupei buvo atlikta fiktyvi operacija, kurią sudarė laparotomija ir manipuliacija inkstų žiedlapiais, tačiau nepažeidžiant inkstų audinio. Vienas CS grupės gyvūnas mirė 6 d. Po operacijos ir buvo pašalintas iš vėlesnių eksperimentų. 8-ąjį savaitgalį po operacijos kiekvienos grupės žiurkės buvo anestezuotos dietilo eteriu (Changshu Chemical Co, Ltd, Jiangsu, Kinija), o kepenų (maždaug 100 mg) ir širdies (maždaug 100 mg) dalys buvo surinktos 1 H. NMR spektro gavimas.

Vandeninių kepenų ir širdies ekstraktų paruošimas ir 1H BMR spektrų gavimas

Liofilizuoti vandeniniai kepenų ir širdies ekstraktai buvo paruošti naudojant metanolio / chloroformo / vandens sistemą, kaip aprašyta anksčiau 31 . Ekstrakto milteliai ištirpinami 600 μL fosfato buferio (0, 2 mol / L Na2 HPO 4 / 0, 2 mol / L NaH 2 PO 4, pH 7, 4), sumaišomi su virpesiu ir po to centrifuguojami 12 000 x g 10 minučių 4 ° C temperatūroje. C. Supernatanto alikvotai (500 μL) buvo perkelti į 5 mm skersmens NMR mėgintuvėlius, o po to įpilama 50 μL D2O. Tirpikliais slopinti 1D1H NOESY spektrai (NoesyPr1d) buvo gauti naudojant impulsų seką (RD-90-t1 -90-t m -90-ACQ), maišymo laiką (t m ) 100 ms. Vandens slopinimas buvo pasiektas švitinant vandens rezonansą per 4 sekundžių pakartotinio uždelsimo (RD) ir maišymo laiką. 90 ° impulso ilgis buvo sureguliuotas iki maždaug 10, 35 μs. T 1 buvo nustatytas 4 μs. Iš viso buvo surinkti 4 netikri nuskaitymai ir 256 laisvieji indukcijos slopinimai (FID) į 120 000 duomenų taškų, naudojant 10 kHz spektrinį plotį, gaunant 6, 13 s gavimo laiką (ACQ). Visi BMR eksperimentai buvo atlikti 298 K atstumu, naudojant Bruker (Karlsruhe, Vokietija) Avance III 500 MHz spektrometrą su ultra žemos temperatūros zondu.

Spektrinių duomenų apdorojimas ir daugiamatė statistinė analizė

Norint pagerinti signalo ir triukšmo santykį, visi 1D FID buvo padauginti iš eksponentinio svertinio koeficiento, kuris buvo 0, 3 Hz linijos praplėtimo koeficientas prieš Furjė transformaciją. Tada visi 1D NMR spektrai buvo susieti su laktato metilo grupe δ 1, 33, atsargiai rankiniu būdu sudedami į fazes, pradinė linija pataisyta ir suderinta naudojant „MestReNova“ programinę įrangą (8.0 versija, „Mestrelab Research SL“). 1D BMR buvo parinktos kiekvieno metabolito smailės be persidengimo. Gauti nedviprasmiški 39 metabolitai kepenų ekstraktuose ir 31 metabolitai širdies ekstraktuose buvo normalizuoti iki spektrinio intensyvumo sumos (išskyrus likutinio vandens, metanolio ir etanolio rezonansų sritis), kad būtų kompensuoti mėginio koncentracijos skirtumai. Vėliau, naudojant SIMCA-P + 12.0 programinės įrangos paketą (Umetrics, Umeå, Švedija), normalizuotos integraliosios vertės visada buvo keičiamos PCA, PLS-DA ir OPLS-DA. PCA ir PLS-DA įvertinimo grafikai buvo vizualizuoti su pirmuoju pagrindiniu komponentu (t [1]) ir antruoju pagrindiniu komponentu (t [2]). OPLS-DA buvo apskaičiuotas naudojant pirmąjį nuspėjamąjį (t [1]) ir vieną ortogonalinį komponentą (iki 1 ). Parametrai R2X (cum), R2Y (cum) ir Q2 (cum) buvo apskaičiuoti atlikus kryžminio patvirtinimo procedūrą, kad būtų patikrintas tinkamumas ir modelio pagrįstumas. R2X (cum) ir R2Y (cum) yra atitinkamai visų X ir Y kvadratų sumos dalis, paaiškinta modeliu. Q2 (cum) žymi kryžminiu būdu patvirtintą paaiškintą variaciją. Modelių patikimumas didėja, kai R2Y (cum) ir Q2 (cum) artėja prie 1 32 . Dėl nedidelio mėginių skaičiaus (CS: OP: SO = 6: 7: 7), modelių tvirtumui įvertinti buvo atlikti penki apvalūs kryžminio patvirtinimo ir permutacijos testai (500 ciklų) 33 .

