Dietos sukeltas riebalų rūgščių sintazės kitimas prostatos vėžio progresavimo metu | onkogenezė

Dietos sukeltas riebalų rūgščių sintazės kitimas prostatos vėžio progresavimo metu | onkogenezė

Anonim

Dalykai

  • Vėžio prevencija
  • Prostatos vėžys

Anotacija

Riebalų rūgščių sintazė (FASN) yra citozolinis metabolinis fermentas, katalizuojantis de novo riebalų rūgščių sintezę. Didelio riebumo dieta (HFD) priskiriama prostatos vėžio (PCa) progresavimui, tačiau FASN vaidmuo HFD tarpininkaujant PCa progresui išlieka neaiškus. Mes ištyrėme FASN vaidmenį PCa progresijoje LNCaP ksenografų pelėms, maitinamoms HFD arba mažai riebalų turinčia dieta (LFD), PCa ląstelėms ir klinikinei PCa. HFD paskatino naviko augimą ir FASN raišką LNCaP ksenografų pelėse. HFD sąlygojo AKT ir tarpląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) aktyvaciją ir 5 'adenozino monofosfato suaktyvintos baltymo kinazės (AMPK) inaktyvaciją. Serumo FASN lygis buvo žymiai mažesnis HFD grupėje ( P = 0, 026) ir koreliuotas atvirkščiai su naviko tūriu ( P = 0, 022). Tarpląstelinis FASN išsiskyrimas buvo padidintas PCa ląstelėse fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) / mitogenais aktyvuotos baltymo kinazės (MAPK) slopinimu ir AMPK signalizacijos aktyvinimu. Dėl FASN slopinimo sumažėjo PCa ląstelių proliferacija dėl PI3K / MAPK žemo reguliavimo ir AMPK aktyvacijos. Be to, AMPK aktyvinimas buvo susijęs su FASN sumažėjusiu reguliavimu ir PI3K / MAPK inaktyvacija. Kliniškai didelis FASN ekspresija buvo reikšmingai susijęs su aukštais Gleasono balais ir pažengusia patologine T stadija. Be to, FASN ekspresija buvo ženkliai sumažinta PCa reakcijoje į androgenų atėmimo terapiją ir chemoterapiją. HFD moduliuoja FASN raišką, o tai gali būti svarbus su HFD susijusios PCa progresijos mechanizmas. Be to, tarp FASN ir PI3K / MAPK sistemos egzistuoja kritinė stimuliacinė kilpa, tuo tarpu AMPK signalizacija buvo susijusi su slopinimu. Tai gali pasiūlyti tinkamus chemoprevencijos ir vėžio terapijos tikslus HFD sukeltoje PCa.

Įvadas

Prostatos vėžys (PCa) yra dažniausiai diagnozuojamas vėžys ir antra dažniausia su vėžiu susijusios mirties priežastis JAV. 1 Nors Japonijoje PCA dažnis yra mažesnis nei vakarų šalyse, jis didėja. 2 Daugelis epidemiologinių tyrimų parodė, kad riebalų dieta (HFD) arba nutukimas yra susiję su PCa dažniu ir progresija. 3, 4 Be to, keli tyrimai parodė, kad HFD vartojimas gali paveikti genų ekspresiją, ląstelių aktyvumą ir cirkuliuojančių biologinių veiksnių lygius per fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) ir mitogenų suaktyvintos baltymų kinazės (MAPK) signalizacijos kelius hiperaktyvuojant. dalyvauti prostatos kancerogenezėje. 5, 6, 7, 8

Riebalų rūgščių sintazė (FASN) yra metabolinis fermentas, katalizuojantis riebalų rūgščių de novo sintezę; jį reguliuoja sterolius reguliuojančius elementus jungiantys baltymai (SREBP). 9, 10, 11 Be to, įrodyta, kad FASN reguliuoja androgenai ir skatina LNCaP ląstelių proliferaciją, 12, 13 ir FASN ekspresiją, kurią, kaip žinoma, reguliuoja PI3K ir MAPK signalizacijos keliai. 14, 15 Be to, neseniai atliktas tyrimas parodė, kad HFD sukeltas nutukimas padidino melanomos progresavimą moduliuodamas FASN raišką 16, o dietinė soja, vitaminas D2 ir žalioji arbata slopino FASN raišką įvairiose vėžio ląstelėse. 17, 18, 19, HFD ir kiti dietiniai komponentai gali būti siejami su PCa progresu dėl pakitusios FASN ekspresijos. Tačiau tikslus mechanizmas yra sunkiai suprantamas.

