„dact2“ yra funkcinis naviko slopintuvas, slopinantis wnt / β-katenino kelią ir susijęs su prastu išgyvenimu gaubtinės žarnos vėžiu | onkogenas

„dact2“ yra funkcinis naviko slopintuvas, slopinantis wnt / β-katenino kelią ir susijęs su prastu išgyvenimu gaubtinės žarnos vėžiu | onkogenas

Anonim

Dalykai

  • Kolorektalinis vėžys

Anotacija

Dapper homologas (DACT) 2 yra vienas iš Dact genų šeimos narių, kurie yra svarbūs Wnt signalizacijos kelio moduliatoriai. Mes siekiame išsiaiškinti jo epigenetinį inaktyvavimą, biologinę funkciją ir klinikinę reikšmę storosios žarnos vėžiui. DACT2 buvo nutildytas penkiose iš aštuonių storosios žarnos vėžio ląstelių linijų, bet tvirtai ekspresuojamas normaliuose storosios žarnos audiniuose. DACT2 ekspresijos praradimą reguliavo promotoriaus hipermetilinimas. DACT2 ekspresijos atkūrimas storosios žarnos vėžio ląstelių linijose slopino naviko ląstelių augimą, sukeldamas ląstelių apoptozę ir slopindamas ląstelių dauginimąsi tiek in vitro, tiek in vivo . Be to, per didelis DACT2 ekspresija sumažino plonųjų pelių storosios žarnos vėžio ląstelių metastazes. Šis DACT2 poveikis buvo priskirtas Wnt / β-katenino signalų slopinimui. DACT2 pakartotinis ekspresija reikšmingai slopino laukinio tipo β-katenino ir skilimui atsparios formos mutanto β-katenino (S33Y) transkripcinį aktyvumą. DACT2 galėtų aktyviai įsitraukti į branduolius ir iš jų, vyraujant pastoviajai būklei citoplazmoje, priklausomai nuo branduolio eksporto signalo. Bendro imunoprecipitacijos rezultatai parodė, kad DACT2 stipriai susijęs β-kateninas, taip pat limfoidą stiprinantis faktorius 1 (LEF1) ir tiesiogiai sutrikdė β-katenino – LEF1 komplekso susidarymą branduolyje. Tuo tarpu citoplazmoje DACT2 atkūrė jungiamąją E-kadherino – β-katenino kompleksų lokalizaciją ir užkirto kelią β-katenino branduolio translokacijai tiesioginės sąveikos su β-kateninu metu. DACT2 metilinimas buvo aptiktas 43, 3% (29/67) storosios žarnos vėžio audinių, tačiau normalioje kontrolėje jo nebuvo. Daugybinė kintama analizė parodė, kad pacientams, kuriems buvo metilinta DACT2 , bendras išgyvenamumas reikšmingai sumažėjo ( P = 0, 006). Kaplano ir Meiero išgyvenamumo kreivės parodė, kad DACT2 metilinimas reikšmingai susijęs su sutrumpėjusiu išgyvenamumu I – III stadijos storosios žarnos vėžiu sergantiems pacientams. Apibendrinant galima pasakyti, kad DACT2 veikia kaip funkcinis naviko slopintuvas storosios žarnos vėžyje, slopindamas Wnt / β-katenino signalizaciją. Jo metilinimas ankstyvose storosios žarnos kancerogenezės stadijose yra nepriklausomas prognostinis veiksnys.

Įvadas

Storosios žarnos vėžys yra trečias pagal dažnumą piktybinis navikas visame pasaulyje. 1 Storosios žarnos vėžio vystymasis yra daugelio pakopų procesas, turintis tiek genominę, tiek epigenominę pasipiktinimą. 2 Aberrantinės CpG salos genų metilinės kaupiasi daugiapakopės gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio patogenezės metu. Naujų genų, nutildytų dėl promotoriaus metilinimo, identifikavimas gali išaiškinti naviko slopinamųjų kelių inaktyvavimo mechanizmus, kurie gali suteikti naujų būdų navikų diagnostikai ir terapiniam vertinimui.

Dapper homologas (DACT) 2 yra vienas iš Dact genų šeimos narių, žinduolių, kurie funkciškai ir fiziškai sąveikauja su Wnt signalizacijos keliu stuburinių vystymosi metu. 3 „ Dact“ šeimą sudaro trys nariai, įskaitant DACT1, DACT2 ir DACT3. DACT1, kaip nuo konteksto priklausantis Wnt reguliatorius, galėtų sinergijuoti su „Disheveled“ (Dvl) 2, kad padidintų Wnt / β-katenino aktyvumą, tuo tarpu kai kuriais atvejais jis veikia kaip „Wnt“ inhibitorius arba neturi reikšmingos įtakos Wnt / β-katenino signalizavimui. 3, 4, 5, 6, 7, palyginti su DACT1, DACT2 buvo mažiau apibūdinamas, o jo vaidmuo darant navikinį signalą ir vystymąsi vis dar nėra aiškus. Nors genetiniai ir epigenetiniai tyrimai patvirtino, kad DACT2 veikia kaip priešvėžinis baltymas, reguliuodamas Wnt / β-katenino signalus plaučių vėžyje, dabartiniai DACT2 tyrimai apsiriboja tik trumpu jo ryšio su Wnt / β-katenino signalizavimu aprašymu. 8 Kaip DACT2 veikia Wnt / β-katenino signalus molekulinėse detalėse ir ar šis poveikis priklauso nuo ląstelių tipo ir konteksto, beveik nežinoma. Atlikdami viso genomo atranką, mes nustatėme, kad DACT2 dažnai nutildė dėl promotoriaus metilinimo storosios žarnos vėžyje . Tačiau DACT2 vaidmuo ir klinikinė reikšmė storosios žarnos vėžiui išlieka neaiški . Šiame tyrime buvo tiriamas DACT2 epigenetinis reguliavimas, biologinė funkcija, molekulinė bazė ir klinikinis poveikis gaubtinės žarnos vėžiui.

Rezultatai

DACT2 tylėjimas arba žemas jo reguliavimas skatinant metilinimą sergant storosios žarnos vėžiu

DACT2 buvo stipriai ekspresuojamas normaliame žmogaus storosios žarnos audinyje (1a pav.). Priešingai, iš aštuonių tirtų storosios žarnos vėžio ląstelių linijų DACT2 mRNR ekspresija buvo nutildyta penkiose ląstelių linijose, išskyrus SW480, SW620 ir Caco-2 (1a pav.). Norint ištirti promotoriaus metilinimo indėlį į DACT2 reguliavimą , DACT2 promotoriaus metilinimo būklė buvo tiriama bisulfito genomo sekos nustatymu (BGS). Tvirtas promotoriaus metilinimas buvo pastebėtas visose penkiose nutildytose storosios žarnos vėžio ląstelių linijose, tačiau metilinimo nebuvo pastebėta SW480, SW620 ir Caco-2, kuriuose pasireiškė DACT2 ekspresija, taip pat normaliame storosios žarnos audinyje (1c paveikslas), darant prielaidą , kad DACT2 transkripcija yra tyli. tarpininkavo promotoriaus metilinimas storosios žarnos vėžio ląstelėse.

