Cxcr2 turinčioms pelėms pasireiškia nuo makrofagų priklausomas perdėtas ūmus uždegiminis atsakas | mokslinės ataskaitos

Cxcr2 turinčioms pelėms pasireiškia nuo makrofagų priklausomas perdėtas ūmus uždegiminis atsakas | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ūmus uždegimas
  • Chemokines
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2017 m. Balandžio 10 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

CXCR2 yra svarbus neutrofilų pritraukimo į uždegimas ir pažeistas vietas reguliatorius ir vaidina svarbų vaidmenį sergant uždegiminėmis patologijomis ir vėžiu. Todėl jis buvo pabrėžtas kaip svarbus terapinis taikinys. Tačiau terapinio CXCR2 taikymo sėkmei gresia santykinis žinių trūkumas apie tikslų jo veikimo būdą in vivo . Čia parodome, kad pelėms, kurių organizme trūksta CXCR2, pasireiškia priešintuzinis trumpalaikis perdėtas uždegiminis atsakas į odos ir pilvaplėvės uždegimo dirgiklius. Abiejose situacijose tai yra susijusi su sumažėjusia citokinų ekspresija, susijusia su uždegiminio atsako išsiskyrimu, ir makrofagų kaupimosi padidėjimu uždegiminėse vietose. Analizė, naudojant neutrofilų išeikvojimo strategijas, rodo, kad tai yra sutrikusios neneutrofilinės CXCR2 teigiamos leukocitų populiacijos įdarbinimas. Mes siūlome, kad šios ląstelės gali būti mieloidinės slopinančios ląstelės. Taigi mūsų duomenys rodo naujus ir anksčiau nenumatytus CXCR2 vaidmenis organizuojant uždegiminį atsaką.

Įvadas

Chemokinų šeimą sudaro apytiksliai 45 struktūriškai susiję baltymai, kurie kartu su giminingais G-baltymų jungiamaisiais receptoriais (GPCR), ekspresuojamais cirkuliuojančiose 1 ląstelėse, tarpininkauja in vivo migracijai ir leukocitų 2, 3 įdarbinimui. Apskritai chemokinus ir jų receptorius galima apibūdinti kaip uždegiminius ar homeostatinius atsižvelgiant į kontekstą, kuriame jie veikia 4, 5 . Uždegiminiai chemokinai vaidina specifinį vaidmenį leukocitų migracijos choreografijoje, reaguodami į uždegiminius ar infekcinius dirgiklius, tačiau tikslūs atskirų chemokinų ir jų receptorių funkciniai vaidmenys šiame sudėtingame procese išlieka menkai apibrėžti. Nenuostabu, kad uždegiminiai chemokinai ir jų receptoriai yra pagrindiniai įvairių imuninių ir uždegiminių patologijų veiksniai. Jie taip pat vaidina pagrindinius vaidmenis tumourigenesis 6, 7, 8, 9 . Apskritai, uždegiminė chemokino / receptorių sistema yra svarbus terapinis taikinys, nors bandymai sukurti terapiškai naudingus chemokino receptorių antagonistus iki šiol buvo pasiekiami ypač ribotai 10, 11 . Yra daugybė galimų priežasčių, iš kurių viena yra mūsų šiuo metu menkai išplėtotas supratimas apie uždegiminės chemokinų / receptorių sistemos sudėtingumą ir jos vaidmenį reguliuojant uždegimą. Mes tvirtiname, kad norint, kad chemokino receptorių antagonistai galėtų būti efektyviai naudojami kaip terapiniai agentai, reikia aiškiau suprasti šią sistemą.

Nepaisant bendro sėkmės trūkumo, vienas perspektyvus taikinys, kurio šiuo metu siekiama, yra neutrofilų išreikštas chemokinų receptorius CXCR2, kuris, kartu su savo ligadais CXCL1–3 ir CXCL5–8, reguliuoja neutrofilų įsisavinimą daugelyje patologinių aplinkybių 12, 13 . Taigi tai yra perspektyvus terapinis taikinys, pavyzdžiui, sergant LOPL ir kitomis neutrofilinėmis uždegiminėmis patologijomis. Be to, naujausi eksperimentiniai duomenys pabrėžė svarbų CXCR2 vaidmenį formuojant ir palaikant vėžį 8 . Tiksliau, nukreipus CXCR2, buvo slopinamas uždegiminis odos ir žarnyno augliogenezė 14, sumažėjo spontaninės adenokarcinomos susidarymas žarnyne 14, sumažėjo ūminė mieloidinė leukemija 15, sumažėjo uždegiminė žarnyno liga 16, nosiaryklės karcionoma 17 ir rabdomiosarkoma (kartu su anti-PD1). 18 . Atitinkamai, mažų molekulių CXCR2 antagonistai yra aktyviai tiriami dėl galimo priešvėžinio poveikio in vivo .

Šiame tyrime išsamiai apžvelgėme CXCR2 delecijos įtaką uždegiminio atsako kinetikai. Dabar mes pranešame apie priešintuitinį trumpalaikį uždegiminio atsako padidėjimą pelėms, kurioms trūksta CXCR2, esant odos ir pilvaplėvės uždegimo modeliams. Šis fenotipas buvo susijęs su padidėjusiu makrofagų kaupimuisi pelių uždegimo vietose CXCR2 trūkumu ir buvo priklausomas nuo CXCR2 sąlygojamo slopinamųjų ląstelių populiacijos įdarbinimo ūmiai uždegimo aplinkoje. Mes hipotezuojame, kad šios ląstelės gali būti mieloidinės slopinančios ląstelės. Apibendrinant, mūsų tyrimas atskleidžia naują CXCR2 vaidmenį ribojant nuo makrofagų priklausomo uždegiminio atsako dydį.