Žmogaus FASN yra 270 kDa citozolinis baltymas, kuris taip pat randamas tarpląstelinėje erdvėje. 20, 21 Pavyzdžiui, FASN buvo rastas tiek žmogaus krūties vėžio ląstelių kultūros supernatantuose, tiek sergančių krūties vėžiu serume. 22, 23 tarpląstelinis FASN lygis buvo susijęs su FASN ekspresija riebaliniame audinyje pacientams, sergantiems 2 tipo cukriniu diabetu. Be to, buvo pranešta, kad 5 'adenozino monofosfato suaktyvinta baltymo kinazė (AMPK), kuri yra svarbi palaikant tarpląstelinės energijos pusiausvyrą, 25 turi didelę reikšmę tarpląsteliniam FASN atpalaidavimui ir ląstelių energijos atstatymui reaguojant į padidėjusį AMP: adenozino trifosfatas. santykiai. 26

Šiame tyrime mes ištyrėme FASN raišką LNCaP ksenografų pelėms, maitinamoms HFD ir mažai riebalų turinčia dieta (LFD). Rezultatai rodo, kad FASN ekspresija padidėja ksenografinio naviko ląstelėse HFD sąlygomis ir kad ją reguliuoja PI3K, MAPK ir AMPK signalizacijos keliai. Kliniškai FASN raiška buvo koreliuojama su PCa progresu. Šie rezultatai rodo, kad FASN ir susiję signalizacijos keliai yra susiję su PCa progresija, ypač esant HFD sąlygoms.

Rezultatai

HFD padidino naviko augimą ir FASN bei SREBP-1 ekspresiją, taip pat sumažino FASN kiekį serume LNCaP ksenografų pelėms

Sukūrėme LNCaP ksenografinės pelės modelį, paskiepydami 1 × 10 6 LNCaP ląsteles ir padalydami peles į HFD ir LFD grupes (papildoma S1 lentelė), po 12 pelių kiekvienoje grupėje. Nors reikšmingo maisto vartojimo lygio skirtumo dviejose dietų grupėse nebuvo, kalorijų suvartojimas HFD grupėje buvo žymiai didesnis nei LFD grupėje (atitinkamai 10, 4 ± 0, 4 ir 9, 3 ± 0, 5 kcal / per dieną, pelė), P = 0, 034; papildoma S2 lentelė). 14 savaitę (mitybos eksperimentų pabaiga) HFD grupėje naviko augimas buvo žymiai padidėjęs, palyginti su LFD grupe ( P = 0, 025, papildomas S1 paveikslas), tačiau reikšmingų skirtumų serumo insulino ir panašaus insulino kiekiuose nebuvo. augimo faktorius 1 (IGF-1) abiejose grupėse, atitinka mūsų ankstesnio tyrimo rezultatus. 6 Toliau mes ištyrėme FASN ir SREBP-1, kritinio FASN transkripcijos faktoriaus, raišką ksenografinėse pelėse. HFD grupės ksenografinių navikų FASN ir SREBP-1 mRNR raiška buvo 1, 8 karto ir 2, 1 karto didesnė, palyginti su LFD grupe, atitinkamai ( n = 12 vienai grupei, P <0, 05; 1a ir b paveikslai). Panašiai FASN išraiška buvo didesnė HFD grupės ksenografiniuose navikuose nei LFD grupėje (1e – g pav.), Tuo tarpu vidutinis FASN lygis serume buvo žymiai mažesnis HFD grupėje nei LFD grupėje (3344, 6 ± 1005, 8 ir 6666, 4 Atitinkamai ± 3685, 8 pg / ml, P = 0, 026; 1c paveikslas). Be to, FASN lygis serume buvo atvirkščiai koreliuojamas su naviko kiekiais (bendras, r = 0, 642, P = 0, 022; HFD grupė, r = –0, 618, P = 0, 024; LFD grupė, r = –0, 439, P = 0, 154; 1d paveikslas). . Šie duomenys rodo, kad HFD padidina FASN ekspresiją PCa ląstelėse ir sumažina FASN tarpląstelinį išsiskyrimą, kartu pagerindamas PCa progresą.