Image

DACT2 buvo inaktyvuota dėl promotoriaus metilinimo storosios žarnos vėžyje . ( a ) DACT2 dažnai buvo nutildomas storosios žarnos vėžio ląstelių linijose. Normalus storosios žarnos audinys yra iš epitelio audinio ir daugiausia sudarytas iš epitelio ląstelių. b ) CpG sala DACT2 . DACT2 metilinimo būklei įvertinti buvo nurodyta transkripcijos pradžios vieta, BGS regionas ir promotoriaus regionas. ( c ) DACT2 promotoriaus metilinimo būsena buvo nustatyta BGS.

Visas dydis

DACT2 slopina storosios žarnos vėžio ląstelių augimą ir indukuoja ląstelių apoptozę in vitro

Norėdami išaiškinti DACT2 funkciją storosios žarnos vėžyje, ištyrėme DACT2 pakartotinio ekspresijos įtaką storosios žarnos vėžio ląstelių augimo charakteristikoms, naudodamos 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-karboksimetoksifenil) -2- ( 4-sulfofenil) -2H-tetrazolio (MTS) tyrimas. DACT2 pakartotinis ekspresija stabiliai transfekuotose HCT116 ir HT-29 ląstelėse buvo patvirtintas Western blot būdu (2a pav.). Dėl negimdinės DACT2 ekspresijos žymiai sumažėjo ląstelių gyvybingumas HCT116 ( P <0, 01) ir HT-29 ( P <0, 01; 2a pav.). Kita vertus, dėl mažų trukdančių RNR (siRNR) sukelto DACT2 sunaikinimo žmogaus embriono inksto ląstelėje HEK-293 reikšmingai padidėjo klonogeninis gebėjimas ( P <0, 01; 2b paveikslas). Be to, negimdinė DACT2 ekspresija sąlygojo reikšmingą apoptozinių ląstelių padidėjimą tiek HCT116 ( P <0, 01), tiek HT-29 ląstelėse ( P <0, 01; 2c paveikslas). Apoptozės indukciją papildomai įrodė padidėjęs PARP (poli (ADP-ribozės) polimerazės) skilimas stabiliai transfekuotose HCT116 ir HT-29 ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis (3a pav.).

Image

DACT2 slopino naviko augimą ir metastazes. ( a ) DACT2 poveikis ląstelių gyvybingumui buvo įvertintas atliekant MTS analizę HCT116 ir HT-29 ląstelėse. b ) DACT2 numušimo poveikis kolonijų susidarymui įamžintoje žmogaus embriono inksto ląstelėje HEK-293. c ) Ląstelių apoptozė buvo tiriama atliekant aneksino V-APC ir 7-AAD dvigubo dažymo srauto citometrijos analizę. Viršutiniame kairiajame krašte yra nekrotinės ląstelės, viršutinėje dešinėje - vėlyvosios apoptozinės ląstelės, apatinėje kairėje - gyvosios, apatinėje dešinėje - ankstyvosios apoptozinės ląstelės. Santykinė aneksino V teigiamų ląstelių dalis buvo įvertinta kaip apoptozinės ląstelės, įskaitant ankstyvas ir vėlyvas apoptotines ląsteles. d ) Reprezentatyvūs navikų pelės (rodyklės), susidariusios nuo nuogų pelių, sukeltų kontrolinių HCT116 ląstelių (kairysis nugaros šonas) ir DACT2 ekspresuojančių HCT116 ląstelių (dešinysis nugaros šonas). ( e ) DACT2 ekspresuojančių HCT116 ląstelių poodinis naviko augimo kreivė nuogoms pelėms buvo lyginamas su kontrolinėmis ląstelėmis. DACT2 grupėje auglio augimas sulėtėjo, palyginti su kontroline grupe ( P <0, 01). f ) Tipinis Ki-67 dažymas nuogų pelių ksenografiniuose navikuose (padidinimas, × 200). DACT2 ekspresuojančiuose navikuose buvo akivaizdus Ki-67-teigiamų ląstelių (rudai dažytų branduolių) skaičiaus sumažėjimas ( P <0, 05). g ) DACT2 slopino naviko metastazes in vivo . Visas metastazavusių mazgelių skaičius buvo nustatytas nuogų pelių plaučiuose ( n = 4 vienai grupei) praėjus 8 savaitėms po kontrolinių uodegos venų injekcijos (raudonos juostos) ir DACT2 ekspresuojančios (mėlynos juostos) HCT116 ląstelių. Atskirų pelių vertės buvo parodytos virš juostų; Taip pat buvo pažymėtos vertės pagal grupes. Duomenys yra vidutiniai ± sd ( h ) Reprezentatyvios hematoksilino ir eozinu dažytos plaučių dalys, kuriose yra metastazavusių židinių.

Visas dydis

Image

Priešnavikinis DACT2 poveikis buvo slopinamas Wnt / β-katenino signalizacijos keliu. ( a ) DACT2 per didelis ekspresijos poveikis Wnt / β-katenino signalizavimui, suskaidytai PARP (poli (ADP-ribozės) polimerazei) ir epitelio žymens E-kadherino ekspresijai buvo įvertintas Western blot būdu. ( b ) DACT2 poveikis Wnt / β-katenino signalizacijos keliui buvo įvertintas naudojant dvigubos luciferazės reporterio testus HCT116 ir HT-29 ląstelėse. c ) DACT2 sumažėjęs padidėjęs β-katenino stimuliuojamas transkripcijos aktyvumas. ( d ) β-katenino imunofluorescencinis dažymas parodė, kad DACT2 ekspresuojančiose HT-29 ląstelėse β-katenino branduolio translokacija buvo ženkliai sumažinta, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis. Branduoliai buvo priešpriešiniai su 4 ', 6-diamidino-2-fenilindoliu (DAPI, mėlynas). e ) DACT2 pakartotinis ekspresija žymiai sumažino laukinio tipo β-katenino, taip pat skilimui atsparaus β-katenino mutanto (S33Y) sukeltą TOPflash aktyvumą. ( f ) Dvigubas imunofluorescencinis E-kadherino ir Flag-DACT2 dažymas buvo atliktas Flag-DACT transfekuotose HCT116 ir HT-29 ląstelėse. ( g ) E-kadherino sunaikinimas iš dalies palengvino DACT2 sąlygojamą metastazių slopinimą.

