Geno, koduojančio metiltransferazę (gidb), ištrynimas suteikia salmonelėms aukšto lygio atsparumą antimikrobinėms medžiagoms | žurnalas apie antibiotikus

Geno, koduojančio metiltransferazę (gidb), ištrynimas suteikia salmonelėms aukšto lygio atsparumą antimikrobinėms medžiagoms | žurnalas apie antibiotikus

Anonim

Dalykai

  • Antibiotikai
  • Antimikrobinis atsparumas
  • Bakterijų genomika
  • Metilinimas

Anotacija

Manoma, kad gliukozės slopinamas dalijimosi genas ( gid ) B , esantis gid operone, turi reikšmės genų, panašių į gidA , moduliacijai . Naujausi tyrimai parodė, kad GidB yra metiltransferazės fermentas, dalyvaujantis metilinant 16S ribosominę RNR (rRNR) Escherichia coli . Šiame tyrime mes ištyrėme GidB vaidmenį jautrumui antibiotikams ir bendrą Salmonella biologiją. Buvo sukurtas gidB izogeninis Salmonella mutantas ir vėliau apibūdintas skirtingomis sąlygomis. Mūsų duomenys parodė, kad gidB mutanto augimo ir invazijos savybės buvo panašios į laukinio tipo (WT). „ GidB“ mutantą WT aplenkė atlikdamas konkurencinį augimo tyrimą, rodantį, kad bendras bakterijų tinkamumas yra sumažėjęs . Dėl nalidikso rūgšties streso žymiai sumažėjo gidB mutanto judrumas. Panašiai mutantas parodė gijinę morfologiją ir mažesnį kolonijų dydį, palyginti su lazdelės formos ir didelėmis WT kolonijomis, esant nalidikso rūgščiai. Svarbiausia, kad gidB ištrynimas suteikė aukštą atsparumą aminoglikozidų grupės antibiotikams streptomicinui ir neomicinui. Grunto prailginimo tyrimas nustatė, kad WT metilinimo vieta būtų 16S rRNR G527. Mutanto metilinimo stoka parodė, kad šiam metilinimui reikalingas GidB. Visi šie duomenys rodo, kad GidB fermentas vaidina svarbų vaidmenį keičiant jautrumą antibiotikams ir augimo bei morfologijos moduliavimą esant stresinėms salmonelių sąlygoms.

Įvadas

Salmonella yra vienas iš labiausiai paplitusių per maistą plintančių patogenų JAV. 1 Salmonella perduodama išmatomis ir oraliniu būdu užteršto maisto ar vandens metu. 2, 3 Jungtinėse Valstijose apskaičiuota, kad salmoneliozės atvejų skaičius siekia 1, 39 milijono per metus, o miršta 415 žmonių, kasmet kainuojantys maždaug 2, 65 milijardo dolerių dėl medicinos išlaidų ir produktyvumo praradimo. 4

Gliukozės slopinamas dalijimosi ( gid) AB operonas, apimantis gidA ir gidB genus, iš pradžių buvo susijęs su gliukozės sukeltu ląstelių dalijimosi slopinimu Escherichia coli ( E. coli ). GidA yra labai konservuotas genas, pirmą kartą aprašytas E. coli, ir buvo manoma, kad jis gali atlikti chromosomų dalijimąsi ir replikaciją dėl savo vietos netoli replikacijos pradžios. 6, 7 gidA, kaip pasaulinio virulentiškumo geno reguliatoriaus, vaidmuo buvo įrodytas keliems bakteriniams patogenams, įskaitant Pseudomonas syringae , Aeromonas hydrophila , Pseudomonas aeruginosa ir Streptococcus pyogenes. 8, 9, 10, 11. Neseniai mūsų laboratorijoje atliktas tyrimas parodė, kad gidA veikia Salmonella virulentiją. 12 Išbraukus gidA , salmonelės susilpnėjo in vitro ir atsirado pelių infekcijos modelis, rodantis vaidmenį moduliuojant virulencijos veiksnius. 12 Tyrimų su E. coli rodo, kad GidA naudoja transkripcijos pagrindu pagrįstą mechanizmą, kad modifikuotų perduodamą RNR. 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16 Kita vertus, gidB genas koduoja metiltransferazės fermentą 17, 18, todėl pasiūlė jį pakeisti į rsmG (ribosominis mažas subvienetas metiltransferazė G). „ GidB“ genas yra labai konservuotas tiek gramneigiamų, tiek gramneigiamų bakterijų atžvilgiu. Jis jungiasi su ribosomos 30S subvienetu ir metiliuoja 16S ribosomą (rRNR). 17, 18, 19 mutacija gidB homologe ( rsmG ) E. coli, Mycobacterium tuberculosis , Thermus thermophilus ir Bacillus subtilis parodė žemą atsparumą streptomicinui dėl 16S rRNR metilinimo stokos. 17, 18, 19, 20 Be to, T. thermophilus gidB mutantas buvo išaugintas iš laukinio tipo (WT) atliekant konkurencinį augimo tyrimą, nurodant metilinimo trūkumo fiziologines sąnaudas. Šie duomenys rodo, kad GidB daro įtaką bakterijų jautrumui antimikrobiniams preparatams mechanizmu, kuris apima transkripcijos modifikaciją.