Kintamųjų koreliacijos koeficientai, palyginti su pirmuoju nuspėjamuoju komponentu OPLS-DA modelyje, buvo paimti iš S-grafiko. Ribinės vertės, kurių reikšmingumo lygis yra 0, 05, buvo naudojamos norint nustatyti tuos kintamuosius, kurie buvo atsakingi už grupių diskriminaciją 34 . Kintama reikšmė projekcijų (VIP) reikšmėse taip pat buvo naudojama identifikuojant diferencijuojamas biomoleules, kurių VIP vertė didesnė nei 1, o tai reikšmingai prisidėjo prie modelių klasterio. Todėl kaip reikšmingiausius ir patikimiausius kintamuosius, kurie buvo atsakingi už klasterių atskyrimą, pasirinkome tuos kintamuosius, kurie atitinka dvejopus kriterijus ( ty , | r |> = ribinė vertė P = 0, 05, o VIP> = 1).

Kiekybinis metabolitų palyginimas kepenų ir širdies vandeninių ekstraktų mėginių1H NMR spektruose

Apskaičiuoti vidutiniai metabolitų pokyčiai tarp dviejų grupių 35 . Dėžutės diagramos buvo naudojamos pavaizduoti reikšmingiausių CS, OP ir SO grupių metabolitų integraalų kitimus, parodytus 4 paveiksle. Reikšmingi skirtumai (1 lentelė) tarp vidutinių verčių (S1 lentelė) buvo įvertinti vienpusė dispersijos analizė (ANOVA) su Bonferroni korekcija. Buvo nustatytas statistinio reikšmingumo slenkstis P <= 0, 05. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant SPSS (Socialinių mokslų statistikos paketas) 17.0 programinę įrangą (SPSS, Čikaga, IL, JAV).

Image

Potencialūs metabolizmo keliai yra sutrikdyti OP grupėje ir pakitę CS grupėje. Santrumpos: GCS: γ-glutamilcisteino sintetazė (EC: 6.3.2.2); GS: glutationo sintetazė (EC: 6.3.2.3); GATM: glicino amidinotransferazė (EC: 2.1.4.1); GAMT: guanidinoacetato N- metiltransferazė (EC: 2.1.2.2); CK: kreatinkinazė (EC: 2.7.3.2); Kreatinazė (EC: 3.5.3.3); PCR: fosfokreatinas. Kitų metabolitų santrumpos žymimos S1 lentelėje.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Pilno dydžio lentelė

Tada statistinio reikšmingumo kategorijos buvo padalintos į tris laipsnius: statistinis reikšmingumas, kai VIP> = 1, | r |> = ribinė vertė ir P = 1, | r |> = ribinė vertė, o P > 0, 05 buvo apibrėžtas kaip „vidutinis “; ir reikšmingumas esant VIP> = 1 ir | r |

