Mirties domeno turintis baltymas unc5cl yra naujas nuo myd88 nepriklausomas priešuždegiminės irak signalizacijos kaskados aktyvatorius | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Mirties domeno turintis baltymas unc5cl yra naujas nuo myd88 nepriklausomas priešuždegiminės irak signalizacijos kaskados aktyvatorius | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Anotacija

Mirties srities (DD) baltymų šeima dalyvauja daugelyje ląstelių procesų, įskaitant apoptozę, uždegimą ir vystymąsi. Viena iš šių molekulių, adapterio baltymas „MyD88“, yra pagrindinis įgimto ir adaptacinio imuniteto veiksnys, integruojantis signalus iš Toll tipo receptorių / interleukino (IL) -1 receptorių (TLR / IL-1R) superšeimos, suteikiant aktyvacijos platformą Su IL-1R susijusios kinazės (IRAK). Čia parodome, kad DD turintis baltymas Unc5CL (dar žinomas kaip ZUD) yra susijęs su nauju nuo MyD88 nepriklausomu IRAK signalizacijos būdu, kurio kulminacija yra transkripcijos faktoriaus branduolio faktoriaus kappa B (NF- κ B) ir c- Birželio N-galo kinazė. „Unc5CL“ reikėjo su IRAK1, IRAK4 ir TNF receptoriais susieto 6 faktoriaus, bet ne „MyD88“, kad galėtų suaktyvinti šiuos kelius. Įdomu tai, kad baltymas iš esmės konstruojamas autoproteolitiškai ir yra pritvirtintas savo N-galu konkrečiai prie gleivinės epitelio ląstelių viršūnės. Transkripcinis profiliavimas nustatė daugiausia chemokinus, įskaitant IL-8, CXCL1 ir CCL20 kaip Unc5CL taikinius. Ryški jo išraiška gleivinės audiniuose, taip pat gebėjimas sukelti prouždegiminę programą ląstelėse rodo, kad Unc5CL yra epitelio uždegimo ir imuniteto veiksnys, taip pat genas kandidatas, dalyvaujantis gleivinės ligose, tokiose kaip uždegiminė žarnyno liga.

Pagrindinis

TLR / IL-1R receptorių šeimai tenka pagrindinis vaidmuo formuojant imuninį atsaką integruojant signalus iš patogenais susijusių molekulinių modelių ir labai uždegiminius citokinus IL-1 ir IL-18. 1, 2 Visi šie receptoriai, išskyrus garsųjį TLR3, naudoja Toll – IL-1R (TIR) ​​ir mirties domeną (DD) turintį adapterio baltymą MyD88, norėdami sukelti signalo perdavimo kelią, kuris baigiasi aktyvinant pro -uždegiminis transkripcijos faktorius NF- κB ir mitogenų suaktyvintos baltymų kinazės. 3, 4, 5, 6, 7 Po ligando sukeltos receptoriaus dimerizacijos, MyD88 yra įtraukiamas į citozolinį TIR domeną per homotipinę TIR – TIR sąveiką. Tai gali įvykti tiesiogiai arba per baltymą TIRAP / Mal. Tada „MyD88“ branduolys sudaro trijų komponentų baltymų komplekso komplektaciją, įdarbindamas nuo DD priklausomą kinazę IRAK1, IRAK2 ir IRAK4. 8, 9 Kartu su E3-ubikvitino ligase TRAF6 šie faktoriai tarpininkauja tolesniam signalo sklidimui. 10

TLR / IL-1R signalizacijos ašies svarbą sveikatai ir ligoms pabrėžia ryšys su daugybe žmogaus piktybinių navikų. Tai apima ne tik pacientų, sergančių MyD88 ir IRAK4, jautrumą pyogeninėms bakterinėms infekcijoms, bet ir jų įtaką uždegiminiams sutrikimams, autoimunumui ir vėžiui. 11, 12, 13

DD turintys baltymai, įskaitant MyD88 ir IRAK, taip pat dalyvauja daugelyje ląstelių signalizacijos procesų, įskaitant apoptozę, uždegimą ir vystymąsi. 14, 15 Funkciškai nevienalytis šių baltymų pogrupis pasižymi trišalio domeno modulio, vadinamo ZU5-UPA-DD supramodula, buvimu, kuriame, be DD, yra ZU5 (domenas, esantis ZO-1 ir Unc5). ir UPA (domenas, išsaugotas Unc5, PIDD ir Ankyrin) domenas. Žinduoliams šią šeimą sudaro PIDD (p53 sukeltas baltymas su DD), Ankyrins1-3, transmembraniniai receptoriai Unc5A-D ir blogai apibūdinamas baltymas Unc5CL (1a pav.). Remiantis Unc5B tarpląstelinės dalies kristalinės struktūros skiriamąja geba, Wang et al. 16 pasiūlė konservuotą šių molekulių aktyvavimo mechanizmą, kuriame ZU5 domenas sekvestuoja tiek UPA, tiek DD, laikydamas jas savaime supresuotoje būsenoje.

Image

„Unc5CL“ domenų organizavimas ir autoproteolitinis apdorojimas. a ) ZU5-UPA-DD turinčių baltymų domenų organizacija. ( b ) Daugybinis žmogaus (hs) ir pelių (mm) Unc5CL baltymų sekų suderinimas, supantis tariamą autoproteolitinę HFS vietą, su atitinkamomis sekomis iš Nup98 ir PIDD. Trikampis: specifinė skilimo vieta; juodas atspalvis: identiškos amino rūgštys; pilkas atspalvis: panašios aminorūgštys. ( c ) HEK293T ląstelės buvo transfekuotos nurodytais C-galo FLAG pažymėtais Unc5CL taško mutantais. Baltymai, pažymėti FLAG, buvo analizuojami Western blot metodu. d ) autoproteolitinio skilimo mechanizmas HFS vietose. Autoproteolizei HFS vietoje buvo pasiūlytas trijų pakopų mechanizmas. Pirmiausia histidinas (His227) dalyvauja dezineruojant serino liekanos (Ser229) hidroksilo grupę. Serino hidroksilo grupė tada funkcionuoja kaip nukleofilas ant ankstesnio amido jungties ir sukelia N → O acilo poslinkį. Sukurtas esteris hidrolizuojamas ir skaidomasi tarp fenilalanino ir serino liekanų. ( e ) HEK293T ląstelės buvo transfekuotos nurodytais C-galo FLAG pažymėtais Unc5CL variantais. Baltymai, pažymėti FLAG, buvo nusodinti, išplaunami ir inkubuojami su 200 mM hidroksilamino (NH2OH) ± 2% SDS, kaip aprašyta nurodytais laiko momentais. Baltymai buvo analizuojami Western blot metodu. ( c ir e ) FL, Unc5CL viso ilgio baltymai; C, Unc5CL C-galo skilimo fragmentas