Antibiotikai yra vienas efektyviausių infekcinių ligų gydymo metodų šiuolaikinėje medicinoje. Tačiau vis dažniau atsiranda antibiotikams atsparių bakterijų padermių, kurios kelia didelę grėsmę visuomenės sveikatai. Antimikrobinis atsparumas netipiniams Salmonella serotipams tapo rimta problema visame pasaulyje. 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 Pavyzdžiui, Salmonella enterica serovaras Typhimurium DT104 yra atsparus daugeliui antimikrobinių vaistų, įskaitant ampiciliną, chloramfenikolį, streptomiciną, sulfonamidą ir tetracikliną. 29 Dešimtojo dešimtmečio pradžioje labai išaugo Salmonella Typhimurium multirezistentų izoliatų skaičius, kuris 1996 m . Sudarė maždaug trečdalį visų žmogaus izoliatų. 30

Aminoglikozidų grupės antibiotikai apima keletą mediciniškai svarbių vaistų, tokių kaip streptomicinas, neomicinas ir kanamicinas. 31 Jie yra labai aktyvūs prieš gramneigiamas bakterijas ir tam tikru mastu gramneigiamas bakterijas. 32 Aminoglikozidai, veikdami baltymų sintezę, prisijungia prie bakterijų ribosomų 30S subvienetų ir sužadina kodono netinkamą pasiskirstymą, taip pat slopina translokaciją. 31, 33 atsparumo aminoglikozidams mechanizmai daugiausia yra ribosomų jungimosi vietų keitimas, sumažėjęs antibiotikų įsisavinimas ir kaupimasis bei aminoglikozidus modifikuojančių fermentų gamyba. 31 Fermentinis modifikavimas yra labiausiai paplitęs atsparumo aminoglikozidams tipas. Keletas fermentų buvo identifikuoti ir klasifikuoti pagal modifikacijos tipą, pavyzdžiui, acetiltransferazės, adeniltransferazės ir fosfotransferazės. 34, 35 Genai, koduojantys aminoglikozidus modifikuojančius fermentus, dažniausiai randami plazmidėse ir transpozonuose, kurie vaidina svarbų vaidmenį jų paskleidime. Streptomicinas jungiasi su 30S ribosomų subvienetu ir sąveikauja su 16S rRNR C526 ir G527 likučiais, todėl slopinamas baltymų sintezė. 36, 37 Kita vertus, neomicinas nukreiptas į konservuotas sekas 16S rRNR A-vietoje. 38

Šiame darbe mes ištyrėme GidB vaidmenį salmonelių fenotipui ir biologijai. Ištrynus gidB , Salmonella padidėjo atsparumas aminoglikozidų grupės antibiotikams. Toliau nustatėme tikslią Salmonella GidB metilinimo vietą. Be to, mutanto analizė parodė, kad gidB ištrynimas parodė bakterijų morfologijos, judrumo ir konkurencinio augimo charakteristikų trūkumus streso sąlygomis, o tai rodo reikšmingą vaidmenį reaguojant į stresą, keičiant ribosominę RNR modifikaciją Salmonella.

medžiagos ir metodai

Bakterijų padermės, plazmidės ir ląstelių linijos

Salmonella enterica serovario Typhimurium 14028 padermė buvo gauta iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC, Manasasas, VA, JAV), o mūsų laboratorijoje buvo sukurtas savaiminis nalidikso rūgštims atsparus štamas ir naudojamas kaip WT. Visos Salmonella padermės buvo auginamos lizogeninio sultinio (LB) terpėje arba Salmonella – Shigella plokštelėse. Prireikus į terpę buvo pridėta nalidikso rūgšties (150 mg ml – 1 ), kanamicino (50 mg ml – 1 ), tetraciklino (15 mg ml – 1 ) arba ampicilino (100 mg ml – 1 ). T84 žmogaus žarnyno epitelio ląstelės buvo gautos iš ATCC ir laikomos Dulbecco modifikuoto Eagle terpės / maistinių medžiagų mišinio F12 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų vaisiaus serumo, ir inkubuotos 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2 .