Rezultatai

Audinių vandeninio ekstrakto mėginių1H NMR spektrai

Kepenų audinių vandeninių ekstraktų, gautų iš CS, OP ir SO grupių, vienodų 1 H NMR spektrų tipiniai (iš trijų) yra parodyti 1 paveiksle, o širdies vandeninių ekstraktų 1D1 H NMR spektrai yra pavaizduoti S2 paveiksle. Metabolito rezonansai buvo komentuojami remiantis cheminiais poslinkiais, protonų ir protonų jungimosi konstantomis, 2D NMR spektrų rezultatais ir paskelbtais duomenimis 36, 37, 38 . Identifikuotų metabolitų priskyrimas (tiek cheminis poslinkis, tiek daugyba) yra apibendrintas S2 lentelėje. Vandeninių audinių ekstraktų BMR spektruose dominavo aminorūgščių (leucinas, izoleucinas, valinas, alaninas, lizinas, glutaminas, glutamatas, glicinas, aspartatas, fenilalaninas ir tirozinas), karboksirūgščių (α-hidroizobutiratas, acetatas, sukcinatas) signalai., malatas, fumaratas, D-3-hidrobutiratas, formatas, laktatas), membranos komponentai (cholinas, sn-glicerolio-3-fosfocholinas, O- fosfolinas), oksidaciniai streso metabolitai (glutationas ir taurinas), azoto turintys heterociklai [nikotinamido adeninas dinukleotidas (NAD), NADP +, nikotinuratas, adenozino trifosfatas (ATP)] ir kt. Medžiagos apykaitos apibūdinimą, remiantis tokiais sudėtingais spektrais, galėtų labai palengvinti daugiamatės statistinės analizės, tokios kaip PCA, PLS-DA ir OPLS-DA. Taigi vientisieji metabolitų duomenys buvo importuoti į SIMCA-P + 12.0 programinės įrangos paketą statistinei analizei. Taip pat buvo atlikta vienpusė dispersijos analizė naudojant Bonferroni post hoc testą, siekiant nustatyti, ar metabolitų vidutinių verčių skirtumai tarp grupių buvo reikšmingi.

Image

Reprezentaciniai 500-MHz1 H NMR NOESY spektrai (δ 0, 6–4, 7, 5, 0–9, 6) žiurkių kepenų audinių CS (A), OP (B) ir SO (C) grupių vandeninių ekstraktų vandeniniams ekstraktams. Metabolitų santrumpos pateiktos S1 lentelėje.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Kepenų vandeninio ekstrakto mėginių statistinė analizė

PCA taškų grafikai, gauti iš vienareikšmiškai identifikuotų 39 kintamųjų iš trijų grupių vienareikšmiškai nustatytų 39 kintamųjų statistinės analizės, pavaizdavo grupės, suskirstytos į OP grupės metabolinius profilius, palyginti su SO grupės mėginiais (S3A pav.). . Nuosekliai tarp PLS-DA balų grafiko išilgai PC1 ašies buvo ir aiškus atskyrimas tarp OP grupės ir SO grupės, ir, palyginti su OP grupe, CS grupės klasteris artėjo prie SO grupės, tai rodo, kad C sinensis vartojimas palengvino metabolinius sutrikimus kepenų audiniuose, sergančiuose CKD žiurkėmis (2A pav.).