Visas dydis

DACT2 slopina invazinį ir tumorigeninį storosios žarnos vėžio ląstelių gebėjimą in vivo

Mes taip pat išbandėme, ar DACT2 gali slopinti storosios žarnos vėžio ląstelių augimą nuogoms pelėms in vivo . Poodinio naviko ksenografai iš HCT116 ląstelių, turinčių stabilią DACT2 ekspresiją, nuogoms pelėms parodė mažesnį naviko augimo greitį, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis ( P <0, 01; 2d ir e paveikslai). Ląstelių proliferacija ksenografinių navikų srityje buvo tiriama dažant Ki-67. Remiantis gautais storosios žarnos vėžio ląstelių linijomis in vitro , DACT2 ekspresuojančiuose navikuose buvo žymiai mažiau proliferacinių ląstelių ( P <0, 05; 2f pav.). Siekiant išaiškinti antiinvazinę DACT2 funkciją in vivo , buvo naudojamas eksperimentinis metastazių tyrimas, siekiant palyginti metastazavusius naviko mazgelius, kurie susidaro nuogų pelių plaučiuose po uodegos venų inokuliacijos su DACT2 ekspresuojančiomis arba kontrolinėmis HCT116 ląstelėmis. Praėjus 8 savaitėms po injekcijos, pelės buvo nužudytos, o plaučiai buvo surinkti. Bendras metastazavusių mazgelių skaičius plaučiuose buvo žymiai mažesnis pelėms, į kurias buvo švirkščiamos DACT2 ekspresuojančios ląstelės, nei pelėms, į kurias buvo įšvirkštos kontrolinės ląstelės (57 ± 13, palyginti su 23 ± 14; P <0, 01; 2g ir h paveikslai). Todėl DACT2 turėjo lemiamą reikšmę storosios žarnos vėžio augimui ir metastazėms.

DACT2 auglį slopinantis poveikis vyksta slopinant Wnt / β-katenino signalizacijos kelią

Kadangi DACT2 priklauso „Dact“ šeimai, kuri pirmiausia buvo nustatyta kaip Dvl, Wnt signalizacijos centrų, antagonistas 9, mes įvertinome DACT2 poveikį Wnt / β-katenino signalizacijos keliui Western blot būdu. Mes nustatėme, kad aktyvioji β-katenino forma buvo aiškiai sumažinta po DACT2 pakartotinio ekspresijos tiek HCT116, tiek HT-29 ląstelėse (3a pav.). Tęsdamas šį atradimą, DACT2 perdėtas ekspresija slopino „SuperTOPflash“ reporterio veiklą abiejose ląstelių linijose (3b pav.). Kita vertus, DACT2 siRNR transfekuotose HEK-293 ląstelėse β-katenino stimuliuota luciferazės veikla buvo žymiai padidėjusi (3c paveikslas). Be to, β-katenino branduolio translokacija žymiai sumažėjo DACT2 ekspresuojančiose HT-29 ląstelėse (3d pav.). DACT2 lėmė β-katenino perkėlimą į ląstelės membraną, o ne difuziškai išsibarstymą citoplazmoje (3d pav.). Paprastai žinoma, kad HCT116 turi padidėjusią funkcijų mutaciją β-catenine, dėl ko jis atsparus skilimui, tuo tarpu HT-29 turi apipjaustytas adenomatozines polipozės coli (APC), svarbiausią β-katenino sunaikinimo komplekso komponentą. Taigi β-katenino signalo slopinimas DACT2 nebuvo skatinamas β-katenino skilimas šiose storosios žarnos vėžio ląstelių linijose. Atitinkamai, bendras β-katenino kiekis nepakito (3a pav.). Norėdami dar labiau patvirtinti, kad β-katenino signalo slopinimas DACT2 neturėjo įtakos β-katenino stabilumui, buvo atliktas SuperTOPflash luciferazės reporterio tyrimas. Pakartotinis DACT2 ekspresija blokavo tiek laukinio tipo β-katenino, tiek konstituciškai aktyvaus mutanto β-katenino (S33Y), skilimui atsparios formos, kurioje 33 serinas buvo pakeistas tirozinu, transkripcinį aktyvumą (3e pav.). Wnt / β-katenino kelias yra vienas iš svarbiausių signalizacijos kelių, kontroliuojančių epitelio – mezenchiminį perėjimą ir sukeliančių ląstelių metastazes. 11, 12 E-kadherino išnykimas iš ląstelių membranos yra laikomas lemiamu epitelio – mezenchiminio pereinamojo laikotarpio progresu. Taigi, buvo ištirtas DACT2 poveikis E-kadherino ekspresijai ir ląstelių lokalizacijai. Mūsų rezultatai parodė, kad DACT2 padidino E-kadherino, kuris buvo praturtintas ląstelių membranoje, ekspresiją (3a pav.), Ypač ląstelių ir ląstelių sąlyčio srityje (3f pav.), Parodant, kad DACT2 atkuria E-kadherino jungties stabilumą. Atliekant E-kadherino numetimą, ląstelių invazinis gebėjimas reikšmingai padidėjo DACT2 ekspresuojančiose HCT116 ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis siRNR transfekuotomis DACT2 ekspresuojančiomis HCT116 ląstelėmis (3g paveikslas), rodantis, kad E-kadherino blokada galėjo iš dalies palengvinti anti-metastazinį DACT2 potencialą. .