Visas dydis

Viename tyrime Unc5CL buvo pasiūlytas kaip neigiamas NF-κB reguliatorius, reaguodamas į įvairius dirgiklius, įskaitant TNF-R1, TRAF2, TRAF6, IKK β ir p65 perraišką arba stimuliaciją TNF α ir IL-1 β . 17 Priešingai nei ankstesni pastebėjimai, Unc5CL identifikuoja kaip priešuždegiminio signalizacijos kaskados, sukeliančios NF- κB ir JNK, induktorių. Pasiskirstęs kelias atskleidžia ryškų panašumą į signalinius įvykius, atsirandančius pasibaigus TLR / IL-1R, apimančius kinazes IRAK1, IRAK4 ir E3-ubiquitin ligazę TRAF6, bet stebėtinai ne adapterio baltymą MyD88, kuris paprastai reikalingas priklausomai nuo IRAK / TRAF6. signalizacijos. Baltymai rodo labai specifinį pasiskirstymą audiniuose, daugiausia aptinkamus gimdos ir plonosios žarnos mėginiuose. Be to, per N-galinį transmembraninį inkarą Unc5CL yra specialiai susijęs su gleivinės epitelio ląstelių viršūnine membrana. Apibendrinant, mūsų rezultatai atskleidžia iki šiol nenustatytą priešuždegiminį signalizacijos kelią gleivinės epitelio ląstelėse, kuris suteikia nuo MyD88 nepriklausomą antrąją IRAK priklausomo signalizacijos ašį lygiagrečiai evoliuciškai išsaugotai TLR / IL-1R sistemai. Dėl savo priešuždegiminio aktyvumo, taip pat dėl ​​stulbinamai specifinio audinių pasiskirstymo gleivinės epitelyje Unc5CL yra nauja kandidatė į gleivinės uždegimą, imunitetą ir ligas.

Rezultatai

„Unc5CL“ domenų organizavimas

Pirmiausia Unc5CL buvo aprašytas kaip naujas ZU5 ir DD turintis baltymas, daugiausia homologiškas Unc5 receptorių šeimos narių tarpląsteliniams fragmentams. 17 Įdomu tai, kad rentgeno spinduliuotės žiurkės Unc5B viduląstelinio domeno išskaidymas parodė trišalę domeno organizaciją, apimančią anksčiau aprašytus ZU5 ir DD, taip pat naują centrinį UPA domeną. 16 Norėdami įvertinti, ar „Unc5CL“ taip pat yra toks ZU5-UPA-DD supramodulas, mes panaudojome Jpred3, kad nuspėtume antrinę Unc5CL struktūrą ir palygintume ją su eksperimentiškai nustatytais žiurkės „Unc5b“ viduląstelinių domenų ypatumais (papildomas paveikslas S1). 18 Lygiavimas poromis naudojant „ClustalW“ parodė 34% sekų panašumą. Be to, tarp analizuotų sekų buvo išsaugota dauguma antrinių struktūrų. Šie stebėjimai pateikia įrodymų, kad Unc5CL iš tikrųjų turi ZU5-UPA-DD supramodulį ir mes anotuojame ZU5 nuo aa 100 iki 237, UPA nuo aa 243 iki 385 ir DD nuo aa 402 iki 491 (1a pav.).

Tolesnė analizė naudojant transmembraninės spiralės prognozavimo įrankį TMHMM nustatė anksčiau nepraneštą N-galo transmembraninį domeną, apimantį aa 13–35. Tai rodo, kad Unc5CL nėra citozolinis, o membranoje įtvirtintas baltymas (1a pav.). 20

Iš pradžių mes klonavome žmogaus Unc5CL cDNR iš CaCo-2 ląstelių („GenBank“ prisijungimas: JF681947), kuri atitinka dabartinę NCBI atskaitos seką (NM_173561.2). Įdomu tai, kad mes pastebėjome, kad ši seka skiriasi vienu nukleotidu nuo cDNR, panaudoto ankstesniame tyrime su „Unc5CL“ („GenBank“: AY510109), atitinkančiu nesinoniminį SNP variantą (dbSNP ID: rs742493). 17 Šiame anksčiau naudotame variante yra glicinas 432 padėtyje (432G), o ne kanoninis argininas (432R), lokalizuotas numatomame DD antrajame alfa spiralėje (1a paveikslas, papildomas S1 paveikslas). Todėl nusprendėme į savo eksperimentus įtraukti ir „Unc5CL 432G“, ir „432R“ variantus.

PIDD yra ZU5-UPA-DD supramodulas, turintis baltymą, kuriam reikalingas autoproteolitinis perdirbimas dviejose pagrindinėse HFS tripeptido vietose jo biogenezei ir aktyvacijai (1a pav.). Plyšimas HFS vietoje taip pat dalyvauja branduolinio apvalkalo baltymo Nup98 biogenezėje. 22 Stebėtina, kad atlikdami sekų palyginimą, mes nustatėme bona fide HFS vietą Unc5CL (aa 227–229), bet ne kituose ZU5-UPA-DD turinčiuose baltymuose, o tai rodo, kad Unc5CL taip pat gali būti skaidomas autoproteolitiškai (1a ir b paveikslai). ir papildomas paveikslas S1).

Unc5CL autoproteolitinis apdorojimas

Kai Unc5CL buvo ekspresuotas HEK293T ląstelėse ir analizuotas atliekant Western blot analizę, mes galėjome aptikti juostą, atitinkančią viso ilgio baltymą maždaug 58 kDa, o apatinę migruojančią juostą - maždaug 32 kDa. Šie molekuliniai svoriai atitinka numatomą fragmentų, kurie susidarys suskaidžius Unc5CL HFS vietoje, dydį (1c paveikslas). Iš tikrųjų HFS taškų mutantų ekspresija pablogino Unc5CL skilimo fragmento atsiradimą. Tik mutantas, turintis HFT vietą, vis dar rodė perdirbimo liekanas, o tai atitinka siūlomus šio skilimo atvejo reikalavimus (1d pav.). Norėdami dar labiau patvirtinti autoproteolizinės HFS vietos buvimą Unc5CL, mes panaudojome mutantą, kuriame HFS serinas keičiamas cisteinu (HFC). Ankstesni Nup98 ir PIDD tyrimai parodė, kad šią vietą galima suskaidyti, susidarant tioesterio tarpiniam junginiui per N → S acilo poslinkį. 21, 22 Tačiau norint suskaidyti tioesterio tarpinį produktą, reikia pridėti nukleofilinį agentą hidroksilaminą. Norėdami patikrinti, ar Unc5CL HFC taip pat sudaro tioesterio tarpinę medžiagą, išanalizavome jautrumą hidroksilamino sukeltam skilimui (1e pav.). Kaip ir tikėtasi, Unc5CL HFC inkubavimas su hidroksilaminu sukėlė C-galo skilimo fragmento susidarymą, kurį galėjo slopinti išankstinis inkubavimas su 2% SDS, sukeliantis baltymų denatūraciją. Visi šie rezultatai pateikia įrodymų, kad Unc5CL, kaip ir Nup98 bei PIDD, autoproteolitiškai skaidomas HFS vietoje.

