Komercinių termiškai jautrių genų patinų sterilių ryžių plėtra pagreitina hibridinių ryžių veisimąsi naudojant crispr / cas9 tarpininkaujamą „tms5“ redagavimo sistemą | mokslinės ataskaitos

Komercinių termiškai jautrių genų patinų sterilių ryžių plėtra pagreitina hibridinių ryžių veisimąsi naudojant crispr / cas9 tarpininkaujamą „tms5“ redagavimo sistemą | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Žemės ūkio genetika
  • Augalų veisimas
  • Žiedadulkės

Anotacija

Hibridinis ryžių veisimas siūlo svarbią ryžių auginimo strategiją, kurioje vyriškos lyties sterilios linijos auginimas yra kryžminio veisimo sėkmės raktas. CRISPR / Cas9 sistemos buvo plačiai naudojamos redaguojant tikslinės srities genomą, tuo tarpu retai buvo pranešta apie jų pritaikymą pasėlių genetiniam gerinimui. Čia, naudodamiesi CRISPR / Cas9 sistema, mes sukėlėme specifines mutacijas TMS5 , kuris yra Kinijoje plačiausiai taikomas termiškai jautrus geninis vyriškojo sterilumo (TGMS) genas, ir sukūrėme naujas „švarias transgeno“ TGMS linijas. Mes sukūrėme 10 tikslinių vietų TMS5 koduojančiame regione, kad būtų galima atlikti tikslią mutagenezę, naudojant CRISPR / Cas9 sistemą, ir įvertinome galimą poveikio tikslinei ir ne tikslinei sritims . Galiausiai, mes sukūrėme efektyviausią konstrukciją - TMS5ab konstrukciją, skirtą potencialiai pritaikytoms „transgenui švarioms“ TGMS linijoms veisti. Taip pat aptarėme veiksnius, turinčius įtakos redagavimo efektyvumui pagal skirtingų tikslinių sekų ypatybes. Pažymėtina, kad naudodamiesi TMS5ab konstrukcija, mes sukūrėme 11 naujų „transgeno požiūriu švarių“ TGMS linijų, kurias galima panaudoti hibridiniame veisime per vienerius metus abiejuose ryžių porūšiuose. Mūsų sistemos taikymas ne tik žymiai pagreitina sterilių linijų veisimąsi, bet ir palengvina heterozės išnaudojimą.

Įvadas

Ryžiai ( Oryza sativa L.) yra vienas iš svarbiausių maisto produktų visame pasaulyje, aprūpinantis beveik ketvirtadaliu viso žmonėms suvartojamo maisto kiekio 1, 2 . Maisto poreikis ir toliau auga, sparčiai augant gyventojų skaičiui, todėl 2030 m. Reikėjo išauginti 40% daugiau ryžių, o ariamos žemės plotas yra ribotas kartu su aplinkos blogėjimu 3 . Hibridiniai ryžiai, kurie buvo sukurti daugiau nei 40 pasaulio šalių ir vaidina pagrindinį vaidmenį teikiant pasaulinį maisto tiekimą 4, turi 10–20% pranašumą prieš įprastinius ryžius ir užima maždaug 60% viso ryžių ploto Kinijoje 5, 6 . Hibridiniai ryžiai, sukurti naudojant trijų ir dviejų eilučių hibridines veisimo sistemas, vyrauja hibridinių ryžių gamyboje Kinijoje 7, 8 . Trijų eilučių sistemoje naudojama citoplazminė vyriškojo sterilumo (CMS) linija, restauravimo linija ir palaikymo linija hibridinėms sėkloms auginti ir CMS 8, 9 linijai palaikyti. Restauratoriaus linijoje yra specialūs CMS restauratorių genai, kurie atkuria specialios CMS linijos vaisingumą. Su citoplazminiu sterilumu susijusių daigų ištekliai yra riboti: tik 1% ryžių daigų gali tarnauti kaip palaikomosios linijos Kinijoje, ir tik 5% ryžių daigų turi CMS atstatančiųjų genus Pietryčių Azijoje 10 . Riboti restauratorių linijų genetiniai ištekliai ir maža CMS bei restauratorių linijų genetinė biologinė įvairovė trijų eilučių sistemoje užkirto kelią tolesnei plėtrai. Dviejų eilučių veisimo sistemoje naudojamos arba fotoperiodiškai jautrios genų patinai (PGMS), arba termiškai jautrūs genų patinai, sterilūs (TGMS), linijos kaip sterilumo linijos ribojamosiomis sąlygomis arba palaikomosios linijos esant leistinoms sąlygoms. Beveik visos įprastos ryžių veislės gali atkurti PGMS ir TGMS linijų vyrų vaisingumą, taip suteikdamos platesnius genetinius išteklius, kad būtų galima geriau išnaudoti ryžių heterozę 11, 12, 13, 14, 15 . Todėl, palyginti su trijų eilučių sistema, dviejų eilučių sistemos pranašumai yra darbo ir laiko taupymas, geresnė grūdų kokybė ir didesnis derlius, didesnis efektyvumas ir ekonomiškesnis paprastų veisimo ir hibridinių sėklų auginimo procedūrų naudojimas. Nors dviejų eilučių mišrioji veisimo sistema buvo sukurta palyginti vėlai, ji suteikia esminių pranašumų, palyginti su trijų eilučių sistema, ir užima maždaug trečdalį viso hibridinių ryžių sodinimo ploto Kinijoje 16 .

Pastaraisiais metais padaryta didžiulė pažanga suprantant P / TGMS, o keli genai, kontroliuojantys P / TGMS požymius, buvo klonuoti ryžiuose. Pirmiesiems PGMS ryžiams „Nongken58S“, identifikuotiems 1973 m., Būdingas visiškas vyrų sterilumas ilgomis dienomis ir vaisingumo atsistatymas trumpomis dienomis. Jo PGMS bruožą lemia pms1, pms2 ir pms3 (žr. 12 ir 17). pms3 koduoja ilgą nekoduojančią RNR (lncRNR), vadinamą ilgą dieną su vyrų vaisingumu susijusią RNR ( LDMAR ) 18 . „Peiai64S“ yra TGMS indica ryžių linija, sukurta perkeliant P / TGMS genus iš „Nongken58S“. Jos TGMS bruožą suteikia p / tms12-1 . Mes nustatėme, kad P / TMS12-1 koduoja unikalią nekoduojančią RNR, kuri gamina mažo 21 nukleotido RNR 13 . Anglis badaujantis skruzdėlynas (csa) yra atvirkštinis fotoperiodams jautrus geninis patinas (rPGMS) ryžiai, kurie yra sterilūs trumpą dieną ir derlingi ilgomis dienos sąlygomis. CSA koduoja R2R3 MYB transkripcijos reguliatorių, kuris tarpininkauja padalinant cukrų 14 . Be to, dėl UDP-gliukozės pirofosforilazės1 ( Ugp-1 ), padidėjusio Ugp-1, ekspresijos dėl temperatūros jautrus temperatūros padidėjimas sukelia ryžių TGMS 19 .

