Pritaikyti raštuoti substratai labai įvairialypei koreliacinei šviesos skenavimo elektronų mikroskopijai | mokslinės ataskaitos

Pritaikyti raštuoti substratai labai įvairialypei koreliacinei šviesos skenavimo elektronų mikroskopijai | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Konfokalinė mikroskopija
  • Fluorescencinis vaizdas
  • Vaizdo gavimo būdai
  • Nuskaitymo elektronų mikroskopija

Anotacija

Koreliacinė šviesos elektronų mikroskopija (CLEM) sujungia šviesos ir elektronų mikroskopijos pranašumus, tokiu būdu sudarydama galimybę stebėti dinaminius įvykius gyvose ląstelėse nanometrų skyra. Buvo sukurti įvairūs CLEM metodai ir įrenginiai, kiekvienas iš jų turi savo privalumų ir techninių iššūkių. Čia aprašome mūsų pritaikytus raštuotus stiklo substratus, kurie pagerina koreliacinės fluorescencijos / konokokinės ir skenuojančios elektroninės mikroskopijos galimybes.

Įvadas

Koreliacinės šviesos elektronų mikroskopijos (CLEM) tikslas - suderinti pranašumus, susijusius su šviesos mikroskopijos (LM) stebėjimu po ląstelėmis gyvų ląstelių ypatybėmis, ir elektronų mikroskopijos (EM) pagalba atskleisti jų ultrastruktūrines detales 1, 2, 3 . Technika yra sudėtinga, nes reikia perjungti iš vieno prietaiso į kitą: kiekvienam reikia tinkamai paruošto mėginio, o vieną reikšmingą kliūtį lemia lėtas ir daug darbo reikalaujantis interesų srities perkėlimas, atliktas šviesos mikroskopijos būdu, kai perjungiama į elektroninis mikroskopas.

Yra du pagrindiniai CLEM tipai: fluorescencinė / konfokalinė mikroskopija su perdavimo elektronų mikroskopija (TEM) arba skenuojančioji elektroninė mikroskopija (SEM). Pirmasis yra sukūręs įvairius protokolus ir įtaisus 4 ir yra plačiai naudojamas 3, 5, 6 biologinėse laboratorijose, tačiau antrasis vis dar nėra pakankamai išvystytas 7, 8, 9, o vienas iš vyraujančių jo apribojimų yra substrato trūkumas. kurie yra optimaliai pritaikyti mėginio perkėlimui, kai perjungiama iš vieno vaizdo režimo į kitą 8, jei nėra vieno mikroskopo, kuriame būtų tiek 8, 10, 11 .

Norėdami įveikti šį apribojimą, mes pagaminome skaidrius, metalo rašto stiklinius dangtelius, kurie idealiai tinka didelės skiriamosios gebos konfokalinei mikroskopijai, leidžia ląstelėms augti ir daugintis, yra atsparūs elektronų mikroskopijos mėginių paruošimo procedūroms ir užtikrina optimalų SEM vietos kontrastą. Parduodami optiniai mikroskopijos išgraviruoti substratai pasirodė esą brangūs ir nesugeba užtikrinti pakankamo kontrasto SEM mėginių perkėlimui, tuo tarpu mūsų rašytiniai dangteliai yra pigūs ir greitai pagaminami, juos galima naudoti su visais optiniais ir skenuojančiais elektroniniais mikroskopais ir jie yra lengvai naudojami. pritaikytas atsižvelgiant į nusodinto metalo pasirinkimą ir modelio dizainą (papildomi 1–3 pav.)

Kaip pasiūlė Jimenez ir kt ., 7 iš pradžių pasirinkome kvadrato formos modelį eksperimentams, naudojant plokščias HEK ir HeLa epitelio ląsteles (žr. Metodai). Kiekvieną pagrindinį modelio elementą sudarė šešios kietos 150 × 150 μm dydžio kvadratai, supantys raidę, buvo tiksliai tokio pat dydžio kaip šviesos mikroskopo 20 × objektyvo regėjimo lauko (775 × 775 μm), kad būtų lengviau greitas daugelio dominamų regionų žemėlapių sudarymas ir buvo pakartotas 25 kartus (5 eilutės × 5 stulpeliai) taip, kad jis tilptų į 10 mm apvalios stiklinės dangtelio centrinę sritį (papildomi 1 ir 2b pav.).