Image

PLS-DA yra vandenilio kepenų ekstraktų (A) ir vandeninių širdies ekstraktų (B) 1H BMR analizės grafikai. Modelio parametrai yra šie: (A) R2X (cum) = 0, 37, R2Y (cum) = 0, 82, Q2 (cum) = 0, 57; (B) R2X (cum) = 0, 52, R2Y (cum) = 0, 60, Q2 (cum) = 0, 22.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Aukščiau paminėti rezultatai buvo pagrįsti atlikus šią OPLS-DA analizę. Taikant OPLS-DA, kurioje buvo naudojamas pirmasis nuspėjamasis komponentas ir vienas ortogonalinis komponentas, siekiant optimizuoti grupių tarpusavio kitimą, atsirado aiškūs biocheminiai skirtumai tarp CS ir OP grupių [R2X (cum) = 40%, R2Y (cum) = 90%, Q2 (cum) = 52%] (3A paveikslas) ir tarp OP ir SO grupių [R2X (cum) = 47%, R2Y (cum) = 97%, Q2 (cum) = 85%] (3C paveikslas). Pirmojo komponento 500 permutavusių modelių grupė buvo vizualizuota naudojant patvirtinimo brėžinius (3B pav., 3D). Permutacijos bandymo grafikuose visos įbrėžtos Q2 vertės į kairę buvo mažesnės nei pradinis taškas į dešinę 39, 40, o tai rodo, kad originalūs modeliai buvo galiojantys.

Image

Rezultatų brėžiniai (kairėje) ir permutacijos testai (dešinėje) gauti iš (A, C) CS vs OP su OPLS-DA modeliais su 5 apvalių kryžminių verifikacijų, (B, D) OP vs SO su 5 apvalių kryželiu. vandeninių kepenų ekstraktų1H BMR spektrų patvirtinimas. Rezultatų brėžinių kintamieji automatizuoja visus kintamuosius pagal vieneto dispersiją.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Be to, remiantis koeficientų skaičiais (| r |), VIP ir P reikšmėmis, palyginant poromis buvo nustatyti pagrindiniai kiekvienos grupės diskriminuojantys metabolitai. Palyginti su SO grupe, leucino, izoleucino, valino, lizino, sarkozino, N, N -dimetilglicino, cholino ir tirozino lygis OP grupėje buvo padidintas. Tam tikrų metabolitų, įskaitant N-acetilglutaminą, glutamatą, glutaminą, glutationą, kreatiną, karnitiną, tauriną, UDP-galaktozę, ATP ir NAD, lygis sumažėjo (1 lentelė). Sušvirkštus C sinenzio , keletas metabolitų koncentracijos pokyčiai ŠK žiurkių kepenyse buvo pakeisti. Palyginti su OP žiurkėmis, CS grupėje aminorūgščių (leucino, izoleucino, valino, lizino ir tirozino), sarkozino, O- fosfolino ir cholino kiekis sumažėjo, o šie pokyčiai lydėjo N- acetilglutamino lygio padidėjimą., glutationas, karnitinas, taurinas, glicinas ir NAD. Tuomet, remdamiesi Kioto genų ir genomų (KEGG) duomenų bazės 41 ir Žmogaus metabolizmo duomenų bazės (HMDB) 42 duomenimis, šie pakitę metabolitai buvo sujungti skirtingais metabolizmo keliais (4 pav.).

Širdies vandeninio ekstrakto mėginių1H BMR duomenų statistinė analizė

Širdies audinio ekstraktuose esančių 31 metabolito vientisumas buvo gautas PCA (S3B paveikslas) ir PLS-DA (2B paveikslas), turint pirmuosius du pagrindinius komponentus (t [1], t [2]). OP žiurkės buvo metaboliškai diferencijuotos nuo SO žiurkių iš esmės pagal pirmąjį pagrindinį komponentą, kuris buvo skiriamasis širdies vandeninio ekstrakto mėginių BMR duomenų PLS-DA modelio bruožas. Be to, trys grupės rodė atskyrimus, dalinai persidengdamos vandeninių širdies ekstraktų balų schemomis PCA sklaidos grafike.