Unc5CL membranų asociacija ir topologija

Norint patvirtinti, kad Unc5CL yra membranos integruotas baltymas, buvo naudojamas TX-114 fazių atskyrimo būdas. Kaip buvo tikėtasi, stabiliai per daug ekspresuoti Unc5CL variantai su nepažeistais N galais (wt, ΔDD ir S229A) daugiausia buvo aptikti membranos frakcijoje (papildomi S2a, b ir d paveikslai). Priešingai, hidrofilinėje frakcijoje buvo rastas mutantas, neturintis N-galo transmembraninio segmento (ΔTM), rodantis, kad ši baltymo dalis tarpininkauja membranų asociacijai (papildomi S2a, b ir d paveikslai).

N-gale pritvirtinti baltymai gali būti įterpti į membranas dviem kryptimis. II tipo inkariniuose baltymuose N-galas lieka citozolyje, o C-galas perkeliamas į ER liumeną, tuo tarpu III tipo inkaro baltymuose topologija yra atvirkštinė. 24 „Unc5CL“ atveju, krūvio pasiskirstymas aplink TM domeną rodo III tipo topologiją („teigiamos vidaus taisyklė“; papildomas S2a paveikslas). Tai patvirtino proteinazės K apsaugos testai (papildomi S2a ir c paveikslai). Šie rezultatai patvirtina, kad Unc5CL yra pritvirtintas prie N-galo ląstelių membranoje su C galu, kuriame yra DD, veikiamas citozolio.

Audinių pasiskirstymas ir tarpląstelinė lokalizacija

Užklausus GNF1M pelių audinių atlasą, galima pamatyti Unc5CL raišką gimdoje, plonojoje žarnoje ir užkrūčio liaukoje (papildomas S3 paveikslas). Norėdami tai patvirtinti baltymų lygiu, pelės audinio grupė buvo patikrinta naudojant antikūnus prieš Unc5CL DD (2a pav.). Remiantis mikrotraumų duomenimis, Unc5CL baltymas buvo apribotas gimdoje, kiaušidėse ir virškinimo trakte, pasižymintis ryškia plonojoje žarnoje. Be to, šiuose audiniuose buvo lengvai aptinkamas C-galo skilimo fragmentas, rodantis, kad baltymas yra veiksmingai ir konstituciškai perdirbamas in vivo . Išraiška plonojoje žarnoje ir gaubtinėje žarnoje galėtų būti toliau apribota epitelio ląstelėmis. Unc5CL baltymas ir mRNR buvo praturtinti epitelinių ląstelių preparatais iš eilės plonojo žarnyno segmentų, juos taip pat buvo galima aptikti storosios žarnos epitelio ląstelėse, nors ir mažesniu mastu (2b ir c paveikslai). Iš daugelio ląstelių linijų, kurioms buvo patikrinta Unc5CL ekspresija, tik žmogaus kolorektalinės CaCo-2 ląstelės parodė įtikinamą signalą Western blot'e (2d pav.). Remiantis in vivo gautais rezultatais, C-galo skilimo fragmentas buvo svarbiausia aptinkama forma. Signalo specifiškumas buvo patvirtintas numušant, naudojant Unc5CL specifines shRNR (2d pav.). Kaip ir HEK293T ląstelėse, Unc5CL buvo rastas CaCo-2 ląstelių membranos frakcijoje (2e pav.).

Image

Unc5CL audinių pasiskirstymas ir tarpląstelinė lokalizacija. ( A ) Unc5CL specifinis viso audinio lizato iš nurodytų audinių lizato vesternų dėmė arba perženklintas nepažymėtas Unc5CL kaip žymeklis. ( B ) Santykinė Unc5CL mRNR išraiška epitelinių ląstelių preparatuose iš eilės plonosios žarnos (1–6) arba storosios žarnos segmentų. Duomenys parodo techninių trigubų vidutines vertes ± SD. ( C ) Unc5CL specifinis Vakarų dėmės žarnyno (1–6) ir storosios žarnos epitelio mėginiai, parodyti ( B ). ( D ) Unc5CL specifinis Western blot iš CaCo-2 ląstelių lizatų stabiliai išreiškiantis maketą (scr sh) arba Unc5CL specifinių shRNR (sh1 – sh5). ( E ) baltymai iš CaCo-2 ląstelių buvo atskirti TX-114 fazėmis. Frakcijos buvo analizuojamos Western blot metodu, naudojant nurodytus antikūnus. CytoC, 14 kDa Citochromas C, I, plovikliuose netirpūs baltymai, D, ploviklio fazė, amfifiliniai integraliosios membranos baltymai, A, vandeninė fazė, hidrofiliniai baltymai. ( F ) „z-stack“ rekonstravimas atlikus per daug išspaustos C-galo FLAG pažymėto Unc5CL (Unc5CL) arba Unc5CL, neturinčio transmembraninio domeno (ΔTM) CaCo-2 ląstelėse, naudojant konfokalinę mikroskopiją, naudojant FLAG specifinius antikūnus. ( G ) (a – c) Imunofluorescencinis Unc5CL dažymas atliekant kriosekcijas iš UŠT įterptos gimdos, naudojant Unc5CL specifinius antikūnus. Mėlyna: branduolinis DAPI dažymas. (a, b) žalia: Unc5CL, c) izotipo valdymas (FLAG). ( A, D ir E ) Žvaigždutės žymi neapibrėžtas juostas

Visas dydis

CaCo-2 ląstelės sudaro poliarizuotą žarnyno epitelį (įskaitant sandarius sujungimus ir viršūninius mikrovidurius), kai yra užaugintos iki konluencijos, ir yra gerai žinomas žarnyno fiziologijos modelis. Todėl mes nusprendėme naudoti šias ląsteles, kad nustatytume Unc5CL poodrąstelinę lokalizaciją. Įdomu tai, kad negimdinis Unc5CL buvo aptiktas daugiausia į viršūninio veido mikrovilnius panašiose struktūrose, tuo tarpu mutantui, kuriam trūko transmembraninio domeno, buvo citozolinis pasiskirstymas (2f paveikslas; papildoma S4a pav.). Remdamiesi šiuo pastebėjimu, mes pastebėjome, kad Unc5CL yra labai praturtintas pelių žarnyno šepetėlio membranos pūslelėse, gautose iš mikrovidurių, (papildomi S4b ir c paveikslai). Imunohistochemija, naudojant Unc5CL specifinius antikūnus, rodo panašią viršūninio epitelio lokalizaciją gimdos audiniuose (2g paveikslas; papildomas S5 paveikslas).

