Streptococcus pneumoniae pneumolizino kristalų struktūra suteikia pagrindinę informaciją apie ankstyvus porų formavimosi etapus | mokslinės ataskaitos

Streptococcus pneumoniae pneumolizino kristalų struktūra suteikia pagrindinę informaciją apie ankstyvus porų formavimosi etapus | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Nanokristalografija
  • SAXS

Anotacija

Porą formuojantys baltymai yra ginklai, kuriuos dažnai naudoja bakteriniai patogenai, kad pažeistų tikslinių ląstelių membraninį barjerą. Nepaisant kritinio jų vaidmens infekcijoje, svarbūs struktūriniai šių baltymų kaupimosi į poras aspektai nėra žinomi. Streptococcus pneumoniae yra pagrindinė pasaulyje pneumonijos, meningito, bakteriemijos ir vidurinės ausies uždegimo priežastis. Pneumolizinas (PLY) yra pagrindinis S. pneumoniae virulentiškumo faktorius ir taikinys tiek mažų molekulių vaisto kūrimui, tiek vakcinoms. PLY yra priklausomas nuo cholesterolio citolizinų (CDC), porų formavimo toksinų, kurie sudaro milžiniškas poras ląstelių membranose, šeimos. Čia pateikiame PLY struktūrą, apibrėžtą rentgeno kristalografija ir tirpale mažo kampo rentgeno spindulių išsklaidymu. Kristalų struktūra atskleidžia PLY agregatus kaip linijinį oligomerą, kuris suteikia pagrindinę struktūrinę informaciją apie blogai suprantamą ankstyvą CDC monomerų ir monomerų sąveiką membranos paviršiuje.

Įvadas

Streptococcus pneumoniae arba pneumokokas yra daugelio rimtų žmonių ligų, įskaitant pneumoniją, bronchitą, bakterinį meningitą, sepsį, vidurinės ausies uždegimą ir ragenos opas 1 sukėlėjas, kai kurie iš jų sukelia sergamumą ir mirtingumą visame pasaulyje. Iš tikrųjų infekcija S. pneumoniae lemia ketvirtadalį mažų vaikų mirčių besivystančiame pasaulyje. Atsiradęs vaistams atsparių pneumokokų ir menkas pneumokokų polisacharidinių vakcinų efektyvumas paskatino ieškoti naujų vakcinų ir mažų molekulių narkotikų taikinių.

Pneumolizinas (PLY), pagrindinis 2 bakterijos virulentiškumo faktorius, yra poras formuojantis toksinas, priklausantis nuo cholesterolio priklausomų citolizinų (CDC) šeimai. Toksinas yra svarbus kandidatas kaip nuo serotipo nepriklausomos vakcinos prieš bakteriją taikinys. PLY gaminamas kaip vandenyje tirpus monomeras ir atpažįsta žinduolių ląsteles per savo C-galinį domeną (4 sritis), prieš sujungdamas į apskritus ~ 30–50 monomerų porus, turinčius daug cholesterolio turinčių membranų 3, 4 . Prepore esantys monomerai patiria kritinius struktūrinius pokyčius, įskaitant dviejų alfa spiralinių pluoštų (α-HB1 ir α-HB2) atsiskyrimą 3 domene kiekviename monomere, kurie vėliau sudedami į β plaukų segtukus (transmembraninius plaukų segtukus TMH1 ir TMH2), kad būtų galima įterpti. į membraną, kurią palengvina konstrukcijos griūtis link membranos paviršiaus 5, 6 . Gautos PLY β-barelio poros skersmuo yra ~ 300 Å, o tai sukelia tikslinės ląstelės 7 lizę.

4 domenas (D4) yra membraną atpažįstantis CDC domenas, ir daugeliui CDC membranų surištas cholesterolis yra 8 receptorius. Du likučiai D4 gale (Thr ir Leu) buvo nustatyti kaip cholesterolio 9 atpažinimo vieta. CDC yra labai konservuotas undekapeptido regionas (ECTGLAWEWWR), vadinamas Trp turtinga kilpa 10, kuri taip pat yra D4 gale ir sudaro sąveikos vietą su membranomis 11 . Triptofano fluorescenciniai tyrimai rodo, kad cholesterolis jungiasi 1: 1 komplekse su PLY, o cholesterolio surišimo vieta yra arti Trp turtingos kilpos 12 . Ši kilpa taip pat yra pagrindinis alosterinio kelio elementas, sujungiantis membranos jungimąsi 4 srityje su konformaciniais pokyčiais, kurie turi įvykti 3 srityje, norint paversti priešporą į 13 porą. Neseniai buvo įrodyta, kad nedidelė CDC grupė, kurios pavyzdys yra netipinis CDC intermedilizinas (ILY), naudoja GPI įtvirtintą baltymą, vadinamą CD59, komplemento porų susidarymo inhibitoriumi, 14 receptorių. Įdomu tai, kad membranos atakos komplekso baltymai, dalyvaujantys komplemento porose (pvz., C8, C9), priima panašius trimačius raukšles kaip CDC, nors jiems trūksta struktūrinio ekvivalento D4 15, 16 . ILY dar reikia sąveikos su cholesteroliu, kad būtų galima įterpti membraną priešpore kompleksą 8, 17. Mutagenezės tyrimais 18 nustatyta, kad CD59 rišančioji vieta yra viename D4 paviršiuje, kuriuos vėliau patvirtino ILY kristalų struktūra, sudėtinga iki CD59 19 . Nors visi CDC turi sudaryti nuo cholesterolio priklausomą sąveiką, kad galėtų funkcionuoti, neseniai atliktas darbas su PLY rodo, kad jis gali surišti dar vieną receptorių tipą: tam tikrus glikanus, įskaitant Lewis histo-kraujo grupės antigenus 20 . Ankstesniame darbe D4 buvo įtrauktas į prisirišimą prie manozės, atsižvelgiant į dozę, atliekant ištraukiamuosius tyrimus 21 . 2014 m. Tyrime, remiantis silico analize ir pagrįstu mutagenezės tyrimais, buvo tariama, kad sialylo Lewis X (sLeX), turinčio didžiausią afinitetą, jungtis su Trp turtinga kilpa.

Šiame darbe pateikiame PLY kristalų struktūrą ir parodome, kad mažo kampo rentgeno spinduliuote išsibarstę tirpale ji įgauna labai panašią konformaciją. Kristalų struktūra rodo, kad PLY gali sudaryti linijinius oligomerus, o PLY oligomerai taip pat gali būti formuojami tirpale, pakeliant temperatūrą iki fiziologinių verčių. PLY struktūra parodo linijinių galvos į galvą oligomerų susidarymą, kuris atitinka ankstesnius eksperimentinius duomenis, rodančius, kad PLY ir PFO gali būti įstrigę ankstyvoje sąveikos stadijoje membranos paviršiuje, užkertant kelią 3 domeno struktūriniams pokyčiams. Šis spąstai lemia silpnai sąveikaujančių monomerų, sudarančių linijinius oligomerus, surinkimą. Taigi pirmą kartą PLY kristalų struktūra atskleidžia ankstyvosios monomerų ir monomerų sąveikos detales PLY, kurios gali būti svarbios visoms CDC.