Image

FASN ir su ja susijusių signalų kelių ekspresija LNCaP ksenografų pelėse HFD ar LFD sąlygomis. Buvo sugeneruotos LNCaP ksenografinės pelės, o tos, kurių navikai buvo apčiuopiami, atsitiktine tvarka buvo priskiriamos HFD ir LFD grupėms (po 12 pelių kiekvienoje grupėje). Po 14 savaičių dietos eksperimentų naviko ir serumo mėginiai buvo atskirti. ( a, b ) FASN ir SREBP-1 mRNR raiška ksenografiniuose navikuose buvo kiekybiškai įvertinta atvirkštinės transkripcijos-PGR metodu ir lyginamas santykinis mRNR raiškos santykis su beta-aktinu abiejose dietų grupėse. * P <0, 05. c ) FASN koncentracija serume buvo matuojama žmogaus FASN ELISA rinkiniu. Vidutinis serumo FASN lygis buvo žymiai mažesnis HFD grupėje nei LFD grupėje: atitinkamai 3344, 6 ± 1005, 8 ir 6666, 4 ± 3685, 8 pg / ml ( P = 0, 026). ( d ) FASN lygis serume kiekvienam gyvūnui buvo nubraižytas atskirai pagal ksenografinių pelių auglių tūrį ir Pearsono koreliacijos koeficientas ( r ) buvo apskaičiuotas naudojant SPSS 12 versiją (iš viso, r = 0, 642, P = 0, 022; HFD grupė (uždaras ratas)., r = –0, 618, P = 0, 024; LFD grupė (atviras ratas), r = –0, 439, P = 0, 154). e ) HFD ir LFD grupių pelių ksenografinių navikų dalims buvo atliktas imunohistologinis dažymas anti-žmogaus FASN, P-AKT (Ser 473 ), P-ERK (Thr202 / Tyr204) ir P-AMPK (Thr172) antikūnais (juosta, 100 μm). Nurodytas didesnis dėmių plotas (rodyklės). ( f ) Ksenografinių vėžinių ląstelių imunohistologinis intensyvumas buvo įvertintas pusiau kiekybiškai. Vidutinis FASN, P-AKT (Ser 473 ) ir P-ERK (Thr202 / Tyr204) intensyvumo balas buvo reikšmingai didesnis HFD grupėje, palyginti su LFD grupe, tačiau vidutinis P-AMPK (Thr172) intensyvumo balas buvo ryškus. žemesnis HFD grupėje. ( g ) Vienodi baltymų kiekiai iš ksenografinio naviko buvo įvertinti naudojant Western blot metodą su anti-FASN, anti-AKT, anti-P-AKT, anti-ERK, anti-P-ERK, anti-AMPK, anti-P-AMPK ir anti-beta-aktino.

Visas dydis

P-AKT ir P-ERK reguliavimas, taip pat P-AMPK reguliavimas pelių LNCaP ksenografų navikuose HFD sąlygomis

Keletas tyrimų parodė, kad nereguliuojami PI3K / AKT, tarpląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) / MAPK ir AMPK signalizacijos keliai yra susiję su PCa progresija ir kad HFD gali suaktyvinti AKT ir ERK signalizaciją. 27 Norėdami ištirti baltymų kinazės kelių raišką HFD sukeltų PCa navikų augime, ištyrėme AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, AMPK, P-AMPK ir Ki67 raišką ksenografų navikuose imunohistochemijos ir (arba) Vakarų metodais. blotinimas (1e – g paveikslai; papildomi S2 ir S3 paveikslai). P-AKT, P-ERK ir Ki67 pozityvumas buvo reikšmingai padidintas, tuo tarpu P-AMPK reikšmingai sumažėjo HFD grupėje, palyginti su LFD grupe (1e – g paveikslai, papildomas S3 paveikslas). Be to, AKT, ERK ir AMPK išraiškos abiejose dietos grupėse statistinių skirtumų nebuvo (papildomas S2 paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad HFD skatino PCa augimą kartu su signalizacijos kelių, tokių kaip PI3K / AKT, ERK / MAPK ir AMPK, moduliavimu.

Pakeista FASN ekspresija per AKT ir ERK slopinimą, taip pat AMPK aktyvacija PCa ląstelėse

