Dendro-dendritinis cholinerginis sužadinimas kontroliuoja dendrito smaigalio inicijavimą tinklainės gangliono ląstelėse | gamtos komunikacijos

Dendro-dendritinis cholinerginis sužadinimas kontroliuoja dendrito smaigalio inicijavimą tinklainės gangliono ląstelėse | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Neuroninės grandinės
  • Tinklainė

Anotacija

Tinklainė apdoroja vaizdinius vaizdus, ​​kad apskaičiuotų tokias savybes kaip vaizdo judėjimo kryptis. „Starburst“ amakrino ląstelės (SAC), be aksonų, nukreipti į priekį ir į priekį, yra svarbūs tinklainės kryptį selektyvios grandinės komponentai. Naujausias darbas pabrėžė, kad SAC tarpininkaujantis dendro-dendritinis slopinimas kontroliuoja pasirinktų krypčiai ganglinių ląstelių (DSGC) veikimo potencialą, vetuojant dendrito smaigalio inicijavimą. Tačiau SAC dendritinėse vietose kartu išskiria GABA ir sužadinantį neurotransmiterį acetilcholiną. Čia mes naudojame tiesioginius dendritinius įrašus, norėdami parodyti, kad pageidaujamos krypties šviesos stimulai sukelia SAC tarpininkaujantį acetilcholino išsiskyrimą, kuris galingai kontroliuoja ON-DSGC dirgiklio jautrumą, receptoriaus lauko dydį ir veikimo potencialo išvestį, veikdamas kaip sužadinimo variklis, sukeliantis dendritinius šuolius. . Remiantis tuo, suporuoti įrašai atskleidžia, kad pavienių ON-SAC aktyvinimas paskatino dendritinių smaigalių generavimą dėl vyraujančio cholinerginio sužadinimo, gaunamo pageidaujamoje ON-DSGC pusėje. Taigi, dendro-dendritinis neurotransmiterių išsiskyrimas iš SAC dvikryptis vartų dendritinio smaigo inicijavimas, siekiant kontroliuoti tinklainės gangliono ląstelių kryptiniu atranku veikimo potencialo išėjimą.

Įvadas

Algoritmai, kuriais grindžiami neuronų grandinės skaičiavimai, yra integruoti į tinklo ryšį ir įgyvendinami atliekant komponentinių sinapsių ir neuronų funkcines operacijas. Tinklainė yra ideali neuronų grandinė, norint ištirti tokius 1 algoritmus, nes regėjimo pasaulį apskaičiuoja gana paprastas trijų sluoksnių tinklas, kad būtų nukreiptas veiksmo potencialas, gaunamas tinklainės gangliono ląstelių klasėse, signalizuojančiose apie ryškias regėjimo ypatybes, tokias kaip vaizdo kryptis. judesys į aukštesnes smegenis 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 . Tinklainėje vaizdo judėjimo kryptį signalizuoja krypčiai pasirinktos tinklainės ganglinių ląstelių klasės (DSGC), kurios sukuria tvirtus veikimo potencialo išvesties modelius, reaguodamos į šviesos dirgiklius, judančius per jų priėmimo laukus arba jų viduje, pasirinkta kryptimi, tačiau reaguojančios. silpnai identiškiems dirgikliams judant priešinga nuline kryptimi. 2, 3, 4, 6, 10 .

Manoma, kad DSGC krypčių selektyviojo veikimo potencialo išvestis yra apskaičiuojama integruojant krypčiai nesuderintą sužadinimo įvestį, daugiausia tarpininkaujant glutamato išsiskyrimui iš bipolinių ląstelių 11, 12, 13 ir krypčiai suderinamą slopinantį sinapsinį įėjimą. dendritinis GABA išsiskyrimas iš aksonų neturinčių priekinių priekinių interneuronų, vadinamų žvaigždinėmis pradinėmis amakrino ląstelėmis (SAC) 9, 14, 15, 16, 17 . SAC yra pagrindiniai tinklainės krypčiai pasirinktos grandinės komponentai 18 . Tiek ON-, tiek OFF-SAC yra paskirstomi mozaikoje visoje tinklainėje 19 ir pasižymi unikalia radialine dendritine morfologija, kurioje kiekvienas dendritas veikia elektros izoliacija 14, 20, 21 . Funkciškai atlikus dviejų fotonų kalcio vaizdavimą paaiškėjo, kad SAC dendritinis kalcio atsakas yra pirmiausia generuojamas, kai šviesos stimulai juda iš somos link galinių dendritinių vietų 14 - tai krypčiai parinktas kalcio signalas, kuris, kaip manoma, generuoja neurotransmiterių dendritinį išsiskyrimą iš galinių dendritinių sinapsių. išėjimo zonos 22, 23, 24 . DSGC kryptinį derinimą sutrikdo farmakologinis GABA A receptorių 23, 25 antagonizmas, parodantis svarbų SAC tarpininkaujamo sinapsės slopinimo vaidmenį. Remiantis tuo, elektrofiziologiniai ir didelės skiriamosios gebos morfologiniai tyrimai parodė, kad esant SAC sąlygotai nulinės krypties šviesos reakcijų slopinančiai sinapsinei kontrolei tarpininkauja didesnis GABA A receptorių sąlygotas sinapsinis laidumas, sinapsių skaičius ir dendrodendritinių sinapsių pasiskirstymas. niekinė DSGC pusė 16, 17, 26, 27, 28 . Tačiau SAC nėra vien tik į priekį slopinantys interneuronai, nes ultrastruktūriniai ir funkciniai įrodymai rodo, kad SAC kartu išleidžia ir GABA, ir acetilcholiną (ACh), kad sukeltų postsinapsinį slopinimą ir sužadinimą. 16, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 . Vis dėlto mažiau išaiškinamas kartu išleisto neurotransmiterio ACh fiziologinis vaidmuo, todėl ir toliau nesutariama dėl šio pirmyn nukreipto sužadinimo signalo indėlio kuriant šviesos sukeltą DSGC veikimo potencialo išvestį ir jo vaidmens apskaičiuojant selektyvumo kryptį. 12, 16, 23, 26, 29, 30, 36, 37, 38, 39, 40, 41 . Pabrėžta, kad įrodyta, kad SAC tarpininkaujantis cholinerginis signalizavimas efektyviai kontroliuoja DSGC veikimo potencialo išvestį reaguojant į laiką kintančius regos dirgiklius ir veikia kaip esminis sužadinimo signalas mezopinėmis, mažo kontrasto sąlygomis, 40, 41 . Todėl šviesos sukeliamas SAC medijuojamas cholinerginis sužadinimas gali užtikrinti vietinę dendritinę depoliarizaciją, kuri nukreipia DSGC 41 bipolinių ląstelių sukeliamą glutamaterginį sužadinimą, kurį daugiausia tarpininkauja NMDA receptoriai 42 . Tačiau naujausi darbai pabrėžė, kad dendritinių smaigalių generavimas vaidina pagrindinį vaidmenį apskaičiuojant krypčių selektyvumą 43, 44, 45 . Tiesioginiai dendritiniai įrašai atskleidė, kad triušių DSGC sudeginimas dėl žaibiško veikimo yra sąlygotas dendritinių smaigalių generatorių kaskados inicijavimo - dendritinio skaičiavimo, kurį nutildo SAC tarpininkaujama slopinimas45. Kadangi GABA ir ACh išsiskiria iš SAC 16–23, 25, 26, 27, 33, 34, 35, 36 dendritinių vietų, šie stebėjimai rodo, kad SAC tarpininkaujantis cholinerginis sužadinimas taip pat gali veikti dendritinės elektrogenezės kontrolei.

Čia mes naudojame kelių vietų elektrofiziologinius registravimo metodus, norėdami parodyti, kad dendro-dendritinis ACh išsiskyrimas iš SAC galingai teigiamai veikia dendritinių smaigalių pradžią, kad būtų galima kontroliuoti dirgiklio jautrumą, priimamojo lauko struktūrą ir šviesos sukelto veikimo potencialo dydį. DSGC.

Rezultatai

Suporuoti įrašai iš ON-SAC ir ON-DSGC

SAC vaidmuo kryptinėje atrankinėje tinklainės schemoje buvo ištirtas atsižvelgiant į ON-OFF-DSGC, ląstelių tipo, gaunančio sinapsinius duomenis tiek vidiniame plexiform sluoksnyje (IPL) tiek ON, tiek OFF. 4, 5, 6 . Atvirkščiai, ON-DSGC varomi tik ON keliu ir turi dendritinį medį, apribotą IPL 4, 5, 6 ON-sublamina, suteikiančią supaprastintą grandinę SAC vaidmens apskaičiavimui apskaičiuojant krypties selektyvumas. Tiesioginis elektrinis įrašymas iš ON-DSGC dendritų parodė, kad aktyvi dendritinė integracija vaidina svarbų vaidmenį kuriant ir kontroliuojant šviesos sukelto veikimo potencialo šaudymą bei apskaičiuojant krypties selektyvumą 45 . Norėdami ištirti SAC tarpininkaujamų cholinerginių signalų vaidmenį šiame skaičiavime, pirmiausia atlikome porinius įrašus iš morfologiškai identifikuotų ON-SAC ir ON-DSGC, išlaikytų suaugusio triušio tinklainės fragmentuose ex vivo (1 pav.).