Annong S-1 (AnS-1) buvo pirmieji indiški TGMS ryžiai, nustatyti 1987 m. Ankstesniame darbe 15 mes parodėme, kad TGMS genas tms5 koduoja endonukleazę RNase Z S1, esančią AnS-1. RNase Z S1 kontroliuoja TGMS bruožą, skaidydama temperatūrai jautrų ubikvitino suliejimo ribosomų baltymo L40 ( Ub L40 ) mRNR. Tms5 nustatytos TGMS linijos vaidina svarbų vaidmenį dviejų linijų hibridinėje veisimo sistemoje Kinijoje 20 . TMS5 mutacijos buvo rastos 24 iš 25 komercinių TGMS linijų, kurios buvo atsitiktinai aptiktos 15 .

Nors naujos komercinės sterilios vyriškos lyties linijos sukūrimas naudojant tradicines veisimo sistemas paprastai užtrunka kelerius metus, kartais daugiau nei dešimtmetį, veisimosi laiką galima dramatiškai sutrumpinti naudojant šiuolaikinius genų inžinerijos metodus 21, 22, 23, 24 . Sekcijai būdingos nukleazės (SSN) gali sukelti tikslinius DNR dvipusius lūžius (DSB) tam tikruose genomo lokusuose ir skatinti endogeninius DNR pažeidimo atstatymo kelius, galiausiai lemia sekos specifinį genomo redagavimą 25, 26 . Kaip SSN rūšis, CRISPR / Cas9 redagavimo sistema buvo panaudota siekiant išmušti tikslinį geną daugeliui rūšių, įskaitant augalus. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 . Nepaisant to, jis vis dar naudojamas retais atvejais genetiniam gerinimui 39 .

Šiame tyrime mes sukūrėme paprastą ir efektyvią ryžių TGMS auginimo sistemą, naudojančią CRISPR / Cas9 redagavimo technologiją, kad išmuštų TMS5 , kuri yra labai vertinga naujose komercinėse TGMS linijos programose. Remdamiesi šia sistema, per vienerius metus mes sukūrėme 11 komercinių „transgenetiškai švarių“ TGMS ryžių linijų. Šis darbas pagreitina TGMS linijų veisimą ir sudaro pagrindą plačiam pritaikymui dviejų eilučių hibridinių ryžių veisime.

Rezultatai

TGMS linijų kūrimas naudojant CRISPR / cas9 TMS5 redagavimą

Redagavimo sistema CRISPR / Cas9 tarpininkauja tiksliniame genomo redagavime per Cas9 endonukleazės ir kreipiamosios RNR kompleksą, kuris suteikia paprastą ir veiksmingą metodą, palyginti su kitomis genomo inžinerijos technologijomis, tokiomis kaip cinko piršto nukleazės (ZFN) ir transkripcijos aktyvatorių primenančios efektorinės nukleazės. (TALEN) 39, 40 . CRISPR / Cas9 sukeltas redagavimo įvykis daugiausia vyksta T-DNR transformuotose kalio ląstelėse prieš regeneruojant ryžius 26 . Todėl T 0 kartoje galima gauti aukšto mutacijos dažnio homozigotinius mutantus, o mutantus be egzogeninės T-DNR galima išskirti po T 1 kartos atskyrimo. Šie mutantai taip pat yra vadinami „švariais transgeno augalais“ 41 . Norėdami sukurti TMS5 nukreiptas mutacijas, kad sukurtume komercines TGMS linijas, mes naudojome redagavimo sistemą CRISPR / cas9, kuri gali nukreipti į kelias svetaines per vieną konstruktą 26 . Norint gauti tikslines sekas, turinčias didelį redagavimą ir mažą efektyvumą, palyginti su taikiniu, 10 tikslinių vietų (1 papildomas paveikslas), patikrintos iš TMS5 koduojančio regiono, atsitiktine tvarka buvo suskirstytos į penkias grupes, o dvi tikslinės sekos vienoje grupėje buvo klonuotos į tą patį vektorių transformuokite ZH11 kallusą (žr. metodus). Transgeniniai augalai buvo gauti remiantis penkiais vektoriais. Norint įvertinti kiekvienos tikslinės sekos redagavimo efektyvumą, buvo sudaromos sekos T 0 augalų lapuose. Mutacijos buvo aptiktos 9 iš 10 taikinių. Tarp šių devynių mutacijų vietų pavienių tikslinės sekos mutacijų dažnis svyravo nuo 46, 2% iki 88, 2% ir nuo 69, 2% iki 94, 1% T 0 augalų buvo mutacijų bent vienoje iš dviejų taikinių vietų (1 pav. A). Pažymėtina, kad homozigotinių mutacijų dažnis atskirose tikslinėse sekose pasiekė 29, 4%, o augalai, atliekantys homozigotines mutacijas bent vienoje iš dviejų taikinių sekų, pasiekė 32, 4% (1A pav.). Be to, visų T 0 augalų, apdorotų aukštoje temperatūroje (HT), metu buvo gauti žiedadulkių sterilumo asmenys. Tarp T 0 augalų žiedadulkių sterilių asmenų procentas svyravo nuo 30, 0% iki 85, 3% (1A pav.). TMS5b parodė aukščiausią montažą, homozigotines mutacijas ir sterilius žiedadulkių dažnius (1A pav.). Aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad dvejetainis konstruktas, skirtas nukreipti į TMS5a ir TMS5b vietas (pavadintas TMS5ab konstruktu), turėjo didžiausią tikslinį redagavimo efektyvumą.