Unc5CL yra NF-κB ir JNK aktyvatorius

Daugybė DD turinčių baltymų dalyvauja signalo perdavimo įvykiuose, sukeliančiuose NF- KB ir JNK aktyvaciją. 14 Kadangi Unc5CL anksčiau buvo susijęs su NF-κB reguliavimu, buvo tikslinga iš naujo įvertinti šiuos duomenis. 17 Priešingai nei ankstesni stebėjimai, per didelis dviejų žmogaus variantų - Unc5CL 432G ir 432R, taip pat pelių Unc5CL - ekspresija lėmė reikšmingą NF-κB indukciją luciferazės tyrime (3a pav.). Įdomu tai, kad 432G variantas buvo ne toks galingas kaip 432R arba atitinkama pelių forma, tai rodo, kad šis vienas aminorūgščių DD variantas turi įtakos baltymo aktyvumui. MyD88, TNF-RI ir TRAF6 buvo naudojami kaip teigiami NF-κB aktyvavimo kontroliniai parametrai. Taikant tą patį testą, mes nustatėme domeno reikalavimus nuo Unc5CL priklausomo NF-κB aktyvacijai (3b pav.). Pirma, HFS į HFA mutantas, turintis įtakos autoproteoliziniam skilimo vietai, nepaveikė NF-κB aktyvacijos, tai rodo, kad skilimo įvykis per se nėra būtinas. Transmembraninio domeno (ΔTM) arba ZU5 domeno (ΔZU5) delecija parodė tarpinį NF- κ B aktyvumo sumažėjimą, kuris yra labiau ryškus naudojant tik C-galo skilimo fragmentą (C), kur trūksta abiejų šių domenų. Taip pat N- ir C-galinių skilimo fragmentų raiška negalėjo pakartoti laukinio tipo baltymo aktyvumo (papildomas paveikslas S6). Labiausiai NF- κB aktyvumas sumažėjo stebint mutantą, kuriam trūko DD (ΔDD), ir tai rodo, kad Unc5CL reikalauja NF-κB indukuoti. Norėdami dar labiau apibūdinti DD ir ZU5 domenų svarbą, mes sukūrėme taškinius mutantus labai konservuotuose regionuose, kurie, kaip buvo numatyta, trukdo šių domenų funkcijai. Remiantis aukščiau aprašytais rezultatais, DD destabilizacija visiškai panaikino NF-κB aktyvavimo gebėjimą, tuo tarpu ZU5 mutantai išlaikė labai mažą aktyvumą (3c paveikslas). Pažymėtina, kad mutacijos, turinčios įtakos ZU5 domenui, taip pat pablogina automatinio apdorojimo galimybes, tai rodo, kad skilimui reikia teisingo šios srities sulankstymo.

Image

Unc5CL yra NF-κB ir JNK aktyvatorius. ( a - c ) HEK293T ląstelės buvo transfekuotos NF-κB luciferazės reporterio geno plazmidėmis kartu su tuščiu vektoriu (EV) ir didinančiomis ar pavienėmis nurodytų ekspresijos konstruktų dozėmis ir buvo tiriamos, atsižvelgiant į NF-κB priklausomą luciferazės aktyvumą 24 val. vėliau. Duomenys parodo techninių trijų egzempliorių vidutines vertes ± SD; rezultatai atspindi trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatus. ( b ir c ) Nurodytos ekspresijos konstrukcijos yra pagrįstos Unc5CL genetiniu variantu 432G. Baltymai buvo analizuojami naudojant FLAG specifinį „Western blot“ ( d ) HEK293 T-Rex ląsteles, stabiliai turinčias doksiciklino indukuojamus ekspresijos konstruktus Unc5CL arba Unc5CLΔDD, nurodytą laiką buvo apdorotos 200 ng / ml doksiciklino. FLAG pažymėtų konstrukcijų ekspresija ir IkB fosforilinimas buvo tiriami Western blot metodu. ( e ) HEK293T ląstelės buvo kartu transfekuotos su FLAG-JNK ir nurodytais konstruktais. Baltymų lizatai buvo analizuojami praėjus 24 valandoms po transfekcijos, naudojant Western blot analizę

Visas dydis

NF- κB aktyvacija, kaip rodo I κB α fosforilinimas, taip pat buvo pastebėta HEK293 T-Rex ląstelėse, kuriose Unc5CL ekspresija indukuojama pridedant doksiciklino (3d pav.).

Signalizacijos kaskados, sukeliančios NF- κB aktyvaciją, taip pat dažnai aktyvina kinazę JNK. Išbandydami Unc5CL šiam gebėjimui perraiškos tyrime, mes iš tikrųjų pastebėjome, kad ir Unc5CL 432G, ir 432R, bet ne mutantas, kuriam trūko DD, išprovokavo kartu išreikšto JNK1 fosforilinimą, patvirtindami, kad Unc5CL yra ne tik NF aktyvatorius. κB, bet ir kinazės JNK (3e pav.).

Pagal transkripcinį profiliavimą chemokinai identifikuojami kaip Unc5CL taikiniai

NF-κB buvo priskirtos kelios funkcijos, įskaitant antiapoptotinių ir priešuždegiminių genų indukciją. Pirmiau aprašyta indukuojama HEK293 T-Rex ląstelių linija, skirta Unc5CL, buvo naudojama mikrotraumos eksperimentuose norint nustatyti genus, kuriuos transkripcijos būdu reguliuoja Unc5CL per didelis ekspresija. Įdomu tai, kad stipriausiai indukuoti genai, patvirtinti realaus laiko PGR, buvo chemokinai (CXCL1, CXCL2, CXCL3, IL-8 ir CCL20) ir keli kiti nuo NF-κB priklausomi genai (TNFAIP3 / A20, PLA2G4C ir TNFRSF9). ; 4a pav.). 29 Unc5CL neturėjo įtakos kito geno, MAP2K5, raiškai. CXCL1, IL-8 ir CCL20 sekrecija padidėjus Unc5CL raiškai buvo patvirtinta ELISA metodu (4b pav.).