Image

a ) Prijungtos ON-SAC (žalios) ir ON-DSGC (juodos) poros rekonstravimas. b ) Suderinus įrašymą paaiškėjo, kad ACh ir GABA yra privalomi kartu išleisti iš ON-SAC. Viršijančios įtampos pėdsakai rodo SAC sukelto sinapsinio ON-DSGC sužadinimo virsmą sinapsiniu slopinimu, kai nAChRs buvo blokuojami mekamilaminu (MMA, 10 μM, mėlyni pėdsakai; aiškumo dėlei buvo sutrumpinti veikimo potencialai (AP)). Apatiniai pėdsakai rodo ON-SAC somatinės srovės sukeltą sužadinimą. c ) Sukauptas kiekvieno SAC sukelto PSP amplitudės tikimybės pasiskirstymas nurodytomis sąlygomis iš nurodyto suporuotų įrašų skaičiaus. ( d ) Skirtingose ​​ON-SAC ir ON-DSGC porose kontrolinėmis sąlygomis buvo sugeneruotas grynasis slopinimas, kuris paverčiamas sužadinimu, blokuojant GABA A receptorius (SR-95531 (GABAzine), 10 μM, raudonas; parodyta morfologija). a punkte. e ) Kaupiamasis PSP amplitudės pasiskirstymas nurodytomis sąlygomis. f ) Farmakologiškai išskirtų sužadinamųjų ir slopinamųjų PSP pradinis latentinis laikotarpis, užfiksuotas atitinkamai GABAzine ( n = 7) ir MMA ( n = 7). Pradinis latentinis laikas buvo matuojamas nuo presinapsinės važiavimo srovės pradžios iki 5% postinapsinio atsako maksimumo. g ) Farmakologiškai išskirtų sužadinimo ir slopinimo PSP vidurkis vertikali punktyrinė linija rodo presinapsinės važiavimo srovės pradžios laiką. h ) Viršutiniai perdengimo pėdsakai parodo dvifazį bangos pavidalą (sumą, juodus pėdsakus), susidariusį aritmetiniu būdu susumavus pavienius sužadinimo ir slopinamuosius PSP. Apatinis pėdsakas rodo vidutinį PSP, užregistruotą kontrolės sąlygomis, atkreipkite dėmesį į dvifazę bangos formą.

Visas dydis

Suporuoti įrašai atskleidė, kad slenkstinės elektrogenezės generavimas ON-SAC sukėlė arba grynuosius sužadinimo, arba grynuosius slopinamuosius postsinapsinius potencialus (PSP) sinaptiškai sujungtuose ON-DSGC (1 pav.; SAC srovės įėjimas: amplitudė = 0, 65 ± 0, 06 nA; trukmė = 10). ms; n = 16 porų). Ryšiuose, kuriuose buvo sužadinamieji PSP, selektyvi nikotininių ACh receptorių (nAChRs) farmakologinė blokada panaikino sužadinimo reakciją, kad būtų parodytas postsinapsinis slopinimas (1a – c pav.; Mekamilamino (MMA, 10 μM) amplitudės pasiskirstymas žymiai skiriasi nuo kontrolinės, P < 0, 0001; Kolmogorovo – Smironovo testas; mediana žymiai skiriasi nuo kontrolinės, P <0, 0001, Manno – Whitney testas; n = 9). Priešingai, specifinis GABA A receptorių antagonistas GABAzinas (10 μM) nerodė nAChR tarpininkavimo sužadinimo jungtyse, kurios kontrolinėmis sąlygomis rodė grynąjį slopinimą (1d pav., E; P <0, 0001; Kolmogorovo – Smironovo testas; mediana, žymiai skirtinga nuo kontrolinės, P). <0, 0001, Manno – Whitney testas; n = 6). Farmakologiškai išskirti cholinerginiai sužadinantys ir GABAerginiai slopinantys PSP pasižymėjo būdingu skirtumu tarp jų pradžios iki SAC aktyvavimo pradžios, o prasidėjus GABAerginiams inhibitoriams PSP sukelia cholinerginius sužadinamuosius PSP (1f – h pav., Papildomas 1a – b pav.; IPSP). laikas = 6, 6 ± 0, 9 ms; EPSP pradžios laikas = 10, 3 ± 1, 3 ms, P = 0, 0432; T = 2, 295; pradžios laikas matuojamas esant 5% PSP amplitudės; IPSP pakilimo laikas = 8, 9 ± 1, 9 ms; EPSP pakilimo laikas = 5, 8 ± 0, 5 ms; pakilimo laikas matuojamas nuo 10 iki 90% PSP amplitudės; n = 14). Šio skirtumo negalėjo būti atsižvelgiama į presinapsinį mechanizmą, pavyzdžiui, laikiną virpėjimą įsitraukiant į dendritinio siųstuvo išleidimą, nes pradinio latencijos pasiskirstymas aplink vidurkį buvo panašus farmakologiškai izoliuotų sužadinimo ir slopinamųjų PSP atveju (papildomas 1c pav.). Tačiau SAC sukeltų PSP pradžią gali įtakoti siųstuvo difuzijos iš SAC dendritinių vietų laikas. Ankstesni tyrimai rodo, kad tinklainėje paracrininiu būdu gali atsirasti cholinerginių signalų, todėl jie gali nepriklausyti nuo struktūriškai nustatytų dendro-dendritinių sinapsių 17, 41 - idėja atitinka čia stebėtą lėtesnį farmakologiškai išskirtų cholinerginių PSP pradžios laiką. . Tačiau atkreipiame dėmesį, kad ankstesni suporuoti įrašai atskleidė panašius SAC medijuojamų cholinerginių ir GABAerginių postsinapsinių srovių pradžios momentus DSGC, kai laikinai sutampančios sužadinimo ir slopinamosios sinapsinės srovės buvo atskirtos somatinės įtampos gnybtais pagal atvirkštinį potencialą 16 . Prognozuojama, kad skirtingas dendro-dendritinio sužadinimo ir slopinimo pradžia, kuris čia stebimas, gali sukelti dvifazių junginių PSP, jei ir GABA, ir ACh yra išlaisvinti iš vieno ON-SAC. Iš tikrųjų, kai farmakologiškai atskirti sužadinimo ir slopinimo komponentai buvo aritmetiškai susumuoti, susidarė aiškus dvifazis junginys PSP (1h pav.). Vadovaujantis tuo, SAC sukeliami PSP, užfiksuoti kontrolinėmis sąlygomis, dažnai rodė dvifazę bangos formą, kuri buvo akivaizdžiai matoma atliekant pavienius bandymus ir vertinant iš eilės einančius atsakus į skaitmeninį vidurkį (atitinkamai, 1d, h pav.). Šie duomenys kartu parodo, kad ACh ir GABA yra išleidžiami iš atskirų ON-SAC.

Kitas klausimas: ar sinapsinis ON-SAC poveikis yra suderintas su postsinapsinių ON-DSGC kryptiniu derinimu (2 pav.). Norėdami tai padaryti, mes suplanavome ON-DSGC veikimo potencialą, kurį sukuria šviesos juostos, perkeltos per jų priėmimo laukus, ir padarėme suporuotus įrašus iš ON-SAC, pastatytų arti dendritinės pavėsinės krašto, pirmiausia suaktyvindami šviesos stimulais, judančiais pageidaujama kryptimi, pageidaujama pusė arba ON-SAC, išdėstyti arti dendritinės pavėsinės krašto, pirmiausia įjungiamo su nulinės krypties šviesos dirgikliais, nulinė pusė (2a pav., b įterpimas ir 2c, d pav., įdėklas, papildomas 2 pav.; šviesa) juostos dydis = 100 x 300–400 μm, perkeltas viena iš 12 krypčių, esant 0, 24 mm s – 1 ; krypties selektyvumo indeksas (DSI) = 0, 93 ± 0, 03; SAC-DSGC somos atskyrimas = 270 ± 14 μm; n = 17). Kai ON-SAC somatos buvo išdėstytos arti ON-DSGC pageidautinos pusės krašto, o artimos dendro-dendritinės SAC-DSGC skyrimo vietos buvo apribotos pageidaujama puse, buvo sugeneruoti grynieji sužadinimo atsakai (2a pav. b, e; PSP amplitudė = 2, 02 ± 0, 37 mV, integralas = 31, 4 ± 4, 3 μV.s; n = 6 poros). Priešingai, kai somata ir dendro-dendrito pasirinkimo vietos buvo sutelktos į nulinę pusę, reakcijos buvo vidutiniškai slopinančios, tačiau demonstravo platų diapazoną (2c-e pav.; PSP amplitudė = −0, 59 ± 0, 8 mV; integralas = - 33, 7 ± 21, 0 μV.s; n = 11 porų; žymiai skiriasi nuo pageidaujamos pusės: P = 0, 035, T = 2, 31; integralas: P = 0, 041, T = 2, 24). Taigi, esant dabartinėms spaustuko įrašymo sąlygoms, SAC sąlygoto cholinerginio sužadinimo pusiausvyra yra didesnė už slopinimo pageidaujamoje ON-DSGC pusėje, tuo tarpu slopinimas yra didesnis už sužadinimo nulinę pusę (2e pav.). Šis radinys yra lygiagretus SAC tarpininkaujamo sužadinimo ir slopinimo tiksliniam dendritiniam poveikiui, apie kurį pranešama ON – OFF DSGC 16, 26, 27, 36, ir tokiu būdu išryškėja stereotipinės dendro-dendritinės schemos vidinio plexiformos ON ir OFF sublamina. sluoksnis.