GidB mutanto konstravimas

„ GidB“ mutantas buvo gautas naudojant „Lambda Red“ sistemą pagal aprašytus metodus. 39 Trumpai tariant, WT Salmonella Typhimurium 14028 buvo transformuotas su plazmidė pKD46, kurioje yra Lambda raudonosios rekombinazės genai. 39 arabinozės sukeltos WT Salmonella, turinčios pKD46 (WT-pKD46), buvo kultivuojamos ir naudojamos elektrokompetentingoms ląstelėms generuoti. Atsparumas kanamicino (Km) genas buvo PGR amplifikacijos iš pKD4 39 plazmidės, naudojant F4 / R4 pradmenis rinkinys (5'-TTTAACACAAGCCGCGTCGTTTTTTTTCTATTTTTTTTGATAAAAATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3 '/ 5'-GCCCGATAAGCGAAAGCGCATCGGGCATTTGATTATTAACAGGTACATATGAATATCCTCCTTAG-3'; primers santykiniai vietos parodytos 1 pav). Šie pradmenys yra homologiški šalia pKD4 esančio Km r geno sekoms. F4 pradmens 5′-gale yra papildomos 47 bazės, homologiškos prieš Salmonella gidB geno seką, tuo tarpu R4 pradmens 5'-galas turi papildomas 45 bazes, homologiškas gidB pasroviui. PGR produktas buvo elektroporuotas į WT-pKD46 elektrokompetentingas ląsteles. Transformacijos reakcija buvo inkubuota 5 valandas 37 ° C temperatūroje ir padengta LB agaru, papildytu kanamicinu. Kolonijos buvo atrinktos ir gidB delecija buvo patvirtinta sekvenavimu, o PGR amplifikacija, naudojant pradmenų rinkinius F1 / R1 (5′-CTGTGCTCGACGTTGTCACT-3 ′ / 5′-GCTCTTCGTCCAGATCATCC-3 ′), buvo sustiprinta km r kasete, F3 / R1. (5′-GCGTGCACCAGATCACACA-3 ′ / R1) pradmenys buvo naudojami paspartinti priešais esančią gidB seką kartu su km r kasete, o F1 / R3 (F1 / 5′-TGCTGCGTCGTAGCGCTTG-3 ′) buvo panaudota pasroviui gidB sustiprinti. seka kartu su km r kasete. „ GidB“ genui amplifikuoti buvo naudojamas F2 / R2 pradmenų rinkinys (5′-AGGCATAAAAACGCCCTTTC-3 ′ / 5′-GGCTATTGTTCTCCCTGACG-3 ′).

Image

Scheminė schema, kurioje parodytos pradinių rinkinių, naudojamų PGR amplifikacijai, gidB delecijos patvirtinimui, santykinės vietos.

Visas dydis

GidB mutanto komplementacija

„ GidB“ geno intarpas PGR buvo amplifikuotas iš WT chromosomų DNR, naudojant F5 / R5 pradmenis (5′-AGAAGCGACGTTGTCATGTT-3 ′ / 5′-AAGGTATGCTGCGTCGTA-3 ′). PGR produktas buvo bukas galas, naudojant PGR poliravimo rinkinį (Stratagene, Santa Clara, CA, JAV), surištas su neryškia gale esančiu pBR322 vektoriu (laboratorijoje) ir suardomas Sca I restrikcijos fermentu. Rekombinantinis vektorius buvo transformuotas į gidB mutanto padermę elektroporacijos būdu. Komplementacijai patvirtinti rekombinantinis pBR322 buvo išskirtas iš gidB komplemento turinčio kamieno ir suardytas BamHI restrikcijos fermentu. Produktas buvo atskirtas gelio elektroforeze, kad būtų galima analizuoti juostų dydžius. Be to, rekombinantinė plazmidė buvo amplifikuota PGR, naudojant pradmenis F5 / R5, apimančius gidB aukštyn ir žemyn sekas, ir išanalizuota gelio elektroforeze.

Morfologija

Kolonijų morfologijai stebėti LB agaro lėkštelės su nalidikso rūgštimi ir be jos buvo padengtos WT, gidB mutantu ir gidB komplementu. Bakterijų kolonijos morfologija buvo ištirta po vienos nakties inkubacijos 37 ° C temperatūroje.

GidB , WT ir papildytų padermių bakterijų ląstelių morfologija buvo ištirta auginant bakterijas LB sultinio terpėje su nalidikso rūgštimi ir be jos. Bakterijų ląstelės buvo dažytos gramais ir ištirtos naudojant „AxioCam HRm“ šviesos mikroskopiją ir išanalizuotos Zeiss AxioVision Rel. 4.8.1 programinė įranga (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY, JAV).

Augimo tyrimai

GidB mutanto augimo charakteristika buvo nustatyta naudojant įprastą augimo testą. Įvairių Salmonella padermių vienos nakties kultūros buvo kiekybiškai įvertintos ir standartizuotos pagal tą patį OD 600 . Vienodas skaičius ląstelių buvo inokuliuotos į šviežią LB sultinio terpę su nalidikso rūgštimi ir be jos ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 8 valandas. Kas valandą buvo imami kultūros mėginiai OD 600 nustatyti .

Konkurencinio augimo tyrimas buvo naudojamas norint nustatyti „ gidB“ mutanto gebėjimą konkuruoti su WT esant stresinėms augimo sąlygoms. Tyrimas atliktas aprašytais metodais. 40 Trumpai tariant, per naktį WT ir „ gidB“ mutantai buvo subkultūruojami šviežiame LB sultinio terpėje. Esant OD 600 0, 6, abi kultūros buvo sumaišytos toje pačioje kultūros kolboje santykiu 1: 1; po to mišinys buvo pasėtas 100 ml šviežio LB sultinio terpės praskiedžiant santykiu 1: 100 ir inkubuotas 37 ° C temperatūroje, purtant 160 aps./min. 2 savaites. Kultūros mėginys buvo imamas kas antrą dieną, nuosekliai praskiedžiamas ir dedamas ant LB agaro plokštelių atitinkamais antibiotikais. Kiekvienam štamui buvo nustatytas CFU ir nubraižyta augimo kreivė.