Rezultatai

Pelėms, kurioms trūksta CXCR2, pasireiškia per didelis odos uždegiminis atsakas

Iš pradžių mes hipotezavome, kad pelėms, kurių organizme trūksta CXCR2, sumažės uždegiminis atsakas į forbolesterio TPA dėl pagrindinio vaidmens, kurį CXCR2 atlieka neutrofilų migracijoje. Norėdami tai patikrinti, mes išmatuojome bendrą odos storį (pakaitinį uždegimo žymeklį), naudodami apkabas. Įdomu tai, kad ramybės būsenos odos storio matavimas parodė, kad CXCR2 neturinti oda yra žymiai plonesnė nei WT oda (1ai pav.). Tai įvyko ne dėl odos ar epidermio storio skirtumų, bet dėl ​​pastebimo poodinio riebalinio sluoksnio storio sumažėjimo (1 pav. Iaii). Atsižvelgiant į tai, kad vidutinis riebalinio sluoksnio storio skirtumas buvo 75 μm, o 2 odos storiai buvo išmatuoti naudojant slankmačius, šis lipnumo skirtumas visiškai atspindi ramybės skirtumus visame odos storyje. Nepaisant šių ramybės skirtumų, mūsų duomenys rodo, kad praėjus 48 valandoms po TPA pritaikymo CXCR2 turinčių pelių apatinei nugaros odai, odos storis žymiai padidėjo, palyginti su WT pelių (1 pav., Ii), rodančiomis padidėjusį uždegimą. Tai patvirtino hematoksilino ir eozino dažymas. Svarbu tai, kad šis laiko momentas yra atidėtas, palyginti su šio modelio neutrofilų įsiskverbimo į odą piko metu (6–24 val.) 14 . Bendras nudažytų pjūvių vaizdas (1b pav.) Parodė, kad nors 24 ar 72 valandos WT ir CXCR2 trūkumo odos storis akivaizdžiai nesiskyrė, 48 valandas po TPA taikymo CXCR2 neturinti oda buvo žymiai storesnė nei WT. (1bii pav.). Tai buvo išmatuota sistemingai matuojant epidermio ir odos storį 48 valandas po TPA taikymo (1c pav.). Šie duomenys parodė panašų, nuo WPA ir CXCR2 turinčių pelių epidermio storio padidėjimą, priklausomą nuo TPA (1ci pav.), Tačiau žymiai didesnis dermos skyriaus storio padidėjimas CXCR2 trūkumu turinčiose pelėse, palyginti su WT pelėmis (1 pav. 1cii), kuris buvo trumpalaikis ir praėjo 72 valandomis (1ciii pav.).

Image

a) Pelių (i) ramybės arba (iii) TPA apdorotų (48 val.) laukinio tipo ar CXCR2 trūkumą turinčių pelių odos nugaros odos storis buvo matuojamas slankmačiais, o ramybės būsenos odos riebalinio sluoksnio storis (ii) buvo skaitmeniškai išmatuotas mikroskopu hematoksilinu ir eozinu dažytos odos dalys. (b) Pelių, kurioms trūko WT ir CXCR2, trūkinta oda, gydoma TPA (i) 24, (ii) 48 arba (iii) 72 valandas, buvo padalinta į dalis ir nudažyta hematoksilinu bei eozinu ir nufotografuota naudojant šviesos mikroskopiją. c) Nudažytos odos dalys, surinktos praėjus 48 valandoms po nešiklio ar TPA apdorojimo, buvo išanalizuotos i) epidermio ir ii) odos storiui nustatyti. iii) odos storis taip pat parodytas iš pjūvių, surinktų per TPA taikymo laikotarpį. a ir ciii: Duomenys pateikiami kaip vieno eksperimento, atlikto su 3–6 pelėmis, vidurkis (± SEM), reprezentuojantis bent du nepriklausomus eksperimentus * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 kaip nustatomas naudojant Studentų T testą. Ci ir Cii: Duomenys pateikiami kaip dviejų eksperimentų, atliktų su 4–7 pelėmis, vidurkis (± SEM) * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, nustatyti naudojant pakartotinių matavimų ANOVA analizę su Tukey post specialusis testas.

Visas dydis

TPA sukelia epidermio hiperproliferaciją ir dauginančių leukocitų antplūdį. Odos pjūvių dažymas pagal Ki67 parodė padidėjusį epidermio proliferaciją pelėms, kurioms buvo WT ir CXCR2 trūkumas, visais tirtais laiko momentais, kai smarkiai padidėjo reziduojančių odos ląstelių proliferacija, praėjus 48 valandoms po TPA taikymo selektyviai pelėms, kurioms trūko CXCR2 (papildomas pav. 1a). Tai buvo įvertinta kiekybiškai (papildomas 1b pav.), Parodant, kad padidėjęs Ki67 + ve dermos ląstelių skaičius pelėse, kuriose trūko CXCR2, įgijo reikšmingumą praėjus 48 valandoms po TPA taikymo. Tai parodė perdėtą odos uždegiminį atsaką pelėms, kurioms trūko CXCR2, o tai taip pat atsispindėjo žymiai padidėjusiame odos nutekėjimo limfmazgių dydyje tiek 48, tiek 72 valandas po TPA taikymo (papildomas 1c pav.). Taigi pelėms, kurių organizme trūksta CXCR2, pasireiškia perdėtos odos uždegiminės reakcijos.

