Dasatinibas skatina atra sukeltą aml ląstelių diferenciaciją | leukemija

Dasatinibas skatina atra sukeltą aml ląstelių diferenciaciją | leukemija

Anonim

Dasatinibas yra JAV maisto ir vaistų administracijos patvirtintas junginys, kuris buvo sukurtas kaip ABL ir Src šeimos kinazių (SFK) inhibitorius. 1 Dasatinibas yra daug stipresnis už imatinibą prieš laukinio tipo BCR – ABL. Be to, išskyrus T315I mutantą, dasatinibas išlaiko aktyvumą prieš daugumą imatinibui atsparių BCR – ABL mutantų, padėdamas paaiškinti dasatinibo efektyvumą visose imatinibui atspariose LML stadijose. Dasatinibo veiksmingumą LML sustiprina šio junginio gebėjimas slopinti SFK narį LYN, kuris nuolat hiperaktyvuojamas sergant imatinibui atsparia liga. 2

Naujausi tyrimai atskleidė dasatinibo poveikį kraujodaros ląstelėms, išskyrus LML, ir pasiūlė papildomų gydymo galimybių bei neigiamą toksiškumą. Dasatinibas slopina osteoklastų ir su naviku susijusių makrofagų gamybą, taip pat osteoklastų, trombocitų, T ląstelių ir natūralių žudikių ląstelių funkcinį aktyvumą. 3, 4, 5, 6, 7, kadangi šie ląstelių tipai neišreiškia BCR – ABL, SFK narių, tokių kaip LYN, ar kitų kinazės taikinių slopinimas greičiausiai lemia dasatinibo poveikį šioms ląstelėms.

Ūmus mieloidinės leukemijos (AML) dažnis yra didelis SFK ekspresija ir (arba) hiperaktyvacija, tačiau dasatinibo poveikis šiai ligai beveik nežinomas. AML yra įvairus piktybinis navikas, kuriam būdinga defektinė mieloidinė diferenciacija ir proliferacinių blastų kaupimasis. Vienas AML potipis - ūminė promielocitinė leukemija (APL) - diferencijuojasi reaguojant į gydymą viso trans-retino rūgštimi (ATRA), o ATRA ir chemoterapijos derinys lemia aukštą šios ligos išgydymo laipsnį. Tačiau kiti AML potipiai, atstovaujantys didžiąją dalį AML atvejų, beveik nereaguoja į ATRA diferenciacijos terapiją. Anksčiau parodėme, kad SFK gali neigiamai reguliuoti mieloidinę diferenciaciją. 8 Šioje ataskaitoje mes siekėme išsiaiškinti, ar AML ląstelių linijų ir pirminių ląstelių gydymas dasatinibu gali atkurti ar sustiprinti ATRA sukeltą diferenciaciją.

Norint nustatyti gydymo dasatinibu įtaką mieloidinei diferenciacijai, HL-60 ir NB4 ląstelės buvo inkubuotos su dasatinibu, esant arba neturint ATRA, po to atlikta mieloidinio diferenciacijos žymens CD11b srauto citometrinė analizė (1a ir b paveikslai). HL-60 ląstelės buvo gautos iš paciento, sergančio AML (FAB M2), o NB4 - iš paciento, sergančio APL (FAB M3). Auginant ATRA, abu iš jų granulocitiškai diferencijuojasi. Norėdami nustatyti, ar dasatinibas padidins ATRA sukeltą diferenciaciją šiuose ląstelių linijų modeliuose, mes panaudojome ATRA dozes, kurios 72 val. Tyrime davė tik žemą diferenciacijos lygį (1 μM HL-60; 0, 01 μM NB4; pav.) 1a ir b, duomenys nepateikti). Dasatinibas buvo vartojamas tokiomis dozėmis (100, 500 nM ir 1, 0 μM), kurios nepakeitė ląstelių gyvybingumo (neparodyta). 1a ir b paveikslai rodo, kad gydymas vien dasatinibu neskatina diferenciacijos. Priešingai, vartojant kartu su dasatinibu ir ATRA 72 valandas, buvo pastebimai indukuota CD11b raiška, palyginti su tuo, kuris pasireiškė vartojant vien ATRA ar dasatinibą. ATRA sukeltos diferenciacijos padidėjimas buvo pastebėtas naudojant dasatinibo koncentraciją, kuri buvo mažiausia 100 nM. Kokybiškai ir kiekybiškai panašūs rezultatai buvo gauti, kai diferenciacija buvo įvertinta pagal citocheminį dažymą nitroblue tetrazolium (1 papildoma lentelė).

Image

Dasatinibas skatina ATRA sukeltą AML ląstelių linijų ir pirminių ne APL AML ląstelių diferenciaciją. HL-60 ( a ) ir NB4 ( b ) ląstelės buvo 72 valandas apdorotos 0, 1% DMSO, vien ATRA (1 μM esant HL-60 ir 0, 01 μM, kai NB4), vien dasatinibo (Das; 100, 500 n M arba 1 μM), arba ATRA ir įvairių dasatinibo dozių derinys. Po apdorojimo ląstelės buvo inkubuotos su anti-CD11b-PE antikūnu arba su izotipu suderintu antikūnu, po to atlikta CD11b ekspresijos citometrinė analizė. Stulpeliai parodo trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkį ir paryškina juos. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas atliekant vienpusę dispersijos analizę, po kurios sekė Tukey daugybinis palyginimo testas. c ) Leukemijos pūsleliai buvo surinkti iš FAB M5 AML sergančio paciento periferinio kraujo, gavus informuotą sutikimą pagal institucines gaires, po to išskiriami naudojant Ficoll-Paque Plus. Atskirti blastai buvo gydomi 72 valandas vien tik 0, 1% DMSO, vien tik 1 μM dasatinibo, 2 μM ATRA atskirai arba dasatinibo ir ATRA deriniu. Po apdorojimo CD11b-teigiamų ląstelių procentas buvo nustatytas srauto citometrine analize. Duomenys pateikiami kaip CD11b-teigiamų ląstelių procentinės dalies padidėjimas, palyginti su DMSO apdorota kontrole. Eksperimentas buvo atliktas du kartus su panašiais rezultatais.