Image

a ) Prijungtos ON-SAC (žalios) ir ON-DSGC (juodos) poros rekonstravimas, nurodant artimų dendro-dendritinių paskyrimų vietas (raudoni simboliai) ir vektorinį kampą (raudona rodyklė, palyginti su SAC somata). Morfologijos buvo suderintos su pageidaujamu ON-DSGC šviesos reakcijų krypčių vektoriu ( b intarpas). Visose plokštėse, kur yra pageidaujama ON-DSGC pusė, dendritinis laukas, pirmiausia įjungiamas šviesos stimulais, judančiais pageidaujama kryptimi, yra virš horizontalios brūkšninės linijos. Atkreipkite dėmesį, kad SAC somatos ir visos dendro-dendritinės artimos pozicijos yra išdėstytos pageidaujamoje postsinapsinio ON-DSGC pusėje. b ) Iš iliustruotų langelių suporuoti įrašai ( a ) parodė, kad SAC sukeltų sužadinamųjų PSP įjungimas ON-DSGC (pilki pėdsakai, raudoni pėdsakai yra skaitmeninis vidurkis). Presomatinės SAC įtampos somatinės srovės sukeltos SAC įtampos reakcijos parodytos žemiau (žalias pėdsakas). c ) ON-SAC, esančio ON-DSGC nulinėje pusėje, rekonstrukcija. Morfologijos buvo suderintos su ON-DSGC šviesos atsako vektoriu ( d intarpas). d ) Iliustruotų langelių poriniai įrašai ( c ) atskleidė SAC tarpininkaujamus slopinamuosius PSP (pilki pėdsakai, mėlyni pėdsakai yra skaitmeninis vidurkis). e ) SAC, esančių postinapsinių ON-DSGC pusių, pirmenybėje ir nulinėje pusėje, poveikio santrauka. Postinapsinių ON-DSGC morfologija parodyta kaip perdengta ir erdviniu būdu filtruota (50 μm, juoda) rekonstrukcija, užregistruota pagal pageidaujamą šviesos reakcijos kryptį, schematiškai parodyta geltonomis šviesos juostomis. Šiame lauke yra SAC perimetriniai vaizdai (žalia). Rodyklės rodo SAC-DSGC artimųjų dendro-dendritinių vertinimų vektoriaus kampą, spalvotą pagal jų postsinapsinį poveikį (raudonas sužadinamasis, mėlynas slopinamasis PSP). Vektoriaus ilgis reiškia 1 kontaktą viename μm. Visi šviesos dirgikliai, kurių kryptis schematiškai pavaizduota, buvo naudojami fotopinėmis sąlygomis. Stimulo intensyvumas buvo dvigubai didesnis nei foninio apšvietimo.

Visas dydis

Cholinerginis sužadinimas kontroliuoja šviesos sukeltą neuronų išėjimą

Norėdami ištirti SAC tarpininkaujamo cholinerginio sužadinimo indėlį į šviesos sukeltą veikimo potencialą DSGC, mes pateikėme judančius šviesos juostos dirgiklius, kurie buvo pernešami per ON-DSGC receptorių laukus (3 pav.; Papildomas 3 pav.). Dėl nAChRs antagonizmo dramatiškai sumažėjo tvirto ON-DSGC veikimo potencialas, sukeltas šviesos juostų, judėtų pageidaujama kryptimi, ir praktiškai panaikintas silpno veikimo potencialas, kurį sukelia nulinės krypties dirgikliai. Šis efektas pastebimas somatinių visos ląstelės ir prie ląstelių pridedamame įraše. režimai (3a – c pav.; papildomas 3 pav.; pageidaujama kryptis: valdymas = 27, 4 ± 2, 5 Hz; nAChR antagonistas = 3, 1 ± 0, 8 Hz; P <0, 0001, T = 11, 62; nulinė kryptis: valdymas = 1, 1 ± 0, 3 Hz; nAChR antagonistas = 0, 03 ± 0, 02 Hz; P = 0, 0008, T = 3, 77; n = 28). Analizuojant ląstelių užfiksuotus šviesos atsakus, paaiškėjo, kad nAChR antagonistai žymiai sumažino membranos depoliarizaciją, kurią sukelia pageidaujamos krypties šviesos dirgikliai, ir nulinės krypties reakcijas pavertė silpnai sužadinančiomis į slopinamąsias (3a pav.). Šis poveikis negalėjo būti įvertintas sumažinus veikimo potencialo sudegimą, nes šis pokytis buvo akivaizdus, ​​kai veiksmo potencialai buvo skaitmeniškai pašalinti naudojant vidutinį filtrą (10 ms) 46 (3 pav.; Papildomas 4 pav.; Vidutinės filtruotos įtampos integralas) šviesos atsakai: pageidaujama kryptis: kontrolė = 12, 0 ± 1, 0 mVs; nAChR antagonistas = 0, 6 ± 0, 7 mV.s; P <0, 0001, T = 11, 2; nulinė kryptis: kontrolė = 4, 0 ± 1, 1 mV.s; nAChR antagonistas = −8, 7 ± 0, 7 mVs; P <0, 0001, T = 10, 27; n = 28). Be to, kai kryptinį derinimą sutrikdė GABA A receptorių antagonizmas, nAChR blokada smarkiai sumažino judančio šviesos juostos sukeltą veikimo potencialą visomis išbandytomis kryptimis (papildomas 5 pav.; Veikimo potencialo šaudymo dažnis: GABAzine = 35, 8 ± 3, 6 Hz, GABAzine + Hex = 7, 8 ± 3, 8 Hz; P <0, 0001, T = 10, 96; n = 6; DSI: GABAzine = –0, 03 ± 0, 03, GABAzine + Hex = –0, 14 ± 0, 05).

Image

a ) Tinklainės tinklainės mikroschemijos fiziologinis aktyvavimas (apibendrinta schema schemoje) šviesos juostomis, perkeltomis per ON-DSGC receptorių lauką (įterptinė morfologinė rekonstrukcija), sukuria galingą veikimo potencialą (AP), šaudant judant pageidaujama kryptis, tačiau nedaug AP išvesties, kai judama nuline kryptimi (valdymas, juodi pėdsakai, AP aiškumo sumetimais). Dėl nAChRs antagonizmo sumažėja pageidaujamos šviesos sukeltos AP šaudymo trukmė ir susidaro gryni slopinantys atsakai, kai šviesos dirgikliai juda nuline kryptimi (heksametonas (Hex); raudoni pėdsakai). b ) pageidaujamo ir nulinės krypties šviesos sukeltos AP šaudymo nurodytomis sąlygomis periostimulinė histograma (šiukšliadėžės dydis 20 μm). c ) NAChR antagonistų (mekamilamino (MMA); mėlyni simboliai) pageidaujamos šviesos sukeltos AP šaudymo sumažėjimo kiekybinis įvertinimas. d ) vidutinės filtruojamos (10 ms) ir nulinės krypties šviesos reakcijų įtampos integralo kiekybinis įvertinimas nurodytomis sąlygomis (kontrolė, palyginti su Hex: pageidautina: P <0, 0001, T = 10, 19; nulis: P <0, 0001, T = 11, 47; kontrolė prieš MMA: pageidautina: P <0, 0001, T = 15, 86; niekinė: P = 0, 0038, T = 6, 02). Visi šviesos dirgikliai buvo naudojami fotopinėmis sąlygomis. Stimulo intensyvumas buvo dvigubai didesnis nei foninio apšvietimo.