Image

Unc5CL skatina chemokinų ekspresiją ir sekreciją. ( a ) HEK293 T-Rex ląstelės, turinčios C-gale pažymėtą VVG žymėtą Unc5CL (WT) arba Unc5CLΔDD (ΔDD), 24 valandas buvo apdorotos 200 ng / ml doksiciklinu arba nebuvo (nt). Ląstelės buvo surinktos ir paruošta RNR. Nurodytų Unc5CL tikslinių genų santykinės išraiškos pokyčiai buvo nustatyti realaus laiko PGR. ( b ) HEK293T ląstelės buvo transfekuojamos didinant nurodytų ekspresijos konstruktų dozes. Po 24 val. Supernatantai buvo tiriami ELISA metodu, siekiant nustatyti CXCL1, IL-8 ir CCL20. a ir b ) duomenys parodo techninių trigubų egzempliorių vidutines vertes ± SD; rezultatai atspindi trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatus

Visas dydis

„Unc5CL“ reikia IRAK1, IRAK4 ir TRAF6, bet ne „MyD88“, kad būtų suaktyvinta NF- κ B

Keletas DD turinčių baltymų buvo identifikuoti kaip pagrindiniai signalizacijos kelių, vedančių į NF- κB aktyvaciją, komponentai. 14 RIP1 yra susijęs su NF-κB aktyvacija, reaguojant į TNF α . 30 IRAK1, IRAK2 ir IRAK4 kartu su E3-ubikvitino ligaze TRAF6 dalyvauja signalizuojant pasroviui po daugumos TLR ir IL-1R superšeimos narių. 1, 2, 3 Adapterio baltymas MyD88 susieja IRAK kinazes su atitinkamais receptoriais. Šių baltymų dalyvavimui Unc5CL sukeltos NF-κB aktyvacijai tirti buvo naudojamas siRNR metodas. RIP1, IRAK1, IRAK4, MyD88 ir TRAF6 buvo sunaikinti transfekuojant genų specifines siRNR ir buvo įvertintas Unc5CL gebėjimas aktyvinti NF-κB specifinės liuciferazės reporterio geną (5a ir b paveikslai). Nors RIP1 numušimas neturėjo įtakos nei Unc5CL, nei TLR2 sukeltai NF-κB, IRAK1, IRAK4 ir TRAF6 numušimas stipriai pablogino šiuos signalizacijos kelius. Be to, „MyD88“ numušimas paveikė tik TLR2-, bet ne Unc5CL sukeltą NF-κB aktyvaciją, o tai rodo, kad Unc5CL dalyvauja naujoje IRAK aktyvinančioje signalizacijos kaskadoje, kurioje naudojamos tos pačios signalizacijos molekulės kaip TLR / IL-1R šeimoje. Tos pačios priklausomybės buvo stebimos ir su Unc5CL tarpininkaujama IL-8 ir CXCL1 sekrecija (5c ir d pav.).

Image

Unc5CL tarpininkaujamas NF-κB aktyvinimas priklauso nuo IRAK, bet nuo MyD88. ( a ) HEK293T ląstelės buvo transfekuotos nurodytomis siRNR. Po keturiasdešimt aštuonių valandų ląstelės buvo transfekuotos NF- KB B luciferazės reporterio geno plazmidėmis kartu su tuščiu vektoriu (EV) ir nurodytomis ekspresijos konstrukcijomis ir buvo tiriamos dėl NF-κB priklausomo luciferazės aktyvumo po 24 valandų. TLR2 transfekuotos ląstelės papildomai buvo apdorotos 200 ng / ml Pam3CSK4. ( b ) Atrinkti baltymai, paimti iš a punkte nurodytų eksperimentų, buvo tiriami Western blot metodu, naudojant nurodytus antikūnus. ( c ir d ) HEK293T ląstelės buvo transfekuotos nurodytomis siRNR. Po 48 valandų ląstelės buvo transfekuotos nurodytais ekspresijos konstruktais, o supernatantai buvo ištirti dėl IL-8 ir CXCL1 sekrecijos ELISA metodu. TLR2 transfekuotos ląstelės papildomai buvo apdorotos 200 ng / ml Pam3CSK4. ( a, c ir d ) duomenys parodo techninių trigubų egzempliorių vidutines vertes ± SD; rezultatai atspindi trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatus. ( e ) HEK293T ląstelės buvo transfekuotos nurodytais ekspresijos konstruktais. Imuniniai krituliai ir ekstraktai buvo analizuojami Western blot metodu, naudojant nurodytus antikūnus

Visas dydis

MyD88 ir IRAK kinazių sąveika tarpininkauja priklausomai nuo DD. 8, 9 Norint patikrinti, ar Unc5CL taip pat gali sąveikauti su IRAK, atlikti imunodecipliacijos eksperimentai (5e pav.). Laukinio tipo arba kinazėje miręs IRAK4 (IRAK4 kd) buvo ekspresuojamas kartu su Unc5CL 432G, Unc5CLΔDD arba Unc5CL 432R. Po Unc5CL baltymų imunoprecipitacijos buvo įvertintas kartu išreikšto IRAK4 arba endogeninio IRAK1 bendras imunoprecipitacija. Kaip ir tikėtasi, laukinio tipo, bet ne Unc5CLΔDD sąveikavo tiek su IRAK4, tiek su IRAK4 kd, taip pat su endogenine IRAK1. Įdomu tai, kad Unc5CL variantai 432G ir 432R parodė skirtingą giminingumą IRAK atžvilgiu. Atsižvelgiant į didesnį Unc5CL 432R aktyvumą NF-KB B luciferazės reporterio tyrimuose, šis variantas parodė didesnį gebėjimą kartu imponuoti IRAK1 ir IRAK4. Todėl skirtingas Unc5CL 432G ir 432R aktyvumo laipsnis gali būti priskiriamas skirtingiems atitinkamo DD giminingumui IRAK atžvilgiu.

Ligando sukeltas Unc5CL signalizacijos aktyvavimas, naudojant chimerinį receptorių