Jautrumas antibiotikams

„ GidB“ mutanto jautrumas antibiotikams buvo patikrintas nustatant MIC, naudojant įprastą mėgintuvėlio metodą ir automatinę jautrumo jautrumui sistemą („Trek Diagnostic Systems“, Cleveland, OH, JAV). WT, gidB mutanto ir gidB komplemento kultūros buvo sudedamos ant LB agaro plokštelių su streptomicinu, inkubuojamos per naktį 37 ° C temperatūroje ir tiriamas augimas. Atliekant įprastinį MIC testą, streptomicinas, gentamicinas ir chloramfenikolis buvo serijiniu būdu praskiedžiami LB terpėje nuo 700 iki 1, 37 μg ml −1 streptomicinui, o nuo 20 iki 0, 625 μg ml −1 - gentamicinui ir chloramfenikoliui. Vienodas ląstelių skaičius iš naktinių WT, gidB mutantų ir papildyto padermės kultūrų per naktį buvo pasėjamas į kiekvieną antibiotiko skiedinį ir inkubuojamos per naktį 37 ° C temperatūroje purtant. Kitą dieną augimas nebuvo lyginamas. Viskonsino veterinarinės diagnostikos laboratorijoje buvo atliekamas automatinis jautrumo jautrumui tyrimas, siekiant nustatyti plataus spektro dažniausiai veterinarijoje naudojamų antibiotikų (gydant galvijų ir paukščių rūšis, taip pat gyvūnus kartu su gyvūnais) GIDB mutantui MIK. ir WT. Trumpai tariant, „ gidB“ mutanto ir WT kolonijos buvo suspenduotos demineralizuotame vandenyje iki 0, 5 McFarland standarto (1 × 105 CFU ml –1 ). 10 μl standartizuotų ląstelių buvo perkelta į 11 ml Mueller Hinton sultinio, o Sensititre plokštės (mikrotitrinės plokštelės, kuriose buvo didėjančios liofilizuotų antimikrobinių medžiagų dozės) buvo pasėjamos 50 μl ląstelių suspensijos. Tada plokštelės buvo inkubuojamos ant „Sensititre“ mašinos 37 ° C temperatūroje per naktį.

Motilumo tyrimas

Šiame tyrime naudotos įvairių Salmonella padermių kultūros buvo auginamos LB sultinyje. Į 0, 35% agaro (pusiau kietas) lėkšteles su nalidikso rūgštimi arba be jos buvo sudužtas vienodas bakterijų skaičius (1 × 106) iš kiekvieno kamieno ir inkubuotas per naktį 37 ° C temperatūroje. Judrumas buvo nustatytas matuojant atstumą, migravusį nuo pasėjimo centro iki plokštelės periferijos.

Grunto prailginimas

Šis tyrimas buvo atliktas siekiant nustatyti metilinimo G527 buvimą ar nebuvimą gidB mutanto 16S rRNR ir Salmonelės WT, arba todėl, ir todėl nustatyti atsparumo antibiotikams mechanizmą. Visa RNR buvo išskirta iš gidB mutanto ir WT, naudojant bakterijų RiboPure RNR ekstrahavimo rinkinį (Ambion, Austin, TX, USA). RNR N7-metilguanozinai buvo suskaidomi redukuojant NaBH4, po to β pašalinant acto rūgšties – anilinu. 41, 42 mielių pernešimo RNR buvo naudojama kaip RNR nešiklis ir buvo hipermodifikuota esant N 7 guanozinui, apdorojant dimetilsulfatu, kuris padidino NR-metilintų guanozinų skaidymą rRNR. 43 rRNR buvo nuskaitytos atvirkštinės transkripcijos būdu, naudojant radioaktyviai paženklintus pradmenis R6 (atvirkštinis vidinis pradmuo 16S rRNR, 5′-CCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGAC-3 ′) ir R7 (atvirkštinis vidinis pradmuo 16S rRNR, 5′-TTCGAATGCAGTTCCCGGTTGC). Pradmenys buvo paženklinti 32 P etikete sumaišant 12 μl 25 ng μl −1 pradinių pradmenų su 5 μl [γ- 32 P] ATP (Perkin-Elmer, Waltham, MA, JAV), 2 μl 10 x polinukleotido. kinazės buferis ir 1 μl T4 polinukleotidų kinazės (NEB, New England Biolabs, Ipswich, MA, JAV). Mišinys buvo inkubuojamas 30 minučių 37 ° C temperatūroje, o laisvieji nukleotidai buvo pašalinti naudojant „QIAquick Nucleotide Removal Kit“ (Qiagen, Valensija, CA, JAV). Grunto prailginimo reakcijai 19 μl (apytiksliai 1 μM) apdorotos RNR buvo hibridizuota su 1 μl 32P pažymėto oligo, esant 5 μl 5x pirmos juostos buferiui 10 min. 80 ° C temperatūroje, po to 1 min. Inkubacija ant ledo. Atvirkštinės transkripcijos reakcija buvo atlikta pridedant 1 μl 5 × pirmųjų stygų buferio, 1 μl 0, 1 M ditiotreitolio, 2, 5 μl 5 m M dNTP ir 0, 5 μl SuperScript III atvirkštinės transkriptazės (Promega, Madison, WI, JAV) fermento. RNR / oligo mišinys. Reakcija buvo inkubuojama 30 min. 48–50 ° C temperatūroje. Norėdami sustabdyti reakciją, buvo pridėta vieno tūrio formamidų sustojimo tirpalo (95% formamido, 20 mM EDTA pH8, 0, 0, 05% bromfenolio mėlynojo ir 0, 05% ksileno cianolio). Mėginiai buvo kaitinami iki 90 ° C 1 min., Po to įpilami į 9% poliakrilamido karbamido gelį su sekos kopėčiomis, pagamintomis naudojant termo sekvenozės ciklo sekvenavimo rinkinį (USB, Cleveland, OH, JAV), naudojant pN01301 plazmidę, kurioje yra visas rrnB rRNR operonas iš E. coli. Gelis buvo džiovinamas, veikiamas fosforo vaizdavimo ekrano, nuskaitytas naudojant „Typhoon“ imtuvą ir išanalizuotas naudojant „ImageQuant“ programinės įrangos paketą („GE Healthcare“, Piscataway, NJ, JAV).