Antrasis apskritimo formos modelis buvo sukurtas eksperimentams, naudojant kultivuojamus neuronus, kuriems būdingas maždaug 30 μm skersmens ląstelės kūnas (soma), kuriame yra daugybė išsikišančių plonų, išsišakojančių neuritų, kurių ilgis yra dešimtys mikrometrų. Atliekant koreliacinę neuronų morfologijos ir neuritų išsišakojimo analizę, reikia didesnio laisvo dangtelio paviršiaus, kad būtų pašalintas bet koks galimas poveikis dėl ląstelių struktūrų ir nusodinto metalo sąveikos, taigi pagrindinį elementą sudaro aštuoni 70 μm skersmens kieti apskritimai, supantys raidę. arba skaičius (papildomi 1 ir 2a pav.), pakartotas 30 kartų (5 eilutės x 6 stulpeliai). Jos dydis buvo parinktas remiantis tuo pačiu kriterijumi, kuris buvo naudojamas nustatant kvadrato formos pagrindinio elemento dydį.

Šie du modeliai visiškai patenkino mūsų ląstelių perkėlimo poreikius, tačiau tą patį techninį metodą galima naudoti norint tinkinti modelį atsižvelgiant į bet kokią ląstelės formą (1a pav.).

Image

a) pradedant modelio dizainu ir baigiant lazeriu iškirpta kauke. b) Pagrindiniai 10 mm skersmens stiklinio stiklo dangtelio kūrimo žingsniai. c) Eksperimento protokolas. Ląstelės sėjamos ant tinkamai supjaustyto, sterilizuoto ir funkcionalizuoto stiklinio dangtelio, prieš tai perkraunant konstruktais, koduojančiais tiriamus ir fluorescencinius baltymus. Kai eksogeniniai baltymai yra tinkamai ekspresuojami, gaunami konokalinės mikroskopijos vaizdai, tada mėginiai fiksuojami, nedelsiant apdorojami SEM ir perkeliami į SEM vaizdo gavimo kamerą. Gauti vaizdai galutinai išanalizuojami, norint gauti dominančius duomenis. Mastelio juostos: 100 μm dideliame konokaliniame mikroskope ir SEM dideliuose regėjimo laukuose; 10 μm padidinimas ląstelėje: 1 μm ir 200 nm detalės.

Visas dydis

Tada mes panaudojome nerūdijančio plieno lazeriu pjaustytą kaukę, norėdami perkelti pasirinktą šabloną į normalius ląstelių kultūros gaubtus, naudodami įprastą garinimo sistemą, pagrįstą metalinio taikinio elektronų pluošto nusėdimu (EBD) (1b pav.). Norėdami rasti metalo ir plėvelės storį, kuris lengviausiai atpažino modelius, naudodamas arba mikroskopinę technologiją, mes išbandėme auksą, titaną ir cirkonį, kurie visi yra biologiškai suderinami ir palaiko ląstelių sukibimą ir augimą 12, 13 . Geriausi rezultatai gauti naudojant 70 nm storio aukso sankaupas, 100 nm storio titano indėlius arba 100–150 nm storio cirkonio indėlius (papildomas 3c pav.), Nors visi aprašyti eksperimentai buvo atlikti naudojant titaną, nes jo yra mažiau brangesni nei kiti metalai, o EBD procesas yra greitesnis (žr. Metodai). Rašytiniai dangteliai buvo sterilizuoti ir funkcionalizuoti prieš sėjant ląsteles, ir paaiškėjo, kad ląstelių gyvybingumui ir tankiui visiškai nedaro įtakos metalų sankaupos po 24–48 valandų auginimo (papildomas 4 pav.). Priklijuotos ląstelės buvo transfekuotos vektoriais, koduojančiais dominančius baltymus ir fluorescencines žymes, o fluorescencinis signalas gyvų ląstelių pogrupyje buvo įgytas mažo padidinimo konokaline mikroskopija, naudojant regėjimo laukus, kuriuose yra modelio koordinatės. Atlikus konfokalinį vaizdą, ląstelės buvo fiksuotos ir apdorotos SEM (žr. Metodai) ir, naudodamiesi etaloniniais žymekliais ant viršelių, mes iškart galėjome identifikuoti tą patį ląstelių pogrupį, gauti aukštesnės skiriamosios gebos SEM vaizdus ir išanalizuoti visus gautus duomenys (1c pav.).