Rezultatai

PLY kristalinė struktūra

PLY priima kanoninį CDC foldą 17, 22, 23, 24, 25, 26, kurio maksimalūs matmenys yra 123 Å iki 20 Å iki 49 Å. Molekulėje yra 11% spiralės ir 32% beta lakšto. Jį sudaro keturi domenai (1a pav.): 1 sritį (D1; likučiai nuo 1 iki 21, nuo 58 iki 147, nuo 198 iki 243 ir nuo 319 iki 342) sudaro trys α-spiralės ir vienas β lapas, 2 sritis (D2). ; 22–57 ir 343–359 likučiai) turi vieną β lapą, 3 sritis (D3; 148–197 ir 244–318 liekanos) sudaro 5 juostų antiparalelinis β lapas, apjuostas dviem α -heliniai pluoštai, kurie tampa transmembraniniais plaukų smeigtukais TMH1 (liekanos 160–186) ir TMH2 (liekanos 257–280), o 4 sritis (D4; liekanos 360–470) yra sulankstyti į kompaktišką β sumuštinį. 2 domenas yra sujungtas su 4 domenu vienu glicino jungikliu. 2 domeno dalys yra labai judrios, o kai kurių liekanų šiuose regionuose elektronų tankis yra dviprasmiškas arba silpnas. 268–280 liekanos α – HB2 (TMH2) kilpoje 3 srityje ir 306–312 liekanos 3 srityje taip pat parodo santykinai mažą tankį. Du aukso cianido junginiai, naudojami kristalų kokybei pagerinti, yra sujungti su Cys 428 (1b pav.). Dviejų aukso junginių vieta atspindi alternatyvias surišimo vietas, kurias jie gali užimti kristaluose. Vienoje vietoje aukso kompleksas kaupiasi nuo Trp 435 ir Trp 436, o kitas - nuo Tyr 461 iš su simetrija susijusios molekulės. Nepaisant šių sąveikų, aukso junginys nekeičia kristalų įpakavimo, kaip galima spręsti iš ankstesnės mažesnės skyros struktūros, kurioje auksas nebuvo naudojamas.

Image

a ) PLY juostos vaizdavimas. 1 sritis yra oranžinės spalvos, 2 sritis - žalsvai mėlyna, 3 sritis yra pilka, o 4 sritis yra rausva. TMH1 ir TMH2 sritys yra geltonos spalvos. Nurodytos 4 domeno (Trp turtingos kilpos ir cholesterolio rišančios kilpos) membranos jutimo kilpos. Likučių, esančių tariamose cukraus rišimosi vietose, šoninės grandinės yra paryškintos rožinėmis (1 vieta) ir geltonomis (2 vieta) lazdelėmis. Likučiai, atitinkantys elektrostatinį jungiklį PFO (Lys 152, Gly 166, Tyr 150, Val 287, Gly 305), yra išryškinti kaip raudoni lazdelės 3 srityje. Likučiai, kurie, kaip nustatyta, sudaro linijinius oligomerus, mutavus PFO (atitinkami likučiai PLY yra W134) ir PLY (Ala 146) yra rodomi kaip žalios spalvos lazdelės 1 srityje. ( b ) Padidintas vaizdas, atsižvelgiant į aukso surišimo vietas (žalias sferas) Trp turtingoje kilpoje. Tyr 461 sukuria molekulė, susijusi su simetrija. Taip pat parodytas vandenilio jungčių tinklas (geltonos punktyrinės linijos) Trp turtingos kilpos srityje. c ) Elektrostatinis paviršiaus vaizdas, apskaičiuotas naudojant APBS 62 programą stačiakampiuose vaizduose. Mėlyna rodo elektropozityvųjį potencialą (> 1 kT), o raudona - elektroneigiamąjį potencialą (<−1 kT).

Visas dydis

Palyginimas su kitomis CDC struktūromis

Galimos CDC kristalų struktūros yra PFO iš Clostridium perfringens 22, 27, ILY iš Streptococcus intermedius 17, suilizinas (SLY) iš Streptococcus suis 24, antrolizinas (ALO) iš Bacillus anthracis 23, streptolizinas (SLO) iš Streptococcus pyo. ) iš Listeria monocytogenes 26 . Reikšmingiausias skirtumas tarp PLY ir kitų CDC yra tas, kad jis ilgą ašį žemyn įgauna tiesią formą (1a pav.), Tuo tarpu kiti CDC yra linkę įvairiais laipsniais būti sulenkti dėl skirtingų D4 orientacijų, palyginti su likusia dalimi. molekulė. Artimiausias homologas pagal seką yra SLY, kurio porų sekos tapatumas yra 52% (remiantis visų CDC subrendusių formų palyginimu, jei yra sekos). SLY struktūros 1, 3 ir 4 sričių superpozicija ant PLY suteikia alfa anglies atomų, esančių 1, 5 Å, 1, 5 Å ir 1, 1 Å, kvadratinio vidurkio (kvadratais) nuokrypius. Žemos vidutinės kvadratinės vertės rodo, kad trimatės struktūros paprastai yra labai panašios. Reikšmingas skirtumas, nepastebėtas nė vienoje iš paskelbtų CDC struktūrų, yra didelis dviejų sruogų (29–35, 46–50 liekanų) regionų mobilumas D2. Todėl vandenilio jungčių sąveikos, kurią D2 formuoja ir su D3, ir su D4, kurios paprastai stebimos SLY ir kituose CDC, nėra PLY.

Nepaisant aukso komplekso jungties su Cys 428, PLY D4 (liekanos nuo 427 iki 437 liekanos) Trp turtinga kilpa turi tokią pačią struktūrą, kaip anksčiau buvo matoma SLY ir SLO. Vienintelis reikšmingas skirtumas yra tas, kad aukso surišimas privertė Trp 426 šoninė grandinė į tirpalą. Vandenilio ryšiai tarp liekanų Trp turtingoje kilpoje yra nuo Glu 427 (O) iki Arg 437 (N), Glu 427 (N) iki Arg 437 (O), Thr 429 (OG1) iki Glu 434 (O), Thr 429 (N) iki Trp 435 (O) ir Leu 431 (O) iki Glu 434 (O) (1b pav.). Tarp simetrijos susijusios molekulės yra vienas vandenilio ryšys [Cys 428 (O) iki Tyr 461 (OH)]. Be Trp 463 SLY ir Trp 537 SLO, kuris yra rotaerio variantas Trp 435 PLY, vandenilio ryšiai Trp turtingoje kilpoje yra išsaugoti PLY, SLY ir SLO. Be to, PLY, priešingai nei kiti CDC, turi ryškų elektroneigiamąjį potencialą (1c pav.), Tačiau to priežastis nėra aiški.