Padidėjęs makrofagų skaičius yra susijęs su perdėtu odos uždegimu pelėms, kurioms trūksta CXCR2

Pažymėtina, kad, kaip buvo pranešta anksčiau, 12 pelių, turinčių CXCR2 trūkumą, pastebimas nedidelis, bet reikšmingas cirkuliuojančių neutrofilų skaičiaus padidėjimas, tačiau kaulų čiulpų gyventojų skaičius nesiskiria (2ai ir ii pav.). Pelėms, kurioms trūko CXCR2, kaulų čiulpų ar cirkuliuojančių ląstelių, turinčių monocitų morfologiją, skaičiaus skirtumų nenustatyta. Atsižvelgiant į nusistovėjusį CXCR2 vaidmenį tarpininkaujant neutrofilų pritraukimui 19, mes ištyrėme neutrofilų skaičių WT ir CXCR2 turinčiose pelių odoje po TPA taikymo. Pjūvio odos mieloperoksidazės dažymas (parodytas 48 valandų odai, 2bi pav.) Patvirtino, kad pelėms, kurioms trūko CXCR2, praėjus 24 valandoms ir 48 valandoms po TPA taikymo žymiai sumažėjo neutrofilų skaičius; Nors pelėse, kurios buvo WT ar CXCR2 ir kurių metu trūko teigiamo dažymo, ramybės būsenoje arba praėjus 72 valandoms po TPA taikymo, jos buvo nedaug, jei tokių buvo (2bii pav.). Tada buvo išanalizuota oda, kad būtų nustatyta MAC2, makrofagų žymeklio 20 (parodyta 48 valandų odai, 2ci pav.) Ekspresija. Tai atskleidė, kad MAC2 + ve ląstelių yra žymiai daugiau CXCR2 trūkumu turinčių ląstelių, palyginti su WT, oda visais laiko momentais, kai matuojama ir pasiekia piką 48 valandas po TPA taikymo. Kiekybiškai įvertinus makrofagų skaičių, nustatyta, kad odoje, kuriai trūksta CXCR2, didelis makrofagų antplūdis buvo stebimas, tuo tarpu per šiuos laiko tarpsnius WT odoje dažymas nedaug pasikeitė (2cii pav.). Galiausiai, atlikus tų pačių pjūvių odos mėginių „Astra blue“ (stiebo ląstelių dėmė 21 ) analizę, 48 valandas po TPA taikymo pelių ląstelių skaičius vidutiniškai padidėjo, palyginti su WT pelėmis (2 pav. 2di). Vėlgi, nedaug, jei tokių buvo, padidėjo stiebo ląstelių buvimas analizuojamais laiko tarpais WT pelių odoje (2dii pav.), O aukštesni pradiniai stiebo ląstelių lygiai ilsintose CXCR2 turinčiose odos vietose rodo, kad bendras uždegimas turėjo mažas poveikis abiejų kamienų stiebo ląstelių skaičiui. Taigi pelių, turinčių CXCR2 trūkumą, uždegiminis fenotipas daugiausia koreliuoja su makrofagų (MAC2 +) ir neutrofilų nebuvimu.

Image

(a ) Cytospin analizė buvo naudojama neutrofilų ir monocitų tipo ląstelių kiekiui nustatyti pelių, sergančių WT ir CXCR2, i) kraujo ar ii) kaulų čiulpuose. Pelių, gautų WT ar CXCR2, kurių TPA buvo apdorotos (surinktos 48 valandas po TPA taikymo), odos pjūviai buvo nudažyti ir išanalizuoti, norint išmatuoti (bi) mieloperoksidazės + ve ląstelių, (ci) MAC2 + ve ląstelių arba (di) stiebo ląstelių kiekį Šių ląstelių tipų kaupimosi kinetika parodyta (0, 24, 48 ir 72 valandas po TPA taikymo) bii, cii ir dii . Duomenys pateikiami kaip vieno eksperimento, atlikto su 3–6 pelėmis, vidurkis (± SEM), reprezentuojantis bent du nepriklausomus eksperimentus * P <0, 05, ** P <0, 01, nustatyti naudojant Studentų T testą.

Visas dydis

Uždegtoje CXCR2 deficito odoje yra sumažėjęs priešuždegiminis ir padidėjęs priešuždegiminis citokinų kiekis

Toliau mes taikėme multipleksavimo metodus, norėdami išmatuoti pro- ir priešuždegiminių citokinų koncentraciją WT ir CXCR2 trūkumų turinčių pelių uždegiminėse vietose. Odos mėginiai buvo imami praėjus 24, 48 ir 72 valandoms po TPA uždėjimo, ir baltymai buvo ekstrahuoti sumalant šlifuojant skystu azotu. Pakartotinės analizės duomenys atskleidė keletą reikšmingų skirtumų tarp pelės odos, kurioje nėra WT ir CXCR2, tačiau jos buvo aptiktos 3a pav. (24 valandos), b (48 valandos) ir c (72 valandos). Šie duomenys rodo, kad TGF-β liko neaptiktas CXCR2 turinčių pelių odoje 24 val., Palyginti su WT, 24 val., O lygis išliko slopinamas 48 val. Naudojant IL-10, kitą priešuždegiminį citokiną, pelių, kurių WT ir CXCR2 trūkumas, koncentracija 24 val. Nebuvo reikšmingai skirtinga (duomenys nepateikti), tačiau praėjus 48 val. Po TPA vartojimo, IL buvo maždaug 5 kartus mažesnis. -10 pelėms, kurių trūksta CXCR2, palyginti su WT. Praėjus 72 valandoms po TPA taikymo, tiek IL-10, tiek TGF-β lygiai buvo palyginami laukinio tipo ir CXCR2 trūkumu pasižyminčioje pelių odoje ir aukštesni nei ankstesniais laiko momentais, atsižvelgiant į vykstantį uždegiminio atsako išsiskyrimą. Priešingai, CXCR2 pelės odoje, kuriai nebuvo odos, praėjus 24 valandoms po TPA taikymo, buvo žymiai daugiau IL-1α, nors 48 valandas ji nebuvo palaikoma. Be to, skirtingai nuo WT pelių, CXCR2 ligandą CXCL1 buvo galima lengvai aptikti CXCR2 turinčiame pelės odoje ir per 24, ir 48 valandas. Tai sutinka su ankstesnėmis išvadomis, leidžiančiomis manyti, kad receptoriaus chemokino ligando dažnai aptinkama didesniame lygyje, jei jo nėra, nes trūksta 22, 23 . Apskritai, šie atradimai rodo, kad sumažėjęs priešuždegiminių citokinų ir padidėjęs priešuždegiminių citokinų kiekis gali prisidėti prie per didelio odos uždegimo pelėms, kurių organizme trūksta CXCR2.