Image

( A ) Mutacija ir žiedadulkių sterilumo dažnis T 0 augaluose su 10 tikslinių vietų. TMS5b tikslinėje vietoje buvo rodomas didžiausias mutacijų dažnis. Dėl TMS5ab konstrukcijos išaugo didesnis augalų, turinčių žiedadulkių sterilumą, procentas, palyginti su kitais konstruktais. Skaičius prieš „“ yra bendras mutacijų skaičius ar dažnis, o skaičius, einantis po „“, yra homozigotų augalų skaičius arba santykis. ( B ) CRISPR / Cas9 sukeltų mutacijų tipai ir dažnis. Visų rūšių indukuotų mutacijų metu dažniausiai buvo nustatomi vieno nukleotido įterpimai. Didžiausias trynimas buvo 253 bazinių porų ilgio. ( C ) TMS5ab konstrukto sukeltų mutacijų dažnis 11 skirtingų skirtingų ryžių porūšių veislių. Išskyrus YNSM, TMS5a mutacijų dažnis kitose dešimt veislių buvo didesnis nei 72, 72%.

Visas dydis

Norint gauti TGMS augalus, T 0 sterilūs augalai buvo apdoroti žemoje temperatūroje (~ 22 ° C, dienos vidutinė temperatūra [DAT]). Augalai, kurių derlingumas buvo atkurtas, buvo gauti iš kiekvienos konstrukcijos tranformandų. Be to, gavome „švarias transgeno“ TGMS linijas T 1 augaluose su kiekvienu konstruktu (2 ir 3A pav. Ir papildomas 2A paveikslas). Kartu paėmus, mes gavome „švarias transgeno“ TGMS linijas per CRISPR / Cas9 tarpininkaujantį TMS5 vietai nukreiptą mutagenezės sistemą.

Image

( A, B ) ZH11 žiedadulkių derlingumas. Įprastos žiedadulkės ( A ) ZH11 prie HT. Paprastos žiedadulkės ( B ) ZH11 ties LT. ( C - M ) TGMS augalų žiedadulkių derlingumas, sukeltas CRISPR / Cas9 tarpininkaujamos TMS5 redagavimo sistemos. Nenormalios žiedadulkės ( C, E, G, I ir K ) TMS5abS-12-3, TMS5cdS-1-8, TMS5efS-16-2, TMS5ghS-7-5 ir TMS5ijS-7-9 HT. Normalios žiedadulkės ( D, F, H, J ir M ) TMS5abS-12-3, TMS5cdS-1-8, TMS5efS-16-2, TMS5ghS-7-5 ir TMS5ijS-7-9 LT. TMSabS-12-3, TMS5cdS-1-8, TMS5efS-16-2, TMS5ghS-7-5 ir TMS5ijS-7-9 yra TGMS augalai, indukuoti TMS5ab, TMS5cd, TMS5ef, TMS5gh ir TMS5ij konstruktais ZH11 fone, atitinkamai. Žiedadulkių augimo temperatūra ir augalų pavadinimai nurodyti atitinkamai paveikslo kairėje ir viršuje. HT, aukšta temperatūra; LT, žema temperatūra. Svarstyklės, 100 μm.

Visas dydis

Image

( A ) ZH11 augalų morfologija HT ir TMS5abS-12-3 augaluose HT ir LT. ( B ) ReB ir ReBS-6-3 augalų morfologija HT. ( C ) WSSM ir WSSMS-2-5 augalų morfologija HT. ( D ) TFB ir TFBS-5-7 augalų morfologija HT. ( E ) ZZB ir ZZBS-10-2 augalų morfologija HT. Šie „transgeno būdu švarūs“ TGMS augalai, pasižymintys žiedadulkių sterilumu, neturėjo akivaizdaus fenotipo skirtumo nuo savo šeimininkų. HT, aukšta temperatūra; LT, žema temperatūra. Svarstyklės, 20 cm.

Visas dydis

Ankstesnės ataskaitos parodė, kad CRISPR / Cas9 technologija turi gana didelį ne tikslinės veiklos potencialą, o tai daro įtaką jos taikymui. Sėklų sekos specifiškumas, įskaitant 10–12 nukleotidų, esančių šalia protospacerio gretimo motyvo (PAM), daro didelę įtaką veiklai, esančiai ne taikinyje 42 . TMS5ab konstrukcija turi didžiausią efektyvumą tarp konstrukcijų, naudojamų CRISPR / Cas9 tarpininkaujant TMS5 redaguoti; todėl išanalizavome TMS5ab netaikomą tikslą. Prognozavome atitinkamai penkias ir devynias galimas TMS5a ir TMS5b netaikymo vietas. Atlikus sekų nustatymą galimose ne tikslinėse vietose, jokiuose tirtuose mėginiuose genomo redagavimo nebuvo nustatyta (1 lentelė). Šie rezultatai parodė, kad TMS5ab konstrukcija turėjo didžiausią redagavimo efektyvumą ir nenustatomą tikslinį efektą. Tikslinės sekos, turinčios didelį redagavimą ir mažai veiksmingos, palyginti su tikslais, pagerins veisimo efektyvumą ir sumažins veisimo sąnaudas, susijusias su komerciškai pritaikytų TGMS linijų kūrimu. Todėl mes panaudojome TMS5ab konstrukciją kitų ryžių veislių transformavimui komerciškai pritaikomoms TGMS linijoms.

Pilno dydžio lentelė

TMS5 redagavimo charakteristika ir veiksniai, darantys įtaką redagavimo efektyvumui

Toliau mes išanalizavome devynių efektyvių taikinių sekų mutacijų tipus ir dažnį (1 pav. B). Tarp visų sukeltų mutacijų tipų dažniausiai buvo aptikti vieno nukleotido įterpimai, kurių dažnis buvo iki 51, 96%, tai atitinka ankstesnes ataskaitas 25, 26 . Antras didžiausias mutacijų dažnis buvo nukleotidų delecija, kurioje vieno nukleotido delecijos parodė aukščiausią mutacijų dažnį - 10, 29%. Kartu su padidėjusiu išbrauktų nukleotidų skaičiumi, tikslinės vietos mutacijų dažnis pamažu mažėjo. Ilgiausias delecijos fragmentas buvo 253 bp ilgio. Taip pat buvo stebimi nukleotidų pakeitimai, kurie sudarė tik 2, 94% visų mutacijų.