Norint įvertinti skirtumus tarp grupių, buvo atlikti permutacijos testai, o iš jų gauti rezultatai (S4B paveikslas) aiškiai parodė, kad CS vs OP grupės OPLS-DA modelis (S4A pav.) Buvo per daug pritaikytas, tai parodo faktas, kad Q2 regresija linija turėjo teigiamą kirtį ir kad Q2 vertės į kairę buvo didesnės nei pradinis taškas į dešinę. Be to, buvo tik keletas pakitusių metabolitų, kurie prisidėjo prie atskyrimo, ir jie buvo identifikuojami pagal koeficiento skaičių, VIP reikšmę ir P vertę. Palyginti su SO žiurkėmis, ryškūs OP žiurkių pokyčiai buvo padidėjęs alanino ir sukcinato kiekis bei mažėjantis kreatino ir taurino kiekis. Be to, vartojant C sinensis , taurino lygio pokytis buvo panaikintas (1 lentelė).

Diskusija

Metabominės analizės rezultatai parodė, kad eksperimentiniu laikotarpiu (8 savaitės) kepenų apykaitos sutrikimai buvo reikšmingesni nei širdyje, o tai rodo, kad praėjus 8 savaitėms po 5 / 6Nx operacijos kepenų funkcijos sutrikimas jau buvo progresavęs, tuo tarpu širdies sužalojimas buvo ankstyvosiose pradžios stadijose. Paaiškėjo, kad su CKD susiję ekstrarenalinių organų funkcijos sutrikimai įvyko nuosekliai, o ne vienu metu.

Šiame tyrime tikėjomės išsiaiškinti mechanizmą, pagal kurį C sinensis moduliuoja metabolizmą extradenaliniuose CKD žiurkių organuose, naudodamas 1H NMR pagrįstą metabolominę analizę. Tiek daugiamatė, tiek ir kintama statistinė duomenų analizė ir paskesni sutrikdytų metabolitų kelio žemėlapiai parodė, kad metaboliniai skirtumai daugiausia buvo nuo oksidacinių su stresu susijusių metabolitų, energijos metabolizmo tarpinių produktų, aminorūgščių ir baltymų metabolitų bei cholino metabolitų. Sutrikę metabolitai kepenyse ir širdies audiniuose bei tie, kurie iš esmės atvirkščiai reguliuojami skiriant C sinensis, galėtų būti laikomi potencialių kandidatų sąrašu, kuriant klinikinius biomarkerius diagnozuojant LKS ir nustatant terapinius taikinius gydymui. su CKD susijusių extrarenal organų pažeidimų.

Antioksidacinis aktyvumas

Glutationas (GSH) yra vyraujantis antioksidantas, saugantis nuo reaktyvių rūšių ir oksidacinio streso 43 . Anksčiau paskelbtas darbas parodė, kad kepenų glutationo reikšmingai sumažėjo sergant alkoholine kepenų liga 44, kepenų venų okliuzijos liga 45, lėtiniu hepatitu C 46, Wilsono liga 47 ir kitomis su kepenimis susijusiomis ligomis. Didelis kepenų glutationo išeikvojimas OP žiurkėms buvo ląstelių redokso būklės sutrikimo žymeklis, susijęs su CKD sukeltu kepenų pažeidimu. Tačiau CS žiurkėms pastebėta padidėjusi glutationo apykaita, o tai reiškė, kad C sinensis dėl antioksidacinio aktyvumo sumažino su CKD susijusį kepenų pažeidimą 48 .

Yra žinoma, kad taurinas, laisva aminorūgštis, neutralizuoja oksidacinį stresą audiniuose (kepenyse, inkstuose ir tinklainėje) 49, 50 . Kaip pranešė Rashid ir kt. , Taurinas gali palengvinti oksidacinį stresą, esant diabeto sukeltam kepenų pažeidimui 51 . Buvo pranešta, kad padidėjęs taurino kiekis LKS sergantiems pacientams padeda gydyti oksidacinį stresą. CS grupės žiurkių kepenyse ir širdyse buvo nustatytas reikšmingas taurino lygio padidėjimas, o tai leido manyti, kad taurinas, galėdamas sušvelninti oksidacinį stresą, galimai prisidėjo prie gelbėjimo C sinensis poveikio CKD sukeltam kepenų pažeidimui ir širdies disfunkcijai.