Image

Oda buvo nuimta ir užšaldyta per (a) 24 valandas, b) 48 valandas arba c) 72 valandas po TPA uždėjimo ant WT arba CXCR2 trūkumų turinčių pelių odos. Tada audiniai buvo sumalami skystame azote, pakartotinai suspenduoti PBS ir išanalizuoti naudojant multipleksinį citokinų ir chemokinų rinkinį. Duomenys pateikiami kaip vieno eksperimento, atlikto su 3 pelėmis, vidurkis (± SEM), reprezentuojantis du nepriklausomus eksperimentus. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, nustatytas naudojant Studentų T testą.

Visas dydis

Pelėms, kurioms trūko CXCR2, padidėjo pilvaplėvės uždegiminiai atsakai

Norėdami išsiaiškinti, ar pelių, kurių organizme trūksta CXCR2, uždegiminiai pokyčiai būdingi tik odos uždegimui, mes toliau analizavome pilvaplėvės uždegiminį atsaką į zymosan injekciją. Šis atsakas buvo matuojamas praėjus 48 valandoms po zimozano vartojimo, po šio modelio neutrofilų įsisavinimo piko 24, kad būtų galima palyginti su odos uždegiminio modelio stebėjimais. Po citocentrifugavimo atliktas pilvaplėvės plovimo morfologinis tyrimas (4a pav.) Atskleidė žymiai didesnį uždegiminių ląstelių tankį pilvaplėvės ertmėje, esant CXCR2 trūkumui, palyginti su pelėmis, turinčiomis WT. Kiekybinė šių 'citospinų' ląstelių analizė parodė, kad, palyginti su WT, žymiai sumažėjo santykinio (4b pav.) Ir bendrojo (4c pav.), Neutrofilų skaičius ir vėl žymiai padidėjo makrofagų skaičius CXCR2 trūkumu. pelės pilvaplėvės eksudatas (4bi pav.). Išsamesnė specifinės ląstelių morfologijos analizė, kaip ir tikėtasi, atskleidė reikšmingą neutrofilų infiltrato sumažėjimą pelėse, kuriose trūksta CXCR2 (4bii pav.), Kartu su kuklesniu limfocitų ir eozinofilų skaičiaus sumažėjimu (4biii ir iv pav.) . Ir vėl, atsižvelgiant į odos analizės duomenis, labai padidėjo makrofagų, esančių pilvaplėvės ertmėje, skaičius iš pelių, kurioms trūko CXCR2 (4bv pav.), Ir taip pat padidėjo stiebo ląstelių dalis ( 4bvi pav.). Tas pats modelis tarp ląstelių buvo pastebėtas analizuojant kaip santykinį procentą (4b pav.) Ir kaip bendrą ląstelių skaičių viename regėjimo lauke (4c pav.). Šie diferenciniai skaičiai buvo patvirtinti atliekant pilvaplėvės plovimo ląstelių turinio citometrinę analizę (pavyzdžių brėžiniai parodyti papildomame 2a pav.), Kurie atskleidė bendro CXCR2 trūkumo pelių, o ypač CD11b + ląstelių, padidėjimą (papildomas 2b pav.). Srauto citometrinė analizė taip pat patvirtino Siglec-F + eozinofilų sumažėjimą pilvaplėvės ertmėje pelėms, kurioms trūko CXCR2.

Image

Zymosan buvo įšvirkštas į pilvaplėvės ertmę pelėms, o po 48 valandų pelės buvo sunaikintos, o pilvaplėvė praplauta PBS. a) Ląstelės buvo citocentrifuguotos ant plokštelių ir atliktos diferencinė analizė, norint nustatyti komponentų ląstelių tipus (vaizdai parodomi padidinant x40). Skaičiai išreiškiami procentine dalimi nuo visų langelių ( b ) arba kaip bendro langelių skaičiaus viename regėjimo lauke (c). Ląstelių skaičius buvo paimtas iš mažiausiai 5 regėjimo laukų viename mėginyje ir nubraižytos (nurodytiems ląstelių tipams) kaip vidurkis (± SEM) iš grupių, kuriose yra mažiausiai 7 pelės. Šie sklypai reprezentuoja du nepriklausomus eksperimentus. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, nustatytas naudojant Studentų T testą.