Šis metodas buvo naudojamas patvirtinti ankstesnio tyrimo 14, kuriame aprašytas baltymo 4.1R (pagrindinis membranos citoskeleto struktūrinis elementas) 15, ekspresijos HEK ląstelėse 14, rezultatus. Konfokalinė mikroskopija parodė, kad 4.1R perdėta ekspresija sąlygojo daugybę struktūrinių pokyčių: transfekuotoms ląstelėms buvo būdingas didesnis paviršiaus plotas ir didesnis filopodijos išsikišimas, fenotipas, kuris buvo visiškai atstatytas, kai ICln (daugiafunkcinis citozolinis baltymas) 16 buvo ekspresuotas kartu su 4.1. R (2a pav.). HEK ląstelės buvo transfekuotos vektoriais, turinčiais 4.1R arba ICln koduojančią nukleotidų seką, ir fluorescenciniu baltymu (EGFP arba DsRed), atskirtu IRES seka (žr. Metodus), ir mūsų kvadratinių modelių viršelių naudojimas leido mums išanalizuokite tas pačias fluorescencines ląsteles, išreiškiančias vien tik 4.1R (2b pav.), vien tik ICln arba abu, kartu su 4.1R ir ICln, kurios pirmiausia buvo identifikuotos konokalinės mikroskopijos būdu, o paskui buvo pavaizduotos skenavimo elektroniniu mikroskopu (2c pav.). EM padidinimas ir skiriamoji geba nuosekliai atskleidė reikšmingą ląstelių paviršiaus ploto ir filipodijos tankio padidėjimą (neturintį įtakos jų ilgiui) HEK ląstelėse, kurių ekspozicija buvo didesnė nei 4.1R, o jų nebuvo ląstelėse, kurios kartu ekspresuoja ICln.

Image

a) Konokokiniai vaizdai, parodantys HEK ląstelių, kurios ekspresuoja nurodytus baltymus, morfologiją (rodomas tik EGFP kanalas). Ląstelių, ekspresuojančių vien 4.1R, plotas yra didesnis nei ląstelių, ekspresuojančių vien EGFP ar ICln, arba tų, kurios ekspresuoja ir 4.1R, ir Icln. Masto juosta: 20 μm. (b) CLEM buvo naudojamas tiksliai apibūdinti 4.1R perdėtos ekspresijos įtaką ląstelių morfologijai. HEK ląstelės, prilipusios prie modelinių viršelių, buvo perneštos vektoriais, koduojančiais 4.1R-IRES-EGFP (4.1R) ir tirpiais DsRed (DsRed) (žr. On-line metodus). Ląstelės, išreiškiančios dominantį baltymą, buvo identifikuotos mažo padidinimo konokalinės mikroskopijos matymo laukuose šviesaus lauko ir fluorescencinio vaizdo režimu („Merge“, viršutinė plokštė: mastelio juosta 50 μm). Norint apibūdinti gyvų ląstelių morfologiją, buvo paimti pasirinktos ląstelės didelės skiriamosios gebos z kaminai (didžiausia iškyša parodyta kairiajame apatiniame skydelyje: skalės juosta 10 μm). Tada ląstelės buvo apdorotos SEM, tas pats matymo laukas buvo greitai perkeltas, ir tos pačios ląstelės buvo vaizduojamos mažu padidinimu (dešiniajame viršutiniame skydelyje: mastelio juosta 50 μm), o tada buvo gauti didelio padidinimo vaizdai, kad būtų galima apibūdinti atrinktos ląstelės morfologiškai nanometrų skiriamąja geba (apatinė plokštė: skalės juosta 10 μm; įdėklas 1 μm). c) tipiniai HEK ląstelių SEM vaizdai, išreiškiantys nurodytą baltymą. Vien tik 4, 1R ekspresija (bet ne kartu su 4.1R ir ICln ekspresija) padidino ląstelių plotą, taip pat padidino filopodijų skaičių ir tankį. Mastelio juosta 10 μm.