Statistinė analizė

Jei reikia, duomenys buvo analizuojami naudojant „Microsoft Office Excel“ ir mokinio testą. P reikšmės ≤0, 05 buvo laikomos reikšmingomis. Eksperimentai buvo pakartoti mažiausiai tris kartus, o duomenys buvo išreikšti kaip aritmetinis vidurkis su sd

Rezultatai

GidB mutanto ir komplemento analizė

„ GidB“ mutantas buvo sugeneruotas naudojant „Lambda Red“ sistemą ir patvirtintas DNR sekos nustatymu ir PGR analize. PGR amplifikacija, naudojant chromosomų DNR iš „ gidB“ mutanto, atskleidė numatomas F1 / R1, F3 / R1 ir F1 / R3 pradmenų juostas, rodančias Km r kasetės įdėjimą. Amplifikacija nesuteikė jokių juostų su F2 / R2 pradmenimis, tai rodo gidB geno deleciją . Panašiai PGR analizė, naudojant WT padermės DNR, patvirtino gidB geno buvimą ir km r kasetės nebuvimą.

Rekombinantinio pBR322, išskirto iš „ gidB“ papildyto štamo, restrikcinio skaidymo analizė parodė numatomus 1509 (įskaitant „ gidB“ intarpą) ir 3733 bazinių fragmentų dydžius, rodančius teisingą intarpo orientaciją. Rekombinantinės plazmidės PGR amplifikacija, naudojant F5 / R5 pradmenis, parodė numatomą „ gidB“ geno dydį (881 bp) su jo aukštyn ir žemyn slenkančiomis sekomis.

„GidB“ mutantas turi trūkumų morfologijoje esant stresinėms sąlygoms

Tiriant kolonijų morfologiją, reikšmingo skirtumo tarp gidB mutanto kolonijų dydžio skirtumų nebuvo, palyginti su WT ir komplementuotomis padermėmis (2a pav.), Auginant LB agare be nalidiksinės rūgšties. Tačiau gidB mutantų kolonijos buvo žymiai mažesnės nei WT ir papildė padermių kolonijas, kai jos buvo auginamos nalidikso rūgšties turinčioje LB agaro plokštelėje (2b paveikslas). Mikroskopiškai ištyrus gramais dažytas bakterijų ląsteles, reikšmingo skirtumo tarp gidB mutanto ląstelių morfologijoje nebuvo, palyginti su WT ir komplementuotomis padermėmis (2c pav.), Kai auginamos LB sultinyje be nalidikso rūgšties. Priešingai, bakterijose, išaugintose nalidikso rūgšties turinčiose terpėse, nustatyta gidB, turinti gijinę morfologiją, palyginti su WT lazdelės forma ir papildytomis padermėmis (2d paveikslas). Šie duomenys parodė, kad GidB gali atlikti svarbų vaidmenį reaguojant į salmonelę į stresines sąlygas, tokias kaip nalidikso rūgštis.