Visas dydis

Tolesnė įdarbintos perteklinės makrofagų populiacijos CXCR2 trūkumu turinčiame pilvaplėvėje analizė (5a pav.) Atskleidė, kad jie daugiausia yra CD11b + F480 + Ly6Clo. Šių ląstelių skaičius žymiai padidėjo (5b pav.) CXCR2 turinčiame uždegiminiame pilvaplėvėje. Ly6C + ląstelės, palyginti su CXCR2 trūkumu turinčiame pilvaplėvėje, buvo palyginti menkos. Įdomu tai, kad CD11b + F480 + Ly6Clo ląstelės nedavė teigiamo poveikio CCR2 ekspresijai (duomenys neparodyti), o tai kartu rodo, kad jos greičiausiai yra išvestos iš neklasikinio patruliavimo 25, audinių taisymo, monocitų, įdarbintų uždegimo vietoje. Šiuos duomenis dar labiau patvirtina mūsų duomenys, rodantys, kad CXCR2 turinčiame pilvaplėvėje žymiai padidėja CD11b + F480 + CD206 + makrofagų skaičius ir dalis (5c ir d pav.). Šie makrofagai tradiciškai buvo apibūdinami kaip alternatyviai aktyvuoti (M2) ir dar rodo šios populiacijos pasisukimą per uždegiminį atsaką CXCR2 pelėms, neturinčioms nieko. Taigi pelėms, kurioms trūksta CXCR2, pasireiškia perdėtas uždegiminis atsakas į pilvaplėvės zimozano vartojimą, kuriam būdingas padidėjęs makrofagų kaupimasis su „patruliuojančiu, audinių taisymo“ fenotipu.

Image

Zymosan buvo įšvirkštas į pilvaplėvės ertmę pelėms, po 48 valandų pelės buvo išpjaustytos, o pilvaplėvė praplauta PBS, o ląstelės buvo nudažytos antikūnais prieš nurodytus epitopus ir išanalizuotos naudojant srauto citometriją. nurodytas papildomoje informacijoje), tada buvo įvertinta Ly6C (A) ir CD206 (C) ekspresija. Kiekybiniai duomenys iš Ly6C (B) ir CD206 (D) srauto citometrinių vertinimų. Duomenys pateikiami kaip vidurkis (± SEM) iš grupių, kuriose yra bent 7 pelės. ** P <0, 01, *** P <0, 001, kaip nustatyta naudojant Studentų T testą.

Visas dydis

Analizuojamas mechaninis fenotipo pagrindas

Anksčiau keli tyrimai parodė svarbų apoptozinių neutrofilų vaidmenį sukeliant priešuždegiminius atsakus per sąveiką su makrofagais 27, 28 . Todėl mes hipotezavome, kad padidėjęs uždegimas, pastebėtas pelėms, kurių organizme trūksta CXCR2, buvo tiesioginė sumažėjusio neutrofilų skaičiaus padidėjimo ir nuo makrofagų priklausomo priešuždegiminio citokinų išsiskyrimo pasekmė. Todėl mes tiesiogiai išbandėme apoptozinių neutrofilų poveikį makrofagų „skiriamosios galios“ fenotipui. Neutrofilams gauti buvo naudojami intraperitoniniai tioglikolato injekcijos būdai, kurie vėliau buvo per naktį brandinami, kad sukeltų apoptozę. Uždegiminiai makrofagai taip pat buvo renkami iš pelių, kurių tioglikolatu stimuliuojamas WT ir CXCR2 trūkumas, pilvaplėvės. Pasenę neutrofilai ir išgryninti makrofagai po to buvo kultivuojami 24 valandas, o ląstelės buvo atskirtos ir analizuojamos, kad būtų išskiriama išsiskyrusio citokino IL-10. Šių bendro inkubavimo eksperimentų terpių ELISA analizė patvirtino, kad IL-10 ekspresija padidėjo, kai makrofagai buvo inkubuojami kartu su neutrofilais, ir tai buvo matoma tiek su WT, tiek su CXCR2 turinčiais makrofagais. Apoptoziniai neutrofilai vien tik inkubuojant negamino IL-10 (duomenys nepateikti). Šie duomenys patvirtina, kad makrofagai, kurių organizme trūksta CXCR2, gali visiškai gaminti priešuždegiminius citokinus, kartu augindami apoptozinius neutrofilus, ir rodo, kad sumažėjęs IL-10 susidarymas uždegiminėse vietose CXCR2 turinčiose pelėse gali būti susilpnėjusio neutrofilų skaičiaus padidėjimas. ir vietinė sąveika su makrofagais.

Image

( A) Pelių iš WT ir CXCR2 trūkumų bei WT amžiaus neutrofilų, išgrynintų iš tioglikolato sušvirkštų pelių pilvaplėvės, makofagai buvo inkubuojami atskirai arba kartu inkubuojami 24 valandas. Kultūrinės terpės buvo analizuojamos naudojant Elisa IL-10 baltymų kiekį. Trimis egzemplioriais pavaizduota kaip vieno eksperimento vidurkis (± SEM). ** P <0, 01; *** P <0, 001, nustatytas naudojant pakartotinių matavimų ANOVA analizę su Tukey post hoc testu. ( B) Kontrolinis arba anti-Ly6G antikūnas (500 μg) buvo įšvirkštas į pelės pilvaplėvę (norint pašalinti neutrofilus) 24 valandas prieš ir po zimozano (1 mg) injekcijos. Praėjus 48 valandoms po zymosan injekcijos, pelės buvo sunaikintos, o pilvaplėvė praplauta PBS, o gautas plovimas buvo analizuojamas naudojant srauto citometriją pagal nurodytus epitopus. C) Kiekybiniai srauto citometrinio įvertinimo duomenys. Duomenys pateikiami kaip vidurkis (± SEM) iš grupių, kuriose yra bent 4 pelės. * P <0, 05, *** P <0, 001, kaip nustatyta naudojant Studentų T testą.