DACT2 slopina β-katenino transkripcinį aktyvumą branduolyje

DACT2 lokalinė ląstelė po ląstelėmis buvo ištirta DACT2 ekspresuojančiose storosios žarnos vėžio ląstelėse. Imunofluorescencinis dažymas parodė, kad DACT2 baltymas daugiausia liko citoplazmoje (4a paveikslas). Bioinforminė analizė parodė, kad DACT2 turi ir numanomą branduolio eksporto signalą (NES), ir branduolio lokalizacijos signalą (NLS), kas leidžia manyti, kad DACT2 greičiausiai yra nukleocitoplazminiai baltymai. Norint patikrinti šią galimybę, DACT2 pasiskirstymas buvo tiriamas imunofluorescenciniu dažymu po gydymo Leptomycin B, stipriu ir specifiniu branduolio eksporto inhibitoriumi. Gydymas leptomicinu B paskatino stiprų DACT2 kaupimąsi branduolyje (4b pav.), Tai reiškia, kad DACT2 aktyviai judėjo tarp branduolio ir citoplazmos. Šis atradimas privertė mus spėlioti, ar DACT2, esant skirtingoms ląstelių ląstelėms, gali turėti skirtingą vaidmenį reguliuojant Wnt / β-katenino signalizaciją, pavyzdžiui, APC. 13, 14 NES ir NLS motyvų identifikavimui, DACT2 N-galo sritis, vidurinė sritis ir C-galo sritis buvo atskirai klonuoti (4c paveikslas). Imunofluorescencinis dažymas parodė, kad DACT2 N-galo sritis buvo visiškai lokalizuota citoplazmoje, o C-galinė sritis buvo branduolyje (4d pav.), Kas rodo, kad NES ir NLS buvo atitinkamai DACT2 N-galo ir C-galo srityje. . DACT2 NES mutantas buvo gautas pakeitus vieną kritinę hidrofobinę liekaną (izoleuciną 103) NES poliarinės aminorūgšties serinu, tuo tarpu DACT2 NLS buvo mutavus, pakeičiant vieną iš pagrindinių lizino / arginino turtingų motyvų C gale rūgštųjį glutaminą. rūgštis (4e pav.). Be to, buvo pastatytas DACT2 NES / NLS dvigubas mutantas. DACT2 NES mutantas rodė vyraujantį branduolio pasiskirstymą (4f pav.), Darydamas išvadą, kad ši mutacija visiškai sutrikdė jo branduolio eksportą į citoplazmą. Priešingai, DACT2 NES / NLS dvigubas mutantas parodė vyraujantį citoplazminį pasiskirstymą (4f pav.). Taigi NES / NLS dvigubas mutantas negalėjo likti branduolyje, nes NLS mutacija buvo pakankama, kad būtų sutrikdyta jo branduolio importo funkcija. Įdomu tai, kad tiek DACT2 NES, tiek NLS mutantai vis dar turėjo slopinamąjį poveikį ląstelių augimui ir β-katenino transkripcijos aktyvumui (4g ir h pav.). „Dapper“ šeimos nariai gali neigiamai sureguliuoti Wnt / β-katenino signalizaciją nukreipdami Dvl į skilimą, 15, 16, nes Wnt suaktyvintiems receptoriams Dvl reikia pastolių, kad būtų galima įdarbinti Axin ir glikogeno sintazės kinazę 3, todėl išardomas β-katenino sunaikinimo kompleksas ir todėl padidėja β-katenino stabilumas. Kadangi šis procesas vyksta citoplazmoje, Wnt / β-katenino signalų slopinimas DACT2 NES mutantu neturėtų būti reguliuojamas Dvl. Kaip ir tikėtasi, per didelis laukinio tipo DACT2 ekspresija sumažino Dvl2 ekspresiją, tačiau DACT2 NES mutantas to nepadarė (4i pav.), Rodantis, kad DACT2 NES mutantas gali labiau nuslopinti β-katenino transkripcijos aktyvumą branduolyje. Be to, E-kadherino ekspresijos lygis reikšmingai nepakito DACT2 NES ir NLS mutantus ekspresuojančiose HCT116 ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (4j paveikslas).

Image

DACT2 slopino Wnt / β-katenino signalizaciją branduolyje. a ) DACT2 daugiausia liko citoplazmoje. b ) Branduolinis DACT2 susilaikymas po gydymo Leptomycin B (LMB). HT-29 ląstelės buvo laikinai transfekuotos Flag-DACT2 konstruktu, po to veikiamos 50 nM LMB 4 valandas, o DACT2 baltymas buvo analizuojamas dažant imunofluorescenciniu būdu. c ) DACT2 delecijos konstruktų grupė. d ) DACT2 delecijos variantų lokalizavimas ląstelėse. e ) Žemėlapiai, iliustruojantys NES ir NLS sekas laukinio tipo DACT2, ir NES ir NLS taškų mutacijas DACT2 mutantuose. NES seka DACT2 yra trumpa aminorūgščių seka, susidedanti iš keturių hidrofobinių liekanų (leucinas arba izoleucinas, paryškinta raudona spalva), nukreipta į jos eksportą iš branduolio į citoplazmą. DACT2 NES mutantas sukėlė taškinę NES mutaciją, dėl kurios 103 kodone atsirado izoleucino ir serino pakaitalas (paryškintas mėlyna spalva). NLS seka yra lizino / arginino turtingas motyvas C gale, nukreipiantis į DACT2, kad būtų galima importuoti į ląstelės branduolį pernešant branduolį. Taškinė NLS mutacija sukėlė lizino ir glutamo rūgšties pakaitą 758 kodone (paryškinta mėlyna spalva). f ) NES mutacija lėmė stiprų DACT2 baltymo branduolių kaupimąsi negydant LMB. DACT2 NES / NLS dvigubas mutantas daugiausia liko citoplazmoje, kas rodo, kad NLS taško mutacija buvo pakankama, kad būtų galima prarasti branduolio lokalizaciją dėl importo. ( g ) DACT2 NES ir NLS mutantų poveikis ląstelių gyvybingumui buvo įvertintas atliekant MTS tyrimą HCT116 ląstelėse. ( h ) Tiek DACT2 NES, tiek NLS mutantai neigiamai reguliavo Wnt / β-katenino signalizaciją, kaip rodo TOPflash reporterio aktyvumo tyrimas HCT116 ląstelėse. DACT2 NES mutantas slopino „TOPflash“ reporterio aktyvumą, kurį HEK 293T ląstelėse sukėlė laukinio tipo β-kateninas, taip pat β-katenino mutantas (S33Y). i ) DACT2 laukinio tipo ir DACT2 NES mutanto poveikis Dvl2 ekspresijai. HCT116 ląstelės buvo laikinai transfekuotos pcDNA3.1, pcDNA3.1-Flag-DACT2 arba pcDNA3.1-Flag-DACT2-NES mutantais. Praėjus keturiasdešimt aštuonioms valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo surinktos Western blot analizei. ( j ) DACT2 NES ir NLS mutantai reikšmingai nepadidino E-kadherino ekspresijos HCT116 ląstelėse.

Visas dydis

DACT2 tiesiogiai sąveikauja su β-kateninu ir sutrikdo β-katenino – limfoidą stiprinančio faktoriaus-1 jungiklio faktoriaus formavimąsi branduolyje.

Norėdami sužinoti apie pagrindinį WACT / β-katenino signalo slopinimo DACT2 mechanizmą, ištyrėme, ar DACT2 fiziškai sąveikavo su β-katenino – T-ląstelių faktoriaus (TCF) / limfoidų stiprintoją rišančio faktoriaus (LEF) transkripcijos komplekso komponentais. kartu imunoprecipitacija. Buvo nustatyta, kad DACT2 stipriai jungiasi su β-kateninu (5a pav.). DACT2 NES ir NLS mutantai taip pat galėjo sąveikauti su β-kateninu (5b paveikslas). Be to, DACT2 taip pat gali jungtis su TCF / LEF šeimos nariu LEF1 (5c pav.), Kuris gali suformuoti transkripcijos kompleksą su β-kateninu, kad suaktyvintų Wnt taikinius. 18 Taigi mes ištyrėme DACT2 poveikį β-katenino – LEF1 transkripcijos komplekso formavimuisi. Kaip parodyta 5d paveiksle, β-katenino nuosėdose iš DACT2 ekspresuojančių ląstelių buvo pastebėtas aiškus mažiau susijęs LEF1, rodantis, kad esant DACT2 akivaizdžiai sutriko sąveika tarp LEF1 ir β-katenino. DACT2 jungiasi prie branduolinio β-catenino ir neleidžia jam susidaryti komplekse su savo partneriu LEF1. Tai buvo svarbus DACT2 tarpininkaujamo Wnt / β-katenino signalizacijos, slopinančios storosios žarnos vėžį, mechanizmas.