Toliau mes ištyrėme AKT ir ERK signalizacijos vaidmenį FASN išraiškai. Gydymas 5 μM PI3K inhibitoriaus LY294002 arba 0, 5 μM MAPK inhibitoriaus U0126 reikšmingai sumažino tarpląstelinį FASN baltymą (nesveiką 270 kDa formą). Tačiau FASN ekspresija (nesveiki buvo 270 kDa ir 100 ir 150 kDa formos) kondicionuotoje terpėje padidėjo LNCaP ir C4-2 ląstelėse (2a paveikslas). Be to, FASN ir SREBP-1 mRNR raiška buvo žymiai mažesnė LNCaP ir C4-2 ląstelėse, apdorotose LY294002 arba U0126, palyginti su tėvų ląstelėmis ( P <0, 01; 2b ir c paveikslai). 5-amino-4-imidazolo karboksamido ribosidas (AICAR), kuris yra farmakologinis AMPK aktyvatorius, stimuliavo tarpląstelinį FASN išsiskyrimą krūties vėžio ląstelėse; Todėl mes ištyrėme AMPK signalizacijos vaidmenį FASN ir SREBP-1 ekspresijoje PCa ląstelėse, apdorotose AICAR. Šiomis sąlygomis baltymų P-AMPK ekspresija padidėjo LNCaP ir C4-2 ląstelėse priklausomai nuo dozės iki efektyvios maksimalios 1 mM dozės (2d pav.). Be to, gydymas AICAR sąlygojo tarpląstelinio FASN (nepažeistos formos 270 kDa) ekspresiją ir SREBP-1 pirmtakų (125 kDa) ir subrendusių (68 kDa) formų reguliavimo sumažėjimą, tuo tarpu FASN baltymo ekspresija kondicionuojamoje terpėje (daugiausia 150 kDa). suskaidyta forma) padidėjo LNCaP ir C4-2 ląstelėse priklausomai nuo dozės (2d pav.). Šie duomenys rodo, kad FASN išraiška buvo sureguliuota padidėjus PI3K / MAPK signalizacijai arba sumažinus AMPK signalizaciją.

Image

PI3K (LY294002) ir MAPK (U0126) inhibitorių ir AMPK aktyvatoriaus (AICAR) poveikis FASN ekspresijai LNCaP ir C4-2 ląstelėse. LNCaP ir C4-2 ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuota Eagle terpėje (DMEM), kurioje yra 10% galvijų vaisiaus serumo (FBS) su 5 μM LY294002 ir be jo, 0, 5 μM U0126 ( a - c ) arba AICAR ( d ) arba be AICAR ( d ). nurodyta koncentracija 24 val. ( a ) Lygus baltymų kiekis iš ląstelių ir kondicionuojamos terpės buvo paveiktas anti-žmogaus-FASN antikūnu. Iš ląstelių buvo išgauta bendra RNR, o FASN ( b ) ir SREBP-1 ( c ) mRNR lygiai buvo išmatuoti kiekybinės atvirkštinės transkripcijos-PGR metodu ir palyginti su negydytų ląstelių lygiais. ** P <0, 01. ( d ) Baltymai iš auginamų ląstelių ir supernatantas buvo paveiktas anti-AMPK, anti-P-AMPK, anti-FASN, anti-SREBP-1 ir anti-beta-aktinu.

Visas dydis

FASN išraiška ir skerspjūvis tarp PI3K, ERK ir AMPK signalų

Toliau mes ištyrėme AKT, ERK ir AMPK kryžminį tašką FASN ekspresijai PCa ląstelėse. AMPK fermentinis aktyvumas žymiai padidėjo priklausomai nuo dozės LNCaP ir C4-2 ląstelėse, apdorotose LY294002 arba U0126, tačiau poveikis buvo panaikintas, jei buvo 10 μM C ​​junginio (3a ir b paveikslai). Išvadą patvirtino Western blotting (3c pav.). Toliau mes ištyrėme AMPK slopinimo arba aktyvavimo poveikį AKT, ERK ir FASN raiškai PCa ląstelėse. FASN, P-AKT ir P-ERK ekspresija buvo iš naujo sureguliuota LNCaP ląstelėse, apdorojant 50 nM AMPK mažų trukdančių RNR (siRNR) 6 valandas (3d paveikslas, papildomas S4 paveikslas). Kai 1 valandą LNCaP ląstelės buvo gydomos 0, 5 mM AICAR, FASN, P-AKT ir P-ERK ekspresija buvo sureguliuota, palyginti su negydytomis ar gydomomis AMPK siRNR sąlygomis (3d pav.).