Apskritai glutationas ir taurinas galėtų būti oksidacinio streso biomarkeriai OP grupės žiurkėms. C sinensis parodė apsauginį poveikį nuo CKD sukelto kepenų pažeidimo, moduliuodamas šių metabolitų kiekį, susijusį su oksidaciniu stresu. Tiesą sakant, Yu ir kt. 53 pranešė, kad kai kurie komponentai, išskirti iš C sinenzio , tokie kaip flavonoidai ir polifenolikai, pasižymėjo dideliu antioksidaciniu poveikiu, ypač šalinant hidroksilo radikalus.

Energijos apykaita

Kepenų ląstelėje glutaminas gali būti paverstas glutamatu, kuris yra pagrindinis ląstelės energijos substratas per anapleurotinį įvedimą į trikarboksirūgšties (TCA) ciklą 54 . Kadangi išmatuotų TCA ciklo tarpinių produktų (ty malato ir fumarato) kiekiai reikšmingai nesiskyrė tarp OP grupės ir SO grupės, ir kadangi sumažėjo glutamino ir glutamato lygis OP žiurkių kepenyse, mes siūlome, kad pamainos glutamino ir glutamato kiekis TCA cikle OP žiurkėms gali padėti išlaikyti TCA ciklo homeostazę. Be to, glutaminolizė taip pat prisideda prie mitochondrinio NAD, kuris naudojamas palaikyti ATP gamybą oksidaciniu fosforilinimu, susidarymo. Tačiau NAD, kaip pagrindinį energijos metabolizmo komponentą 55, kepenų audiniuose, palyginti su OP žiurkėmis, reikšmingai sumažino, ir šis pokytis gali būti glaudžiai susijęs su sumažėjusiu ATP kiekiu kepenyse. Padidėjęs NAD lygis CS grupėje gali būti tiesiogiai priskirtas energijos metabolizmo atsistatymui po gydymo C sinensis .

L- karnitinas yra metabolitas, kuris yra labai svarbus lipidų metabolizmui, nes jis palengvina riebalų rūgščių transportavimą į mitochondriją, kur vyksta β oksidacija 56 . Dėl kepenų pažeidimo sumažėja L- karnitino kiekis 57, kuris buvo pastebėtas OP grupės žiurkių kepenyse. Karnitino lygio sumažėjimas gali užkirsti kelią lipidų β oksidacijai OP grupėje, o tai savo ruožtu prisidėjo prie stebimo energijos nepakankamumo ir kepenų pažeidimo. Tačiau suleidus C sinensio, L- karnitino lygis buvo padidintas iki normalaus lygio, o tai gali paaiškinti hepato-apsauginį C sinensis poveikį. Apibendrinant galima pasakyti, kad C sinensis padidino energijos apykaitą ir palaiko pažeistų kepenų funkciją.

Amino rūgščių ir baltymų metabolizmas

Palyginti su SO grupe, OP žiurkių audiniuose buvo pastebimai padidėjęs aminorūgščių, įskaitant tiroziną, liziną, izoleuciną, leuciną, valiną (kepenyse) ir alaniną (širdyse), lygis (1 lentelė). Kadangi daugybė laisvųjų aminorūgščių yra svarbūs pirmtakai ir gali būti išnaudojami kaip substratai energijai papildyti, dėl per didelio aminorūgščių vartojimo padidėtų pažeistų kepenų proteolizė (4 paveikslas). Sutikdamas su šiuo atradimu, kreatinas, kaip azoto junginys, taip pat parodė reikšmingą OP žiurkių kepenų sumažėjimą, o tai rodo, kad dramatiškas poveikis baltymų metabolizmui buvo. Sušvirkštus C sinensis , penkių sutrikdytų aminorūgščių lygis buvo sumažintas iki normalaus lygio, o tai buvo aiškus CS grupės metabolinis bruožas, palyginti su OP grupe, rodantis pagerintą CS žiurkių aminorūgščių ir baltymų metabolizmą.