Toliau išanalizavome veiksnius, turinčius įtakos redagavimo efektyvumui. Pirmiausia mes išanalizavome taikinių sekų GC turinį, nes tikslinis genomo redagavimas priklauso nuo to, ar viena-kreipiančioji RNR (sgRNR), turinčioje tikslinę seką, jungiasi prie tikslinių vietų. Palyginę GC turinį tikslinėse sekose ir atitinkamą redagavimo efektyvumą, mes nustatėme, kad didelis GC kiekis yra susijęs su dideliu tikslinės sekos redagavimo efektyvumu (1A pav. Ir 3 papildomas paveikslas). Tada mes pradėjome tikrinti sgRNR ir Cas9 ekspresijos lygius iš T 0 augalų, turinčių skirtingas taikinių sekas, lapų (4 pav.). Cas9 ekspresijos lygiai buvo mažiausi TMS5abS-4 augaluose, kuriuose buvo modifikuotos TMS5b tikslinės vietos, o modifikuotų TMS5a vietų nebuvo. Priešingai, Cas9 ekspresijos lygiai TMS5efS-2, TMS5ghS-2 ir TMS5ijS-1 augaluose buvo atitinkamai 14, 1, 15, 3 ir 58, 1 karto didesni nei TMS5abS-4. Tačiau nė vienoje iš šių trijų eilučių tikslinėse vietose genomo redaguoti nebuvo. Panašus reiškinys taip pat pastebėtas dėl tikslo ir sgRNR santykio bei redagavimo efektyvumo. Šis atradimas leido manyti, kad kai sgRNR ir Cas9 ekspresijos lygiai pasiekia tam tikrą ribinę vertę, nėra akivaizdaus ryšio tarp jų ekspresijos lygių ir redagavimo efektyvumo. Be to, kadangi PAM yra būtinas norint identifikuoti tikslinę vietą tikslinės sekos-sgRNR pagalba, mes išanalizavome skirtingų PAM poveikį tikslinių vietų redagavimo efektyvumui (1 pav. A ir 1 papildoma lentelė). Vidutinis tikslinės vietos PAM su AGG (TMS5c, d ir f), TGG (TMS5b, g, h ir j) ir CGG (TMS5a ir i) redagavimo efektyvumas buvo atitinkamai 80, 6%, 68, 8% ir 70%. Nors AGG parodė didesnį vidutinį redagavimo efektyvumą, palyginti su TGG ir CGG, TMS5b, kuriame TGG buvo PAM, rodomas didžiausias redagavimo efektyvumas tarp visų devynių tikslinių sekų. Šios išvados parodė, kad tikslinės sekos PAM neturėjo reikšmingos įtakos redagavimo efektyvumui. Mes taip pat nustatėme, kad TMS5e taikinio seka smarkiai papildo sgRNR, sudarydama antrinę struktūrą, kuri galėjo slopinti tikslinės sekos surišimą su genomu (papildomas 4 paveikslas). Tai buvo tikėtina genomo redagavimo nesėkmės priežastis, ir tai patvirtina ankstesni tyrimai 25, 26 .

Image

( A ) Cas9 ekspresijos lygiai T 0 augaluose (TMS5abS-1, TMS5abS-2, TMS5abS-4, TMS5abS-5, TMS5cdS-1, TMS5cdS-11, TMS5cdS-12, TMS5cdS-13, TMS5efS-1, TMS5efS-1, TMS5efS-7, TMS5efS-9, TMS5ghS-1, TMS5ghS-2, TMS5ijS-1 ir TMS5ijS-11), įvertinti realaus laiko PGR analize. ( B ) Tikslinės-sgRNR raiškos lygiai T 0 augaluose (TMS5abS-4, TMS5efS-7, TMS5efS-9, TMS5ghS-2, TMS5ijS-1 ir TMS5ijS-11), įvertinti realiojo laiko PGR analize. Tikslinių sekų pavadinimai nurodyti virš stulpelio. ( C ) Mutacijų tipai T 0 augaluose (TMS5abS-1, TMS5abS-2, TMS5abS-4, TMS5abS-5, TMS5cdS-1, TMS5cdS-11, TMS5cdS-12, TMS5cdS-13, TMS5efS-1, TMS5efS-1, TMS5efS-7, TMS5efS-9, TMS5ghS-1, TMS5ghS-2, TMS5ijS-1 ir TMS5ijS-11). Jis, heterozigotas; Ho, homozigota; WT, laukinis tipas.

Visas dydis

Komercinių ryžių TGMS linijų plėtra

Mūsų tyrime nustatytas TMS5ab konstruktas parodė perspektyvų panaudojimo potencialą. Taikomoms TGMS linijoms kurti pasirinkome 11 derlingų dviejų skirtingų ryžių porūšių elitinių veislių (įskaitant septynias trijų eilučių sistemos palaikančiąsias linijas, tris indus ir vieną japonica tradicinę veislę) kaip tikslinio genomo redagavimo, naudojant TMS5ab konstrukciją, šeimininkus. per vienerius metus (1 pav. C). Visose 11 veislių gavome įvairius skaičius T 0 transgeninių augalų. Išskyrus tik vieną YNSMS (Yuenongsimiao (YNSM), transformuotą su TMS5ab), augalą, turintį redaguotą TMS5a, redagavimo efektyvumas tarp kitų veislių buvo nuo 72, 72% iki 100%. Nors YNSMS nerasta homozigotinės TMS5a mutacijos, kitų kultūrų homozigotinių mutacijų dažnis svyravo nuo 11, 1% iki 54, 55%. Šie rezultatai parodė, kad mes auginome TMS5 nukreiptus mutacijos augalus visose 11 veislių ir kad CRISPR / Cas9 sistemos redagavimo efektyvumas gali skirtis priklausomai nuo skirtingų veislių genetinio pagrindo. Po T 0 sterilių asmenų apdorojimo LT buvo atrinkti augalai, kurių derlingumas buvo atkurtas.