Neseniai archetipiniame CDC perfringolizinas O (PFO) parodėme, kad tarpmolekulinis elektrostatinis jungiklis kontroliuoja perėjimą prieš porą iki poros 28 . Į preporą surinkti monomerai šiek tiek pakreipiami, o procesą greičiausiai palengvina aromatinė krovimo sąveika tarp Tyr 181 ir Phe 318. Ši pakreipimo padėtis „Glu 183“ (ant β1 grandinės) sudaro druskos tiltą su „Lys 336“ (šalia β-stygos). 5) gretimame preporo monomere - sąveika, sukelianti suderintą 1 ir 2 sričių (D1, 2) sąsajos su vienu iš dviejų D3 esančius α – HB sutrikimus. Sutrikus šiai sąsajai (D3-D1, 2 sąsaja), gali išsiskleisti α – HB1, kuris vėliau sudaro membraną apimančią TMH1 sritį. Buvo parodyta, kad bet kurio likučio mutacija sulaiko PFO buvusią būseną, tačiau poveikį galima panaikinti arba susilpninant domeno sąsają mutuojant Asn 197, arba padidinant temperatūrą. Šie likučiai yra konservuoti daugumoje CDC, bet ne PLY (PLY yra lizinas ties Glu 183, glicino liekanos ties Lys 336 ir Asn 197 ir valinas ties Phe 318), kurie rodo, kad PLY koordinuoja kritinį D3 sutrikimą. -D1, 2 sąsaja kitu mechanizmu. PLY kristalų struktūros analizė suteikia informacijos apie tai, kaip palengvinamas jo perėjimas nuo poros iki poros: 2 domenas yra labai mobilus ir sudaro daug mažiau sąveikos su 3 domenu, palyginti su PFO, taigi jo sąsaja iš prigimties yra mažiau stabili nei analogiškos struktūros PFO. . Tai atitinka pastebėjimą, kad PLY šiluminio lydymosi temperatūra (T M ), kurią daugiausia lemia D3-D1, 2 sąsajos sutrikimas, yra maždaug 3 ° C žemesnė (čia nustatyta 46, 2 ° C) nei anksčiau rastas PFO (49 ° C) 28 .

PLY kristaluose sudaro pailgintą linijinį oligomerą

Monomerai kristaluose yra sandariai supakuoti pailgos formos linijine forma (2a pav.). PLY kristalų SDS-AGE gelis atskleidžia didelės molekulinės masės SDS atsparių oligomerų, turinčių monomero ir mažos molekulinės masės oligomerų, kopėčias (papildomas S1 pav.). Kristalai buvo ypač patvarūs plovimo metu ir, norint juos ištirpinti, reikėjo virti SDS užpildymo buferyje. Patvarių oligomerų buvimas kristalų pavyzdyje rodo, kad jungtys tarp kristalų monomerų yra pakankamai stiprios, kad būtų iš dalies atsparios SDS ir terminiam apdorojimui. Stebima monomerų sąveika gali atspindėti tai, kaip pradinis CDC oligomeras kaupiasi po membranos surišimo, prieš formuodamas žiedus. Palaidotas paviršius tarp PLY subvienetų yra platus - daugiau nei 1500 Å 2 yra palaidota sąsajoje (750 Å 2 iš vieno monomero ir 770 Å 2 iš antro). Subvienetų sąsajose yra trys druskos tilteliai (K18 - E84, D93 - R208 ir K188 - E260) su dviem kitais potencialiais druskos tiltais (K171 - D59 ir D398 - K442), kur liekanos yra arti, bet nėra tinkamai orientuotos. Dviejų iš trijų druskos tiltelių tarp PLY monomerų sutrikimas buvo pasiektas pakeičiant K18 arba R208 alaninu (2b pav.). Gauti mutantai pasižymėjo mažiau kaip 3% natūralaus PLY aktyvumo, kas rodo, kad ši elektrostatinė sąveika yra kritiniai monomerų ir monomerų sąsajos komponentai (1 lentelė). Yra 13 vandenilio rišamųjų sąveikų ir 68 van der Waals sąveikos su dauguma kontaktų, esančių 1 ir 3 srityse (papildoma S1 lentelė). Iš viso tarpmolekuliniuose kontaktuose yra 56 liekanos (apibrėžtos kaip liekanos, turinčios atomus, esančius viena nuo kitos 4 Å viena nuo kitos), o formos papildomumo balas 0, 56 rodo specifinę, bet silpną baltymų ir baltymų sąsają 29 . Sąsajose taip pat yra ryškus krūvio papildomumas (1c pav.).

Image

a ) PLY monomerų krištolo įpakavimas. Monomerai yra išdėstyti linijiniu masyvu. b ) Padidintas vaizdas, atsižvelgiant į a ) skyriuje pateiktą PLY oligomero monomero ir monomero sąsają su likučiais, kurie mutavo, paryškinti geltonai, ir liečiasi likučiais raudonoje arba mėlynoje sferose, atsižvelgiant į tai, iš kurio monomero jie atsirado. c ) sandariai supakuoto linijinio CDC oligomero formavimo žingsniai. PLY buvo modeliuojamas pagal ILY-CD59 komplekso struktūras ir LLO kristalų struktūras, atskirai dengiant PLY domenus nuo 1 iki 3 ir 4 domenus ant dviejų gretimų monomerų ILY ir LLO linijiškai supakuotų kristalografinių oligomerų. Parodyta iš kairės į dešinę: santykinė PLY orientacija, modeliuojama pagal ILY-CD59 oligomerą, LLO oligomerą, ir faktinė orientacija pačiame PLY oligomere. Dimeras susitraukia ir 1, 2, 3, 3 srities - 4 srities domenai ištiesėja, einant iš kairės į dešinę.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Norint toliau ištirti likučius, susijusius su monomero-monomero sąsaja, didelių gabaritų šoninės grandinės buvo įvestos dviejose pagrindinėse padėtyse: N66, kuris yra tarp gretimo monomero T201 ir S203, ir S68, kuris sąveikauja su gretimo monomero D205 (pav. 2b). N66 pakeitimas triptofanu sumažino citolitinį aktyvumą 50%, o S68 pakeitimas triptofanu neturėjo įtakos (1 lentelė). Tačiau abiejų liekanų mutacija triptofanu (N66W ∙ S68W) panaikino aktyvumą (1 lentelė). Be to, įvedus sterinį tūrį kartu su R208-D93 druskos tilto ardymu, mutavus R208 į alaniną, taip pat buvo pašalintas citolitinis aktyvumas (1 lentelė). Visi šie rezultatai rodo, kad šioje sąsajoje turi įvykti specifiniai monomerų-monomerų kontaktai, kurie skatina PLY porų susidarymą.