Visas dydis

Norėdami išsamiau ištirti cholinerginės signalizacijos vaidmenį kontroliuojant šviesos sukeltą DSGC veikimo potencialą, mes sutrikdėme ACh hidrolizę, naudodami acetilcholinesterazės (AChE) inhibitorių ambenonį. Esant ambenoniui, buvo veiksmingai palengvintas ON-DSGC sukeltas veikimo potencialas, kurį sukelia pageidautini ir nulinės krypties šviesos dirgikliai, ir nutrauktas krypčių selektyvumas (4a pav., B; DSI: kontrolė = 0, 93 ± 0, 0, 1; ambenonium = 0, 17 ±). 0, 03; P = 0, 002, „Wilcoxon“ pasirašytas eiliškumo testas; vidutinių filtruotos šviesos reakcijų įtampos integralas: pageidautina kryptis: kontrolė = 8, 8 ± 0, 8 mV.s; ambenoniumas = 27, 6 ± 2, 1 mVs; P = 0, 0002, T = 9, 85; nulinė kryptis : kontrolė = 2, 2 ± 0, 6 mVs; ambenonis = 28, 8 ± 3, 1 mVs; P = 0, 0004, T = 8, 17; n = 6). Ankstesnis darbas parodė, kad farmakologinis manipuliavimas AChE leidžia ištirti erdvinį ryšį tarp cholinerginio atpalaidavimo vietų ir postsinapsinių nAChRs, nustatant, kad manipuliavimas ACh hidrolize keičia cholinerginį signalizavimą tik tada, kai išsiskyrimo vietos yra erdvėje nutolusios nuo aktyvuotos postsinapsinės nAChRs 47, 48 . Todėl mes ištyrėme, ar AChE kontroliuojamų farmakologiškai izoliuotų vienetinių nAChR tarpininkaujamų PSP blokada atsirado dėl suporuotų SAC-DSGC įrašų. Esant tokioms sąlygoms, AChE inhibitoriaus ambenonio taikymas žymiai padidino vieningą cholinerginį sužadinimo perdavimą, tačiau nepaveikė farmakologiškai izoliuoto vieningo GABAerginio slopinimo (4c pav., D; sužadinamojo PSP integralas: kontrolė = 20, 8 ± 4, 2 μV); ambenonio = 54, 3 ±. 11, 5 μV.s; P = 0, 011, T = 4, 49; n = 5). Be to, porinis SAC-DSGC registravimas atskleidė, kad ACh hidrolizės padidėjimas lokaliai naudojant egzogeninį AChE atvirkščiai sumažino farmakologiškai išskirtų nAChR tarpininkaujamų PSP amplitudę (papildomas 6 pav.; AChE (0, 4 U / μl), ištirpinto Ames tirpale: kontrolė). = 1, 87 ± 0, 25 mV; AChE pūtimas = 1, 10 ± 0, 17 mV; P = 0, 0023, T = 5, 72; n = 6). Atvirkščiai, kontroliuojamas vietinis Ameso tirpalas nepakeitė SAC-DSGC sužadinimo perdavimo (papildomas 6 pav.; Kontrolė = 2, 15 ± 0, 64 mV; Ames pylimas = 1, 99 ± 0, 67 mV; P = 0, 105, T = 2, 09; n = 5). ). Dviejų krypčių vieningo SAC sukelto cholinerginio perdavimo kontrolė padidinant ir sumažinant AChE aktyvumą yra suderinama su erdviniu atskyrimu tarp SAC išsiskyrimo vietų ir aktyvuotų postsinapsinių AChRs 47, 48 . Norėdami patikrinti, ar ACh išsiskyrimas kontroliuoja pageidaujamą ir nulinės krypties šviesos atsaką, išeikvojome presinapsinį ACh, užblokavę vezikulinio ACh pernešėją vesamikoliu 49 . Kai presinapsinis ACh išsiskyrimas buvo išeikvotas, buvo smarkiai susilpnintos lengvosios ir nulinės krypties šviesos reakcijos, o SAC-DSGC sužadinimo sinapsinis perdavimas buvo selektyviai nuspaustas (4e – h pav.; Vidutinių filtruotų šviesos reakcijų įtampos integralas: pageidaujama kryptis: kontrolė = 14, 5 ± 3, 4 mV). .s; vesamikolis = -3, 3 ± 1, 5 mVs; P = 0, 0008, T = 9, 05; nulinė kryptis: kontrolė = 4, 9 ± 3, 2 mV.s; vesamikolis = -11, 1 ± 1, 9 mV.s; P = 0, 0004, T = 11, 11 ; n = 5; sužadinimo PSP amplitudė: kontrolė = 3, 0 ± 0, 6 mV; vesamikolis = 0, 9 ± 0, 2 mV; P = 0, 004, T = 4, 47; n = 7). Visi šie duomenys atskleidžia, kad ACh išsiskyrimas iš ON-SAC leidžia efektyviai kontroliuoti ON-DSGC fiziologinį reagavimą, aktyvinant postsinapsinius nAChR, laikantis vietinės paracrininės formos neurotransmisijos.

Image

( a ) Acetilcholinesterazės aktyvumo blokada stipriai padidina veikimo potencialą (AP), sukeliantį pageidaujamas ir nulinės krypties šviesos juostas (AP aiškumo sumetimais buvo sutrumpintos). b ) Šviesos sukelto AP šaudymo periostimulinės histogramos nurodytomis sąlygomis (ambenonis (ABN); šiukšliadėžės dydis 20 μm). c ) Ambenonis padidina farmakologiškai išskirtus SAC tarpininkaujamus sužadinimo PSP (užfiksuotus tetrodotoksine (TTX); 1 μM ir GABAzine (10 μM)), bet ne slopinančius PSP (užfiksuotus TTX ir mekamilaminu (MMA); 10 μM). d ) Kaupiami duomenys, rodantys selektyvų sužadinamųjų PSP ploto padidinimą blokuojant acetilcholinesterazės aktyvumą (plotas matuojamas per 100 ms laiko langą). e ) Vezikulinio ACh pernešiklio blokada susilpnina pageidaujamos krypties šviesos sukeltą AP išėjimą ir atidengia nulinės krypties membranos hiperpolarizaciją. f ) Šviesos sukelto AP šaudymo periostimulinės histogramos nurodytomis sąlygomis (vesamikolis (VES); šiukšlių dydis 20 μm). ( g ) Vesamikolis silpnina farmakologiškai išskirtus SAC sukeltus sužadinimo PSP, bet ne slopinančius PSP. h ) Kaupiami duomenys, rodantys selektyvų sužadinamųjų PSP sumažinimą dėl vezikulinio ACh pernešėjo farmakologinės blokados (PSP amplitudė normalizuota). Visi šviesos dirgikliai buvo naudojami fotopinėmis sąlygomis. Stimulo intensyvumas buvo dvigubai didesnis nei foninio apšvietimo. Duomenys d, h reiškia vidurkį ± sem

Visas dydis

Norėdami ištirti, ar cholinerginis sužadinimas turėjo įtakos ON-DSGC reagavimui į šviesos dirgiklius plačiame stimulų diapazone, mes sistemingai kintame šviesos stimulų intensyvumą ir jų judėjimo greitį, kad būtų sukurtas stimulo ir atsako santykis kontroliuojamomis sąlygomis ir esant nAChR. antagonistas (5a pav., b; stiprumas: nuo 10 iki 100% virš fono; greitis: 0, 04–0, 9 mm s –1 ). Kontrolinėmis sąlygomis ON-DSGC kryptinės selektyviosios išėjimo reakcijos atsirado esant šviesos stimulo slenksčiui, kad būtų suaktyvinamas veikimo potencialas, ir buvo palaikomos per 50 kartų didesnį pasirinkimo kryptį (5c pav.). NAChRs antagonizmas padidino slenkstinę šviesos intensyvumą, suvaržė stimulų, generuojančių veikimo potencialo išvestį, greitį ir sumažino veikimo potencialo šaudymą visame šviesos stimulų diapazone (5a, b pav.). Pabrėžtina, kad šis dinaminio diapazono glaudinimas nebuvo susijęs su selektyvumo krypčių apskaičiavimo tikslumo sumažėjimu (5c pav.; DSI: kontrolė = 0, 946 ± 0, 014; Hex = 0, 990 ± 0, 004; n = 70 bandymų, n = 9 ląstelės). ). Norėdami išsamiau ištirti šviesos diapazoną, per kurį SAC tarpininkaujantys cholinerginiai signalai kontroliavo ON-DSGC reagavimą, mes atlikome įrašus preparatuose, pritaikytuose mezopinės šviesos sąlygoms (fono apšvietimas ir stimulo intensyvumas sumažintas iki 0, 06 standartinio fotopo lygio). Esant tokioms silpnoms šviesos sąlygoms, nAChR antagonizmas dramatiškai sumažino ON-DSGC veikimo potencialą, kurį sukelia pageidaujamos ir nulinės krypties šviesos juostos (papildomas 7 pav.; Pageidautina kryptis: kontrolė = 15, 1 ± 2, 3 Hz; nAChR antagonistas = 0, 4 ± 0, 1 Hz; P <0, 0001, T = 6, 314; n = 11; nulinė kryptis: kontrolė = 1, 0 ± 0, 3 Hz; nAChR antagonistas = 0, 04 ± 0, 02 Hz; P = 0, 0027, T = 3, 961). Iš viso šie duomenys rodo, kad cholinerginis sužadinimas kontroliuoja jautrumą šviesai ir ON-DSGC išėjimo reakcijų dydį.