Norint gauti TGMS augalus be egzogeninės T-DNR, augalai, kurių derlingumas buvo atkurtas iš 11 veislių, buvo pasodinti aukštos temperatūros (HT) sąlygomis. Be to, sterilūs augalai be higromicino fosfotransferazės ( HPT ) ir Cas9 buvo gauti PCR ir Southern blot aptikimo būdu (2B, C paveikslas ir 2 papildoma lentelė). Šie „švarūs transgeniniai“ sterilūs augalai buvo auginami LT sąlygomis ir buvo gautos T 2 sėklos. TGMS atskirtos „švarios transgeninės“ TGMS linijos. Nors šie transgeniškai švarūs TGMS augalai pasižymėjo panašiu žiedadulkių sterilumu, jie neturėjo akivaizdžių fenotipinių pokyčių, palyginti su jų šeimininkais (3B – E pav. Ir papildomas 5B pav.). Šių TGMS linijų fenotipai dėl genomo redagavimo buvo stabilūs T 2 ir T 3 kartose. Norėdami gauti TGMS linijas, kurios buvo pritaikytos hibridiniam dviejų eilučių veisimui, mes vėliau apdorojome šias TGMS linijas skirtingais temperatūros gradientais ir nustatėme, kad vaisingumas palaipsniui mažėja didėjant temperatūrai (5 pav.). TGMS ZZBS ir YJSMS linijose buvo nustatyta santykinai žema kritinė sterilumą sukelianti temperatūra (CSIT), ty žemesnė nei 24 ° C (DAT), tuo tarpu ReBS, TFBS ir WSSMS TGMS linijose CSIT buvo apie 24 ° C (DAT). . GAZS TGMS linijų CSIT buvo maždaug 26 ° C (DAT), o ZS97BS CSIT viršijo 26 ° C (DAT). ZZBS, ReBS, TFBS, WSSMS ir YJSMS buvo be sterilumo be žiedadulkių, o ZS97BS ir GAZS - 28 ° C (DAT) temperatūroje visiškai nutraukė žiedadulkes. Šie rezultatai parodė, kad CSIT reguliuoja ryžių genetinis pagrindas. „Transgeniniu būdu švarių“ YJSMS populiacijos buvo išaugintos Kinijos nacionalinio hibridinių ryžių tyrimų ir plėtros centro (Čangša, Kinija) eksperimentiniuose sklypuose 2015 m. Vasarą ir jose vyravo be žiedadulkių sterilumas (papildomas 5 paveikslas). Norėdami patvirtinti, kad TMS5 redagavimas nepadarys aborto moters organams, GAZS ir YJSMS buvo apdulkintos įprastomis žiedadulkėmis. Sterilūs GAZS ir YJSMS augalai daigino dirbtinį apdulkinimą (6 papildomas paveikslas), rodantį normalų moters organų vystymąsi ir apvaisinimo funkcijas. Šie rezultatai parodė, kad šias linijas buvo galima naudoti kaip sterilias vyriškas linijas, kurios beveik nesiskiria nuo tradicinių vyriškų sterilių linijų. Apibendrinus, išvados rodo, kad tikslingas TMS5 redagavimas naudojant CRISPR / Cas9 sistemą gali būti sukurtas praktinėmis TGMS linijomis, turinčiomis geras agronomines savybes.

Image

ZZBS-10-2, ReBS-6-3, TFBS-5-7, WSSMS-2-5, YJSMS-2-4, ZS97BS-8-7 ir GAZS-9-9 yra TGMS augalai, indukuoti TMS5ab konstrukto. atitinkamai ZZB, ReB, TFB, WSSM, YJSM, ZS97B ir GAZ fonuose. Šie TGMS augalai buvo auginami 22 ° C, 24 ° C, 26 ° C ir 28 ° C temperatūroje fotoperiodo sąlygomis 13, 5 h šviesos ir 10, 5 h tamsos metu. Augalai ZZBS-10-2 ir YJSMS-2-4 buvo visiškai sterilūs 24 ° C (DAT); ReBS-6-3, TFBS-5-7 ir WSSMS-2-5 augalai buvo beveik sterilūs 24 ° C (DAT); GAZS-9-9 augalai buvo sterilūs maždaug 26 ° C temperatūroje (DAT); ir ZS97BS-8-7 augalai buvo sterilūs aukštesnėje nei 26 ° C (DAT) temperatūroje. TGMS augalų pavadinimai ir žiedadulkių augimo temperatūra yra nurodyti atitinkamai paveikslo kairėje ir viršuje. Svarstyklės, 100 μm.

Visas dydis

Norėdami patikrinti gautų TGMS linijų kombinatorinį pajėgumą, sukryžiavome HNBS su Huahang1179 (HH1179), YJSMS su R94, YJSMS su R340, YJSMS su R297, YJSMS su R173, WSSMS su R364, WSSMS su R173, WSSMS su R340 ir WSSMS. su R297. Vėliau gavome F1 kartos HNBS ir HH1179 ir nustatėme, kad palikuonys buvo stipresni ir davė didesnį derlių nei kontrolinės veislės (papildomas 7 paveikslas). Be to, hibridas parodė, kad pagrindinio gaublio ilgis padidėjo 31, 4%, grūdų skaičius padidėjo 47, 9% vienam pagrindiniam smaigaliui, 19, 8% padidėjo tūkstančio sėklų svoris, 14, 4% padidėjo vieno augalo derlius ir padidėjo 15, 9%. sklypo derlingumu (3 papildoma lentelė). Visi šie rezultatai parodė, kad TGMS linijos su TMS5 tiksliniu redagavimu naudojant CRISPR / Cas9 sistemą gali būti pritaikytos hibridinių ryžių veisimo produktyvumui pagerinti.