Visas dydis

Norėdami oficialiai pasakyti apie sutrikusį neutrofilų įsisavinimą pagal fenotipą, apie kurį pranešėme, mes atlikome papildomus eksperimentus, kurių metu prieš intraperitoninį zymosano vartojimą WT pelėse panaudojome anti-Ly6G antikūną, kad pašalintume cirkuliuojančius neutrofilus WT pelėse. Kaip parodyta 6b pav., C, šis antikūnas iš esmės panaikino neutrofilų (Ly6G +) populiaciją. Tačiau, skirtingai nuo duomenų, gautų naudojant CXCR2 turinčias peles, WT pelių neutrofilų išeikvojimas iš tikrųjų apsunkino makrofagų įdarbinimą į pilvaplėvę. Visi šie duomenys rodo, kad stebimo fenotipo pagrindas atrodo labiau susijęs su susilpnėjusios alternatyvios CXCR2 + ve leukocitų populiacijos įdarbinimu, nei su mažesniu apoptozinių neutrofilų įsisavinimu iš makrofagų. Mes siūlome, kad šią alternatyvią CXCR2 + ve populiaciją galėtų sudaryti mieloidinės slopinančios ląstelės 29 . Šiuo atžvilgiu pažymėtina, kad monocitiniai MDSC (M-MDSCs 30 ) priskiriami Ly6CHi 31, 32 kategorijai ir kad LyXCHi mieloidinių ląstelių populiacijoje WT pilvaplėvėje trūksta CXCR2 trūkumo pilvaplėvėje (žr. 5a pav., Viršutiniai vartai). .

Diskusija

Atsižvelgiant į tebevykstančius bandymus nukreipti CXCR2 į uždegimines ligas ir vėžį 8, 15, 18, akivaizdu, kad svarbu gerai suprasti ir apibūdinti šio receptoriaus vaidmenį uždegiminiame atsake. Nors mūsų duomenys pakartoja CXCR2 svarbą palaikant neutrofilų pritraukimą į uždegimines vietas, tai taip pat atskleidžia anksčiau nenumatytą vaidmenį kontroliuojant nuo makrofagų priklausomo uždegiminio atsako dydį. Konkrečiai kalbant, mūsų duomenys rodo, kad pelėms, kurių pienas ir pilvaplėvė yra CXCR2 trūkumas, būdingas didelis neutrofilų, esančių uždegimo vietoje, sumažėjimas ir atitinkamai padidėjęs makrofagų skaičius. Makrofagų skaičiaus didėjimo greitis, ypač zymosano modelyje, rodo, kad tai nėra vien tik padidėjusio vietinio proliferacijos pasekmė ir greičiausiai iš esmės priklauso nuo šių ląstelių pritraukimo de novo į uždegiminę vietą. Tai lemia trumpalaikį perdėjimą. uždegiminio atsako abiejose vietose tam tikrais momentais po neutrofilų įsisavinimo piko 14, 21, 24, 33 . Odoje tai ypač atspindi padidėjęs bendras odos storis, kuris paaiškinamas vien tik padidėjusiu odos sutirštėjimu. Mes nepastebėjome epidermio sustorėjimo ir aiškinome tai kaip T ląstelių nedalyvavimo šioje reakcijoje pasekmę, nes anksčiau buvo įrodyta, kad T ląstelės yra svarbios sukeliant epidermio sustorėjimą TPA sukelto uždegimo metu 21, 34 .

Mes pasiūlėme dvi hipotezes, kad paaiškintume savo pastebėjimus. Pirmiausia, esant uždegimui, neutrofilų įsisavinimas vyksta prieš makrofagų pasikartojimą 33, 35, o apoptozinių neutrofilų sąveika su vėliau pasamdytais makrofagais inicijuoja uždegiminį atsaką36. Atitinkamai pastebimas sumažėjęs neutrofilų skaičiaus padidėjimas pelėse, kuriose trūksta CXCR2, gali prisidėti prie sutrikusio pro-skiriamųjų veiksnių indukcijos įdarbintose makrofaguose. Tačiau eksperimentai, atlikti naudojant neutrofilus ardančius antikūnus, parodė, kad paprasčiausias neutrofilų įsisavinimo nebuvimas nepaaiškina stebėtų fenotipų. Pelės, kuriose neutrofilai buvo sistemingai išsekę, makrofagų pritraukė mažiau, o ne per daug. Tai leido mums daryti išvadą, kad pagrindinis CXCR2 vaidmuo ribojant uždegimą yra susijęs su jo raiška neneutrofilų tipo ląstelėse. Potencialus kandidatas į tokias ląsteles yra mieloidų sukeliamos slopinančios ląstelės 29, o jų vaidmenį stebėtuose fenotipuose taip pat rodo specifinis Ly6Chi monocitinių ląstelių populiacijos sumažėjimas 31, 32 kartu su padidėjusia pro-skiriamųjų citokinų, tokių kaip TGFβ ir IL-10 37 pelėms, kurioms trūko CXCR2.