Image

( a, b ) nAChRs (heksametonio (šešiakampis); raudoni simboliai ir pėdsakai) antagonizmas silpnina veikimo potencialą (AP), sukeliantį pageidaujamos krypties šviesos juostas, perkeltas per priėmimo lauką plačiu greičio diapazonu ( a ) ir esant optimalus greitis šviesos stiprio intervale ( b ; greitis = 0, 24 mm / s). ( c ) Cholinerginio signalo poveikis apskaičiuojant krypties selektyvumą ir pageidaujamos krypties šviesos sukeltas AP šaudymas per a, b parodytų stimulų diapazoną. Atkreipkite dėmesį į sumažėjusį dirgiklio jautrumą, AP šaudymo greičio susilpnėjimą, tačiau išlaikant kryptinį derinimą heksametone. Visi šviesos dirgikliai buvo naudojami fotopinėmis sąlygomis. Stimulo intensyvumas yra susijęs su foniniu apšvietimu.

Visas dydis

Cholinerginė signalizacija skatina aktyvią dendritinę integraciją

Norėdami sužinoti, kaip SAC medijuojamas cholinerginis sužadinimas yra integruojamas į postsinapsinius gangliono ląsteles, pirmiausia nustatėme, ar cholinerginiai signalai kontroliuoja ON-DSGC receptorių lauko struktūrą. Kontrolinėmis sąlygomis mes nustatėme glaudų erdvinį ryšį tarp virš slenksčio esančio receptoriaus lauko dydžio ir ON-DSGC dendritinio lauko dydžio plačiame apšvietimo diapazone, suderinamu su ankstesnėmis ataskaitomis 50 (6 pav.; Priimamo lauko dydis). = 923 ± 24 μm; dendritinio lauko dydis = 851 ± 23 μm, r = 0, 574; P <0, 0001, n = 66 ląstelės). Pažymėtina, kad, kai pageidaujamos krypties šviesos juostos buvo perbrauktos per priėmimo lauką, buvo nustatytas glaudus ryšys tarp laiko, per kurį šviesos dirgikliai suaktyvino tinklainės schemą, kuri inervuoja ON-DSGC pageidaujamo dendritinio polaukio kraštą, ir pirmojo atsiradimo laiko. šviesos sukeltas veikimo potencialas, kurį galima paversti erdviniu santykiu (6a – e pav.; valdymas: poslinkis = 19, 8 ± 3, 6 μm; n = 642 bandymai, n = 66 ląstelės). Farmakologinė nAChR blokada sumažino suveikimo potencialą ir sulėtino jo pradžią, nes pageidaujamos krypties šviesos juostos buvo perbrauktos per receptorinį lauką, todėl nutrūko ryšys tarp dendritinio lauko krašto ir veikimo potencialo generavimo, o dramatiškai suprastėjo virš slenksčio esantis receptas. lauko dydis (6a pav. - e; kontrolė = 923 ± 24 μm; nAChR antagonistas = 471 ± 40 μm; P <0, 0001; T = 11, 27; n = 66). SAC medijuojamo cholinerginio sužadinimo blokada panašiu mastu sutrikdė ON-DSGC plataus lauko receptorių lauko savybes fotopinės ir mezopinės šviesos sąlygomis (palyginkite grafikus 6d, e pav.), Kas rodo, kad SAC tarpininkaujantys cholinerginiai signalizacijos funkcijos veikia galingai. skatinti dendritinį sužadinimą plačiame fiziologiniame dirgiklių diapazone.

Image

( a ) NAChR antagonizmas (kontrolė, juodi pėdsakai; heksametoniumas (šešiakampis); 100 μM) raudonais pėdsakais sutrikdo glaudų erdvinį ryšį tarp pradinio veikimo potencialo (AP) ir ON-DSGC dendritinės pavėsinės periferinio krašto., * nurodo pirmąjį AP). Nubrėžta atskaitos linija rodo iš dalies rekonstruoto dendritinio medžio kraštą. Šviesos dirgikliai buvo naudojami fotopinėmis sąlygomis (stimulo intensyvumas 50% didesnis nei foninis apšvietimas). ( b, c ) Dendritinės briaunos, nukreiptos į periostimuliacinę pageidaujamos krypties šviesos sukeltos AP šaudymo kontrolę (juoda) ir esant nAChR antagonistams (raudona; Hex; 100 μM, šiukšliadėžės dydis 20 μm, fotopiniai 50% dirgikliai) . d ) Cholinerginis sužadinimas kontroliuoja receptoriaus lauko dydį plačiame šviesos intensyvumo diapazone. Grafikai apibendrina ryšį tarp pirmojo AP vidutinės (± sem) erdvinės padėties, kurią sukelia pageidaujamos krypties šviesos dirgikliai, atsižvelgiant į kontroliuojamo pageidaujamo dendritinio poteksto briaunos kraštą (juoda) ir nAChR antagonistų (raudona). Procentinis stimulo intensyvumas, palyginti su fonu, rodomas virš kiekvienos diagramos. Kiekvienoje eilutėje pateikiami vienos ląstelės rezultatai (> = 5 bandymai kiekvienoje sąlygoje), pilkos rodyklės rodo ON-DSGC, kurie nesugeneravo AP išvesties, esant nAChR antagonistui. e ) Kaupiamojo pirmojo AP erdvinės padėties tikimybės grafikai, kuriuos pavieniai bandymai sukelia pagal pageidaujamus krypties šviesos dirgiklius, palyginti su pageidaujamo dendritinio poteksto briauna, duomenys pateikiami per dirgiklio intensyvumo diapazoną, nurodytą d .

Visas dydis

Ankstesni triušio tinklainės stebėjimai parodė, kad aktyvi dendritinė integracija yra būtina, norint atsirasti plataus ON-DSGC receptorių lauko savybių 43, 45 . Todėl mes panaudojome vienu metu somatinius-dendritinius įrašymo būdus, kad tiesiogiai išnagrinėtume dendritinius mechanizmus, kuriais grindžiamas SAC medijuojamo cholinerginio sužadinimo integravimas. Kontrolinėmis sąlygomis vienu metu atlikti somatiniai-dendritiniai įrašai parodė, kad pageidaujamos krypties šviesos dirgikliai paskatino tvirtą dendritinių smaigalių generavimą, kurie į priekį plinta į somatą ir aksoną, kad būtų pradėtas šaudymas po veikimo potencialą (7a pav., B; papildomas 8 pav.). Farmakologinis SAC medijuojamo cholinerginio sužadinimo blokavimas dramatiškai sumažino šviesos sukeltų dendritinių smaigalių susidarymą ir iš to išplaukiantį veikimo potencialą (7a – d pav.). Analizė parodė, kad cholinerginis sužadinimas kontroliavo šviesių juostų iškeltų dendritinių smaigalių skaičių, nes jie sužadino galines dendritines vietas, kurios pateko į dendrito registracijos vietą, parodydami, kad SAC medijuojamas cholinerginis sužadinimas yra integruotas vietoje ON-DSGC dendritinės pavėsinės (pav. 7a – d, galinis dendritinis medis rekonstravimo metu paryškintas mėlyna spalva; epizodo dendritiniai smaigai: kontrolė = 14, 4 ± 1, 9; šešiakampis = 2, 0 ± 0, 8; P = 0, 0002, T = 6, 4; n = 9; dendritinis užrašas, kurio pageidaujama pusė = 275 ± 22 μm atstumu nuo somos; n = 5; nulio polaukis = 265 ± 41 μm; n = 4, papildomas 8 pav.). Norėdami ištirti šios pogrupės ląstelių integracijos formos lemiančius veiksnius, mes ištyrėme, ar cholinerginis sužadinimas, kurį suteikia vienas SAC, galėjo paskatinti dendritinių smaigalių atsiradimą ON-DSGC. Tam mes atlikome vienu metu somatinius-dendritinius įrašus iš ON-DSGC ir trečiąjį somatinius įrašus iš presinapsinio ON-SAC, dalyvaujant GABA A receptorių antagonistui GABAzinui (7e – g pav .; n = 7). Šiomis sąlygomis suaktyvinus vieną SAC, susidarė nAChR tarpininkaujantys dendritiniai sužadinimo PSP, kuriuos vainikavo šaudymas į dendritinius smaigalius, įrašuose, kur dendro-dendritiniai SAC-DSGC parinkimai buvo sutelkti į įrašytą dendritinę pavėsinę. ON-DSGC lokaliai atstumu nuo dendrito registravimo vietos (7e – g pav .; dendritiniai įrašai - 145 ± 5 μm nuo somos; vidutinė SAC dendro-dendritinių paskyrimų vieta iš DSGC somos = 437 ± 26 μm; n = 5). Tuo pačiu metu atliktas somatinis registravimas parodė, kad prieš kiekvieną dendritinį smaigalį buvo sušaudytas ir sukeltas veikimo potencialas (dendritinis smaigas iki veiksmų potencialo uždelsimas = 0, 40 ± 0, 05 ms). Atliekant dendritinius įrašus iš dendritinio polaukio, esančio priešingai vyraujančiai SAC inervacijos vietai, SAC išprovokuotas cholinerginis sužadinimas sukėlė veikimo potencialo šaudymą, kuris pirmiausia buvo užfiksuotas somatiniu būdu, o vėliau vėl išplatintas į dendritinį įrašymo vietą, suderintą su cholinerginiu. priešingo dendritinio medžio sužadinimas (papildomas 9 pav.). Visi šie duomenys tiesiogiai parodo, kad dendro-dendritinis cholinerginis sužadinimas gali paskatinti dendritinių smaigalių susidarymą ON-DSGC.