Image

Aptikimas tarp PI3K, MAPK ir AMPK signalizacijos kelių, susijusių su FASN išraiška. ( a, b ) LNCaP ir C4-2 ląstelės buvo kultivuojamos LY294002 ir U0126 nurodytoje koncentracijoje su 10 μM C ​​junginiu arba be jo 1 valandą. Ląstelės buvo plaunamos ir lizuojamos, o fermentinis AMPK aktyvumas buvo matuojamas naudojant „CycLex AMPK kinazės testo rinkinį“. Fermentinis aktyvumas buvo įvertintas, palyginti su neapdorotų ląstelių aktyvumu. * P <0, 05, ** P <0, 01. ( c ) LNCaP ir C4-2 ląstelės buvo kultivuojamos su 5 μM LY294002 ir 0, 5 μM U0126 1 val. Vienodas baltymų kiekis iš auginamų ląstelių buvo paveiktas anti-AMPK, anti-P-AMPK ir anti-beta-aktinu. ( d ) LNCaP ir C4-2 ląstelės buvo kultivuojamos 0, 5 mM AICAR arba veikiamos 50 nM AMPK siRNR atitinkamai 1 ir 6 valandas. Tada baltymai iš auginamų ląstelių buvo įvertinti atliekant Western blot analizę su anti-AMPK, anti-P-AMPK, anti-AKT, anti-P-AKT, anti-ERK, anti-P-ERK, anti-FASN ir anti-beta -aktinas.

Visas dydis

FASN vaidmuo ląstelių proliferacijai ir ląstelių signalizavimui PCa ląstelėse

Toliau mes ištyrėme FASN vaidmenį PCa ląstelių proliferacijoje. Ląstelių proliferacija žymiai sumažėjo tiek LNCaP, tiek C4-2 ląstelėse, apdorojant FASN siRNR ir ceruleninu 48 ir 72 valandas. Poveikis buvo iš dalies išsaugotas pridedant 75 μM palmitino rūgšties (PA), pirmosios pagamintos riebalų rūgšties. FASN ir ilgesnių riebalų rūgščių pirmtakas (4a ir b pav.). Be to, mes ištyrėme, ar FASN slopinimas turi įtakos AKT, ERK ir AMPK aktyvavimui PCa ląstelėse. Western blot tyrimas parodė, kad P-AKT ir P-ERK baltymų ekspresija turi būti sumažinta, tuo tarpu P-AMPK ekspresija padidėjo LNCaP ir C4-2 ląstelėse po gydymo FASN siRNR arba ceruleninu (4c ir d paveikslai; papildomas S5 paveikslas). Šie duomenys rodo, kad reguliuojamas FASN padidina naviko augimą HFD sąlygomis. Be to, gali būti kritinė FASN ekspresijos abipusė stimuliacinė sistema ir PI3K bei MAPK keliai, susiję su PCa progresu. AMPK gali turėti slopinamąjį vaidmenį FASN / PI3K / MAPK signalizacijos sistemoje.

Image

FASN ir susijusių signalų teikimo būdų vaidmuo PCa ląstelių gyvybingumui. LNCaP ir C4-2 ląstelės buvo kultivuojamos 96 šulinėlių plokštelėje su Dulbecco modifikuota Eagle terpe (DMEM), turinčioje 5% galvijo vaisiaus serumo (FBS), ir apdorotos 50 nM siRNR ( a, c ) ir 10 μM cerulenino ( b, d ) su nurodytu laikotarpiu su 75 μM PA PA arba be jo. Buvo atliktas MTT tyrimas ir ląstelių gyvybingumas palygintas su ląstelių, apdorotų kontroline siRNR arba FBS ( a, b ), gyvybingumu. * P <0, 05, ** P <0, 01. Ląstelės buvo surinktos, baltymai ekstrahuojami ir lygus kiekvieno baltymo mėginio kiekis buvo atliktas Western blot analize naudojant anti-FASN, anti-AKT, anti-P-AKT, anti-ERK, anti-P-ERK, anti-AMPK, anti-P-AMPK ir anti-beta-aktino ( c, d ).

Visas dydis

Pacientams, sergantiems PCA, kuriems buvo atlikta radikali prostatektomija, FASN raiška buvo susijusi su nepageidaujamais patologiniais atradimais

Norėdami nustatyti FASN klinikinį vaidmenį progresuojant PCa, atlikome FASN imunohistochemiją pacientams, sergantiems PCA, kuriems buvo atlikta radikali prostatektomija. Anti-FASN antikūnas parodė, kad FASN daugiausia ekspresuojamas vėžinių epitelio ląstelių citoplazmoje. FASN dažymo lygis PCa mėginiuose buvo apskaičiuotas pagal teigiamų ląstelių intensyvumą ir proporciją (5A pav.). Kai buvo įvertintas ryšys tarp FASN išraiškos ir Gleasono balo (GS), FASN dažymo lygis buvo žymiai didesnis PCa sergančių pacientų, kurių GS buvo 7, palyginti su GS, lygiu P6 ( P <0, 01; 5B paveikslas). Be to, dažymo lygis buvo žymiai didesnis pacientams, sergantiems PCa, o GS lygus 8, nei pacientams, kurių GS buvo 6 ( P <0, 01; 5B paveikslas). FASN dažymo lygis buvo žymiai didesnis pacientams, sergantiems pažengusia patologine T (pT) stadija (pT3), nei pacientams, sergantiems labiau lokalizuota liga (pT2) ( P <0, 001; 5C pav.).