Diskusija

Pastaraisiais metais RNR interferencija (RNR) ir antisense metodai vis dažniau naudojami atvirkštinės genetikos sistemose 40 . Ankstesniame darbe mes numušėme TMS5 ekspresiją naudodami RNR. Nors buvo sukurti homozigotiniai TGMS augalai, tuo pat metu buvo gauti sterilūs heterozigotai aukštoje temperatūroje 15 . Todėl hibridinių ryžių veisimui negali būti naudojami sterilūs heterozigotiniai TGMS augalai. Tada mes numušėme TMS5 raišką, naudodamiesi antisense RNR metodu, ir gavome labai mažus TGMS augalų su santykinai dideliu CSIT dažnį (8 papildomas paveikslas), galbūt dėl ​​nepilno TMS5 slopinimo. Šis rezultatas leido manyti, kad tiek RNR, tiek antisense RNR technologija suteikia po sekos priklausomą genų ekspresijos slopinimą po transkripcijos, dėl to nevisiškai išeikvojami tiksliniai genai 40 . Nepaisant to, TGMS linijos su mažai CSIT garantuoja sėklų auginimą dviejų eilučių hibridinių ryžių veisime 43 . Svarbu tai, kad naudojant modifikuotą sgRNR, kad būtų galima suskaidyti tikslinio geno egzoną per DSB ir nehomologinį galutinio sujungimo (NHEJ) taisymą CRISPR / Cas9 sistemoje, augaluose gali būti sąmoningai generuojami gesinimo tipai. CRISPR / Cas9 tarpininkaujama vietinė mutagenezė sukėlė TMS5 funkcijos praradimą ir sukūrė TGMS ryžius su žemu ir stabiliu CSIT (5 pav.). Be to, nepaisant CRISPR / Cas9 transgeno, tikslinio geno mutacijos galėtų būti stabiliai perduodamos ateities kartoms 41 . Todėl T1 kartoje buvo galima gauti „švarius transgeninius“ mutantus (2, 3 ir 5 pav. Bei 2 papildomas paveikslas). Apibendrinant galima pasakyti, kad mutacijos, sukurtos naudojant šią strategiją, iš esmės yra panašios į spontaniškas ar sukeltas mutacijas, vykstančias įprastiniame veisime, be to, kad privalumas yra tai, kad objektyviai CRISPR / Cas9 redagavimo augaluose bruožas gali būti sąmoningai pagerintas 39 .

Šiuo metu hibridinis veisimas yra svarbus būdas pagerinti ryžių derlių Kinijoje 6 . Norint gauti ir parinkti sterilias linijas tam tikromis temperatūros ir šviesos sąlygomis, dviejų linijų veisimo sistemoje reikėjo keleto metų ar dešimtmečių. Priešingai, tik vieneriems metams prireikė „ TGMS TMS“ augalų, gautų iš „transgeno“, švarių „ Tms“ augalų, naudojant CRISPR / Cas9 tarpininkaujamą, vietoje nukreiptą mutagenezės sistemą. Komercinės sterilios linijos dažniausiai gaminamos naudojant turimas sterilias linijas kaip sterilų genų donorę (motininę patelę) tradicinėse kryžminimo ir kryžminimo veisimo programose 21 . Tačiau intensyviam vieno vyriškos lyties sterilios citoplazmos šaltinio naudojimui yra riboti genetiniai ištekliai, o sterilios citoplazmos šaltinio įvairovės žlugimas laikomas pražūtingu kuriant hibridus 44 . Todėl, plėtojant TGMS linijas skirtinguose genetiniuose sluoksniuose, genetinė įvairovė, ypač citoplazmos įvairovė, gali būti padidinta, padidinant heterozės išnaudojimo efektyvumą. TGMS linijoms gaminti naudojama metodika sušvelnins apribojimus, susijusius su tradiciniu hibridiniu veisimu.

Hibridinių ryžių auginimas naudojant trijų eilučių sistemą apima CMS, palaikymo ir restauravimo linijas. Komercines CMS linijas daugiausia galima suskirstyti į tris grupes: laukinių abortų (WA), Honglian (HL) ir Baotai (BT) 45 . Skirtingų tipų trijų eilučių CMS linijų panaudojimas yra apribotas, nes iš vyriškų tėvų reikia specialių CMS atstatymo genų, o prižiūrėtojų ir restauratorių daigų nėra gausu. Pavyzdžiui, maždaug 5% ryžių daigų gali būti naudojami kaip restauratorių linijos Kinijoje, Pietryčių Azijoje ir Amerikoje 10, 46, 47 . CMS ir palaikymo linijos turi tą patį branduolį, bet skirtingą citoplazmą 8 . Šiame tyrime mes panaudojome CRISPR / Cas9 tarpininkaujantį branduolinių genų, koduojančių TMS5 , redagavimą palaikymo linijose, kad gautume TGMS linijas, turinčias ypatingai panašias charakteristikas kaip jų atitinkamas CMS linijas. Beveik visos įprastos veislės su specifiniais CMS atstatymo genais arba be jų galėtų atkurti TGMS linijų vaisingumą 12, 14 . Šis metodas išlaiko visus CMS linijų privalumus, išvengia ribotų genetinių išteklių sukeltų problemų ir pagerina heterozės panaudojimo efektyvumą. Todėl šį tiesioginį ir efektyvų TGMS veisimo metodą pavadinome „trijų linijų pavertimu dviem linijomis“.

Japonikos hibridinių ryžių veisimas nebuvo plačiai naudojamas, nes trūksta vyriškų sterilių linijų, turinčių didelę agronominę vertę. Japonikos hibridiniai ryžiai užima maždaug tik 3% japoninių ryžių sodinimo ploto Kinijoje 10, 48 . Japonikos hibridinių ryžių veisimo skatinimas bus ryžių gamybos proveržis Kinijoje. Sterilumo genas japonikos P / TGMS linijose daugiausia buvo gautas iš „Nongken58S“, naudojant vieną genetinį foną, ir jis turi aukšto CSIT požymių 43 . Nepaisant to, bus labai patogu naudoti CRISPR / Cas9 tarpininkaujantį TMS5 redagavimą, kad būtų galima auginti sterilias japonikos linijas arba plačiai suderinamą sterilų linijų veisimą, siekiant pagerinti japonica ar japonica - indica hibridinių ryžių veisimą 48 .

Dviejų eilučių hibridiniame veisime, norint užtikrinti hibridinių sėklų grynumą, svarbu auginti sterilias linijas, kurių CSIT yra žemas 43 . Mes ištyrėme 7 TGMS linijų, sukurtų naudojant TMS5ab redagavimo sistemą, CSIT (5 pav.) Ir nustatėme, kad veislės, turinčios skirtingą genetinį foną, turėjo skirtingą CSIT ir kad dauguma jų atitiko veisimo programų reikalavimus. Šie rezultatai rodo, kad tms5 TGMS linijų CSIT buvo nustatytas atsižvelgiant į jų genetinį pagrindą, bet ne į tms5 . Be to, TGMS eilutes su aukštesnėmis CSIT galima kirsti su žemesnėmis CSIT linijomis, kad būtų pasirinktos naujos TGMS eilutės su mažesnėmis CSIT.