Visas dydis

Norėdami ištirti, ar dasatinibas gali būti naudojamas atkurti ATRA sukeltą diferenciaciją pirminėse AML ląstelėse, turinčiose ne APL potipį, gydėme paciento, kuriam diagnozuotas AML FAB M5 potipis, leukeminius blastus (1c pav.). Kaip parodyta, vartojant kartu su dasatinibu ir ATRA, padidėjo diferenciacija, palyginti su gydymu vien tik vienu agentu. Šie duomenys rodo, kad FDA patvirtintas dasatinibas kartu su ATRA gali suteikti terapinę naudą gydant ne APL AML, kai dabartiniai chemoterapijos režimai yra susiję su dideliu neigiamu toksiškumu ir tik nedideliu išgyvenamumo pagerėjimu.

Mūsų išvados atitinka naujausius duomenis, kad tirozinkinazės inhibitoriai gefitiniibas ir erlotinibas gali būti naudojami mieloidų diferenciacijai skatinti. 9, 10, 11 Įspūdingai įrodyta, kad nesteroidinio širdyje užsikrėtusių pacientų, sergančių tuo pat metu AML, gydymas EGFR inhibitoriumi erlotinibu sukelia AML remisiją. 12, 13 Gefitinibo ir erlotinibo poveikį AML, atrodo, lemia netikslinis poveikis kitoms tirozino kinazėms, galbūt SFK, nes AML ląstelės neišreiškia EGF receptorių. Mes siūlome, kad panašus terapinis aktyvumas prieš AML gali būti pasiektas naudojant dasatinibo / ATRA derinį.

SFK yra pagrindiniai dasatinibo taikiniai ir daugelyje AML mėginių yra pernelyg išryškinti ir (arba) hiperaktyvinti. Imunoblotuojant bendrą baltymų kiekį, paaiškėjo, kad HL-60 ir NB4 ląstelės ekspresuoja SFK narius LCK, LYN, FYN, HCK ir c-SRC, tuo tarpu pirminės AML (FAB M5) ląstelės ekspresuoja LCK, LYN ir HCK (duomenys nepateikti). Norėdami nustatyti, kuris iš šių SFK buvo aktyvios formos, mes atlikome imunodeficito tyrimus, kurių metu iš ląstelių lizato buvo imuniniu būdu nusodinti specifiniai SFK, po to atliktas imunoblotavimas antikūnu (α-fosfoSRC Y418), atpažįstančiu daugelio SFK narių fosforilintą / aktyvuotą formą. Šie eksperimentai parodė, kad imunodeficituotas LYN rezultatas buvo beveik visiškas fosforilintų / aktyvuotų SFK pašalinimas iš HL-60 ir NB4 ląstelių lizatų (2a ir c pav.), Taip pat iš pirminių AML ląstelių (papildomas 1 paveikslas). Kartu fosforilinti / aktyvinti fermentai buvo aptikti tik LYN imunoprecipitato nuosėdose (2b ir d paveikslai). Šie rezultatai rodo, kad LYN yra dominuojanti aktyvuota SFK tiriant HL-60, NB4 ir pirmines AML ląsteles, ir tai atitinka naujausius Dos Santos ir kt. Stebėjimus . 14 atkreipia dėmesį į vyraujantį LYN aktyvavimą AML ląstelėse. Šios išvados taip pat iškelia galimybę, kad selektyvus LYN taikymas gali būti naudingas optimizuojant ATRA sukeltą diferenciaciją, suteikiant dar daugiau patikslinimo ir įtakos mūsų atradimui, kad gydymas dasatinibu gali sustiprinti ATRA stimuliuotą AML diferenciaciją.

Image

LYN yra dominuojanti aktyvuota SFK AML ląstelėse. Iš HL-60 ( a, b ) arba NB4 ( c, d ) ląstelių susidariusios lizatų ląstelės buvo imunoprecipitacinės su kontroliniais IgG antikūnais arba antikūnais, nukreiptais prieš bendrą LCK, LYN, FYN, HCK arba c-SRC baltymus. Po skirtingų SFK imunoprecipitacijos, ląstelių lizatai ( a, c ) ir nusodinti granulės ( b, d ) buvo imituojami naudojant anti-fosfo-SFK antikūną (α-phosphoSRC Y418). Įvestieji (neapdoroti) lizatai buvo įpilti į kairiąsias juostas kaip kontroliniai, o imituotų lizatų blotai buvo nuimti ir pakartotinai įterpti anti-β-aktinu, kad būtų parodytas vienodas baltymų kiekis. Imunologinis LYN pašalinimas sąlygojo aktyvuotų SFK pašalinimą iš lizatų ir aktyvuotų SFK atsiradimą LYN imuniteto nuosėdų granulėse. Eksperimentai buvo atlikti tris kartus, kiekvieną kartą gaunant panašius rezultatus.

Visas dydis

Interesų konfliktas

Autoriai teigia, kad interesų konflikto nėra.

Papildoma informacija

„Powerpoint“ failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento Leukemijos svetainėje (//www.nature.com/leu)