Image

PCA sergantiems pacientams FASN ekspresija buvo susijusi su GS ir pT stadijomis. Radikalios prostatektomijos PCa audinio mėginių stikleliai buvo imunohistologiškai dažyti naudojant anti-žmogaus FASN specifinius antikūnus, o dažymo balas buvo apskaičiuotas įvertinant dažymo intensyvumą ir plotą. ( A ) Šie tipiniai vaizdai rodo neigiamą dažymą (a), silpną (b), vidutinį (c) ir stiprų (d). ( B ) FASN dažymo lygis buvo žymiai didesnis pacientams, kuriems nustatytas didelis GS (GS = 7, n = 56; ir GS> 7, n = 27), nei tiems, kurių žemas GS (GS <7, n = 53). P <0, 01. ( C ) FASN dažymo lygis chirurginiame mėginyje buvo žymiai didesnis pacientams, kuriems buvo patologinė pT3 stadija, arba aukštesnis nei pacientams, kuriems pT2 ( P <0, 001).

Visas dydis

FASN sumažinimas atsižvelgiant į ADT ir chemoterapiją pacientams, sergantiems PCA

Norėdami įvertinti FASN raiškos pokyčius pacientams, sergantiems PCa, gydomiems androgenų deprivacijos terapija (ADT) ir chemoterapija, ištyrėme FASN dažymo lygį radikaliose prostatektomijos mėginiuose, gydomuose neoadjuvantais chemoterapiniais metodais ar be jų. Į šį tyrimą įtraukti pacientai: (a) prieš prostatektomiją nebuvo gavę jokio ADT ar chemoterapijos ( n = 10), b) 3–6 mėnesius buvo gydomi tik ADT ( n = 10) arba (c) nebuvo vartoję ADT. 3 mėnesius ir docetakselio / estramustino fosfato chemoterapija 6 savaites ( n = 9) (papildomas S6 paveikslas). FASN dažymo lygis buvo mažesnis PCa mėginyje, kai buvo skiriama neoadjuvantinė terapija ( P = 0, 079; 6A ir B paveikslai). FASN dažymo lygis buvo žymiai mažesnis pacientų, kurie buvo gydomi neoadjuvantiniu chemoterapiniu vaistu, skyriuose, nei tų, kuriems nebuvo taikomas priešoperacinis gydymas ( P = 0, 040; 6A ir B paveikslai).

Image

FASN raiška sumažėjo reaguojant į ADT ir chemoterapiją PCa sergantiems pacientams. ( A, B ) Kito audinio mėginio skaidrės, gautos atlikus radikalią prostatektomiją, buvo nudažytos anti-žmogaus FASN specifiniais antikūnais ir įvertintas FASN dažymo lygis. ( A ) FASN išraiškos reprezentaciniai vaizdai. Trys PCa pacientų tipai, kuriems buvo atlikta radikali prostatektomija kartu su neoadjuvantiniu chemoterapiniu gydymu arba be jo, buvo šie: a) priešoperacinis gydymas nebuvo atliekamas, b) neoadjuvantinis ADT ir c) neoadjuvantinis ADT kartu su chemoterapija. ( B ) FASN dažymo lygis buvo žymiai mažesnis PCa, kuriam buvo atlikta neoadjuvantinė ADT, arba chemoterapija prieš radikalią prostatektomiją, palyginti su negydytu PCa.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime HFD, kaip tikėtasi, padidino naviko augimą ir FASN ekspresiją LNCaP ksenografų pelėse. Įdomu tai, kad serume FASN lygis buvo žymiai mažesnis HFD grupėje nei LFD grupėje ir atvirkščiai koreliavo su naviko augimu. Be to, HFD padidino P-AKT, P-ERK ir Ki67 teigiamą lygį ksenografinių navikų srityje. Nors šis tyrimas nepateikė jokių tiesioginių įrodymų, patvirtinančių, kad FASN aktyvavimas yra būtinas HFD sukeltam LNCaP ksenografo naviko augimo padidėjimui, aukštesnis P-AKT, P-ERK, Ki67 pozityvumo ir FASN lygis HFD ksenografijoje gali patvirtinti rezultatus. eksperimentų in vitro ir dėl to FASN svarbos. In vitro eksperimentais mes taip pat parodėme, kad FASN ekspresija sumažėjo PCa ląstelių citoplazmoje, tuo tarpu ji padidėjo atitinkamoje kondicionuotoje terpėje, gydant PI3K ir MAPK inhibitoriais (atitinkamai LY294002 ir inhibitoriais U0126). Šie radiniai rodo, kad HFD daro įtaką PCa progresui per FASN ekspresijos reguliavimą ir tarpląstelinio FASN išsiskyrimo slopinimą, kurie taip pat buvo siejami su padidintu PI3K ir MAPK signalizavimu. Kaip alternatyva, HFD gali suaktyvinti PI3K ir MAPK signalizaciją ir skatinti PCa ląstelių augimą pasitelkdamas kitus mechanizmus, tokiu atveju tarpląstelinis FASN buvo padidintas dėl sustiprinto PI3K ir MAPK signalizacijos. Bet kuriuo atveju, mūsų tyrimo rezultatai rodo, kad tarp FASN ir PI3K bei MAPK signalų yra kritinė stimuliacinė kilpa.