Kadangi Unc5CL aktyvatorius išlieka sunkiai pasiekiamas, mes sukūrėme sulietą baltymą, pagrįstą DD turinčiu TNF receptorių šeimos nariu EDAR, kad gautume įžvalgą apie Unc5CL aktyvavimo mechanizmą (papildomas paveikslas S7). EDAR yra ypač tinkamas šiam tikslui, nes endogeninis baltymas vystymosi metu yra apribotas ektoderma ir jo nėra HEK293T ląstelėse. 31, 32 EDAR DD buvo pakeistas Unc5CL 432R arba neaktyvių taškų mutantų E421K ir F461A DD. Laikinai pereinant prie ekspresijos, chimerinis receptorius, kuriame yra Unc5CL 432R DD, parodė panašų gebėjimą kaip laukinio tipo EDAR aktyvinti NF-κB (6a pav.). Priešingai, chimeros, turinčios inaktyvinančias taškų mutacijas, nesugebėjo suaktyvinti NF- κB , tai rodo, kad šio chimerinio receptoriaus NF- κ B aktyvinimo gebėjimas yra DD (6a pav.). HEK293T ląstelės, stabiliai ekspresuojančios chimerinį receptorių, parodė bazinį NF- κ B aktyvavimą, kurį sustiprino gydymas Fc-EDA (heksamerinė EDAR ligando forma, sukelianti receptorių grupavimą). Tai parodė principo įrodymą, kad signalus per Unc5CL DD galima sukelti (6b paveikslas). Pagrindinį aktyvavimą taip pat atspindėjo konstitucinis I κB α fosforilinimas ir skaidymas. (6c pav.). Įdomu tai, kad ląstelėse, ekspresuojančiose Unc5CL chimerinį receptorių, taip pat stebėjome sumažintą IRAK1 baltymo kiekį nei paslėptose užkrėstose ląstelėse (6c paveikslas). Be to, šių ląstelių apdorojimas Fc-EDA paskatino didesnės molekulinės masės IRAK1 formų atsiradimą (6c paveikslas). Šie IRAK1 pokyčiai greičiausiai koreliuoja su jo aktyvacija. 33 Norėdami homogeniškiau suaktyvinti chimerinį receptorių, mes nustatėme vienos ląstelės kloną, kuriam būdingas žemas bazinis NF- κB aktyvinimas, tačiau kurį veiksmingai galėtų suaktyvinti Fc-EDA ligadas. Laiku vykstant eksperimentui, Fc-EDA sukėlė greitą I κB α fosforilinimąsi ir po jo skaidymą (6d paveikslas). Remdamiesi pastebėjimu, kad Unc5CL yra JNK aktyvatorius, mes taip pat pastebėjome efektyvų šios kinazės fosforilinimą. Kaip pastebėta chimerinius receptorius ekspresuojančių ląstelių grupėje, visos stimuliacijos metu pasirodė didesnės molekulinio svorio IRAK1 formos. Norėdami ištirti aktyvacijos sukeltą signalinių molekulių pritraukimą į chimerinį receptorių, mes sujungėme Fc-EDA stimuliaciją su vėlesniu ligando imuniniu nusodinimu (6e pav.). Kaip ir tikėtasi, Fc-EDA veiksmingai kartu nusodino savo receptorių EDAR-Unc5CL. Be to, modifikuotos IRAK1 ir TRAF6 formos buvo įtrauktos į kompleksą priklausomai nuo laiko. Visos ląstelės lizato analizė vėl patvirtino indukuojamą I κB α fosforilinimą ir skilimą, JNK fosforilinimą ir IRAK1 modifikaciją. Taigi ligamento sukelta Unc5CL DD oligomerizacija receptoriaus kontekste yra pakankama, kad sukeltų signalinius įvykius, kurie labai primena nuo MyD88 priklausomą TLR / IL1R šeimos šaką.

Image

Ligando sukeltas Unc5CL signalizacijos aktyvavimas. ( a ) HEK293T ląstelės buvo transfekuotos NF-κB luciferazės reporterio geno plazmidėmis kartu su tuščiu vektoriu (EV) arba nurodytų ekspresijos konstruktų didinančiomis ar vienkartinėmis dozėmis ir buvo tiriamos, kad po NF-κB priklausomo luciferazės aktyvumo 24 val. vėliau. 432R: EDAR-Unc5CL, turintis Unc5CL DD variantą 432R; E421K, F461A: EDAR-Unc5CL, kuriame yra Unc5CL DD su nurodytomis taškinėmis mutacijomis. Nurodytos ekspresijos konstrukcijos yra pagrįstos Unc5CL genetiniu variantu 432R. ( b ) Šablonu užkrėstos arba HEK293T ląstelės, kurios ektopetiškai ekspresuoja EDAR-Unc5CL, buvo perneštos NF- κ B luciferazės reporterio geno plazmidėmis, buvo stimuliuojamos 1 μg / ml Fc-EDA 24 valandas ir buvo tiriamos priklausomai nuo NF-κB. luciferazės aktyvumas. a ir b ) duomenys parodo techninių trigubų egzempliorių vidutines vertes ± SD; rezultatai atspindi trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatus. ( c ) Maketinės transduotos HEK293T ląstelės arba HEK293T ląstelės, stabiliai ekspresuojančios chimerinį EDAR-Unc5CL receptorių, nurodytą laiką buvo stimuliuojamos 1 μg / ml Fc-EDA. Baltymų lizatai buvo analizuojami Western blot metodu, naudojant nurodytus antikūnus. ( d ) Kloninės HEK293T ląstelės, stabiliai ekspresuojančios chimerinius EDAR-Unc5CL receptorius, nurodytą laiką buvo stimuliuojamos 1 μg / ml Fc-EDA. Baltymų lizatai buvo analizuojami Western blot metodu, naudojant nurodytus antikūnus. ( e ) Maketinės transdukcijos HEK293T ląstelės arba kloninės HEK293T ląstelės, stabiliai ekspresuojančios chimerinį EDAR-Unc5CL receptorių, nurodytą laiką buvo stimuliuojamos 1 μg / ml Fc-EDA arba Fc-TNF. Fc-EDA ir susiję baltymai buvo nusodinami iš baltymų lizatų, naudojant „Protein G“ granules. Kritiniai baltymai (IP: Fc) arba ląstelių lizatai (lizatas) buvo analizuojami Western blot metodu, naudojant nurodytus antikūnus.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes nustatėme, kad Unc5CL yra naujas priešuždegiminio signalizacijos kaskados, sukeliančios NF- κB ir JNK, induktorius. Ištyrus kelią, kinazės IRAK1 ir IRAK4, taip pat E3-ubikvitino ligazės TRAF6 buvo identifikuotos kaip pagrindiniai komponentai pasroviui. Įdomiausia, kad „MyD88“, reikalingas IRAK / TRAF6 priklausomam signalizavimui pasroviui po IL-1- ir į Toll panašius receptorius, buvo būtinas Unc5CL aktyvumui. Šis radinys rodo, kad Unc5CL teikia nuo MyD88 nepriklausomą antrąją lygiagrečią evoliucijos konservavimo IRAK signalizacijos kaskados šaką. Nors „MyD88“ yra įtrauktas į transmembraninius receptorius dėl jo TIR srities, „Unc5CL“ jau yra membranoje įtvirtintas baltymas. Abu baltymai turi DD, reikalingą sąveikai su IRAK šeimos nariais.

Intriguojantis Unc5CL bruožas yra labai specifinis audinių pasiskirstymas gleivinės epitelyje, gausiausiai gimdoje ir žarnyne. Ši svetainė suteikia sąsają tarp kūno vidaus ir išorės, kur epiteliai atlieka pagrindinę barjerinę funkciją nuo įsiveržiančių patogenų. 34 Įdomu tai, kad baltymai rūšiuojami pagal šių ląstelių viršūnę. Atsižvelgiant į priešuždegiminį signalą, kuris atsiranda suaktyvinus Unc5CL, ir tarpląstelinio domeno trūkumą, galima manyti, kad, kaip ir MyD88, Unc5CL yra naudojamas kaip membranoje surištas adapterio baltymas iki šiol nežinomam receptoriui, kuris yra aktyvuojamas šviesos koeficientu. Vis dėlto negalima atmesti galimybės, kad Unc5CL yra suaktyvinamas tarpląstelinės membranos proksimaliniu signalu.