Yra dar dvi CDC kristalų struktūros, kuriose kristalų gardelėse buvo pastebėtas linijinis oligomeras. ILY: CD59 komplekso struktūroje ILY molekulės sąveikauja kiekvienoje ištiestoje masyve panašiai kaip PLY su mažesnės formos papildomumo balais - 0, 45 19 . Tačiau bendras tarpląstelinių kontaktų skaičius (10 - 56 PLY) ir nedidelis palaidoto paviršiaus plotas (140 Å 2 vienam monomerui) rodo silpną monomerų sąveiką. Panašus įpakavimas yra ir LLO kristalų struktūroje, kur figūros papildomumo balas yra 0, 47, iš viso 16 tarpmolekulinių kontaktų ir šiek tiek didesnių palaidotų paviršiaus plotų (287 Å 2 vienam monomerui) 26 . Biologinis šių sąsajų reikšmingumas buvo pabrėžtas pastebėjus, kad likučių mutacija LLO sąsajoje (Lys 175 Glu, Glu 262 Lys, Ser 176 Trp) panaikino hemolizinį aktyvumą 26 . Šie duomenys rodo galimą monomerų ir monomerų sąveikos modelį, kuris yra pirmasis CDC priešformos formavimosi žingsnis (2c pav.). Iš pradžių tarp monomerų susiformuoja silpna sąveika (kaip matyti iš ILY oligomero), turinti labai mažai kontaktų ir tik nedidelius palaidotus paviršius baltymų sąsajose. Tada monomerai glaudžiau supakuojami, didėjant kontaktų skaičiui ir toliau užkasant baltymų paviršių (kaip matyti iš LLO oligomero), kol jie pasiekia gana sandarų oligomerą, turintį plačius kontaktus ir reikšmingus palaidotus paviršius (kaip matyti PLY oligomere). Tuo pat metu tiesinamas D1, 2, 3 - D4 kampas, kai baltymai pereina iš laisvai supakuotų į sandariai supakuotas struktūras (2c pav.). Kai PLY kristalų struktūra yra pavaizduota ant ILY ir LLO oligomerų (2c pav.), Paaiškėja, kad PLY monomero ir monomero sąsajoje yra pusšimčio sąveikų, išsaugotų visuose trijuose linijiniuose oligomeruose: Asp 177 iki Lys 152, Asn 181 - Arg 51, Gln 225 - Leu 11, Lys 288 - Glu 264 (druskos tiltas), Ser 298 - Arg 147 (vandenilio jungtis) ir Thr 304 - Lys 268. Sąveika visais atvejais, išskyrus vieną, apima D3 sąveiką ( išimtis yra viena D1 – D1 sąveika), iš kurių dauguma yra tarp kaimyninio monomero D3, bet kiekvienas pavyzdys yra D3 sąveika su D1 arba D2 (papildoma S1 lentelė).

PLY tirpalo struktūra atskleidžia monomerą

PLY oligomerų buvimas kristaluose kėlė klausimą, ar jie taip pat egzistuoja tirpale. Norėdami atsakyti į šį klausimą, pirmiausia atlikome PLY (0, 2 mg / ml) dinaminės šviesos sklaidos (DLS) analizę (3a pav., B, papildoma S2 lentelė). Po PLY inkubacijos 25 ° C temperatūroje (3a pav., Papildoma S2 lentelė) buvo gauta atskira smailė, kurios vidutinis dalelių skersmuo buvo 6, 6 nm (3a pav., S2 papildoma lentelė), kuri atitiko PLY monomerą, remiantis palyginimu su baltymų standartais. PLY mėginiai, inkubuojami 37 ° C temperatūroje 10 minučių, davė siaurą dalelių skersmens 3446 nm (± 834) smailę (3b pav., Papildoma S2 lentelė), kuri atitiko tiksliai apibrėžtą oligomerą. Tai koreliuoja su ankstesne ataskaita, kad PLY 30 tirpale sudaro taisyklingo dydžio žiedo formos oligomerus.

Image

a ) Dinaminis šviesos išsibarstymo profilis po inkubacijos 25 ° C temperatūroje. b ) Dinaminis šviesos išsibarstymo profilis, inkubuotas 10 minučių 37 ° C temperatūroje. c ) SDS agarozės gelio analizė tų pačių PLY tirpalų, kurie buvo ištirti DLS. Numatoma PLY molekulinė masė yra 53, 7 kDa, remiantis aminorūgščių seka. d ) SEC-SAXS analizė. Vidutinis intensyvumas, atsižvelgiant į išsibarstymo vektoriaus dydį ( I ( q ) ir q ), parodomas apskritimais, o klaidų juostos nurodo ± 1 standartinį nuokrypį. Teorinis PLY kristalų struktūros išsklaidymo profilis buvo pritaikytas prie eksperimentinių duomenų naudojant CRYSOL 37 ir parodytas kaip vientisa juoda linija (Chi CRYSOL = 0, 611 ). DAMMIF 36 sukurto tipinio manekeno atomo modelio teorinio išsibarstymo profilio tinkamumas parodytas kaip vientisa raudona linija (Chi DAMMIF = 0, 593). e ) Guinier sklypas. Pirmieji 20 išsklaidytų duomenų taškų patenkinti q . R g <1, 3. ( f ) poros atstumo vektoriaus paskirstymo funkcija, sugeneruota iš SAXS duomenų, naudojant GNOM 63 . g ) SAXS gauto ab initio formos voko palyginimas su PLY kristalų struktūra. Vidutinis filtruotos „DAMAVER 53“ formos vokelis, gautas iš 10 DAMMIF modelių, yra pavaizduotas žalsvai mėlynose sferose ir optimaliai uždėtas ant PLY struktūros. Normalizuotas erdvės atitikimas buvo 1, 21.

Visas dydis

Oligomero prigimtis 37 ° C temperatūroje buvo toliau tiriama, abu DLS mėginius veikiant SDS-AGE tricino geliais, siekiant nustatyti, ar oligomerinė struktūra yra atspari SDS. Mėginiai, inkubuojami tiek 25 ° C, tiek 37 ° C temperatūroje, buvo monomerai (3c pav.), Rodantys, kad 37 ° C temperatūroje susidaręs oligomeras nebuvo atsparus SDS. Anksčiau SDS jautrūs PFO oligomerai buvo apibūdinami atliekant liposomų 31 porų susidarymo tyrimus. Skirtinga DLS smailės forma rodo, kad oligomeras yra vienodo dydžio, galbūt linijinis arba žiedinis. Apie tirpius PLY oligomerus praeityje buvo pranešta ir elektronų mikroskopu parodyta žiedinė struktūra 30 . Atrodo mažai tikėtina, kad DLS stebimi oligomerai atitinka linijinius oligomerus, pastebėtus kristaluose, nes galima tikėtis, kad linijiniai oligomerai tirpale pasirinks platų dydžių diapazoną, kas atitiktų ankstesnius radinius tiesiniams oligomerams, kuriuos sudaro Trp 165 mutantai PFO 32 . Tikėtinas paaiškinimas, kodėl oligomerai, esantys tirpale, cirkuliuoja, yra tas, kad aukštesnė temperatūra suteikia pakankamai energijos, kad išstumtų D3 iš molekulės kūno ir tokiu būdu sudarytų sąlygas konformaciniams pokyčiams, reikalingiems priešgimiui formuoti 28 .