Image

a ) ON-DSGC rekonstravimas, parodant įrašymo elektrodų išdėstymą ir pageidaujamą šviesos juostos judėjimo kryptį; mėlynos spalvos dendrito medžio atkarpa patenka į dendrito registravimo vietą. b ) Dendritinių smaigalių (dendritinių įrašų (mėlynos spalvos pėdsakai), 1 ir 2 padėčių a punkte) susidarymą ir atgalinio sklidimo veikimo potencialus (3 ir 4 padėtis a ) sušvelnino nAChRs (heksametonio (Hex)) antagonizmas. 100 μM), kai pageidaujamos krypties šviesos juosta buvo perbraukta per priėmimo lauką. Pėdsakai yra suderinti su somatiniu būdu užfiksuoto veikimo potencialo (AP) viršūne. c ) AP išvesties sumažinimo ir dendritinių smaigalių susidarymo heksametoniu santrauka. d ) Somatinių-dendritinių smaigalių uždelsimo erdvinis modelis (juodi simboliai) ir po nAChR blokavimo (Hex; raudoni simboliai). e ) Vienu metu įrašytų ON-SAC ir ON-DSGC rekonstravimas, parodant įrašymo elektrodų išdėstymą. f ) ON-DSGC somatiniai (juodi pėdsakai) ir dendritiniai (mėlyni pėdsakai) įrašai rodo, kad presinapsinis SAC skatina dendritinių smaigalių generavimą (rekonstrukcija a ; įrašai buvo atlikti GABAzine (10 μM); penki iš eilės SAC iškviesti viršutiniai slenksčiai. parodomi sužadinimo atsakai). Apatiniai perdengimo pėdsakai parodo SAC aktyvavimo sukelto mažesnio slenksčio įtampos dendro-somatinį silpnėjimą (žalias pėdsakas). g ) SAC-DSGC artimojo pasirinkimo vietų kiekybinis įvertinimas užfiksuotuose DSGC dendritiniuose pogrindžiuose (kairioji schema, vertikali linija žymi vidutinę dendrito įrašymo vietą; 145 ± 5 μm nuo somos; n = 5). Atkreipkite dėmesį, kad visos aptiktos vietos buvo nutolusios nuo dendritinių įrašymo vietų. Dešinėje diagramoje parodyta, kad dendritiniai smaigaliai viršijo visų potencialų bandymus virš slenksčio.

Visas dydis

Cholinerginiai signaliniai vartai pradeda dendritinį smaigalį

Norėdami kiekybiškai ištirti, kaip šviesos sukeliamas dendro-dendritinis cholinerginis sužadinimas kontroliuoja dendritinių smaigalių susidarymą, mirksėjome šviesiomis dėmėmis kontroliuojamose galinėse dendrito vietose ir esant nAChR antagonistams (8 pav.; Šviesos taškas = 105 ± 5, 2 μm; n). = 20). Patvirtinant ankstesnius stebėjimus 45, tiesioginiai dendritiniai įrašai atskleidė, kad šviesiomis dėmėmis kontrolės sąlygomis atsirado tiek mažos, tiek didelės amplitudės dendritiniai šuoliai. Mažos amplitudės, galiniai dendritiniai smaigaliai buvo suskaidyti į dendritinį medį ir veikė kaip kintamieji didelės amplitudės dendritinių smaigalių, kurie buvo prieš ir nukreipiantys į veikimo potencialo išvestį, trigeriai (8a pav.). Taikant nAChR antagonistus, žymiai buvo apribotas dendritinių smaigalių atsiradimas, nes sumažėjo šviesos taškinių iššaukiamų galinių ir didelės amplitudės dendritinių smaigalių atsiradimas ir dėl to išnyko potencialas (8a – c pav.). Remiant pagrindinį cholinerginio sužadinimo vaidmenį šioje vietinės dendritinės integracijos formoje, tuo pat metu atlikus somatinius-dendritinius įrašus paaiškėjo, kad dendritinės depoliarizacijos, kurią sukelia šviesos taškiniai dirgikliai, dramatiškai sumažėjo amplitudė dėl nAChRs antagonizmo, kai įrašai buvo daromi esant tetrodotoksino (TTX) ir GABAzino, kad blokuotų dendritinių smaigalių susidarymą ir SAC tarpininkaujamą slopinimą, atitinkamai 45 (papildomas 10 pav.; šviesos taškas = 100 μm; dendritiniai įrašai 240 ± 11 μm nuo somos; n = 7, kontrolė: dendritas = 16, 6 ± 2, 2 mV, soma = 4, 5 ± 0, 7 mV; Hex: dendrit = 6, 8 ± 1, 2 mV, soma = 1, 7 ± 0, 3 mV; P = 0, 0008, T = 6, 24 ir P = 0, 0009, T = 6, 04; n = 7). Visi šie duomenys rodo, kad šviesos taškinis bipolinių ląstelių sukeliamas glutamaterginis 12, 42 ir SAC medijuojamas cholinerginis sužadinimas yra integruotas lokaliai į dendritinį medį, kad paveiktų galinių dendritinių smaigalių pradžią ir vėlesnį naujos amplitudės įdarbinimą. pirminiai dendritiniai smaigaliai, kurie savo ruožtu skatina veikimo potencialo išėjimą.

Image

( a ) Šviesos taškinės dendritinės (pažymėtos *) ir didelės amplitudės dendritinių smaigalių susidarymo dramatiškas silpninimas blokuojant nAChR (Hex; 100 μM). Įdėkle parodyta ON-DSGC morfologija, įrašymo elektrodų ir šviesos taškų dirgiklių išdėstymas. b ) AP deginimo periodinio stimulo laiko histograma, kurią nurodytomis sąlygomis sukelia dendritinės šviesos dėmės (įjungimo laikas = 0–0, 5 s). c ) Kontroliuojamo šviesios dėmės iššaukto dendritinio regeneracinio aktyvumo amplitudės pasiskirstymas (juodas) ir heksametone rodo nAChR tarpininkavimą kontroliuojant terminalo ir didelės amplitudės dendritinių smaigalių generavimą.