Šiame tyrime mes atrinkome 10 taikinių sekų TMS5 koduojančiame regione, kad išnagrinėtume tikslinės svetainės redagavimo efektyvumą ir nustatėme, kad TMS5b efektyvumas buvo didžiausias (iki 88, 2%). Tarp penkių konstrukcijų TMS5ab redagavimo efektyvumas siekė net 94, 1%, o vienos iš tikslinių sekų homozigotinis laipsnis siekė net 32, 4%. Šie duomenys parodė, kad „TGMS“ augalų, turinčių švarų transgeną, auginimas buvo labai patogus naudojant CRISPR / Cas9 sistemą T 1 kartoje ir kad veisimo efektyvumą buvo galima žymiai pagerinti. Be to, CRISPR / Cas9 sistemos redagavimo efektyvumui turėjo įtakos keli veiksniai. Kaip anksčiau buvo pranešta 25, 26, tikslai su didesniu GC kiekiu parodė palyginti didesnį redagavimo efektyvumą (1A pav. Ir 3 papildomas paveikslas). Be to, kaip aprašyta anksčiau, 26, 49, stabilesnė antrinė struktūra lėmė netobulą taikinio sekos ir tikslinės vietos papildomą bazių poravimą (1A pav. Ir papildomas 4 paveikslas). Dėl to šioje sistemoje yra pasirinkta tikslinė seka su mažiau stabilia antrine struktūra su sgRNR 49 . Mes taip pat pažymėjome, kad tos pačios tikslinės sekos redagavimo efektyvumas buvo pakitęs skirtingose ​​ryžių veislėse (1 pav. C). Šį pastebėjimą gali lemti sumažėjęs CRISPR / Cas9 redagavimo sistemos aktyvumas kai kuriose veislėse arba didesnis procentas nepriekaištingų taisymų po DSB 25 . SgRNR raiškos lygis gali būti ribojantis veiksnys tikslinės vietos redagavimui Arabidopsis 26 . Tačiau kai sgRNR ir Cas9 ekspresijos lygiai pasiekė tam tikras ribas, jų ekspresija gali būti nesvarbi ryžių tikslinės vietos redagavimo efektyvumui.

Šiame tyrime mes suprojektavome 10 tikslinių sekų TMS5 gene ir pasirinkome optimaliausią TMS5ab konstrukciją komercinių TGMS linijų kūrimui, palygindami redagavimo efektyvumą ir analizuodami tikslinių sekų efektyvumą prieš taikinį. Naudojant TMS5ab konstrukciją, TMS5 genas buvo suredaguotas 11 elitinių ledo linijų, kad per vienerius metus būtų sukurtos „švarios transgeninės“ TGMS linijos. Šis metodas gali sutrumpinti veisimosi periodą, sumažinti darbo sudėtingumą ir sąnaudas bei palengvinti heterozės išnaudojimą. Mūsų darbas labai paskatins TGMS linijų veisimo procesą ir maksimaliai padidins kryžminių trijų eilučių sterilių linijų skaičių, o tai palengvins hibridinių ryžių veisimą. Šis darbas gali būti pritaikytas ne tik hibridinių ryžių veisimui, bet ir galimai kitų hibridinių augalų veisimui.

Metodai

Augalinės medžiagos, augimo sąlygos ir transgeninių augalų generavimas

TMS5as buvo gautas iš zhonghua11 (ZH11), numušant TMS5, naudojant antisenseninę RNR technologiją. TMS5abS, TMS5cdS, TMS5efS, TMS5ghS ir TMS5ijS buvo gauti iš ZH11, atitinkamai pertvarkant TMS5ab, TMS5cd, TMS5ef, TMS5gh ir TMS5ij vektorius, naudojant Agrobacterium mediaciją. ZS97BS, HNBS, TFBS, YXBS, ReBS, HHBS, ZZB, YJSMS, YNSMS, WSSMS, and GAZS were derived from the transformation of the TMS5ab vector using Zhenshan97B (ZS97B), HuanongB (HNB), TianfengB (TFB), YixiangB (YXB), ReB, HuahuiB (HHB), ZhongzheB (ZZB), Yuejingsimiao (YJSM), Yuenongsimiao (YNSM), Wushansimiao (WSSM), and GAZ as hosts, respectively. ZH11 and GAZ are conventional Japonica rice; Zhenshan97B (ZS97B), HuanongB (HNB), TianfengB (TFB), YixiangB (YXB), ReB, HuahuiB (HHB) and ZhongzheB (ZZB) are “three-line” indica maintainer lines. Yuejingsimiao (YJSM), Yuenongsimiao (YNSM), and Wushansimiao (WSSM) are conventional indica rice. Transgenic plants were generated using Agrobacterium -mediated transformation as previously described 13, 15 . Unless indicated, all rice plants were grown in the field at the South China Agricultural University, Guangzhou (23_N, 113_E), during normal rice growing seasons, or in a growth chamber at DATs of 22, 24, 26, 28 and 30 °C with three replicates as previously described 15 .