Image

DACT2 tiesiogiai sutrikdė β-katenino – LEF1 transkripcijos komplekso formavimąsi. ( a ) Bendras imunoprecipitacija parodė fizinę DACT2 ir β-katenino sąveiką. Anti-Flag antikūnas buvo naudojamas imunoprecipitacijai, pažymėtam DACT2 arba β-catenino turinčiu kompleksu iš sveikų ląstelių ekstraktų, paruoštų iš HCT116 ląstelių, išrašančių Vėliavos-DACT2 ir HA-β-katenino arba Vėliavos-β-katenino ir GFP-DACT2. . ( b ) Tiek DACT2 NES, tiek NLS mutantai sąveikavo su β-kateninu. c ) DACT2 sąveikavo su LEF1. HCT116 ląstelės buvo transfekuotos vien tik HA-LEF1 arba kartu su Flag-DACT2 ir buvo surinktos siekiant apsaugoti anti-vėliavą. ( d ) DACT2 sąveika žymiai sutrikdė β-katenino ir LEF1 komplekso formavimąsi. HCT116 ląstelės buvo kartu transfekuotos su Flag-β-kateninu ir HA-LEF1 ekspresuojančiomis konstrukcijomis su Myc-DACT2 ekspresija arba be jos. Ląstelių lizatai buvo imunoprecipipuoti, naudojant anti-Flag antikūną, ir analizuojami implantų tyrimais. e ) DACT1 ir DACT3 dažnai buvo sureguliuojamos storosios žarnos vėžio ląstelių linijose. ( f ) DACT1 ir DACT3 neturėjo sąveikos su β-kateninu. g ) Siūlomi DACT2 naviko slopinimo mechaniniai modeliai esant storosios žarnos vėžiui.

Visas dydis

DACT1 ir DACT3 storosios žarnos vėžyje

Kelių sekų derinimas parodė, kad „Dact“ genų šeimos nariai turi didelį sekų panašumą savo N-galo ir C-galo srityse (papildomas paveikslas). Bioinformatine analize taip pat nustatyta, kad tiek DACT1, tiek DACT3 turi būdingą NES savo N-galo regionuose ir bent vieną NLS jų C-galo regionuose. Tai rodo, kad DACT1 ir DACT3 taip pat yra nukleocitoplazminiai jungiamieji baltymai, tokie kaip DACT2. Pusiau kokybinis atvirkštinės transkripcijos PGR parodė, kad DACT1 ir DACT3 buvo sureguliuotos daugumoje storosios žarnos vėžio ląstelių linijų (5e pav.). Tačiau nei DACT1, nei DACT3 negalėjo sąveikauti su β-kateninu, tai patvirtina bendro imunoprecipitacijos tyrimas (5f pav.). DACT1 nesugebėjo sureguliuoti β-katenino transkripcijos aktyvumo HT29 ląstelėse (duomenys nepateikti). Remiantis ankstesniais atradimais, DACT3 slopino storosios žarnos vėžio ląstelių klonogeniškumą ir skatino ląstelių apoptozę, silpnindamas Wnt / β-katenino signalizacijos kelią storosios žarnos vėžyje. 16 Taigi, nors ir DACT2, ir DACT3 buvo funkciniai navikų slopintuvai, slopindami Wnt / β-katenino signalų perdavimo kelią, tikriausiai jie veikė skirtingus molekulinius taikinius Wnt / β-katenino signalizacijos srityje gaubtinės žarnos vėžiui.

DACT2 metilinimas skatinamas dėl blogo storosios žarnos vėžiu sergančių pacientų išgyvenimo

Klinikinis DACT2 metilinimo pritaikymas buvo įvertintas 67 pirminiuose storosios žarnos vėžiuose ir 12 sveikų storosios žarnos audinių mėginių. Dalinis ir tankus DACT2 promotoriaus metilinimas buvo nustatytas 43, 3% (29/67) vėžio audinių, bet nė vienoje iš 12 normalių storosios žarnos biopsijų BGS nebuvo nustatyta (6a pav.). Tarp DACT2 metilinimo būklės ir klinikinės patologinės ypatybės koreliacijos nenustatyta (1 papildoma lentelė). Tuo tarpu vienmatė Cox regresinė analizė parodė, kad naviko mazgo-metastazės (TNM) stadija buvo reikšmingas prognostinis faktorius ( P <0, 0005; 2 papildoma lentelė). Nustačius amžiaus, lyties ir TNM stadiją, nustatyta, kad DACT2 metilinimas storosios žarnos naviko audiniuose prognozuoja prastesnį storosios žarnos vėžiu sergančių pacientų išgyvenamumą (rizikos santykis (HR), 4, 590; 95% pasikliautinasis intervalas, 1, 542–13, 660; P = 0, 006; lentelė). 1). Kaplan – Meier 5 metų išgyvenimo kreivės parodė, kad storosios žarnos vėžiu sergantiems pacientams, kuriems buvo metilinta DACT2 , ankstyvoje stadijoje (I – III; P = 0, 009) išgyvenimas buvo žymiai trumpesnis, bet ne IV stadijoje (6b paveikslas).

Image

DACT2 dažnai buvo metilinamas sergant pirminiu storosios žarnos vėžiu. a ) DACT2 metilinimo būklės reprezentatyvūs BGS rezultatai storosios žarnos vėžyje ir normaliuose storosios žarnos audinių mėginiuose. b ) storosios žarnos vėžiu sergančių pacientų Kaplano ir Meier išgyvenamumo kreivės, išskaidytos pagal DACT2 metilinimo būklę, ankstyvosios stadijos (TNM I – III) ir vėlyvosios stadijos (TNM IV). Ankstyvosios stadijos grupėje metilinimo grupėje išgyvenimas buvo žymiai trumpesnis nei kitų. Tačiau IV stadijos grupėje bendras išgyvenamumas reikšmingai nesiskyrė tarp metilinimo ir be metilinimo.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