Visas dydis

Kritiškai įvertindami cholinerginio sužadinimo indėlį į šį daugiapakopį integracinį procesą, bandėme atkurti šviesos sukelto dendritinio cholinerginio sužadinimo postsinapsinį poveikį dendritinio smaigalio inicijavimui, kai nAChRs buvo blokuoti farmakologiškai arba kai presinapsinis ACh išsiskyrimas buvo išeikvotas (9 pav.). ). Kai nAChRs buvo užblokuoti, šviesos taškų sukeltas terminalas ir didelės amplitudės dendritinių smaigalių generavimas buvo žymiai susilpnintas. Dendrinių smaigalių susidarymą naudojant šviesos sukeliamas bipolinių ląstelių sukeliamas glutamaterginis sužadinimo įvestis vis dėlto galėjo išgelbėti sujungiant šviesos taškų dirgiklius su tiesiogine dendritine depoliarizacija, sukuriama įpurškiant teigiamos srovės apatinius slenksčio žingsnius per dendritinį registravimo elektrodą (pav. 9a, b; šviesos taškas = 107, 1 ± 12 μm; dendritinės srovės įpurškimas = 138, 1 ± 27, 5 pA; dendritiniai įrašai 215 ± 12 μm nuo somos; n = 7). Pažymėtina, kad tiek galinių, tiek didelės amplitudės dendritinių smaigalių atsiradimą žymiai padidino šviesos taškų dirgiklių susiejimas su tiesiogine dendritine depolarizacija, tuo tarpu vien dendritinė depoliarizacija nesugebėjo sukelti mažos amplitudės, galinio dendritinio smaigalio susidarymo, tačiau nedažnai pasiekė slenkstinę vertę. didelės amplitudės dendritinių smaigalių generavimas dalelėje bandymų (9c, d pav.; galinių ir didelės amplitudės dendritinių smaigalių atsiradimas žymiai skiriasi tarp suporuotų ir neporinių šešiakampių sąlygų; P = 0, 0071, T = 4, 0 ir P = 0, 0274, T = atitinkamai 2, 9; n = 7). Norėdami tiksliau atkartoti šviesos sukelto ACh išsiskyrimo iš SAC veiksmus, vietinį dendritinį jonoforetinį ACh tiekimą suderinome su šviesos sužadinimu vietoje, kai SAC sąlygotas ACh išsiskyrimas buvo išeikvotas blokuojant ACh vezikulinį transporterį (9e pav. f; papildomas 11 pav.). Under these conditions the pairing of ACh iontophoresis with light spot stimuli powerfully drove dendritic spike generation and action potential output, whereas light stimuli, or ACh iontophoresis alone infrequently reached the threshold for dendritic spike generation (Fig. 9e, f; occurrence of terminal and large-amplitude dendritic spikes significantly increased in the paired condition; P =0.0047; q=6.44 (light alone) and P =0.0012; q=7.99 (iontophoresis alone); ANOVA; n =5; dendritic recordings 315±15 μm from soma). Consistent with this, when SAC-mediated excitation and inhibition were blocked, the pairing of light-evoked bipolar cell-mediated excitatory input with direct dendritic depolarization dramatically facilitated dendritic spike generation and neuronal output, underscoring the role of SAC-mediated inhibition in the control of dendritic spike generation 45 (Supplementary Fig. 12; light spot=87.5±12.5 μm; dendritic recordings 132±14 μm from soma; dendritic current=225±47.1 pA; dendritic spikes per episode: unpaired=1.1±0.5; paired=12.8±2.9; P =0.003, T=6.3; n =4). These data therefore demonstrate that SAC-mediated cholinergic and bipolar cell-mediated glutamatergic excitation drive the generation of dendritic spikes, revealing a mechanism by which dendro-dendritic ACh release acts in a spatially selective manner in the dendritic tree of DSGCs to control neuronal output.

Image

( a ) Light spot-evoked terminal dendritic (marked by *) and large-amplitude dendritic spike generation were powerfully attenuated by nAChR antagonism (upper traces, hexamethonium; Hex). This reduction could be rescued by pairing light stimuli with sub-threshold dendritic depolarization (lower left traces). The insets show light spot-evoked dendritic spikes (blue traces) and somatically recorded activity (black traces). A section of the ON-DSGC morphology, the placement of electrodes, and the position of the light spot stimuli are also shown. ( b ) Peri-stimulus time histogram of light spot-evoked (ON time=0–0.5 s) action potential (AP) output under the indicated conditions. ( c ) Amplitude distribution of dendritically recorded spikes under the indicated conditions. Note that pairing of light spot stimuli with dendritic depolarization increased the generation of both terminal and large-amplitude dendritic spikes. ( d ) Number of terminal and large-amplitude dendritic spikes evoked by light spot stimuli under the indicated conditions (data represent mean±sem). ( e ) When presynaptic ACh release was depleted (vesamicol), the pairing of light spot stimuli with the local dendritic iontophoretic delivery of ACh augmented dendritic spike generation. The insets show overlain spikes, a section of the ON-DSGC morphology, the placement of recording and iontophoresis electrodes, and the position of light spot stimuli. ( f ) Number of terminal and large-amplitude dendritic spikes evoked by light spot stimuli per trial under the indicated conditions (data represent mean±sem).

Visas dydis

Diskusija

The retinal microcircuitry that underlies the processing of image motion has been solved at ultrastructural resolution 9, 17, but a full understanding of the mechanisms underlying the computation of direction selectivity requires investigation of circuit function at a similar scale. Here we used multi-site somatic and dendritic electrophysiological recording techniques to demonstrate that the direction-selective action potential output of rabbit ON-DSGCs is powerfully controlled by SAC-mediated dendro-dendritic cholinergic excitation.

In confirmation of previous findings obtained from ON-OFF-DSGCs 16, 26, 34, 35, 36, our paired ON-SAC to ON-DSGC recordings revealed the dendro-dendritic co-release of ACh and GABA from SACs, which drove postsynaptic excitation and inhibition, mediated by the activation of nAChR and GABA A receptors, respectively. Notably, we observed that the postsynaptic impact of SACs was defined by their position in the receptive field of postsynaptic DSGCs. SACs positioned on the preferred side, which made close dendro-dendritic appositions from dendrites oriented in the preferred direction of DSGCs, generated net excitatory responses in DSGCs, whereas, SACs located on the null side generated, on average, postsynaptic inhibition. These data suggest that when light stimuli enter the receptive fields of DSGCs in a preferred or null direction, the activation of SACs located on the periphery of the preferred and null side should differentially influence the action potential output of ON-DSGCs. Consistent with this, when the direction-selective microcircuit was physiologically activated, the robust preferred direction light-evoked action potential output of ON-DSGCs was greatly attenuated by the pharmacological antagonism of nAChRs, and by the selective depletion of presynaptic ACh release from SACs. Notably, we found across a broad range of light stimuli that the antagonism of nAChRs disassociated the tight relationship between the receptive and dendritic field areas of ON-DSGCs, and disrupted the characteristic generation of action potential firing evoked by preferred direction light bars as they entered the receptive field.

Direct dendritic electrical recording, calcium imaging and computational modelling have shown that active dendritic integration underlies the wide-field responsiveness of DSGCs 13, 43, 44, 45 . Multi-site somato-dendritic recording techniques have deconstructed this process to reveal that dendritic spikes are first initiated in the small calibre terminal dendrites of DSGCs 45, which receive excitatory glutamatergic synapses from bipolar-cells 51, 52 . Terminal dendritic spike generation has been found to be the first step in a multi-layered active integration cascade, as these spikes act as variable triggers for the generation of dendritic spikes in larger calibre parent dendrites that, once initiated, forward propagate to the axon to drive action potential output 45 . Our results demonstrate that SAC-mediated cholinergic signalling is a major component of this integrative process. Simultaneous somato-dendritic recordings revealed that the generation of terminal and large-amplitude parent dendritic spikes by light spots or preferred direction moving light bars were powerfully attenuated by the antagonism of nAChRs. An effect underscored by the rescue of dendritic spike generation when cholinergic excitation was mimicked by local dendritic depolarization or the terminal dendritic application of ACh. The dendro-dendritic release of ACh therefore controls the action potential output of DSGCs by driving terminal dendritic spike generation, and enhancing the coupling between active dendritic integration sites. We suggest that SAC-mediated cholinergic excitation acts as a dendritic subunit-specific gate of bipolar-cell signalling, that when activated by moving light bars powerfully controls the action potential output of DSGCs, to define the stimulus sensitivity and receptive field area over which the computation of direction selectivity is executed (Fig. 10). An idea supportive of previous observations made from ON-OFF-DSGCs, which have revealed that cholinergic excitation acts to control bipolar-cell mediated glutamatergic excitation by supplying membrane depolarization to relieve the voltage-dependent block of NMDA receptor-mediated PSPs 41 . Our findings however extend this idea to demonstrate that these excitatory inputs act in concert to drive the initiation of terminal dendritic spikes, and thus launch a cascade of dendritic spike generation which ultimately results in the driving of action potential output, providing a substrate for the localized dendritic processing of light stimuli 3 (Fig. 10).

Image

( a ) SAC-mediated cholinergic excitation and GABAergic inhibition gate terminal dendritic integration to control action potential output under control conditions. ( b ) In the absence of cholinergic excitation terminal dendritic spike generation is weakly driven by bipolar cell-mediated excitation.

Visas dydis

In contrast, SACs located on the null side of DSGCs drove net postsynaptic inhibition, a finding that is consistent with the greater GABA A receptor-mediated synaptic conductance, and distribution of dendro-dendritic synapses on the null side of DSGCs 16, 17, 26, 27, 28 . However, at these sites, we find that dendro-dendritic cholinergic signalling plays a functional role, as the blockade of cholinergic excitation transformed null direction light-evoked voltage responses from weakly excitatory to strongly inhibitory. Consistent with this, when GABAergic inhibition was pharmacologically blocked, the antagonism of nAChRs attenuated moving light bar-evoked action potential output in all tested directions, as has been shown for ON-OFF-DSGCs 23 . Furthermore, when the uptake of ACh was inhibited, both null and preferred direction light responses were strongly facilitated, and direction tuning disrupted. These data reveal that a balance between the postsynaptic impact of SAC neurotransmitters is essential for the emergence of directional selectivity, questioning how action potential firing is suppressed by null direction light stimuli.