Mūsų eksperimentai, naudojant chimerinį EDAR-Unc5CL receptorių, atskleidė, kad Unc5CL DD oligomerizacija yra svarbi signalo inicijavimui, greičiausiai teikiant surinkimo platformą IRAK. We therefore postulate that oligomerization, which is required for MyD88-dependent signaling, is also a prerequisite for wild-type Unc5CL activity, and that this is stimulated by the putative upstream factor.

Transcriptional profiling identified mainly pro-inflammatory chemokines such as IL-8, CXCL1 and CCL20 as downstream targets of Unc5CL. These factors are well known to orchestrate the initial phase of an immune response by recruitment of immune cells including neutrophils, macrophages, dendritic cells and T cells to sites of potential danger. 35 It is therefore possible that Unc5CL is involved in responses to epithelial danger.

Unc5CL is constitutively autoproteolytically processed at an HFS site that is also found in PIDD and Nup98. 21, 22 While cleavage of the Nup98 precursor into mature nucleoporins Nup98 and Nup96 is required for its correct biogenesis and sorting to the nucleoplasmic side of the nuclear pore complex, inducible processing of PIDD is required for DNA damage-induced responses. 21, 36, 37 Cleavage of Unc5CL appears constitutive and is not required for signaling, as evidenced by using a non-cleavable version (HFA). This hints to a role of Unc5CL autoprocessing in its biogenesis, localization or availability rather than activation, which should be addressed in future experiments.

Inflammatory bowel diseases (IBDs), including Crohn's disease and ulcerative colitis, are chronic inflammatory disorders predominantly affecting the small and large intestine They are thought to arise from a complex interplay of environmental factors in a genetically predisposed host. 38 Though many genetic linkage studies have revealed a number of genetic risk loci, identified genes can only be attributed to ca 10–20% of human cases. Unc5CL was previously identified as marker for IBD, together with several other genes that are transcriptionally upregulated in the diseased tissues (United States Patent no. 20100004213). Considering, in addition, the pro-inflammatory activity and the strikingly specific expression in mucosal epithelia, we propose Unc5CL as a putative candidate molecule causally involved in mucosal diseases such as IBD. This warrants investigation of Unc5CL in future genetic association studies.

Medžiagos ir metodai

Mice, cell culture and reagents

Six- to twelve-week-old mice were housed at the animal facility of the University of Lausanne. All animal procedures were conducted in compliance with Swiss federal legislation for animal experimentation. The human embryonic kidney HEK293T- and HEK293T-Rex cell lines (Invitrogen, Basel, Switzerland), were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Invitrogen) supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS). The human colorectal adenocarcinoma cell line CaCo-2 was maintained in DMEM supplemented with 15% FCS and 1% MEM non-essential amino acids (Invitrogen). All cells were maintained in the presence of 100 U/ml penicillin and 100 μ g/ml streptomycin (Invitrogen). Doxycyline, hydroxylamine and FLAG-peptide were obtained from Sigma (Buchs, Switzerland), Pam3CSK4 was from Invivogen (Nunningen, Switzerland). Fc-EDA and Fc-TNF were reported previously. 32, 39

Antikūnai

Monoclonal mouse anti-FLAG (M2) and anti-VSV (P5D4), as well as rabbit polyclonal anti-FLAG and anti-VSV were from Sigma; anti-Unc5CL (AT116) and anti-cytochrome C (7H6.2C12) were from Apotech (Epalinges, Switzerland); anti-Bap31 (CC-1) from Alexis (Lausen, Switzerland). Anti-phospho-I κ B (# 9241) and anti-JNK (9252) from Cell Signaling (Allschwil, Switzerland); anti-phospho-JNK (44–682G) from Biosource (Basel, Switzerland); anti-I κ B (sc-371), anti-MyD88 (sc-74532) and anti-IRAK1 (sc-7883) from Santa-Cruz (Nunningen, Switzerland); anti-RIP1 38 and anti-caspase-3 (46) from Transduction Laboratories (Allschwil, Switzerland); anti-IRAK4 from ProSci (Lausen, Switzerland) (3125); anti-TRAF6 from MBL (Nunningen, Switzerland) (597).

Expression plasmids and siRNA

Human Unc5CL 432R was amplified from a cDNA clone (GenBank: JF681947) by PCR and cloned in derivatives of pCR3 (Invitrogen), in frame with C-terminal FLAG and VSV tags. Unc5CL variant 432G was generated by site-directed mutagenesis with two sequential rounds of PCR (double PCR). Unc5CL point and deletion mutants were generated by PCR or double PCR. pCR3 plasmids expressing N-terminally VSV-tagged human IRAK4 or IRAK4 kd and pCAGGS-E-MyD88 were reported previously. 40 Retroviral pMSCV plasmids, expressing Unc5CL and mutants, were generated by subcloning from pCR3, lentiviral pRDI_292 plasmids (a kind gift from R Iggo, University of St Andrews, Scotland) were generated by PCR. The packaging plasmids for pMSCV, pCG (encoding VSV G envelope glycoprotein) and pHit60 (encoding gag and pol retroviral genes) were kind gifts of CA Benedict (San Diego, CA, USA). Packaging plasmids for lentiviral gene transfer, pMD2.G and pCMVΔR8.91, were generously provided by Dr. Didier Trono. pcDNA5/FRT/TO plasmids (Invitrogen) for establishment of inducible HEK293 T-Rex cells were generated by subcloning from pCR3. The EDAR-Unc5CL fusion (EDAR aa 1–343, Unc5CL aa 402–518) was generated by double PCR and cloned in pCR3 or pMSCV. Derivatives corresponding to point mutations E421K and F461A were generated by double PCR. Lentiviral pLKO.1 plasmids expressing Unc5CL-specific shRNAs were obtained from Sigma. siRNAs were obtained from Ambion (Rotkreuz, Switzerland).

Transfection, immunoprecipitation and western blot

Transfections were performed using the calcium-phosphate precipitation technique. Cells were usually lysed in Nonidet P (NP)-40 lysis buffer (0.1% NP-40, 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM NaVO 4, complete protease inhibitor cocktail; Roche, Basel, Switzerland) for 15 min, 4°C. Murine tissue lysates were equally generated in RIPA buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA and protease inhibitor mix) using a rotor-stator-type tissue homogeniser ART Miccra D-8 (Müllheim, Germany) (4 pulses of 10 s, 4°C).