Šiame tyrime mes nustatėme, kad DACT2 ekspresija dažnai buvo sureguliuota storosios žarnos vėžio ląstelių linijose. Sumažėjusi ekspresija buvo susijusi su promotoriaus metilinimu, kurį patvirtina tiesioginis BGS, darydamas išvadą, kad DNR metilinimas yra pagrindinis DACT2 inaktyvacijos storosios žarnos vėžyje reguliavimo mechanizmas. Nutildžius DACT2, gali būti panaikintas naviko slopinimas, kad būtų galima prisidėti prie kancerogenezės. Tariamą DACT2 naviko slopinimo funkciją storosios žarnos vėžyje mes išbandėme atlikdami in vitro ir in vivo tyrimus. DACT2 pakartotinis ekspresija dviejose nutildytose storosios žarnos vėžio ląstelių linijose (HCT116 ir HT-29) parodė reikšmingą augimo slopinimą, slopindamas ląstelių dauginimąsi ir sukeldamas ląstelių apoptozę, tai patvirtina ląstelių gyvybingumo tyrimas ir aneksino V apoptozės tyrimas. Poodinių ksenografinių navikų modelyje auglių augimo sumažėjimas DACT2 dar labiau patvirtintas. Kita vertus, siRNR sąlygotas DACT2 sunaikinimas žmogaus embriono inkstų ląstelėse HEK-293 reikšmingai padidino klonogeniškumą. Be to, DACT2 sureguliavo E-kadheriną, atstatė epitelio jungiamąją E-kadherino / β-katenino kompleksų lokalizaciją ir sumažino storosios žarnos vėžio ląstelių metastazes in vivo nuogoms pelėms. E-kadherino numušimas galėtų iš dalies palengvinti DACT2 sąlygojamą metastazių slopinimą, darydamas išvadą, kad E-kadherinas buvo pagrindinis DACT2 taikinys reguliuojant naviko ląstelių invaziją. Toliau išsiaiškinome paskesnius signalizacijos kelius, kad DACT2 atliko auglio slopinimo funkciją gaubtinės žarnos vėžiu ir nustatėme, kad DACT2 sukeliamas antiproliferacinis ir antiinvazinis poveikis bent jau buvo susijęs su Wnt / β-katenino signalizacijos slopinimu, o tai yra kritiška daugumos storosios žarnos vėžio pradžia ir progresavimas. 19 Bendrai, moduliuodamas Wnt / β-katenino signalizaciją, DACT2 galėtų veikti kaip naviko slopinimo genas, slopindamas naviko augimą ir metastazes.

DACT2 yra daktų šeimos narys, kuris pirmiausia identifikuojamas kaip Dvl sąveikaujantis baltymas ir moduliuoja Wnt signalus antagonizuodamas Dvl. Kanoniniame „Wnt“ kelyje, kai tik Wnt ligandas prisijungia prie „Frizzled“ receptorių ir su mažo tankio lipoproteinų receptoriais susijusių 5 ir 6 baltymų (LRP5 / 6), „Dvl“ įdarbina „Frizzled“ receptoriai, tada jie savo ruožtu skatina „Axin“ įdarbinimą. ir glikogeno sintazės kinazės 3 į Wnt aktyvuotus receptorius. 17, 20 Tai lemia β-katenino sunaikinimo komplekso išardymą, o vėliau padidėja β-katenino stabilumas ir jo branduolio translokacija. Todėl nukreipimas į Dvl skaidymąsi citoplazmoje yra aukščiau esantis mechanizmas, reguliuojantis β-katenino stabilumą, 21, 22, kuris veikia tik tuo atveju, jei tenkinamos abi sąlygos: pirma, Wnt signalizacija įjungiama stimuliuojant kanoninius Wnt ligandus. Antra, sunaikinimo technika, esanti β-catenino ir β-catenino pasroviui, galėtų tinkamai veikti be jokių mutacijų ar kitokio pasipriešinimo pasroviui. Kaip mes žinome, beveik visose storosios žarnos vėžio ląstelių linijose, įskaitant HCT116 ir HT-29, yra arba funkcijų praradimo mutacija sunaikinimo sudėtiniame komponente APC, arba funkcijos padidėjimo mutacija β-katenine, prisidedanti prie nenormalios Wnt / β-katenino signalizacijos aktyvacija. 23 Mūsų tyrimo metu pakartotinis DACT2 ekspresas sąlygojo reikšmingą Wnt / β-katenino signalo signalo sumažėjimą tiek HCT116, tiek HT-29 storosios žarnos vėžio ląstelių linijose, nepaveikdamas β-katenino stabilumo. Atitinkamai, DACT2 slopino TOPflash aktyvumą, kurį sukėlė atsparus skilimui β-kateninas (S33Y). Be to, branduolyje lokalizuotas DACT2 NES mutantas vis dar slopino β-katenino transkripcijos aktyvumą, tačiau prarado gebėjimą reguliuoti Dvl2 skilimą, kuris vyksta citoplazmoje. Taigi, nors DACT2 galėjo sumažinti Dvl raiškos reguliavimą, Wnt / β-katenino signalo slopinimo mechanizmas, kurį sukelia DACT2 storosios žarnos vėžyje, nepriklausė nuo Dvl reguliavimo.

DACT2 vaidmuo reguliuojant Wnt / β-katenino signalizaciją buvo išsamiau išaiškintas tiriant jo pasiskirstymą po pooduliu. Mes nustatėme, kad DACT2 gali dinamiškai judėti į branduolius ir iš jų, vyraujant pastoviajai būklei citoplazmoje, priklausomai nuo NES. Įdomu tai, kad branduolyje lokalizuotas DACT2 NES mutantas išsaugojo savo sugebėjimą slopinti Wnt / β-katenino signalizaciją, todėl mums kilo hipotezė, kad DACT2 gali tiesiogiai dalyvauti β-katenino transkripcijos branduolyje procese. Gerai žinoma, kad TCF / LEF šeima yra pagrindinis β-katenino partneris transkripciniam Wnt tikslinių genų reguliavimui. 24 Stimuliuojant Wnt, β-kateninas perkeliamas į branduolį ir sudaro kompleksą su TCF / LEF šeimos nariu, kad būtų išstumti jo branduoliai ir įdarbinti koaktyvatoriai, taigi įjungiami onkogeniniai Wnt taikiniai. Šiuo atžvilgiu mes ištyrėme DACT2 sąveiką su β-katenino – TCF / LEF transkripcijos komplekso komponentais. Bendro imunoprecipitacijos rezultatai parodė, kad DACT2 stipriai sieja β-kateniną ir TCF / LEF šeimos narį LEF1, o tai patvirtino ankstesni Kivimäe et al. 25 Dar svarbiau, kad β-katenino – LEF1 komplekso susidarymą labai sutrikdė DACT2 sąveika, tai rodo, kad DACT2 slopino Wnt / β-katenino signalizavimą, tiesiogiai sutrikdydamas β-katenino – LEF1 komplekso susidarymą branduolyje. Kadangi DACT2 sąveikavo tiek su β-kateninu, tiek su LEF1 ir sumažino jų komplekso susidarymą, DACT2 negalėjo sudaryti stabilaus komplekso su β-kateninu – LEF1, o tai rodo, kad DACT2 gali konkuruoti su LEF1 dėl jungimosi su β-kateninu. Būsimame tyrime dar reikia atkreipti dėmesį į išsamų molekulinį mechanizmą, kaip DACT2 funkcionuoja išardant β-katenino – LEF1 kompleksą. Pažymėtina, kad APC, pagrindinis Wnt signalizacijos reguliatorius, moduliuoja β-katenino aktyvumą panašiai kaip DACT2. APC, būdamas nukleocitoplazminiu baltymu, ne tik skaido β-kateniną, nukreipdamas jį į citoplazmos ubikvitinimą, bet ir išskiria β-kateniną iš savo transkripcijos partnerio TCF / LEF šeimos branduolyje. 14 Be to, DACT2 NLS mutantas taip pat slopino Wnt / β-katenino signalizaciją, greičiausiai užkirsdamas kelią β-katenino branduolio translokacijai, tiesiogiai sąveikaudamas su β-kateninu. Mūsų išvados praplečia mūsų supratimą apie Wnt signalizacijos reguliavimą, išaiškinant naująjį DACT2 vaidmenį storosios žarnos vėžyje. Kadangi DACT2 iš esmės ekspresuojamas normaliame storosios žarnos audinyje, mes siūlome, kad DACT2 yra vidinis reguliatorius, kuris griežtai kontroliuoja bazinį β-katenino aktyvumą ir Wnt tikslinių genų ekspresijos lygį normaliame storosios žarnos epitelyje.