Šiame tyrime HFD grupės ksenografinių navikų ląstelėse FASN raiška buvo didesnė, o P-AMPK raiška mažesnė nei LFD grupės. In vitro tyrimuose gydymas AMPK farmakologiniu aktyvatoriu (AICAR) sumažino FASN ir SREBP-1 ląstelių ekspresijos lygį ir padidino FASN kondicionuotoje terpėje priklausomai nuo dozės. Be to, tiek fermentinis AMPK aktyvumas, tiek baltymo P-AMPK ekspresija buvo žymiai padidintos PCa ląstelėse, apdorotose LY294002 ir U0126. Be to, AMPK slopinimas AMPK siRNR žymiai stimuliavo P-ERK ir P-AKT aktyvaciją. Nors šiame tyrime nebuvo nustatyta jokios tiesioginės sąveikos tarp AMPK ir PI3K ar MAPK signalizacijos, rezultatai rodo, kad yra grįžtamojo ryšio sistema tarp AMPK ir PI3K bei MAPK signalizacijos.

Įrodyta, kad FASN yra sureguliuotas PCa, o jo slopinimas gali būti susijęs su sumažėjusiu ląstelių proliferacija ir padidėjusia apoptozė. 28 Remdamiesi tuo, mes nustatėme, kad PCa ląstelių proliferacija sumažėjo gydant FASN siRNR ir farmakologiniu FASN inhibitoriumi - ceru. Be to, šį poveikį iš dalies išgelbėjo PA, kuris yra pagrindinis FASN tarpininkaujamas produktas. Įdomu tai, kad P-AKT ir P-ERK baltymų ekspresija atrodė nepakankamai sureguliuota, tuo tarpu P-AMPK buvo sureguliuota slopinant FASN, tuo tarpu nustatyta, kad slopinant arba PI3K, arba MAPK, sumažėjo ląstelėje esantis FASN. Tai rodo, kad tarp FASN ir PI3K / MAPK signalizacijos gali būti stimuliuojančio grįžtamojo ryšio kilpa, kuri gali turėti reikšmingą vaidmenį PCa progresijoje. Lygiai taip pat AMPK sistema gali veikti kaip neigiamas FASN / MAPK / PI3K sistemos stimuliuojančio grįžtamojo ryšio ciklo reguliatorius. Be to, stimuliuojančio grįžtamojo ryšio kilpa gali būti glaudžiai susijusi su PCA progresu, susijusiu su HFD, nors dar reikia išsiaiškinti, ar stimuliuojančio grįžtamojo ryšio ciklo slopinimas galėtų užkirsti kelią su HFD susijusiai progresijai PCa ląstelėse.

Ettinger ir kt. 29 parodyta, kad FASN ir SREBP-1, transkripcinis FASN reguliatorius, buvo sureguliuoti progresuojant kastracijai atsparios PCa. Kaip parodėme chirurginiuose žmogaus PCa pavyzdžiuose, FASN ekspresijos lygis buvo susijęs tiek su GS, tiek su pT stadija. Be to, FASN ekspresijos lygis buvo sumažėjęs reaguojant į 3 mėnesių trukmės hormonų atėmimo terapiją arba chemoterapiją. Ši išvada atitiko Ettinger ir kt. Pranešimus. 29, kuris nustatė, kad SREBP-1 baltymų ekspresija buvo sumažinta iki žemiausio lygio po hormonų terapijos 3 mėnesius, bet po to padidėjo. Šios išvados tvirtai rodo, kad FASN gali būti ne tik progresuojantis žymeklis, bet ir reikšmingas PCA terapinis taikinys.