Vektorinės konstrukcijos

The TMS5as vector was constructed as previously described 50 . An antisense fragment from TMS5 was amplified and cloned into pYLox vector 15 . CRISPR/Cas9 was constructed as previously described 26 . Briefly, according to the design principles of the target sequences in the CRISPR/Cas9 system, 19 to 20 bases upstream of the PAM motif were selected as candidate target sequences, and target sequences in TMS5 were determined for TMS5a, TMS5b, TMS5c, TMS5d, TMS5e, TMS5f, TMS5g, TMS5h, TMS5i and TMS5j (Supplemental Table 4) by Blast analysis of the rice genome (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) to ensure that no other genes were targeted. Equivalent amounts of forward and reverse primers (0.05–0.1 μM) for one target were mixed and incubated at 90 °C for 1 min, followed by a gradual cool-down to room temperature to form the target adaptor. Approximately 1 μg each of the pYLgRNA-OsU6a and pYLgRNA-OsU3 vectors was digested using 10 U Bsa I (NEB), respectively. The ligation reaction (10 μl) contained 1 μ1 of 10 x T4 DNA ligase buffer, 20 ng of pYLgRNA-OsU6a or pYLgRNA-OsU3 vector, 1 μ1 of the target sequence adaptor, and 35 U of T4 DNA ligase (Takara, Dalian, China). The target sequence adaptors TMS5a, TMS5c, TMS5e, TMS5g and TMS5i, respectively, were ligated into the linearized pYLgRNA-OsU6a vector (digested with 10 U of Bsa I), and TMS5b, TMS5d, TMS5f, TMS5h, and TMS5j, respectively, were cloned into pYLgRNA-OsU3 to generate sgRNA expression cassettes with target sequences. The sgRNA expression cassettes with the target sequences TMS5a, TMS5c, TMS5e, TMS5g and TMS5i were amplified from pYLgRNA-OsU6a using primers Pps-GGL and Pgs-GG2 and the sgRNA expression cassettes with target sequences TMS5b, TMS5d, TMS5f, TMS5h, and TMS5j were amplified from pYLgRNA-OsU3 using primers Pps-GG2 and Pgs-GGR with High-Fidelity DNA polymerase KOD-Plus (Toyobo, Osaka, Japan) over 30 cycles (94 °C, 30 s; 58 °C, 30 s; 68 °C, 20 s). The sgRNA expression cassettes with target sequences and binary plasmid pYLCRISPR/Cas9Pubi-H were digested with Bsa I and subsequently purified. Ten microliters of the reaction solution consisted of 1 μl of 10 x T4 DNA ligase buffer, 15 ng of purified sgRNA expression cassettes of TMS5a and TMS5b, 60 ng of pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, and 70 U of T4 DNA ligase (Takara, Dalian, China). The TMS5ab vector was constructed by ligating sgRNA expression cassettes of TMS5a and TMS5b to the binary plasmid pYLCRISPR/Cas9Pubi-H. The same procedures were used for the TMS5cd, TMS5ef, TMS5gh, and TMS5ij constructs as for TMS5ab. The relevant PCR primers are listed in Supplementary Table 4.

Mutation detection and analysis of transgenic plant lines

To determine the mutation of target sites, genomic DNA from the leaves of transgenic rice plants was extracted using the sodium dodecyl sulphate method 51 . PCR amplifications were performed using primer pairs (Supplemental Table 4) surrounding the designed target sites. The PCR products were directly sequenced or cloned into the pEASY-Blunt (TransGen Biotech, Beijing, China) vector and sequenced using the Sanger method. Mutations were identified by comparing the sequences of transgenic and WT plants. The sequencing chromatograms from mutations were analysed, and mutations containing normal sequencing chromatograms were considered homozygotes. Mutations containing superimposed sequencing chromatograms were considered heterozygous or biallelic mutations. Heterozygous sequences from direct sequencing were decoded using the degenerate sequence decoding method 52 . The relevant PCR primers are listed in Supplementary Table 4.

The identification of “transgene clean” plants was conducted using T 1 progeny of T 0 homozygous mutations. The transgenic lines were analysed by PCR using HPT and Cas9 primers and agarose gel electrophoresis. The pYLCRISPR/Cas9Pubi-H plasmids and ZH11 DNA were selected as positive and negative controls, respectively. HPT - and Cas9 -negative plants were considered “transgene clean” plants. Some “transgene clean” plants identified by PCR were further confirmed by Southern blotting. Southern blots were performed using a DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) according to a standard program supplied by the manufacturer. In brief, PCR products of HPT were labelled with GIG-dUTP by random priming (Roche Diagnostics) and used as hybridization probes. Genomic DNA from the leaves of rice plants was extracted using the Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method. Genomic DNA was digested overnight using Eco RI (Takara, Dalian, China) and then separated by 0.8% agarose electrophoresis and transferred onto Hybond N + nylon membranes (Amersham Bioscience, Bucks, UK) using the capillary transfer method. Hybridization was performed at 65 °C in DIG Easy Hyb buffer. The membranes were washed twice with wash buffer (2 x SSC, and 0.1% SDS) at 68 °C and then blocked with blocking solution and incubated with anti-digoxigenin-AP solution for 30 min. Subsequently, the membranes were washed twice with wash buffer (0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.3% (v/v) Tween 20, pH 7.5) at room temperature for 15 min each, followed by equilibration with detection buffer (100 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, pH 9.5) for 2–5 min. One millilitre of CSPD ready-to-use solution was added to the membranes to stimulate chemiluminescence. The chemiluminescence signals were detected and analysed using X-ray films.

Išraiškos analizė

Total RNA was isolated from the leaves or panicles of T 0 rice plants using TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). DNase I-treated total RNA (2.0 μg) was used for reverse transcription using an M-MLV-RT kit (Takara, Dalian, China) with a mixture of oligo(dT) and sgRNA RT primers (Supplemental Table 4). Real-time quantitative PCR was performed with gene- and target-specific primers (Supplemental Table 3) using the SsoFast™ EvaGreen Supermix kit (Bio-Rad, USA) and CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) as previously described 15 . Three replicates were evaluated for each gene. The internal standard gene OsActin1 was used to normalize the cDNA levels of the target genes. Total protein was extracted from rice panicles, and immunoblot analysis was performed using a previously described method 15 . HSP82 53 (Code: AbM51099-31-PU; BPI, China) was used as the internal standard protein. The relevant PCR primers are listed in Supplementary Table 4.

RNA secondary structure analysis

Secondary structure analysis of target-sgRNA sequences was performed with the RNA Folding Form (//unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).

Characterization of phenotypes

Rice florets were photographed using an OLYMPUS DP70 digital camera under an OLYMPUS SZX10 dissecting microscope. Mature pollen grains were stained using 1% I 2 –KI solution and photographed using an OLYMPUS BX51 or Leica DNRXA microscope.

Papildoma informacija

How to cite this article : Zhou, H. et al . Development of Commercial Thermo-sensitive Genic Male Sterile Rice Accelerates Hybrid Rice Breeding Using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 Editing System. Mokslas. Rep. 6, 37395; doi: 10.1038/srep37395 (2016).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.