Be to, pakartotinis DACT2 ekspresija padidino E-kadherino reguliavimą ir E-kadherino / β-katenino kompleksų lokalinę lokalizaciją ląstelių membranoje. Membranoje lokalizuotas β-kateninas sąveikauja su E-kadherinu, sudarydamas adreno jungtis, kurios yra būtinos norint palaikyti epitelio vientisumą normaliame epitelyje. 26, 27 β-katenino / E-kadherino kompleksas adreno sankryžose taip pat yra atsakingas už kontaktinio slopinimo signalo, kuris sukelia ląstelėms sustabdyti proliferaciją, perdavimą, kai epitelio lapas yra užpildytas, 28, 29, tuo tarpu kontaktinis proliferacijos slopinimas prarandamas auglio augimo metu . E-kadherino / β-katenino praradimas adreno jungtyse tampa pagrindiniu epitelio – mezenchiminio perėjimo įvykiu, dėl kurio prarandamas epitelio fenotipas ir išardomi ląstelių-ląstelių sandūros, taigi sumažėja ląstelių tvirtinimas ir padidėja ląstelių judrumas. Be to, β-kateninas iš E-kadherino išsiskiria ląstelės paviršiuje ir persikelia į branduolį, kur jis veikia kaip onkogeninis transkripcijos faktorius pasroviui. Įrodyta, kad branduolinis β-kateninas suaktyvina daugelio epitelio ir mezenchiminio pereinamojo laikotarpio veiksnių, tokių kaip fibronektinas, ir įvairių matricinių metaloprotezių transkripciją, paversdamas juos labiau invaziniu fenotipu. 30 Įrodyta, kad šis procesas yra glaudžiai susijęs su daugelio epitelio sukeliamų navikų, ypač storosios žarnos vėžio, progresavimu ir metastazėmis. Taigi β-katenino / E-kadherino pagrindu sukurtų adreno jungčių pertvarkymas buvo kritinis mechanizmas, kuriuo DACT2 slopino invazines storosios žarnos vėžio ląstelių savybes in vivo .

Norėdami išsiaiškinti DACT2 klinikinį pritaikymą gaubtinės žarnos vėžiui, mes ištyrėme DACT2 promotoriaus metilinimą 67 pirminiuose gaubtinės žarnos vėžiuose ir 12 normalių BGS kontrolių. DACT2 promotoriaus metilinimas buvo pastebėtas 43, 3% pirminių storosios žarnos navikų, tačiau normaliųjų storosios žarnos audiniuose jo nebuvo - tai rodo, kad metilinimas sukelia DACT2 inaktyvaciją dažnai dėl storosios žarnos kancerogenezės. DACT2 ekspresijos praradimas dėl metilinimo promotoriais gali sukelti Wnt / β-katenino signalizacijos signalų aktyvavimą ir galiausiai navikogenezę. Naviko audiniuose aptiktas DACT2 metilinimas gali reikšmingai numatyti prastesnį pacientų, išgyvenusių storosios žarnos vėžiu, išgyvenamumą (1 lentelė, 6b pav.). Taigi DACT2 metilinimas gali būti laikomas vertingu nauju prognostiniu veiksniu pacientams, sergantiems ankstyvąja storosios žarnos vėžio stadija. Vis dar neaiškus DACT2 metilinimo mechanizmas progresuojant storosios žarnos vėžiui. Dabartiniai duomenys rodo, kad kai kuriais atvejais abejotiną DNR metilinimą gali tiesiogiai sukelti ankstesni genetiniai ar molekuliniai pokyčiai, o DNR metilinimą taip pat gali pakeisti skirtingos aplinkos sąlygos, dieta ir lėtinis uždegimas. 31, 32, 33, 34, 35 DACT2 metilinimo storosios žarnos vėžiu mechanizmas ateityje turėtų būti nagrinėjamas atliekant epidemijos analizę ir gyvūnų modelius.

Apibendrinant, mes nustatėme naują funkcinį naviko slopintuvo geną DACT2, inaktyvuotą dėl promotoriaus metilinimo gaubtinės žarnos vėžyje . DACT2 slopina storosios žarnos vėžio augimą, slopindamas Wnt / β-katenino signalizaciją dviem būdais (5d pav.). Viena vertus, DACT2 griežtai kontroliuoja β-katenino transkripcijos aktyvumą, tiesiogiai blokuodamas β-katenino – LEF1 komplekso susidarymą branduolyje. Kita vertus, DACT2 skatina β-katenino translokaciją į citoplazmą ir atkuria β-katenino / E-kadherino jungiamąją vietą adreno jungtyse per tiesioginę sąveiką su β-kateninu. Naviko audiniuose aptiktas DACT2 metilinimas buvo susijęs su trumpesniu išgyvenimu ankstyvose storosios žarnos vėžio stadijose. Taigi DACT2 metilinimas gali būti naudingas biologinis žymeklis ankstyvosios storosios žarnos vėžio stadijoje.

medžiagos ir metodai

Ląstelių linijos

Aštuonios storosios žarnos vėžio ląstelių linijos (SW480, LoVo, LS 180, Caco-2, HT-29, DLD-1, SW620 ir HCT116), HEK-293 ir HEK 293T buvo gautos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (Manassas, VA, JAV) ). Ląstelių linijos buvo palaikomos pagal „American Type Culture Collection“ protokolus.