Image

WT, gidB mutantų ir papildytų padermių kolonijų ir ląstelių morfologija. ( A ) skyriuje ląstelės buvo auginamos LB agare be nalidikso rūgšties ir Salmonella padermėse nesiskyrė kolonijų morfologija. ( B ) skydelyje buvo parodytas gidB mutantas su mažomis kolonijomis, palyginti su WT, ir papildytos padermės, auginant jas nalidikso rūgšties turinčioje terpėje. ( C ) skydelyje buvo parodytos GT dėmės WT, gidB mutantams ir komplementuoti padermės, turinčios normalias lazdelės formos ląsteles, auginant LB sultinyje be nalidiksinės rūgšties. ( D ) skiltyje nurodyta gidB mutanto, išauginto nalidikso rūgšties turinčioje terpėje, gijinė morfologija, palyginti su įprasta lazdelės formos WT ir papildytomis padermėmis. Spalvotą šio paveikslėlio versiją galite rasti žurnale „ The Journal of Antibiotics“ internete.

Visas dydis

GidB ištrynimas daro įtaką augimui ir išgyvenimui streso sąlygomis

Augimo kreivės nenurodė reikšmingo gidB mutanto augimo modelio skirtumo, palyginti su WT ir komplementuotomis padermėmis, išaugintomis su nalidikso rūgštimi arba be jos (3a pav.), Parodydamos, kad gidB pašalinimas neturėjo įtakos Salmonella augimui. Tačiau konkurencinio augimo tyrimas parodė, kad per pirmąsias 7 tyrimo dienas tiek gidB mutantų, tiek WT padermės parodė panašų augimo greitį ir vienodai varžėsi dėl turimų maistinių medžiagų. Tačiau po 8 dienos mutanto padermės laipsniškas augimo sumažėjimas, palyginti su WT, rodo, kad sumažėjo bendras kūno rengybos lygis ir sumažėjo išgyvenamumas (3b pav.).

Image

GidB mutantų ir WT padermių augimo kreivės. Dviejų štamų auginimo su nalidikso rūgštimi ar be jos reikšmingo augimo modelio skirtumo nepastebėta. ( A ) skydelyje buvo pavaizduotos gidB mutantų ir WT padermės, išaugintos LB sultinyje be nalidikso rūgšties (LB sultinio su nalidikso rūgštimi augimo kreivė nerodoma). ( B ) skydelyje parodytas gidB mutantų ir WT padermių konkurencinis augimo tyrimas. „ GidB“ mutantas negalėjo konkuruoti dėl ribotų maistinių medžiagų šaltinių. Spalvotą šio paveikslėlio versiją galite rasti žurnale „ The Journal of Antibiotics“ internete.

Visas dydis

GidB ištrynimas suteikia atsparumą antibiotikams

Nors gidB mutantas sugebėjo augti LB plokštelėse, kuriose buvo 250 μg ml −1 streptomicino, WT ir papildytų padermių nebuvo (duomenys nepateikti). 1 lentelėje parodytas gidB mutanto atsparumas antibiotikams, palyginti su streptomicino, gentamicino ir chloramfenikolio WT. Nors duomenys neparodė reikšmingų gentamicino ir chloramfenikolio MIK skirtumų tarp WT ir gidB mutantų, streptomicino MIC buvo 700 μg ml −1 gidB mutantui, 87, 5 μg ml −1 WT ir 175 μg ml −1 papildytas kamienas. Šie duomenys parodė, kad gidB ištrynimas sukelia streptomicino atsparumą Salmonella .

Pilno dydžio lentelė

Automatizuotas jautrumo jautrumo tyrimas parodė mažą florfenikolio (WT: tarpinis, gidB mutantas: jautrus) ir spektinomicino (WT: atsparus, gidB mutantas: tarpinis) MIC skirtumą tarp WT ir gidB mutantų. Tačiau reikšmingas skirtumas buvo neomicinui (WT: jautrus (4 μg ml −1 ), gidB mutantui: atsparus (32 μg ml −1 )) ir streptomicinui (WT: jautrus (16 μg ml −1 ), gidB). : atsparūs (128 μg ml −1 )) GIDB mutanto MIK, palyginti su WT, rodo svarbų GidB vaidmenį keičiant jautrumą antibiotikams salmonelėse . Įdomu tai, kad streptomicinas ir neomicinas yra iš tos pačios antibiotikų šeimos, aminoglikozidai, kurie veikia prisijungdami prie mažo ribosomų subvieneto ir trukdydami baltymų sintezei.

„GidB“ mutantas turi nepakankamą bakterijų judrumą esant stresui

Motilumo tyrimas parodė, kad atstumas nuo inokuliacijos taško iki periferijos buvo 45, 3 mm gidB mutantui ir 43, 33 mm WT, kai pasėjama terpėje be nalidikso rūgšties (4a paveikslas). Tačiau judesio plokštelės, papildytos nalidikso rūgštimi, parodė, kad gidB mutantas migruoja 30, 5 mm nuo pasėjimo taško į periferiją, tuo tarpu WT ir papildytos padermės migruoja atitinkamai 63, 5 mm ir 51, 5 mm. Šie duomenys rodo, kad nalidikso rūgšties buvimas terpėje žymiai sumažino gidB mutantų judrumą (4b paveikslas), o ne WT.