Mūsų duomenys iš esmės sutampa su ankstesniais tyrimais, rodančiais uždelstą žaizdų gijimą CXCR2 turinčiose pelėse, susijusias su sumažėjusiu TGF-β lygiu ir padidėjusiu monocitų įsisavinimu vėlesniais laiko momentais 38, 39 . Tačiau mūsų duomenys akivaizdžiai prieštarauja daugeliui kitų tyrimų, įrodančių sumažėjusį ūmų uždegiminį atsaką pelėms, kurioms trūksta CXCR2 40 . Tai aiškinama kaip pakitusio neutrofilų įsiskverbimo pasekmė. Tačiau šie tyrimai apžvelgė tik ankstyviausius uždegiminio atsako momentus (paprastai 24 valandas), todėl praleido šiame tyrime nustatytą perdėto uždegimo langą. Tiksliau, mūsų tyrimas atspindi Jamiesono ir kt., 14 pateiktą įrodymą, kad neutrofilų infiltracija į odą, reaguojant į vieną TPA injekciją, po 24 valandų yra didžiausia, ir kad pelėms, kurioms trūksta CXCR2, visais laikais tai žymiai sumažėja. Tačiau, priešingai nei čia aprašyti duomenys, ląstelių kiekis ir bendra odos morfologija nebuvo stebimi vėliau kaip per 24 valandas po vienkartinio TPA taikymo (ūminė fazė) dėl tyrimo dėmesio. Svarbu tai, kad Jamiesono ir jo kolegų tyrimas buvo atliktas naudojant CXCR2 neturinčias peles tame pačiame C57Bl / 6 fone, kaip ir naudojamas šiame tyrime, tokiu būdu įrodinėjant specifinį kamienų poveikį fenotipui. Kiti tyrimai aiškiai parodė teigiamą CXCR2 trūkumo poveikį pelėms, sergantiems lėtiniu uždegimo modeliu 14, 40 . Vis dėlto šie modeliai visada apima pakartotinį uždegiminių dirgiklių paskyrimą ir todėl nėra iš karto palyginami su šiuo tyrimu, kuris stebi vėlesnius uždegiminio atsako momentus, po neutrofilų įsisavinimo piko. Mūsų eksperimentiniai modeliai gali tiksliau pakartoti įprastus ūmius uždegiminius atsakus, kai organizmas patiria vienkartinį stimulą, dėl kurio greitai išnyksta uždegiminis atsakas.

Apibendrinant, šis rankraštis praneša apie anksčiau nenumatytas priešuždegimines CXCR2 delecijos pasekmes ūmioms uždegiminėms reakcijoms. Taigi mūsų duomenys padeda geriau suprasti šio receptoriaus dalyvavimą organizuojant uždegiminį atsaką.

Metodai

Pelės ir uždegimo modeliai

Eksperimentai su gyvūnais buvo atliekami naudojant peles, atitinkančias amžių, pagal gyvūnų priežiūros ir gerovės protokolus, patvirtintus Gyvūnų gerovės ir etikos apžvalgos tarybos Glazgo universitete ir atliktus globojant JK vidaus reikalų ministerijos projekto licenciją. Pelės, turinčios WT C57Bl / 6 ir CXCR2, buvo auginamos „specifiniais patogenais neužkrėstomis“ sąlygomis Beatson vėžinių tyrimų instituto gyvūnų skyriuje. Gyvūnų skaičius atspindi skaičių, kurio reikia norint pateikti patikimus statistinius duomenis apie reikšmingą poveikį. Norėdami sukurti sterilų odos uždegimą, pelės buvo nuskutamos apatinėje nugaros dalyje ir prieš tai nešiojant nešiklį (acetonu) arba 12-O tetradekanoilforbobo 13-acetatu (TPA), kaip aprašyta 21, 34 . Pelės buvo sunaikintos praėjus 24, 48 arba 72 valandoms po panaudojimo, o norimi audiniai buvo išpjaustyti ir ištirti, kaip aprašyta žemiau. Pilvaplėvės uždegimas buvo sušvirkščiamas į 200 μl 5 mg / ml zimozano (iš viso 1 mg) į kiekvienos pelės pilvaplėvės ertmę, po 48 valandų pelės buvo sunaikintos ir pilvaplėvės ląstelių kiekis ištirtas, kaip aprašyta toliau.

Odos storio analizė, dažymas ir histologija

Nuskleista apatinė nugaros oda buvo suspaudžiama kartu, o storis matuojamas apkabais. Odos mėginiai buvo surinkti panaudojus TPA, pritvirtinti formaline, prieš perdirbant ir įterpiant į parafino vašką. Iš kiekvieno mėginio buvo perpjautos 5 μm sekcijos, perkeltos į „SuperFrost“ mikroskopo plokšteles („Thermo Scientific“) ir kepamos 65 ° C temperatūroje 30 minučių. Po to sekcijos buvo pakartotinai hidratuotos ir nudažytos hematoksilinu ir eozino kontrastine danga, dehidratuotos ir pritvirtintos naudojant DPX (Leica). Odos ir epidermio storis iš odos atkarpų buvo aklai matuojamas naudojant „Zen“ programinę įrangą (Zeiss).

Kirkšnies limfmazgių analizė

Kiaulinės dalies limfmazgiai buvo pašalinti, priklijuojami ant „SuperFrost“ mikroskopinių plokštelių („Thermo Scientific“) ir fiksuojami per naktį formaline. Tada mėginiai buvo dehidratuoti ir inkubuojami ksilene, prieš tai pakartotinai hidratuojant ir dažant karmino tirpalu, dehidratuojama ir montuojama DPX. Tada limfmazgiai buvo pavaizduoti naudojant šviesaus lauko mikroskopiją naudojant EVOS mikroskopą (Life Technologies), o limfmazgių užimamas plotas apskaičiuotas pagal atvaizdus, ​​naudojant FIJI programinę įrangą 41 .