PLY mėginio, kuris buvo naudojamas kristalografiniams tyrimams, pobūdis buvo toliau tiriamas atliekant mažo kampo rentgeno spindulių išsklaidymą (SAXS) kartu su dydžio išskyrimo chromatografija (SEC-SAXS) 33 . Mėginiai, inkubuoti 37 ° C temperatūroje, pasirodė mažai tirpūs SAXS analizei, todėl buvo analizuojami tik mėginiai, inkubuoti 25 ° C temperatūroje. Išsklaidytos rūšys išplaukė vienoje smailėje, kurios didžiausias ilgis ( Dmax ) yra 115 Å, o išpūtimo spindulys - 32, 9 ± 0, 5 Å (papildoma S3 lentelė ir 3d – f pav.). Apskaičiuota, kad išsklaidytų rūšių molekulinė masė yra 53, 8 ± 0, 6 kDa, naudojant AUTOPOROD 34 pateiktą tūrio įvertinimą ir iš SAXS išvestą dalinį savitąjį tūrį 0, 7425 cm 3 / g35. Tai koreliuoja su molekuline mase, lygia 53, 7 kDa, apskaičiuotai pagal PLY seką, ir yra indikatorius, kad molekulė yra monodispersinė ir monomerinė tirpale. P (r) kreivės forma (3f pav.) Rodo šiek tiek pailgos molekulės, o ne visiškai rutulinę molekulę (3 e pav.). Ab initio pailgos ir santykinai plokščios PLY apvalkalas (3g pav.) Buvo apskaičiuotas pagal P ( r ) pasiskirstymą, naudojant fiktyvaus atomo modeliavimą 36 . Kristalografinės PLY koordinatės gerai tilpo į voką ir, kaip buvo tikėtasi, teorinis išsibarstymo profilis, sugeneruotas iš PLY koordinačių naudojant CRYSOL 37, gerai atitiko eksperimentinį SAXS išsklaidymo profilį (3d pav.). Apibendrinant galima pasakyti, kad SAXS duomenys rodo, kad PLY (esant 25 ° C) įgauna monomerinę struktūrą, labai panašią į kristalografijos stebimą struktūrą.

Silikoninis „sLeX“, „LeB“ ir manozės prijungimas prie PLY

Remiantis darbu, kuris pasiūlė manozės vaidmenį reguliuojant PLY oligomerizaciją 21, buvo pasiūlyta, kad PLY galėtų naudoti tam tikras angliavandenių dalis iš glikolipidų ir glikoproteinų kaip receptorius ląstelių-šeimininkų membranos paviršiuje 20 . Glikano sialilas Lewis X (sLeX), turintis didžiausią afinitetą (Kd = 1, 88 × 10 –5 M), susijungusį su PLY, tuo tarpu susijęs Lewis B (LeB) visiškai nesirišo 20 . Angliavandenių surišimo numatymo serveris 38 buvo naudojamas identifikuoti galimas glikano jungimosi vietas PLY homologijos modelyje, kuris numatė surišimo vietą D4. Vietos nukreipti mutagenezės tyrimai patvirtino, kad D4 liekanos Gln 374, Tyr 376, Trp 433 ir Leu 460 buvo susijusios su sLeX 20 surišimu. Tačiau palyginimas naudojant PLY išvestą homologinį modelį, naudojamą prognozuojant, su PLY kristalų struktūra, apie kurį pranešta, rodo, kad yra didelių šių struktūrų skirtumų, ypač liekanų, esančių D4, pavyzdžiui, Trp 433, vietoje. Taigi mes panaudojome tą patį numatymą. serverio PLY kristalų struktūroje ir nustatė dvi galimas rišimo vietas: 1 vieta (Gln 374, Tyr 376, Arg 426, Trp 436), atitinkanti paskelbtą prognozę D4 ir 2 vietoje (Ser 254, Lys 255, Ser 256, Trp 278, Gln 280), ties D3-D4 sąsaja (1a pav.). Tada skaičiavimais įterpėme „sLeX“, „LeB“ ir „mannozę“ abiejose vietose naudodami „Sybyl-X 2.1“ („Certara“, LP; //tripos.com/) (4 pav.). Dokavimo balai numatė, kad 2 vieta yra daug palankesnė visų trijų junginių jungimosi vieta nei 1 vieta (papildoma S4 lentelė). Abu glikanai „sLeX“ ir „LeB“ gali jungtis beveik taip pat abiejose vietose, pirmoje vietoje pirmenybė teikiama „LeB“, o 2 vietoje - „sLeX“. Manozė yra žymiai silpnesnis rišantis ligandas abiejose vietose.

Image

Abiejose vietose geriausiai pažymėtos „sLeX“ pozos parodytos kaip geltonos lazdelės, spalvotos pagal atomo tipą. Baltymai yra spalvoti pagal domenus, kaip parodyta 1 pav., Ir pavaizduoti kaip karikatūra, o numatomi angliavandenius jungiantys likučiai rodomi kaip lazdelės spalvos. Likusios angliavandenių sąveikaujančios liekanos parodytos kaip lazdelės, spalvotos pagal domeną. a ) 1 svetainė. b ) 2 svetainė.

Visas dydis

Diskusija

Mes išsikristalizavome ir išsprendėme PLY struktūrą ir parodėme, kad bendra PLY struktūra iš esmės yra panaši į kitų CDC struktūrą, tačiau joje yra skirtumų tarp kintamų kilpų regionų. Molekulė, palyginti su kitomis CDC, buvo labiau pailgi, o kampas tarp pagrindinio molekulės kūno (D1-3) ir D4 nebuvo sulenktas. Šis PLY molekulės ištiesinimas gali atsirasti dėl to, kad PLY trūko suvaržymų, kuriuos patiria kiti CDC dėl vandenilinių ryšių, kurių PLY nėra D2-4 sąsajoje, įtakos. SAXS nustatyta struktūra atitinka PLY išlaikant tiesiškumą tirpale (3 pav.), Suderinta su senais tyrimais, rodančiais, kad PLY yra pailgi molekulė 39 tirpale. Ankstyvieji elektroninės mikroskopijos tyrimai parodė, kad PLY gali įgyti lenkimo formą, kai jis oligomerizuojasi 40, tačiau naujausi tyrimai rodo, kad toksinas, o ne lenkimas, yra žymiai pakreiptas, palyginti su membranos paviršiumi 28 . Mūsų struktūriniai tyrimai taip pat parodė, kad PLY Trp turtinga kilpa įgauna panašią struktūrą kaip SLY ir SLO.

Mūsų tyrimai taip pat siūlo ankstyvosios CDC monomerų sąveikos membranos paviršiuje struktūrą, kuri atitinka paskelbtus rezultatus 32, 41 . Stebina tai, kad trys CDC, parodyti, kad jų kristalinės būklės sankaupos sudaro tiesinius oligomerus, kartu su nedideliu CDC klodu, kuriam trūksta elektrostatinio jungiklio 28 komponentų. Analogiški likučiai elektrostatinio jungiklio komponentams PFO (Glu 183, Lys 336) nėra konservuoti ILY (Ser, Gly), LLO (Asp, Asp) ar PLY (Lys, Gly).