Image

Įvairių Salmonella padermių judrumo tyrimas. ( A ) skydelyje buvo parodytos gidB mutantų ir WT padermės, išaugintos LB judrumo plokštelėse (be papildymo nalidikso rūgštimi), be reikšmingo jų migracijos atstumo skirtumo ( P > 0, 05). ( B ) skydelyje pastebimas reikšmingas gidB mutantų judrumo sumažėjimas, palyginti su WT ir papildytomis padermėmis, auginant nalidikso rūgšties turinčiose LB judrumo plokštelėse ( P <0, 005).

Visas dydis

GSB mutanto 16S rRNR metilinimo stoka

Autoradiogramos analizė parodė, kad „ gidB“ mutantas ir WT baigimo schemos skiriasi atvirkštinėje transkripcijoje nukleotide C526, kuris yra tiesiai priešais G527 ant 16S rRNR šablonų (5 paveikslas). Juosta, suformuota WT ties C526, o ne gidB mutante , rodė, kad WT yra N-metilintas guanozinas, dėl kurio jis suskaidytas, ir kad tokio metilinimo gidB mutante trūko dėl GidB veiklos praradimas. Šie duomenys parodė, kad GidB yra atsakingas už 16S rRNR N5 metilinimą Salmonelėse .

Image

GidB metilinimo vietos nustatymas. Gelio autoradiograma rodo NaBH 4 ir acto rūgšties – anilino paveikto gidB mutanto ir WT RNR prailginimo produktus. Tik WT RNR buvo supjaustyta fosfodiesterio stubure, kai m 7 G527, gaunant juostą, atitinkančią C526. Ši juosta nebuvo nustatyta gidB mutante dėl metilinimo G527 trūkumo.

Visas dydis

Diskusija

Norėdami ištirti galimą gidB ištrynimo poveikį salmonelių augimui ir bendrajai kūno rengybai , atlikome įprastinius ir konkurencinius augimo tyrimus. Šis tyrimas buvo plačiai naudojamas norint įvertinti bendrą tinkamumą ir nustatyti bakterijų mutantų sugebėjimą išgyventi ir konkuruoti su WT stresinėmis sąlygomis. 19, 40, 45 Remiantis tuo, kas buvo parodyta T. thermophilus , gidB ištrynimas žymiai sumažino bendrą Salmonella sugebėjimą išgyventi ir konkuruoti su WT esant stresinėms augimo sąlygoms. Tai gali būti dėl fiziologinių išlaidų, susijusių su metilinimo (m 7 G527) trūkumu gidB mutante , 19 ar biosintetinių pakitimų pokyčiais dėl gidB delecijos, kuriuos reikia papildomai ištirti.

Salmonella gidB mutantas parodė gijines ląsteles, kuriose buvo nalidikso rūgšties. Filamentacija yra nuolatinis ląstelių augimas be ląstelių dalijimosi, daugiausia susijęs su metaboliniais pokyčiais, DNR pažeidimais ir ląstelių dalijimosi mechanizmų mutacijomis. 46 Įrodyta, kad gijimas yra įprasta daugelio bakterijų išgyvenimo streso sąlygomis, tokiomis kaip maistinių medžiagų ribojimas, šeimininko efektoriai ir antimikrobinis gydymas, strategija. 46, 47 Pavyzdžiui, magnio trūkumas sukelia ląstelių dalijimosi slopinimo mechanizmą Clostridium welchii . 48, 49, E. coli , nustatyta, kad gijimas yra išlikimo strategija siekiant išvengti neutrofilų fagocitozės. 50 Taip pat nustatyta, kad β-laktaminiai antibiotikai sukelia gijų plėtrą bakterijose. 51, 52, 53 Burkholderia pseudomallei veikė gijų ląsteles, kai buvo veikiamos ceftazidimo. Buvo nustatyta, kad salmonelėse filamentinis fenotipas susijęs su in vitro išgyvenimu makrofaguose. Buvo teigiama, kad azoto oksido radikalai slopina ląstelių dalijimąsi, o siūlai - tarpininkaujant DNR pažeidimo reakcijai (SOS). Nalidikso rūgštis taip pat buvo įtraukta į E. coli ląstelių gijimą. 56, 57 Šiame tyrime nalidikso rūgštis nesudarė reikšmingų WT salmonelių siūlelių . Todėl labiausiai tikėtina, kad gidB gali reaguoti į streso sąlygas ir sukelti gijinės morfologiją salmonelėse .