Cholino apykaita

Padidėjęs cholino kiekis OP žiurkėms galėjo atsirasti dėl membranos fosfolipidų metabolizmo sutrikimo. Cholinas gali būti skaidomas iki N, N -dimetilglicino per sarkoziną. Šiame tyrime N, N -dimetilglicino, sarkozino ir cholino kiekis reikšmingai padidėjo OP žiurkių kepenyse. Tačiau, palyginti su OP grupe, CS grupėje buvo sumažėjęs O- fosfocholino, cholino ir sarkozino kiekis, rodantis, kad sutrikęs cholino metabolizmas iš dalies atsigavo gydant C sinensis .

Išvada

Šiame darbe atlikta 1H BMR metodais pagrįsta metabolizmo analizė tiriant metabolinio C.sinensis poveikį esant CKD sukeltoms kepenų ir širdies traumoms. Metabolizmo pokyčiai, endogeninių metabolitų lygio svyravimai ir pakitę keliai C sinensis dozuotoms 5 / 6Nx žiurkėms ir CKD modeliuotoms žiurkėms buvo nustatyti naudojant PCA, PLS-DA ir OPLS-DA metodus. Oksidacinis stresas, energijos apykaita, aminorūgščių ir baltymų apykaita ir cholino metabolizmas gali būti laikomi ryšiais tarp LŠD ir extrarenal organų disfunkcijos. Moduliuodamas šiuos kelius, C sinensis darė apsauginį poveikį extrarenal organams. Be to, mūsų darbas taip pat parodė, kad nusistovėjęs1H NMR metodu pagrįstas metabolizmo metodas gali suteikti sistemingą ir holistinį vaizdą, kad būtų galima geriau suprasti ligą ir gydymą nuo narkotikų, o metodologija taip pat gali būti taikoma išsamiai ištirti tradicinius tradicinius gydymo mechanizmus. Kinietiški vaistai.

Autoriaus indėlis

Xia LIU, Fang ZHONG, Xu-long TANG, Wei-ming WANG, Nan CHEN ir Nai-xia ZHANG sumanė ir suprojektavo eksperimentus; Eksperimentus atliko Xia LIU, Fang ZHONG, Xu-long TANG, Fu-lin LIAN, Qiao ZHOU, Shan-mai GUO, Peng SUN, Xu HAO, Ying LU; Xia LIU, Nai-xia ZHANG išanalizavo duomenis; Jia-fu LIU pataisė rankraštį; Xia LIU ir Nai-xia ZHANG parašė rankraštį.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    S1 lentelė

    Kiekybiniai metabolitų integralai, rasti CS, OP ir SO grupės žiurkių kepenų ir širdies audinių vandeniniuose ekstraktuose.

  2. 2.

    S2 lentelė

    Metabolitų rezonanso priskyrimai 1H BMR spektrams.

  3. 3.

    S1 pav

    C. sinensis vandeninio ekstrakto 500 MHz 1 H ZGPR spektras.

  4. 4.

    S2 pav

    Trys tipiški 500 MHz1H NMR noesyPr1d spektrai (δ 0, 5–4, 6, 6, 0–9, 2) vandeninių širdies mėginių iš CS (A), OP (B) ir SO (C) žiurkių.

  5. 5.

    S3 pav

    PCA užfiksuoti vandenilio kepenų ekstraktų (A) ir vandeninių širdies ekstraktų (B) 1H BMR duomenys.

  6. 6.

    S4 pav

    Rezultatų brėžiniai (kairėje) ir permutacijos testai (dešinėje) gauti iš (A) CS vs OP PLS-DA modelių su 5 apvalių kryžminių verifikacijų, (C) OP vs SO su 5 apvalių kryžminio validumo 1 H verte. Vandeninių širdies ekstraktų BMR spektrai.