Pasirinktų liekanų mutacija sąsajoje, vadovaujantis linijinio oligomero kristalų struktūra, parodė, kad visos liekanos atskirai arba kartu daro reikšmingą poveikį PLY porų formavimo aktyvumui. Abi pagrindinės liekanos, K18 ir R208, kurios atitinkamai dalyvauja elektrostatinėje sąveikoje su E84 ir D93, monomerų sąsajoje sumažino hemolizinį aktyvumą ≥ 100 kartų. Įdomu tai, kad mutantai, kuriuose N66 arba S66 buvo pakeisti triptofanu, pasilikusiu šalia laukinio tipo aktyvumo; tačiau kartu jie sumažino aktyvumą> 100 kartų. Šie tyrimai tvirtai rodo, kad šie likučiai prisideda prie funkcinių porų susidarymo, greičiausiai, užkertant kelią ar pakeisdami teisingą tarpmolekulinę sąveiką tarp membranų paviršiaus monomerų.

CDC linijiniai oligomerai anksčiau buvo stebimi membranose su tam tikrais PFO 32 mutantais. D1 likučio Trp 165, kuris yra konservuotas visuose CDC (Trp 134 PLY), mutacija į aromatinius likučius inaktyvina PFO, užkertant kelią visiems D3 struktūriniams perėjimams, dėl kurių susidaro linijiniai membranos oligomerai. Netoliese esančio likučio Ala 146 ištrynimas PLY (Ala 177 PFO) taip pat sumažina porų formavimo aktyvumą ir lemia linijinės membranos oligomerų 41 formavimąsi. Gimtasis PFO surenka SDS atsparius oligomerus, kaip įvertino SDS-AGE, tačiau aromatiniai Trp 165 mutantai sudaro SDS jautrius linijinius oligomerus, kurie yra įstrigę ankstyvame pereinamojo laikotarpio tarpiniame etape, kuriame monomerai pradėjo kauptis membranos paviršiuje. Laukinio tipo toksine ši sąveika skatintų keletą konformacijos pokyčių, įskaitant D1-3 pakreipimą 30 ° kampu D4 link membranos, kuris pasklistų po visą augančią oligomerą, kad nustatytų žiedo komplekso geometriją ir neatšaukiamai sudarytų membraną. surišti monomerai, kad susidarytų oligomerinė porų struktūra. Tikėtina, kad šių PFO ir PLY mutantų sutelkimas membranos paviršiuje arba PLY sukoncentravimas kristalizacijos metu leido monomerams inicijuoti šias sąveikas. Taigi atrodo, kad linijiniai oligomerai, stebimi ILY, LLO ir PLY struktūrose, yra labai ankstyvų silpnesnių monomerų ir monomerų sąveikos, reikalingos prieš tai, kai sąveika tampa pakankamai tvirta, konformacijos pokyčių, reikalingų oligomero cirkuliacijai sukelti, žvilgsniai. Šių ankstyvųjų CDC oligomerizacijos stadijų schema pateikta 5 pav.

Image

PLY parodytas kaip supaprastintas granulių modelis, spalvotas pagal domenus, kaip parodyta 1 pav. PLY artėja prie tikslinės membranos kaip tirpūs monomerai ir jungiasi prie cholesterolio turinčių regionų per kilpas 4 domeno gale. Monomerai pradeda formuoti laisvą tiesinę liniją. surinkimas, pirmiausia per 1 ir 3 domenus, kaip pastebėta PLY modelyje, paremtame ILY. Kadangi pakuotės tarp monomerų tampa glaudesnės, sąveika didėja, kad atspindėtų tuos, kurie matomi PLY modelyje, paremtame LLO. Galiausiai monomerai yra sandariai supakuoti, panašūs į linijinį SDS jautrų oligomerą, kaip matyti PLY kristalų struktūroje. Visi šie linijiniai oligomerai yra trumpalaikio pobūdžio, tačiau gali būti įstrigę mutacijos būdu (žr. Tekstą) arba kristale. Vėlesniuose citolitinio aktyvumo (neparodyta) etapuose sąveika su cholesteroliu sukelia konformacinius 3 srities pokyčius, sukeliančius monomerų pakrypimą, oligomerų cirkuliaciją ir SDS jautrų ankstyvąjį priešgimį. 3 domeno struktūriniai pertvarkymai lemia SDS atsparų vėlyvąjį priešpopuliarumą prieš TMH sričių išsiskleidimą 3 srityje, kad susidarytų SDS atsparios poros (nepavaizduotos).

Visas dydis

Tačiau faktas, kad monomerai kristalizacijos metu sudaro tik linijinius oligomerus, rodo, kad norint pakeisti šios sąveikos geometriją, norint formuoti žiedinius oligomerus 13, monomerų struktūros pokyčiams inicijuoti reikalinga membraninė sąveika. Svarbiausias struktūrinis pokytis nustatant oligomero žiedinę geometriją yra β-krypties poslinkis 5 32 . Iš linijinio komplekso kristalų struktūros matyti, kad β-kryptis išlieka savo vietoje. Jo atsijungimas nuo β-krypties 4 yra būtinas, kad vėliau susidarytų vandenilio ryšiai su gretimo monomero β-styga 1 oligomeriniame komplekse 3 . Užkertant kelią šių β-gijų sąveikai, nėra nustatyta galutinė monomero-monomero sąveikos geometrija, kuri neleidžia formuotis žiediniams kompleksams, todėl susidaro tiesinė oligomerinė struktūra 32 .

Mūsų dokų tyrimai taip pat siūlo dvi galimas neseniai identifikuotų LeX ir sLeX glikanų, kaip tariamų PLY 20 receptorių, jungimosi vietas: vieną šalia konservuoto undekapeptido, esančio arti D4 bazės, panašų į tą, kuris anksčiau buvo siūlomas PFO pagrindu pagamintam PLY modeliui 20 ir antrasis prie D3-D4 sąsajos, kuri yra D4 viršuje. Jei PLY prisijungia prie LeX ir sLeX glikano receptorių prieš sudarydamas nuo cholesterolio priklausomą sąveiką su membrana, atrodo, kad antroji čia nustatyta vieta labiau orientuojasi prie cholesterolio surišimo motyvo membranos paviršiuje. Vis dėlto belieka nedviprasmiškai parodyti, kad PLY kaip receptorius naudoja LeX arba sLeX. PLN kristalai, įmirkyti mannozėje (tūkstančio kartų perteklius) arba kartu kristalizuoti su toksinu, neatskleidė surišto glikano; tačiau neįmanoma kristalų mirkyti mililijoną kartų didesniu glikano kiekiu, palyginti su PLY, kuris, kaip buvo pranešta, yra būtinas norint slopinti PLY jungimąsi ir hemolizinį aktyvumą 20 . Esant per dideliam „sLeX“ ir „PLY“ santykiui, kuris naudojamas norint teigti, kad „sLeX“ yra kaip PLY receptoriai, negalima atmesti galimybės, kad šis konkretus glikanas, esant labai didelei panaudotai santykinei koncentracijai, galėjo sėkmingai nespecifiškai sąveikauti su undekapeptidiniais triptofanais: triptofanu yra dažniausiai angliavandenius jungiančių baltymų liekana 42 . Pririšimas prie Undecapeptido galėjo slopinti surišimą ir hemolizinį aktyvumą tokiu būdu, kuris nesusijęs su veikimu kaip receptoriais, pakeisdamas D4 struktūrą, nes gerai žinoma, kad CDC mechanizmas yra labai jautrus Undecapeptide struktūros pokyčiams 13, 43, 44, 45 .