Lysates were cleared by centrifugation in a microcentrifuge (13 000 rpm, 10 min, 4°C) and resolved by SDS-PAGE. Proteins were transferred onto nitrocellulose membranes (Amersham, Glattbrugg, Switzerland) and probed using the indicated antibodies.

siRNAs at final concentrations of 10 nM were also transfected into HEK293T cells using the calcium-phosphate precipitation technique.

For immunoprecipitation, 24 h after transfection cells were harvested and lysed as described above. Lysates were incubated for 1 h at 4°C with 20 μ l sepharose6B (Sigma) on a rotating wheel for a pre-clearing step. After centrifugation (5000 rpm, 1 min, 4°C) 1/10 supernatant (SN) was frozen (loaded as a cell extract control the following day) and 9/10 SN was immunoprecipitated O/N at 4°C on a rotating wheel, with 15 μ l of a 1 : 2 mixture of FLAG M2-agarose beads (Sigma) and sepharose6B beads or 15 μ l protein G beads. After extensive washing of the beads with lysis buffer the cell extracts and immunoprecipitates were loaded on a SDS-PAGE and the proteins were revealed by western blotting.

In vitro cleavage assays

HEK293T cells in 10 cm dishes were transfected with C-terminally FLAG-tagged expression vectors for Unc5CL that contain point mutations in the autoproteolytic HFS site (HFA, HFC). 24 h later cells were lysed and Unc5CL was immunoprecipitated as described above. FLAG-tagged proteins were washed and eluted by incubation for 10′ at RT with 120 μ l 3 × FLAG peptide (Sigma, 100 μ g/ml in lysis buffer). In all 20 μ l of every eluate was kept for later analysis (0 h time point), the rest was divided in three parts. One part was left untreated, the other two were incubated with 200 mM hydroxylamine (NH 2 OH) with or without 2% SDS. 20 μ l samples were taken at the indicated time points, mixed with SDS-sample buffer and analyzed by western blot.

Liuciferazės reporterio tyrimai

Cells in 24-well dishes were co-transfected in triplicate with 40 ng NF- κ B firefly luciferase reporter gene constructs, in combination with 40 ng phRLTK (encodes a constitutively expressed Renilla luciferase), the indicated constructs, and an empty vector to normalize for the total quantity of 240 ng/well transfected DNA. 24 h after transfection, cells were either stimulated for the indicated periods or lysed in passive lysis buffer (Promega, Dübendorf, Switzerland), and dual luciferase activity was measured in a Packard Top-Count NXT (PerkinElmer, Schwerzenbach, Switzerland) using the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), according to the manufacturer's instructions.

Triton X-114 phase separation

Triton X-114 (TX114) phase separation experiments were performed as described in Bordier. 23 Briefly, 5 × 10 6 HEK293T cells stably expressing the indicated mutants were resuspended in 500 μ l PBS and 100 μ l 6% pre-condensed TX114, mixed by pipetting/inversion and incubated for 15 min on ice. The samples were centrifuged for 1 min at 13 000 rpm, the supernatants were transferred to new tubes, the pellets, which correspond to the insoluble fractions, were resuspended in 200 μ l SDS-sample buffer by sonication. The supernatants were incubated for 5 min at 37°C to induce phase separation and centrifuged for 1 min at 13 000 rpm at room temperature. The upper aqueous phases were transferred to new tubes. To wash, the lower, detergent phase was mixed with 500 μ l PBS, the upper phase with 100 μ l 6% TX114 and incubated for 5 min on ice and for 5 min at 37°C. Samples were centrifuged again and the initial phases were kept for further processing. Proteins were precipitated by adding 500 μ l methanol and 125 μ l chloroform to the aqueous phases and 450 μ l PBS, 500 μ l methanol and 125 μ l chloroform to the detergent phases, followed by vortexing. Samples were centrifuged for 4 min at 13 000 rpm, 750 μ l of the upper phases was removed and 400 μ l methanol was added and mixed by pipetting. Samples were centrifuged again for 1 min at 13 000 rpm, supernatants were removed and the pellets were dried under the chemical hood. Precipitated proteins from the aqueous phase were resuspended in 200 μ l, those from the detergent phase in 50 μ l SDS-sample buffer. Proteins were solubilized by sonication and analyzed by western blot.

ELISA

Twenty four hours after transfection of HEK293T cells in 24-well plates, cell supernatants were analyzed for human CXCL1, CCL20 (R&D Systems, Abingdon, UK) and IL-8 expression (Immunotools, Friesoythe, Germany) by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), according to the manufacturer's instructions.

Preparation of intestinal epithelial cells

The small intestine and colon were wholly dissected from euthanized C57BL/6 mice (6–12 weeks of age), cut in ca 3-cm sections, freed from residual feces and mucus after longitudinal section and transferred in ice-cold Hanks' balanced salt solution (HBSS) without Ca 2+ and Mg 2+ (Invitrogen). After rinsing several times in HBSS at RT, residues were shaken gently in 15 ml of HBSS containing 2 mM EDTA (pH 8.0) for 30 min at 37°C. The solid material was transferred to a new 50 ml tube containing 20 ml PBS and the supernatant was discarded. The remaining mucosa was vortexed vigorously and the supernatant containing complete crypts and some single cells were collected into a fresh 50 ml tube. Single cells and crypts were centrifuged at 400 g for 5 min at 4°C.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi 1-7 paveikslai

  2. 2.

    Papildomos medžiagos

Žodynas

DD

mirties sritis

EDA

ectodysplasin-A

EDAR

ectodysplasin-A receptor

IBD

uždegiminė žarnų liga

I κ B

inhibitor of kappa B

IKK β

I κ B kinase beta

IL-1R

interleukin (IL)-1 receptor

IRAK

IL-1R-associated kinase

JNK

c-Jun N-terminal kinase

MyD88

myeloid differentiation primary response gene 88

NF- κ B

nuclear factor kappa B

Nup98

nuclear pore complex protein 98

PIDD

p53-induced protein with a DD

PLA2G4C

phospholipase A2 group IVC

TIR

Toll–IL-1R domain

TLR

Į rinkliavas panašus receptorius

TM

transmembrane

TNF α

tumor necrosis factor alpha

TNFAIP3

TNF alpha-induced protein 3

TNF-RI

tumor necrosis factor receptor type I

TNFRSF9

TNF receptor superfamily member 9

TRAF6

TNF receptor-associated factor 6

Unc5CL

Unc5C-like protein

UPA, domain found in Unc5

PIDD and Ankyrins

ZU5

domain found in ZO-1 and Unc5

Papildoma informacija pridedama prie dokumento apie ląstelių mirtį ir diferenciaciją svetainėje (//www.nature.com/cdd)