Bakterijų kolonijos morfologijos pokyčiai gali būti kolonijos dydžio ar formos. Kolonijos formos pokyčiai buvo susiję su bakterijų reakcija į įvairius streso dirgiklius, tokius kaip badas, aukšta temperatūra, antibiotikų buvimas sub-IC ir genetinės mutacijos. 58, 59, 60 Įrodyta, kad keli genai dalyvauja morfologiniuose bakterijų pokyčiuose kolonijose. 61, 62 E. coli gripo (koduojančio O-antigeną) ir fimo (koduojančio 1 tipo fimbrijas ) genai reikšmingai paveikė kolonijos morfologiją. Salmonelėse buvo aptiktos mažesnio dydžio kolonijos lpd (koduojančios dihidrolipoamido dehidrogenazės) mutantą, hemL (koduojančios glutamato-1-semialdehido aminotransferazę) mutantą ir aroD (koduojančios 3-dehidrochinatinės dehidratazės) mutantą. Įdomu tai, kad šie Salmonella mutantai taip pat buvo mažiau jautrūs aminoglikozidų grupės antibiotikams. Staphylococcus aureus , veikiant gentamicinui, taip pat buvo pastebėtos mažos kolonijos. 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 Mažesnės kolonijos parodė lėtesnį daugelio bakterijų, įskaitant S. aureus , augimą . 73 Šiame tyrime, veikiant nalidikso rūgščiai, „ gidB“ mutantas sudarė mažas kolonijas, neparodė poveikio augimo greičiui.

Sumažėjęs „ gidB“ mutanto judrumas, veikiant nalidikso rūgščiai, gali būti susijęs su jo siūleliu. Buvo parodyta, kad siūlinis Burkholderia pseudomallei žymiai sumažino judrumą. Manoma, kad šį judrumo sumažėjimą lemia energijos apykaitos šiose gijų ląstelėse slopinimas, kuris yra būtinas žiedlapių judėjimui. Dėl tokio siūlomo mechanizmo taip pat galėjo atsirasti Salmonella gidB mutanto judrumas, esant nalidikso rūgščiai.

Susitarus su daugeliu kitų E. coli , T. thermophilus , Bacillus subtilis ir M. tuberculosis , gidB mutacija suteikė atsparumą streptomicinui Salmonella. 17, 18, 19 Nors mūsų mutantas suteikė žemą atsparumą streptomicinui kitose bakterijose, jo atsparumas buvo aukštas. Atsparumas antimikrobinėms medžiagoms buvo nepriklausomai patvirtintas komerciškai prieinamu automatizuotu MIC tyrimu. Šis tyrimas parodė, kad „ gidB“ mutantas, be streptomicino, turėjo didelį atsparumą neomicinui. Įdomu tai, kad streptomicinas ir neomicinas priklauso aminoglikozidų grupės antibiotikams. Abu antibiotikai veikia slopindami bakterijų baltymų sintezę, prisijungdami prie ribosomos 30S subvieneto 16S rRNR. 33, 36, 74, 75, 76, 77 Šio rišimo metu streptomicinas kontaktuoja su 16S rRNR likučiais C526 ir G527, todėl vertimo procese genetinis kodas gali būti klaidingai suprastas. 63, 78 Buvo pranešta, kad metilinimo praradimas G527 ( E. coli numeracija) dėl gidB mutacijos sukėlė atsparumą streptomicinui B. subtilis , M. tuberculosis ir kitose bakterijose. 17, 18 Mūsų duomenys parodė, kad trūksta metilinimo gidB mutanto 16S rRNR, nurodant panašų atsparumo mechanizmą Salmonella . Kita vertus, neomicinas jungiasi prie 16S rRNR kitoje vietoje nei streptomicinas. Metodas, kuriuo GidB suteikia atsparumą neomicinui salmonelėse , nėra aiškus. Gali būti, kad metilinimo nebuvimas „ gidB“ mutante galėjo paveikti neomicino jungimosi vietą arba kitu mechanizmu, kurį dar reikia nustatyti.

Apibendrinant, mes sukūrėme Salmonella padermę, iš kurios gidB buvo pašalinta iš chromosomos. Vėliau gidB mutantas buvo apibūdinamas naudojant biologinius ir virulentiškumo testus. Nors GidB neturėjo įtakos salmonelių augimui, konkurencingas augimo tyrimas parodė, kad gidB ištrynimas turėjo reikšmingą poveikį bendrai bakterijų būklei, ypač esant ribotoms stresinėms augimo sąlygoms. Esant nalidikso rūgščiai, gidB mutantas, palyginti su WT, parodė mažesnio dydžio kolonijas, gijinių ląstelių morfologiją ir sumažėjo bakterijų judrumas. Svarbiausia, kad gidB mutantas įgijo aukštą atsparumą streptomicinui, palyginti su WT. Šiuos GidB padarinius būtų galima atkurti WT fenotipui papildžius gidB mutantu. Atsparumas streptomicinui buvo susijęs su gidB mutanto 16S rRNR metilinimo praradimu ties G527 , kaip parodė pradmens prailginimo tyrimas. MIC duomenys parodė, kad gidB mutantas taip pat buvo atsparus kitam aminoglikozidų grupės antibiotikui neomicinui. Visi šie duomenys aiškiai rodo, kad gidB vaidina svarbų vaidmenį reaguojant į stresines salmonelių sąlygas. Labai svarbu ištirti GidB poveikį ribosomų struktūrai ir funkcijai salmonelėse . Norint nustatyti GidB vaidmenį reaguojant į stresą ir keičiant medžiagų apykaitos kelius, reikia papildomų tyrimų. Tokie tyrimai dabar vyksta mūsų laboratorijoje.