Vis labiau tiriamos naujos baltymų pagrindu pagamintos pneumokokinės vakcinos, kad būtų išvengta vakcinų, kurių pagrindą sudaro kapsulės, kurių variacijos yra> 90, o PLY buvo laikoma svarbiu šių būsimų vakcinų komponentu dėl labai konservuotos struktūros ir svarbos S. pneumoniae virulencija 41, 46, 47, 48, 49, 50, 51 . Todėl PLY struktūra yra svarbus pagrindas kuriant naujus gydymo būdus, įskaitant ir mažų molekulių vaistus, ir vakcinas, skirtus pneumokokinėms ligoms gydyti. PLY oligomero struktūra suteikia pagrindą, kuriuo remiantis eksperimentai gali būti geriau suprantami dėl konformacinių pokyčių ir molekulinės sąveikos, susidarančios dėl to, kad CDC perkelia iš ankstyvosios monomerų ir monomerų sąveikos ląstelės paviršiuje į formavimąsi. stabilių porų kompleksas.

Metodai

Klonavimas, ekspresija ir gryninimas

Laukinio tipo PLY buvo klonuotas į pQE-30 9 . Hexahis-PLY (čia nurodytas kaip PLY) buvo ekspresuotas E. coli BL21 (DE3) pREP4 Turbo sultinio terpėje (Athena Enzyme systems, Baltimore) 37 ° C temperatūroje. Ląstelės nuosėdos buvo suspenduotos 21 ° C temperatūroje lizės buferyje (25 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10% (v / v) glicerolio, 0, 1% (v / v) Triton X-100, 100 μM PMSF, 10 μg). / ml lizocimo, 10 μg / ml 1-osios DNR, 20 mM imidazolo, pH 7, 2). Ląstelės lizuojamos 21 ° C temperatūroje, purtant jas 1 valandą, po to ultragarsu apdorojamos 6 × 10 sekundžių. PLY buvo išgryninta 5 ml HisTrap TM HP kolonoje (GE), išbalansuota buferiniame tirpale A (25 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolo, 10% glicerolio, pH 7, 2). Kolonėlė plaunama 50 ml buferio A, pH 7, 2. PLY iš kolonėlės buvo išplauta su buferiniu tirpalu B (25 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 400 mM imidazolo, 10% glicerolio, pH 7, 2). Frakcijos, turinčios PLY, buvo sujungtos ir dializuotos į 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7, 5, esant 21 ° C temperatūrai 16 valandų. Dializuotas PLY buvo toliau išgrynintas atliekant dydžio išskyrimo chromatografiją Superdex 200 26/60 kolonoje (GE) 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7, 5. Frakcijos, kuriose yra PLY baltymo (stebimos SDS-PAGE), buvo sujungtos ir sukoncentruotos iki 10 mg / ml ir laikomos –80 ° C.

Likučiai PLY, kurie, kaip buvo numatyta, tarpininkaus monomerų ir monomerų sąveikai, buvo mutavę PCR QuickChange mutageneze (Stratagene), naudojant šabloną kodonui optimizuotą PLY. Oklahomos universiteto Sveikatos mokslų centro molekulinės biologijos ir citometrijos tyrimų laboratorija atliko seką, kad patikrintų mutacijų įtraukimą. PLY ir PLY dariniai buvo transformuoti į E. coli Tuner ląsteles ir išgryninti, kaip aprašyta 5 . Baltymų koncentracija buvo tiriama naudojant baltymų analizės dažų reagento koncentratą (Bio-Rad) ir ekstrapoliuota iš standartinės kreivės naudojant BSA.

Dinaminis šviesos sklaidymas

Dinaminis šviesos sklaidymas (DLS) buvo atliktas naudojant „Malvern Instruments Zetasizer Nano“ serijos instrumentą. Mėginiai buvo tiriami greinerio bio-one polistireno pusiau mikro-kiuvetėse, kurių kelio ilgis buvo 10 mm. Duomenys buvo analizuojami naudojant „Zetasizer 7.02“ versiją. Buvo tiriama PLY koncentracija 0, 2 mg / ml 300 μl tūrio, esant 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7, 5) ir 2 mM EDTA. Mėginiai buvo inkubuojami 10 minučių 25 ° C arba 37 ° C temperatūroje ir prieš įkėlimą 3 minutes buvo centrifuguojami esant 13 000 x g. Išmatuoti trys kiekvieno mėginio techniniai pakartojimai. Apskaičiuotas techninių pakartojimų vidurkis, tada techninių pakartojimų vidurkis buvo sujungtas, norint nustatyti vidurkį n = 3. Dalelių skersmuo (nm) nurodomas atliekant intensyvumo analizę, o smailės santykinis procentas nurodomas atliekant tūrio pasiskirstymo analizę. .

PLY šiluminio lydymosi temperatūra (T m )

Tm buvo nustatytas taip, kaip aprašyta anksčiau PFO 28 .

PLY ir PLY darinių citolitinis aktyvumas

Citolitinis aktyvumas buvo nustatytas taip, kaip aprašyta PFO ant žmogaus eritrocitų (RBC) 5 . Pranešama apie veiksmingą 50% citolizės koncentraciją (EC 50 ), apskaičiuotą pagal duomenų netiesinės sigmoidinės dozės ir atsako kreivės atitiktį, taip pat pagal vidurkio standartinę paklaidą.

SDS agarozės gelio analizė

Į 20 μl (0, 2 mg / ml) PLY mėginių iš aukščiau aprašytų DLS tyrimų buvo įpilama šešis kartus nesumažinančio SDS užpildymo buferio (2 μl) ir jie buvo paleisti 1, 5% SeaPlaque® agarozės (Lonza) SDS agarozės geliu (SDS- AGE) tricino gelis tricino buferyje (25 mM Tris – HCl, 250 mM glicino, 1% SDS, pH 8, 3) esant 110 mA 1 val. Gelis buvo iš dalies dehidratuotas ir nudažytas momentine mėlyna spalva („Expedeon“), nusodintas 7% acto priemaiša, 10% metanoliu.

PLY kristalai (neaugantys esant aukso junginiams), paimti iš 4 μl tūrio kristalizacijos kabančio lašo, buvo nuplauti 100 μl 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7, 2 ir surinkti centrifuguojant. Skalbimas buvo pakartotas tris kartus. Liekamasis plovimo tirpalas buvo pašalintas, o kristalai buvo ištirpinti 20 μl plovimo buferio ir 4 μl 6 x SDS, nemažinančiame, užpildymo buferyje (375 mM Tris-HCl, pH 6, 8, 6% SDS, 48% glicerolio ir 0, 03% bromfenolio mėlynojo). The protein were boiled for 2 minutes at 95 °C and loaded onto SDS-AGE gel with 10 μl SeeBlue® Plus2 Pre-stained Protein Standard (Life Technologies) and 1 μg PLY monomer as size references.