Visas dydis

Norėdami parodyti, kad mūsų substratai buvo tinkami skirtingų tipų ląstelių augimui ir koreliaciniam vaizdavimui, mes taip pat atlikome CLEM eksperimentus, naudodami fluorescenciškai pažymėtas HeLa ląsteles (3 pav., Papildomas 5b pav.) Ir pirminius žiurkių žievės žievės neuronus (papildomas 5a pav.). ).

Image

a) Vaizdo laukai, kuriuose HeLa ląstelės, ekstensyviai ekspresuojančios tirpias EGFP, augančias modeliuojamame dangtelyje, gautos optinės mikroskopijos (šviesus laukas, fluorescencija ir suma) ir SEM pagalba. Svarstyklės 100 μm. Modelis buvo sukurtas taip, kad jį būtų galima lengvai pamatyti abiem mikroskopais, kad būtų galima greitai perkelti tas pačias ląsteles, kai judama iš vienos į kitą. b) Aukštos skiriamosios gebos optiniai vaizdai (ryškiojo lauko ir didžiausios fluorescencijos projekcijos) ir dviejų (EGFP) išreiškiančių langelių (raudonos spalvos langelio) 3D rekonstrukcija (a punkte). Masto juosta: 10 μm. c) b punkte pažymėtų EGFP ekspresuojančios HeLa ląstelių elektroninių mikroskopinių vaizdų nuskaitymas, parodantis labai išsilaikiusią ultrastruktūrą, gautą atlikus SEM paruošimą, ant raštuoto pagrindo ir aukštos skyros detales, stebimas pakreipus mėginio laikiklį. Svarstyklės 2 μm.

Visas dydis

Čia aprašome prietaiso ir protokolo, leidžiančio atlikti bet kokį koreliacinį vaizdavimo eksperimentą, apimantį šviesos ir skenavimo elektronų mikroskopiją, sukūrimą. Pagrindiniai metodo pranašumai yra šie: 1) galimybė naudoti įvairių formų ir dydžių substratus su visiškai pritaikytais modeliais, specialiai sukurtais konkrečioms ląstelių rūšims ar dominantiems objektams, ir daugybe skirtingų metalų (titano, aukso, cirkonio), tokiu būdu užtikrinant didžiausią eksperimentinį lankstumą; 2) galimybė substratų paviršių funkcionalizuoti skirtingais būdais, atsižvelgiant į naudojamas ląsteles (poli-L-lizinas, fibronektinas, kolagenas ar lamininas); ir 3) galimybė naudoti bet kurį įprastą fluorescencinį / konokalinį mikroskopą ir skenuojantį elektroninį mikroskopą, tokiu būdu išvengiant brangių integruotų mikroskopų 10, 11 . Mūsų etaloninę žymeklių sistemą, kurią nesunkiai galima aptikti naudojant tiek LM, tiek SEM, nesudėtinga sukurti bet kurioje laboratorijoje, kurioje įrengta įprasta metalų nusodinimo sistema, paprasčiausiai uždėjus vieną metalo sluoksnį ant stiklo pagrindo, ir tai leidžia pasirinkti norimą regioną. būti stebimi judant nuo vieno instrumento prie kito, net jei elektroninės mikroskopijos pavyzdžių apdorojimo metu pasitaiko iškraipymų. Visų pirma, kadangi visas piešinys matomas net mažo padidinimo SEM, galima priartinti atitinkamą žymeklį ir per kelias sekundes surasti dominantį langelį. Be to, kadangi dangtelis yra pagrindinis sukibusių ląstelių SEM vaizdavimo substratas, pavyzdį galima paprastai pakreipti ant SEM scenos, kad būtų galima gauti vaizdus norimu žiūrėjimo kampu (3c pav.), O tai leidžia aukštos skiriamosios gebos SEM vaizdai, kurie turi būti dedami 3D rekonstrukcijose, remiantis fluorescenciniais vaizdais, gautais didesniu padidinimu naudojant konfokalinę mikroskopiją (papildomas 5b pav.). Pagrindų medžiagos (stiklo) lūžio rodiklis puikiai atitinka konokalinių mikroskopų šviesos kelią, o nusėdę metalai yra labai stabilūs po SEM elektronų pluoštu, taip užtikrindami geriausios kokybės šviesą ir skenuojančius elektronų mikroskopijos vaizdus, ​​be to, paviršiaus krūvio kaupimasis (po padengimo ir naudojant pagreičio įtampą nuo 1 iki 5 kV, žr. Metodai) yra panašus į tą, kuris susidaro tomis pačiomis vaizdavimo sąlygomis naudojant neapdorotus stiklo gaubtus ir silicį (papildomas 6 pav.). Šių medžiagų pobūdis taip pat garantuoja optimalias ląstelių (ir pirminių neuronų) augimo ir gyvybingumo sąlygas, o modelio nusėdimo procesas neužteršia substrato paviršiaus šiukšlėmis, kurios gali atsirasti, kai naudojami kiti metodai (pvz. „Aclar®“ plėvelė) 7 (papildomas 7 pav.). Galiausiai, norint naudoti mėginio vietą, nereikia naudoti jokios specialios programinės įrangos arba laikiklių ar etapų su patikimumo žymekliais.