Dendritic recording and neuronal modelling has demonstrated that null direction light stimuli evoke sparse action potential output in rabbit DSGCs because of the SAC-mediated inhibitory control of dendritic spike initiation 44, 45 . Direct recording has demonstrated that this inhibitory control is restricted to terminal dendritic sites, as null direction synaptic inhibition does not inhibit the initiation of large-amplitude parent dendritic spikes in DSGCs generated in response to steps of direct current 45 . When considered together with our current work, these data suggest that the dominant SAC-mediated null side inhibition acts to clamp the terminal dendritic membrane potential at a voltage sub-threshold for the generation of terminal dendritic spikes, thereby negatively gating their generation by bipolar-cell-mediated glutamatergic and SAC-mediated cholinergic excitation (Fig. 10).

A structural substrate for the dual excitatory and inhibitory roles of SACs in the retinal circuitry is well documented 16, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 . The dendrites of ON- and OFF-SACs form dense choline acetyl transferase and vesicular ACh transporter delineated fascicles in the inner plexiform layer, the passage of which are closely followed by the dendrites of DSGCs 51, 53, 54 . Notably this mapping is most refined for small terminal DSGC dendrites, the predominant site of SAC-DSGC synaptic connectivity 22 . Ultrastructural analysis of murine ON-OFF-DSGCs has, however, shown that the distribution of dendro-dendritic synapses is asymmetrical, with a ∼ 13-fold greater density established by SACs positioned on the functional determined null side of ON-OFF-DSGCs 17 . Our results demonstrate in the simplified circuitry of the ON-sublamina of the inner plexiform layer that the postsynaptic impact of ON-SACs is position dependent, with cholinergic excitation dominating on the preferred, and GABAergic inhibition on the null side, consistent with previous results from ON-OFF-DSGCs 16, 26, 27, 28, 36 . As our paired recordings, and previous results, have revealed the obligatory co-release of ACh and GABA from SACs, these data suggest that ACh may be released from, or have postsynaptic impact at, sites other than dendro-dendritic synapses, a finding that is supported by the relatively long time to onset of cholinergic PSPs, and the effects of manipulating ACh hydrolysis 47, 48 . Furthermore, direct dendritic recordings revealed that light stimuli, and direct activation of SACs drove localized nAChR-dependent dendritic excitation, which was integrated locally in the dendritic arbour to control dendritic spike initiation. Our findings are therefore consistent with a model in which ACh operates in a localized paracrine fashion in the IPL 17, 41, at sites constrained by the co-fasciculation of SAC and DSGC dendrites. The development of new tools for the direct visualization of ACh release and diffusion are, however, required to definitively address this issue. Based on our findings we conclude that the excitatory and inhibitory neurotransmitters released from the dendrites of feed-forward interneurons in the output layer of the retina are integrated together with direct bipolar-cell-mediated glutamatergic excitation to drive and control the generation of dendritic spikes in DSGCs, the initiation of which determines the light stimulus sensitivity, receptive field size and direction selectivity of action potential output (Fig. 10).

Metodai

Retinal preparation

Adult pigmented or albino rabbits of either sex (Nanowie Small Animal Production Unit) were dark-adapted for 1-2 h, anesthetized with ketamine (12 mg kg −1 of body weight, intramuscular) and xylazine (12 mg kg −1, intramuscular) then overdosed with pentobarbarbitone sodium (150 mg kg −1, intravenous), before the eyes were quickly enucleated, hemisected, and placed in carbogenated Ames solution (8.8 g l −1 Ames, 1.9 g l −1 sodium bicarbonate, 0.75 g l −1 glucose) at room temperature (22–24 °C). Large sections of the inferior peripheral retina were separated from the sclera and pigmented epithelial layer, and stored in carbogenated Ames solution at room temperature. A single section was placed in a recording chamber perfused with Ames solution at 35–37 °C. The Animal Ethics Committee of the University of Queensland approved all procedures.

Whole-cell recording

Dual and triple whole-cell recordings were made from visually identified DSGCs and SACs, using infrared differential interference contrast video microscopy, with identical current-clamp amplifiers configured in 'bridge-mode' (BVC 700A, Dagan Corporation) 45 . Voltage and current signals were low-pass filtered at DC to 10–30 kHz and sampled at 50 kHz. DSGC recording pipettes were filled with (in mM): 135 K-gluconate; 7 NaCl; 10 HEPES; 10 phosphocreatine; 2 Na 2 -ATP; 0.3 Na-GTP; 2 MgCl 2 and 0.35 Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) (pH 7.3–7.4; KOH), and had an open tip resistance of 4–5 MΩ for somatic and 15–20 MΩ for dendritic pipettes. All DSGC recordings were made from the resting membrane potential (soma=−52.7±0.7 mV; n =156; dendrite=−54.9±0.4 mV; n =47; 136.9±8.8 μm from soma). SAC recording pipettes were filled with (in mM): 110 Cs-methysulphate; 5 NaCl; 10 HEPES; 10 phosphocreatine; 2 Na 2 -ATP; 0.3 Na-GTP; 2 MgCl 2 and 0.35 Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) (pH 7.3–7.4; CsOH), and had an open tip resistance of 5–7 MΩ. For SAC recordings, a period of 7–25 min was left to allow for the intracellular blockade of potassium conductances 56, before testing connectivity with DSGCs. SAC-DSGC connectivity was tested for by the generation of threshold regenerative activity evoked by the injection of short somatic positive current steps (10 ms; 0.87±0.11 nA; n =42; usually terminated by a negative current step: 0.5–0.9 s; −0.15±0.01 nA; inter-trial interval 20–30 s; connectivity=84%) in the presence of the glutamate receptor antagonists (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2, 3-dione; 10 μM and DL -2-amino-5-phosphonopentanoic acid; 100 μM). No correction was made for liquid junction potentials. Drugs were typically applied by addition to the perfusion medium at determined concentrations. In some experiments ACh was delivered by iontophoresis (100 mM in iontophoresis pipette) to a site co-aligned with light spot stimuli distal (93±16 μm) to the dendritic recording electrode (ejection current=50–200 nA; retention current=5–20 nA) 45, 57 . Exogenous AChE (0.4 U per μl) 47 dissolved in Ames solution, or Ames solution, were applied by pressure application (0.58±0.03 PSI for 10 min; n =11) under visual guidance from a pipette with similar characteristics as those used for somatic recording. At the termination of each whole-cell recording, the location of the recording pipettes and neuronal morphology were examined by fluorescence microscopy, and recorded using a digital camera (QImaging) or confocal microscopy (Zeiss), and reconstructed using Neurolucida software (MBF Bioscience).

Visual stimulation and analysis

Visual stimuli were generated using custom software (developed by WR Taylor (Oregon Health and Science University) and RG Smith (University of Pennsylvania)), and presented on a 800 × 600 pixel OLED screen. Images were projected and focussed on the plane of photoreceptor outer segments to physiologically activate the retinal network using a × 10 water objective lens with a numerical aperture of 0.3 (Olympus) 45 . Standard light stimuli were applied under photopic conditions (background illumination was maintained above the level of rod saturation at≈3.5 × 10^11 quanta cm −2 s −1 ) and the visual stimuli were standardly set at 100% of the background, in some preparations mesopic conditions were established (background and visual stimuli reduced by 0.06 with a neutral density filter). Moving light bars (100 × 300–400 μm) were standardly moved across receptive fields in 12 directions at 30° intervals, at a speed of 0.24 mm s −1 (inter-trial interval=12–17 s). A range of light spot stimuli (50–200 μm) flashed (500 ms) at determined receptive field loci were also employed. Directional selectivity was quantified by calculating a directional selectivity index of the number of action potentials, or action potential firing rate, recorded in multiple trials ( n =5±0.5), generated by preferred and null direction stimuli, according to the equation: preferred - null/preferred+null 35 . Directionally selective output responses were represented as polar plots, and a directional vector calculated. Peri-stimulus time histograms of preferred or null direction moving light bar-evoked action potential firing were binned for each segment when the moving bar (240 μm s −1 ) traversed 20 μm of the receptive field. The time delay between simultaneously recorded regenerative events was measured at peak amplitude. For analysis of the time delay between simultaneously recorded spikes as a function of visual stimulus position, regenerative events from each cell were binned according to their spike times for each segment where the moving bar traversed 20 μm of the receptive field.

Statistinė analizė

Data sets were compared using a Student's t -test (two-sided), analysis of variance (Tukey's multiple comparison), the Wilcoxon signed rank test or the Mann–Whitney test, with the test selected according to data structure. The statistical difference between amplitude distributions was determined with the Kolmogorov–Smironov test. Statistical significance was accepted at P <0.05, and normality of distribution established with the Kolmogorov–Smironov test with a Dallal–Wilkson–Lillie post test. No statistical methods were used to predetermine sample sizes. Data collection and analysis were not randomized or performed blind to the conditions of the experiments. Numerical values are presented as mean±sem

Duomenų prieinamumas

The data sets generated during and/or analysed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi skaičiai ir papildomi metodai

  2. 2.

    Tarpusavio apžvalgos byla

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.