Odos uždegiminių ląstelių infiltrato analizė imunocitochemija

Oda buvo apdorota taip, kaip aprašyta aukščiau. Po pakartotinės hidratacijos pjūviai buvo nuplauti PBS, užblokuoti 3% H2O2 (SigmaAldrich) ir 20% ožkos serumu (SigmaAldrich), tada pjūviai buvo nudažyti anti-MAC-2 antikūnais (CedarlaneLaboratories) arba kontroliniu žiurkės izotipu IgG 2a, κ (BD Biosciences) praskiedžiamas 1/6000 PBS, turinčiame 1% BSA (SigmaAldrich), ir inkubuojamas per naktį 4 ° C temperatūroje. Skyriai buvo plaunami prieš pridedant ožkos anti-žiurkės IgG antrinį antikūną (Vector Laboratories) (30 minučių, kambario temperatūra), toliau plaunant PBS, pridedant ekstravidino peroksidazės (Sigma), praskiesto 1/200, PBS, turinčiame 1% BSA (30 minučių). kambario temperatūroje) prieš skalbimą ir signalo plėtrą DAB reagentu (vektorių laboratorijose) ir gesinimą vandentiekio vandeniu. Po to dažytos sekcijos buvo nuplaunamos, nudažytos hematoksilinu, dehidratuotos ir sumontuotos naudojant DPX.

Kaip alternatyva, po vaško pašalinimo ir pakartotinio hidratacijos iki 95% etanolio, jie prieš tai plaunami Astra Blue, ištirpintu 95% etanolyje (1 valanda, kambario temperatūra), prieš plaunant etanolyje, kuriame yra 5% druskos rūgšties, po 1 % Safranino-O (1 minutė, kambario temperatūra), tolesnis plovimas, dehidracija ir montavimas į DPX.

Ki67 ir mieloperoksidazės analizė buvo atlikta Glazgo universiteto Veterinarinės medicinos mokyklos Diagnostikos paslaugų skyriuje, naudojant audinius, apdorotus taip, kaip aprašyta aukščiau.

Aklų ląstelių skaičiavimas buvo atliktas naudojant aklino ryškiojo lauko mikroskopiją nurodytu padidinimu naudojant Zeiss Axiolimager M2, naudojant Zeiss ZEN programinę įrangą.

Odos baltymų kiekio analizė

Odos mėginiai, gauti iš TPA eksperimentų, buvo „užšaldyti“ skystame azote, sumalti ir pakartotinai suspenduoti PBS, turinčiame proteazės inhibitorių (Life Technologies). Tada mėginiai buvo analizuojami naudojant pelės citokinų 20-plex rinkinį (Life Technologies), naudojami pagal nurodymus rinkinyje ir analizuojami Luminex 100 aparatu (Bio-Rad).

Citopsino analizė ir srauto citometrija

Iš pelių, įšvirkštų zymosan, pilvaplėvės ląstelių plovimas buvo suverptas ir išplautas prieš pakartotinę suspensiją FACS buferyje (PBS + 0, 1% BSA). Tada ląstelės buvo suveržiamos ant mikroskopinės plokštelės, naudojant citocentrifugą, prieš dažymą 10% Giemsa tirpalu ir aklųjų ląstelių morfologijos analizę. Alternatyviai, ląstelių suspensijos buvo dažomos fiksuojamais gyvybingumo dažais (eBioscience) ir antikūnais prieš CD11b (eBioscience), F480 (eBioscience), Ly6C (Biolegend), CD206 (Biolegend) ir SiglecF (BD Biosciences) (1/200 FACS buferyje). Tada ląstelių suspensijos buvo plaunamos FACS buferiu ir paleistos MACSQuant analizatoriumi (Miltenyi) ir duomenys apdoroti naudojant FlowJo programinę įrangą (Treestar Inc.).

Makrofagų ir neutrofilų bendra kultūra

Į pelių pilvaplėvę buvo sušvirkšta 1 ml 3% tioglikolilato, o gyvūnai buvo sunaikinti arba po 18 valandų (neutrofilai), arba po 4 dienų (makrofagai). Norint išvalyti neutrofilus, pilvaplėvė praplaunama 5 ml PBS, turinčio 2 mM EDTA, ląstelės buvo atskirtos ir 2 valandas pakartotinai suspenduotos visa mitybinėje terpėje (DMEM su 10% FBS) audinių kultūros kolboje, kad būtų pašalintos lipnios ląstelės. Nelipnios ląstelės (neutrofilai) buvo pašalintos ir pakartotinai suspenduotos iki 5 × 106 ląstelių / ml ir brandinamos per naktį. Neutrofilų preparatų grynumas buvo įprastas> 90%, įvertintas FACS. Makrofagai buvo išskirti tuo pačiu metodu: po inkubacijos audinių kultūros kolboje neprilipusios ląstelės buvo pašalintos, kad liktų prilipę makrofagai (100 000 / duobutėje). Tada jie buvo plaunami ir inkubuojami su senais neutrofilais (200 000 / duobutėje) 12 arba 24 valandas. Kiekviename etape buvo paimti ląstelių mėginiai citospino analizei patvirtinti ląstelių gryninimą. Tuomet kultivavimo terpė buvo pašalinta ir laikoma -80 ° C temperatūroje prieš analizę atlikta naudojant Il-10 ELISA rinkinį, kaip nurodyta (Affymetrix, eBioscience).

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Dyer, DP et al . Pelėms, kurioms trūksta CXCR2, pasireiškia nuo makrofagų paūmėjusios ūmios uždegiminės reakcijos. Mokslas. Rep. 7, 42681; „doi“: 10.1038 / srep42681 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildomas duomenų rinkinys

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.