Dėl visų šių priežasčių modelinių stiklo dangtelių ir tvirto SEM ląstelių paruošimo protokolo naudojimas yra daug žadanti priemonė atlikti greitus, pritaikomus ir tikslius koreliacinius eksperimentus.

Metodai

Rašto dizainas

Norėdami suprojektuoti geriausius etaloninius žymenis, leidžiančius atpažinti dominančius objektus tiek šviesos, tiek skenavimo elektronų mikroskopu, mes sukūrėme skirtingus modelius, pagrįstus skirtingais tirtų neuronų, HEK ir HeLa ląstelių dydžiais ir morfologija, įskaitant vieną, tinkantį apvaliam fibroblastui. / epitelio tipo ląstelės ir kitas skirtas pailgintoms į neuronus panašioms ląstelėms, kurios abi buvo suprojektuotos sukuriant „AutoCAD®“ elektroninį failą, kurį būtų galima perskaityti kompiuterizuotu skaitmeninio valdymo (CNC) aparatu. Pradėjome nupiešdami vieną šabloną, kuris vėliau buvo pakartotas, kad būtų sukurtas tinklelis, apimantis 10 mm apvalios stiklinės dangtelio centrinę sritį (papildomas 1 pav.), O paskui pakartojome ypatybes užpildydami 10 × 10 kvadratą. cm, atspindinti galutinę trafaretinę kaukę, kurią norėjome panaudoti metalo nusodinimui.

Nerūdijančio plieno trafareto kaukės gamyba ir priežiūra

Kaukę pagamino „Società Italiana per il Chemical Machining“ (San Donato Milanese, Milanas, Italija), kuri lazeriu pjaustė 100 μm storio nerūdijančio plieno pagrindą, kurio nuokrypis yra ± 0, 01 mm. Po kiekvieno naudojimo kaukė kruopščiai plaunama etanoliu (Sigma-Aldrich Co., Sent Luisas, MO, JAV) ultragarso vonioje (Elmasonic S30H, Singen, Vokietija) 10 minučių ir išdžiovinama azotu (N2). Ši valymo procedūra yra svarbi norint išsaugoti savybių dydį ir garantuoti pakartotiną metalo pluošto nusėdimą.

Raštuotų apklotų generavimas naudojant elektronų pluoštą

Prieš nusodinimą stikliniai mikroskopo dangteliai, kurių skersmuo 10, 13, 15 ir 24 mm (VWR International, Milanas, Italija), buvo ultragarsu apdoroti (Elmasonic S30H) etanolyje (Sigma-Aldrich Co.), po to 2-propanolyje (Sigma-Aldrich). Co) 30 minučių ir džiovinamas azotu (N2). Įdėję į dangtelio laikiklį su kauke modelio generavimui (1 pav.), Jie buvo įpilti į įprastą pagal poreikį pagamintą garinimo sistemą ir slėgis nusodinimo kameros viduje buvo padidintas iki 6, 0 × 10 –6 mbar. Sija buvo įjungta ir nustatyta iki 6 kV įtampos, o garinimas buvo pradėtas palaipsniui didinant srovę iki 34 mA - vertės, kuria titanas (grynas 99, 999%, Kurt J. Lesker, Hastings, UK) pradeda tirpti., išgarinkite ir nusodinkite 0, 2 Å / sek greičiu. (tokia pati nusėdimo norma buvo naudojama ir auksui bei cirkoniui, tačiau, atsižvelgiant į skirtingas jų fizines savybes, reikėjo naudoti didesnes sroves (atitinkamai 420 mA ir 165 mA) ir ilgesnį nusodinimo laiką). Plėvelės storis ir nusėdimo greitis buvo kontroliuojami kvarco kristalų monitoriumi. Kai buvo pasiektas norimas storis (titano atveju - 100 nm), spindulys buvo išjungtas, kamera išvėdinta ir substratai buvo nuimti paruošti naudoti koreliaciniams eksperimentams.