Small-angle X-ray scattering analysis

Small–angle X-ray scattering (SAXS) data were collected on the SAXS/WAXS beamline at the Australian Synchrotron (Clayton, Victoria). The X-ray beam size was 250 μm horizontal × 120 μm vertical. Data collection was on a Dectris-Pilatus 200 K detector. Sample to detector distance was 1576 mm ( q -range 0.006–0.4 Å −1 ) with a 11 Ke V beam and X-ray wavelength of 1.0322 Å. PLY (80 μl at 5.35 mg/ml in 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl and 1 mM DTT) samples were run using in-line gel filtration 33 with a Wyatt Technology WTC-050N5G SEC column equilibrated in the same buffer. The column flow rate was 0.8 ml min −1 at 298 K and exposures were 2 seconds (2.1 sec. repeat time). Data acquisition and reduction analysis were carried out with Australian Synchrotron scatterBrain 9-1_0 software 52 . Further analysis was carried out using ATSAS 2.6.0 data analysis software 34 . Ab initio shape reconstructions were performed using DAMMIF 36 . Averaged filtered shape envelopes were generated from ensembles of 10 DAMMIF envelopes with DAMAVER 53 . Theoretical scattering profiles were generated from model coordinates and compared to experimental data using CRYSOL 37 . Dry volume was calculated using //www.basic.northwestern.edu/biotools/proteincalc.html.

Kristalizacija

Initial crystallisation trials of PLY were set up at 21 °C on a Crystal Gryphon robot (ARI, Sunnywale CA, USA) in 96-well sitting drop format using Rigaku UV + 96 plates (AXT, Sydney, Australia). Drops containing 0.2 μl of protein and 0.2 μl of crystallisation solution were equilibrated against 35 μl of crystallisation solution. PLY was in 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 20 mM Tris-HCl pH 7.5 at a concentration of 10.5 mg/ml. Crystallisation screens were set up at room temperature and included MCSG-I, MCSG-II, MCSG-III and MCSG-IV from Microlytic (Burlington, USA). The screen solutions gave a number of initial hits in drops of solutions 23, 37, 38 of MCSG -III and 4, 24, 31, 44, 65 in MCSG-IV, resulting in needle and plate crystals. The drops were scaled up to drops containing 2 μl protein and 2 μl precipitant solution in a hanging drop format using Linbro culture plates (ICN, Biochemicals Inc., Ohio, USA) and equilibrated against 1 ml of well solution. The best needle crystals grew in solution 37 of MCSG-III. Improvement of the size of the needles was achieved by using a range of different concentrations of precipitant and a range of buffer pHs. A shower of rod crystals each of a size of 0.02 mm × 0.02 mm × 0.6 mm grew within a day in 10% polyethylene glycol (PEG) 8000, 10% glycerol, 10% ethylene glycol and 100 mM HEPES buffer at pH 7.5. Flash freezing was performed by transferring the crystals straight from the drop into liquid nitrogen. These crystals diffracted to ~3.6 Å resolution but initial phases derived from molecular replacement approaches were of poor quality (see below) prompting a search for heavy atoms to improve the phases. In one experiment 5 mM KAu(CN) 2 was made up in the crystallisation buffer and mixed with PLY. The addition of the heavy atom was crucial for the growth of larger crystals (typically 0.04 mm × 0.04 mm × 0.8 mm) and resulted in better diffraction of 2.9 Å resolution.

Duomenų rinkimas, struktūros nustatymas ir tobulinimas

X-ray diffraction data were collected at the Australian Synchrotron Beamline MX2 (Clayton, Australia) at 100 K using the program Blue-Ice 54 . The data were processed with the program XDS 55 . The crystals belonged to the space group P2 1 2 1 2 1 with unit cell dimensions of a = 24.9 Å, b = 133.6 Å and c = 220.4 Å. One molecule was found in the asymmetric unit giving a V M value 56 of 3.46 Å Da −1 and an estimated solvent content of 64%. Molecular replacement was first used to obtain initial phases. Initial attempts with PFO (intact and by domain) proved fruitless. It was then decided to try the crystal structure of SLY (PDB code: 3HVN) as a probe since it is the CDC of known 3D structure with the most similar sequence to PLY (sequence identity of 52%). A molecular replacement solution was obtained but the resultant phases were of poor quality. A heavy atom search led to the discovery that co-crystallisation of PLY with KAu(CN) 2 resulted in the growth of larger crystals (typically 0.04 mm × 0.04 mm × 0.8 mm) and to an increase in diffraction from 3.6 Å to 2.9 Å resolution. With the better quality data the molecular replacement approach using SLY was much more successful. Molecular replacement was performed using the program Phaser 57 with domains 1 to 3 and domain 4 of SLY as two separate ensembles. Alternate rounds of model building and refinement were carried out with the program COOT 58 and PHENIX 59 . Electron density for three N-terminal residues, all part of the Hexhis tag/linker region, were visible and added to the model. Twenty-nine water molecules, 5 ethylene glycol molecules, two PEG molecules (consisting of two ethylene glycol units) and two gold cyanide compounds (occupancies of 0.4 each) bound to Cys 428 were built into the structure. The final model of PLY resulted in R work and R free of 19.9% and 30.7%, respectively. The data and refinement statistics are given in Supplementary Table S5. A Ramachandran plot produced by PROCHECK 60 showed that 97.7% are in the allowed regions and there are 10 outliers (Phe 32, Glu 35, Lys 34, Ala 107, Glu 189, Ile 267, Met 309, Asp 311, Thr 321 and Lys 389). All are in regions of poor density.

Prediction of carbohydrate binding sites and computational docking

Residues identified by the carbohydrate binding prediction server 38 were used as the basis for defining a pair of Surflex binding sites using Sybyl-X 2.1 (Certara, LP; //tripos.com/). This process included a set of additional residues that defined a larger potential binding surface than that identified as 'likely sugar contacts' by the server. For Site 1 these were Tyr 371, Val 372, Gln 374, Tyr 376, Gly 401, Gln 402, Asp 403, Thr 405, Arg 426, Cys 428, Trp 435, Trp 436 and Thr 459. For Site 2 these were Asp 41, Glu 42, Thr 253, Ser 254, Lys 255, Ser 256, Trp 278, Gln 280, Ile 281, Asp 283, Asn 284, Ala 357, Tyr 358, Arg 359, Asn 360, Gly 361, Arg 449 and Asn 470. Mannose, LeB and sLex were built in SybylX-2.1 and docked into both putative carbohydrate binding sites using Surflex 61 in GeomX mode. Docked poses for each compound were inspected in SybylX2.1.

Papildoma informacija

Accession codes : Coordinates and structure factors have been deposited in the Protein Data Bank under the accession code 4ZGH.

How to cite this article : Lawrence, SL et al. Crystal structure of Streptococcus pneumoniae pneumolysin provides key insights into early steps of pore formation. Mokslas. Rep. 5, 14352; doi: 10.1038/srep14352 (2015).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.