Pirminis storosios žarnos navikas ir normalių audinių mėginiai

Prieš bet kokią terapinę intervenciją, kaip aprašyta anksčiau, operacijos metu iš storosios žarnos vėžio pacientų buvo paimti pirminio storosios žarnos naviko biopsijos mėginiai. 36 DACT2 metilinimas buvo ištirtas 67 pacientams, kuriems nustatytas patvirtintas storosios žarnos vėžys. Tai sudarė 36 vyrai ir 31 moteris. Vidutinis pacientų amžius buvo 62, 7 metai (diapazonas - 32–84 metai). Be to, kaip normali kontrolė buvo paimta 12 amžių atitinkančių sveikų asmenų storosios žarnos gleivinės. Tyrimo protokolą patvirtino Honkongo Kinijos universiteto Klinikinių tyrimų etikos komitetas.

Plazmidės

Informacija apie sukonstruotas plazmides yra išvardyta 3 papildomoje lentelėje. PcDNA3.1-Flag-β-catenin, pcDNA3.1-Flag-β-catenin (S33Y), HA-tagged LEF1 and HA-tagged β-catenin constracts buvo maloniai aprašyti. teikia dr. Zhijie Chang (Tsinghua universiteto medicinos mokykla).

RNR ekstrahavimas ir pusiau kokybinis atvirkštinės transkripcijos PGR

Visa RNR buvo ekstrahuota naudojant reagentą „Trizol“ (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV). Iš visos RNR buvo susintetinta papildoma DNR, naudojant atvirkštinę transkriptoriaus transkriptazę (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN, JAV). DACT2 genas buvo sustiprintas β- aktinu kaip vidine kontrole. Grunto sekos išvardytos 4 papildomoje lentelėje.

DNR ir BGS bisulfito modifikacija

Apdorojimas DNR bisulfitu ir BGS analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau (4 papildoma lentelė; 1b pav.). Buvo įvertinta 37 penkiolika CpG vietų, kurių transkripcijos pradžios vieta buvo nuo –4 iki +85.

Stabilių DACT2 ekspresuojančių ląstelių sukūrimas

Retrovirusai pBABE-puro-DACT2 arba pBABE-puro kontrolė buvo gaminami kartu transfekuojant 293FT ląsteles su pBABE-puro-Flag-DACT2 arba pBABE-puro tuščiais vektoriais ir dviem pakavimo plazmidėmis pUMVC ir pCMV-VSV-G (Addgene, Cambridge, MA), JAV). HCT116 arba HT-29 ląstelės buvo užkrėstos retrovirusu ir atrinktos puromicinu (Invitrogen).

Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas MTS tyrimu (Promega, Madison, WI, JAV).

Apoptosis assay

Apoptosis was determined by dual staining with APC Annexin V (Cat. No. 550474, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) and 7-AAD (7-amino-actinomycin; Cat. No. 559925, BD Biosciences) as described previously. 7

Colony formation assay

For DACT2 knockdown assay, HEK-293 cells were transfected with DACT2 siRNA (sc-95473, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) or negative control siRNA (Santa Cruz Biotechnology). After 24 h transfection, 1000 cells were seeded and cultured for 10–14 days. Colonies (50 cells/colony) were counted.

Inactivation of nuclear export by Leptomycin B

HT-29 cells were transfected with pcDNA3.1-Flag-DACT2. Twenty-four hours post transfection, Leptomycin B (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA; dissolved in methanol) was added to the culture medium to a final concentration of 50 n M . After 4 h incubation, cells were then fixed with 4% paraformaldehyde and DACT2 cellular localization was analyzed by immunofluorescence staining.

Western blot

Total protein was extracted from cells' pellet. Thirty micrograms of protein from each sample were separated on 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred onto nitrocellulose membranes (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Blots were immunostained with primary antibody and secondary antibody. GAPDH served as a loading control. Antibodies are listed in Supplementary Table 5.

Fluorescent immunohistochemistry

HCT116 or HT-29 cells were fixed and stained with primary antibodies (anti-FLAG M2, β-Catenin (D10A8) XP and E-Cadherin (24E10) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA): 1:50 dilution) as described previously. 37 Images were captured by fluorescent microscopy.

Dual-luciferase reporter assay

HEK293T cells were plated in 24-well plates and co-transfected with various plasmids as indicated in the figures. Cells were colleceted 24 h post transfection and luciferase activities were analyzed by the dual-luciferase reporter assay system (Promega). Reporter activity was normalized to the control Renilla.

Invasion assay

Stable DACT2-expressing or control HCT116 cells were transfected with 50 n M E-cadherin siRNA (sense: 5'-GAUUGCACCGGUCGACAAA dTdT-3') (RiboBio, Guangzhou, China) or control siRNA (RiboBio). Forty-eight hours post transfection, cells were collected for western blot and Transwell assays using a BD BioCoat Growth Factor Reduced MATRIGEL Invasion Chamber (BD Biosciences) as described previously. 38

Co-immunoprecipitation

Co-immunoprecipitation analyses were carried out as previously described. 37 Briefly, total protein was extracted from HCT116 cells (~5 × 10 6 /reaction) in radio-immunoprecipitation assay buffer. Immunoprecipitation was performed using anti-Flag M2 antibody (Sigma-Aldrich) and Protein G-agarose beads (sc-2002, Santa Cruz Biotechnology) overnight at 4 °C. Finally, the precipitated proteins were denatured and evaluated by western blot.

In vivo tumorigenicity and metastasis assays

Stable DACT2-expressing or control HCT116 cells (1 × 10 6 cells in 0.2 ml phosphate-buffered saline) were injected subcutaneously into the right or left dorsal flank of each 4-week-old male Balb/c nude mice, respectively. Tumor volume was measured every 2 days for 11 days. The tumors were excised and embedded in paraffin.

Male Balb/c nude mice (4 weeks old) were used, and each experimental group (control and DACT2) consisted of four mice. Stable DACT2-expressing or control HCT116 cells (1 × 10 6 ) were injected intravenously through the tail vein into each nude mouse. All mice were killed 8 weeks after injection. The lungs from each mouse were excised and embedded in paraffin for hematoxylin and eosin staining. All experimental procedures were approved by the Animal Ethics Committee of the Chinese University of Hong Kong.

Hematoxylin and eosin staining and immunohistochemistry

The paraffin-embedded tumor tissue and lung tissue sections were deparaffinized, rehydrated and stained with hematoxylin and eosin following standard protocols. 39 Ki-67 immunohistochemistry was performed using the Histostain-Plus Bulk Kit (Invitrogen) as described previously. 7

Statistinė analizė

Data are presented as mean±sd The independent Student's t -test was used to compare the difference between the two preselected groups. The difference in tumor growth rate between the two groups of mice was determined by repeated-measures analysis of variance. The χ 2 test was used for comparison of patient characteristics and DACT2 methylation. The univariate and multivariate Cox regression analysis was performed to assess the prognostic value of DACT2 methylation. Overall survival in relation to methylation status was evaluated by the Kaplan–Meier 5-year survival curve and the log-rank test. Value of P <0.05 was considered to be statistically significant.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos lentelės

  2. 2.

    Papildoma paveikslo legenda

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas paveikslas

    Prie šio dokumento pridedama papildoma informacija „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)