Raštuotų viršelių sterilizavimas ir funkcionalizavimas

Prieš sėjant ląsteles, raštuotos dangteliai buvo sterilizuojami viryklėje 180 ° C temperatūroje per naktį ir (arba) plaunami 70% etanoliu ir (arba) 50 minučių veikiami ultravioletinių spindulių, funkcionalizuojami lašeliu 0, 1% poli-L-lizino tirpalo. m / v vandenyje („Sigma-Aldrich Co.“) penkias minutes, po to nuplaunamas distiliuotu vandeniu. Eksperimentams, aprašytiems 6 papildomame paveiksle, silicio substratai 10 minučių buvo sonikuoti acetonu ir izopropanoliu ir sterilizuoti naudojant etanolį ir ultravioletinę spinduliuotę, prieš tai veikiant 1 mg / ml poli-L-lizinu.

Ląstelių kultūros

HeLa arba žmogaus embrioninio inksto (HEK) 293T ląstelės buvo auginamos būtiniausioje Eagle terpėje (EMEM; 12-125F, Lonza © Walkersville, Inc., Walkersville, MD, JAV), papildyta 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS), L- 2 mM glutamino, nepakeičiamų aminorūgščių 0, 1 mM, penicilino 100 V, streptomicino 100 μg / ml ir natrio piruvato 1 mM, ir kultūros buvo palaikomos drėkintame inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2 .

Ląstelės buvo dalijamos kas 3–4 dienas, kai 80–90% susikaupė. Trumpai tariant, mitybinė terpė buvo išmesta, o ląstelių sluoksnis išplautas fosfato buferiniu druskos tirpalu (PBS: NaCl 136, 89 mM, KCl 2, 69 mM, Na 2 PO 4 1, 47 mM, NaOH 10 mM, pH 7, 4), kad būtų pašalinti visi serumo pėdsakai, kuriame yra tripsino inhibitoriaus. Pridėta 0, 25% tripsino-EDTA, ir kultūrinis indas penkias minutes buvo dedamas į inkubatorių 37 ° C temperatūroje, po to buvo pridėta visa auginimo terpė ir ląstelės buvo atskirtos švelniai pipetuojant. Atitinkami ląstelių suspensijos alikvotai buvo įpilti į naujus auginimo indus, ir kultūros buvo vėl inkubuojamos 37 ° C temperatūroje.

CLEM eksperimentams HeLa arba HEK ląstelės buvo pasėtos 160 ląstelių / mm 2 koncentracija ant modelinių dangtelių plokštelių, funkcionalizuotų poli-L-lizinu, ir kultūros buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje iki ląstelių sukibimo.

Po to, kai raštinės dangteliai buvo valomi 100% etanoliu 37 ° C temperatūroje dvi valandas, plauti sterilizuotu H20, penkias valandas kaitinti 180 ° C temperatūroje, funkcionalizuoti 1 mg / ml poli-L-lizinu ir nuplauti vandeniu, Žiurkės hipokampo neuronai buvo pasėti substratuose, kurių koncentracija 160 ląstelių / mm 2, į Dulbecco modifikuotą Eagle terpę (DMEM), papildytą 10% FBS, L-glutaminu 2 mM, neesminėmis aminorūgštimis 0, 1 mM, penicilinu 100 U, streptomicinu. 100 μg / ml ir 1 mM natrio piruvato (visi reagentai buvo įsigyti iš Life Technologies ™, Monza, Italija).

Plazmidės

4.1R-IRES-GFP ir ICln-IRES-dsRED vektoriai 14, išreiškiantys 4.1R135 arba ICln baltymus ir fluorescencinį baltymą kaip du skirtingus polipeptidus, buvo savotiška Dr. Claudia Bazzini (Milano universiteto, Milanas, Italija) dovana. ir atitinkamai prof. Markus Paulmichl (Paracelsus medicinos universitetas, Zalcburgas, Austrija). Tuščia vektoriai: pIRES2-EGFP ir pIRES2-dsREDexpress buvo naudojami kaip kontroliniai.

HEK ir HeLa ląstelės buvo laikinai transfekuotos 24 valandas po sėjimo. Ko-transfekcijos eksperimentuose kiekvienas vektorius transfekcijos mišinyje buvo ekvimoliarus.

Neuronai buvo transfekuoti pEYFP-C1 („Clontech Laboratories, Inc.“ © - St. Germain en Laye, Prancūzija).

Pereinamasis transfekcija

Ląstelių linijos buvo laikinai transfekuotos kalcio fosfato metodu, pridedant 1 μg DNR ir 2, 5 μl CaCl2 2, 5 M (Sigma-Aldrich Co.) kiekvienam 1, 6 cm indeliui ir distiliuotu vandeniu, kad bendras tūris būtų 25 μl. Po penkių minučių į CaCl2 / DNR mišinį švelniai įpilama 25 μl HBS 2 × (NaCl 140 mM, NaHPO 4 1, 5 mM, HEPES 50 mM, pH 7, 05), o po to į ląstelių kultūrą lašinamas transfekcijos mišinys. . Indas buvo perkeltas į inkubatorių esant 37 ° C ir 5% CO2 kiekiui, o po 6–10 valandų terpė buvo pakeista šilta visa terpe ir inkubacija atnaujinta. Neuronai buvo transfekuoti po trijų dienų in vitro (DIV), naudojant 3 μg DNR, ta pačia procedūra, kaip aprašyta ląstelių linijoms, ir pavaizduoti 5 in vitro dieną.

MTT tyrimas

HeLa ląstelės buvo pasėtos esant 600 ląstelių / mm 2 koncentracijai 10 mm stikliniuose dangteliuose arba raštuotuose substratuose, kurie buvo sterilizuoti 70% etanoliu ir 50 minučių ultravioletiniu spinduliu bei funkcionalizuoti poli-L-lizinu 1 mg / ml. Dvidešimt keturias ir 48 valandas po pasėjimo ląstelės buvo inkubuojamos keturias valandas su MTT tirpalu (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromidas, ląstelių proliferacijos rinkinys I, kat. Nr. 11465007001, „Roche Diagnostic GmbH“, Manheimas, Vokietija). Po inkubacijos purpuriniai formazano druskos kristalai buvo ištirpinti pridedant tirpinimo tirpalo ir inkubuojant plokšteles per naktį drėgnoje atmosferoje (37 ° C, 5% CO 2 ). Ištirpintas formazano produktas buvo spektrofotometriškai nustatytas naudojant ELISA skaitytuvą („Tecan Sunrise“, „Tecan Group Ltd.“, Männedorf, Šveicarija). Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas kiekvienu laiko momentu atliekant keturis nepriklausomus kiekvieno substrato eksperimentus.

Konfokalinė mikroskopija

Ląstelių atvaizdai ant raštuotų dangtelių buvo gauti naudojant „Leica TCS SP5“ konfokalinį apverstą mikroskopą („Leica Microsystems GmbH“, Wetzlar, Vokietija) su objektyvu HC PL FLUOTAR 20 × 0, 5 (NA 0, 5), vaizdo elemento dydis 378, 8 × 378, 8 nm, ir nuskaitymo greitis - 400 Hz (maža skiriamoji geba / mažas padidinimas). EGFP sužadino 488 nm lazerio linija, o PMT1 emisijos pralaidumas buvo 500–550 nm; DsRED sužadino 561 nm lazerio linija, o PMT2 emisijos pralaidumas buvo 570–650 nm; EYFP sužadino 514 nm lazerio linija, o PMT2 emisijos pralaidumas buvo 525–600 nm; ir Hoechst branduoliniai dažai buvo sužadinti 405 nm lazerio linija, o PMT1 emisijos juostos plotis buvo 415–455 nm. Ryškių laukų vaizdai taip pat buvo gauti, uždedant fluorescencinius kanalus („ImageJ 1.45“ programinė įranga, Wayne Rasband, NIH, JAV), kad būtų galima vizualizuoti modelį kartu su perkeltomis ir neperkeltomis ląstelėmis ant dangtelio. Gaunant konfokalinį vaizdą, ląstelės buvo gyvos mikroskopo inkubatoriuje (Okolab, Neapolis, Italija), esant 37 ° C ir 5% CO 2 DPBS (PBS, papildytas CaCl 2 1 mM, MgCl 2 0, 5 mM, ir gliukozės 25 mM)., pH 7, 4).

Didelės skiriamosios gebos vaizdai 3D rekonstrukcijai buvo gauti naudojant HCX PL APO 63 × 1.4 (NA 1.4) objektyvą, 988 × 98, 8 nm taškų dydį ir 250 nm „z“ žingsnį, naudojant tuos pačius parametrus kaip ir. aprašytieji aukščiau. 3D vaizdai buvo sukurti naudojant „UCSF Chimera“ paketą iš Biokompiuterių, vizualizacijos ir informatikos šaltinio Kalifornijos universitete, San Fransiske (palaikoma NIH P41 RR-01081) (papildoma nuoroda).

Ląstelių adhezijos analizė

HeLa ląstelės buvo pasėtos 600 ląstelių / mm 2 koncentracija ant 10 mm stiklinių dangtelių ar raštinių substratų, kurie buvo sterilizuoti 70% etanoliu ir 50 minučių ultravioletinės spinduliuotės bei funkcionalizuoti 1 mg / ml poli-L-lizinu. Dvidešimt keturias ir 48 valandas po sėjimo ląstelės 30 minučių buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu PBS, praplaunamos PBS, inkubuojamos su Hoechst 33342 0, 01 mg / ml (H1399, Molecular Probes®, Life Technologies Europe BV, Monza, Italija). ) 30 minučių ir įdėtas į 90% glicerolio. Ant substrato išaugusių ląstelių tankis buvo įvertintas kiekvienu laiko momentu atliekant keturis nepriklausomus kiekvieno substrato eksperimentus, suskaičiavus ląstelių branduolių tankį regėjimo lauke (775 × 775 μm), įgytą naudojant konokalinio mikroskopo 20 × objektyvą, naudojant „ImageJ“ programinė įranga. Buvo užfiksuoti tiek ryškūs lauko, tiek fluorescenciniai vaizdai.

SEM mėginio paruošimas

Ląstelės buvo apdorotos SEM vaizdavimui iškart po konokalinio vaizdo gavimo. Jie vieną valandą buvo fiksuojami 1, 2% glutaraldheydu 0, 1 M NaCacodylate naCacodylate, 10 minučių plaunami tris kartus 0, 1 M NaCacodylate ir vieną valandą po to pritvirtinami 1% osmio tetroksidu (OsO 4 ) 0, 1% NaCacodylate. Pašalinus OsO 4 tirpalą ir du kartus praplaunant distiliuotu vandeniu, mėginiai buvo palaipsniui dehidruojami etanolio serijomis, o po to džiovinami naudojant Emitech K850 kritinio taško džiovintuvą (Bad Schwalbach, Vokietija) arba heksametildisilazaną (HMDS). Visi reagentai buvo įsigyti iš Electron Microscopy Sciences (EMS, Hatfield, PA, JAV). Išdžiūvę mėginiai buvo apipurkšti auksu („Polaron E5100 Sputter Coater“, Bad Schwalbach, Vokietija), o atvaizdai buvo gauti 1–5 kV įtampoje, naudojant lauko emisijos pistoleto skenavimo elektroninį mikroskopą (Ξigma, Zeiss, Oberkochen, Vokietija) su antriniu. elektronų detektorius (SE1). Mėginiai eksperimentams, aprašytiems 6 papildomame paveiksle, buvo pavaizduoti prieš aukso padengimą ir po jo, kaip aprašyta aukščiau.

„Aclar®“ modelio substrato, skirto CLEM, generavimas

Ant „Aclar®“ plėvelės, naudojant impulsinio mikroskopo 7 impulsinį lazerį (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Vokietija), buvo pavaizduotas modelis su koordinatėmis, sudarytomis iš asimetrinio maždaug 140 μm kvadratų tinklo. Prieš sėjant ląsteles, kiekvienas 10 mm ilgio „Aclar®“ diskas buvo sterilizuotas naudojant 70% etanolį ir UV spinduliuotę 50 minučių, o po to funkcionalizuotas poli-L-lizinu. Ląstelės buvo kultivuojamos ir transfekuojamos, kaip aprašyta aukščiau.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    papildomi skaičiai

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.