PCa ląstelių tarpląstelinis FASN sekrecija kondicionuojamoje terpėje buvo pagerintas apdorojant LY294002, U0126 ir AICAR. Be to, serumo FASN lygis buvo atvirkščiai koreliuojamas su naviko augimu LNCaP ksenografu pelėms HFD sąlygomis. Be to, buvo pasiūlyta, kad kondicionuojamoje terpėje buvo įvairių formų FASN, įskaitant nepažeistas ir (arba) suskaidytas formas. Nors tikslus tarpląstelinio FASN biologinis vaidmuo nėra aiškus, tyrimais nustatyta, kad FASN yra krūties vėžio ląstelių mitybinėje terpėje ir pacientų, sergančių krūties vėžiu, serume, todėl tarpląstelinis FASN gali būti naudojamas kaip diagnostinis ir prognostinis žymeklis. 20, 21, 22 FASN turi septynis katalizinius domenus, todėl FASN fragmentai tikriausiai neturi jokio aktyvumo, nes jiems trūksta esminių domenų. 30, 31 Taigi, tarpląstelinis, o ne tarpląstelinis FASN gali būti reikšmingas metabolinio pakitimo modifikatorius PCa progresijos metu, tuo tarpu tarpląstelinis FASN lygis gali būti svarbus diagnostinis ir prognostinis žymeklis.

Šiame tyrime mes parodėme, kad HFD padidina tiek FASN, tiek SREBP-1 raišką ir slopina tarpląstelinį FASN išsiskyrimą LNCaP ksenografinių pelių modelyje. Be to, sumažėjo tarpląstelinis FASN ir padidėjo tarpląstelinis FASN išsiskyrimas PCa ląstelėse, slopinant PI3K / MAPK arba AMPK. Dėl FASN slopinimo įvyko PI3K / MAPK žemas reguliavimas ir AMPK aktyvinimas, tuo tarpu AMPK aktyvinimas buvo susijęs su FASN žeminančiu reguliavimu ir PI3K / MAPK inaktyvacija. Rezultatai aiškiai rodo, kad tarp PI3K / MAPK sistemos ir AMPK signalizacijos yra kritinė reguliavimo grįžtamojo ryšio kilpa. Kliniškai atliktas chirurginių mėginių imunohistologinis įvertinimas parodė, kad aukšta FASN ekspresija buvo reikšmingai susijusi su dideliu GS ir pažengusia pT vėžio stadija. Be to, FASN raiška pastebimai sumažėjo PCa reakcijoje į ADT ir chemoterapiją. Todėl FASN ir su juo susiję kinetiniai keliai gali būti geri chemoprevencijos ir PCA gydymo tikslai.

medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūra ir reagentai

Žmogaus PCa LNCaP ląstelės buvo nupirktos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (Manassas, VA, JAV), o PCa C4-2 ląsteles maloniai pateikė dr Leland WK Chung iš Emery universiteto. 32 Ląstelės buvo laikomos RPMI 1640 terpėje arba Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV), turinčios 10% vaisiaus galvijo serumo ir 1% penicilino – streptomicino. PI3K inhibitorius (LY294002), MAPK inhibitorius (U0126) ir AMPK aktyvatorius (AICAR) buvo įsigyti iš „Cell Signaling Technology“ (Bostonas, MA, JAV). PA ir FASN inhibitorius (ceruleninas) buvo įsigyti iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO, JAV). AMPK inhibitoriaus junginys C buvo įsigytas iš EMD Millipore (Billerica, MA, JAV).

Tyrimai su gyvūnais

Akito universiteto Medicinos aukštosios mokyklos Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto institucinė peržiūros taryba patvirtino visas šio tyrimo eksperimentus su gyvūnais. Šešių savaičių amžiaus atletiškos BALB / c-nu / nu pelės ( n = 24) buvo gautos iš Japan SLC (Shizuoka, Japonija) ir buvo maitinamos autoklave CE-2 dieta (Japan SLC); 1 x 106 LNCaP ląstelės buvo užšvirkščiamos po oda su ledu šaltu BD Matrigel (0, 25 ml; BD Bioscience, Bedford, MA, JAV) ir RPMI terpe (0, 25 ml) užpakalinėje galūnėje. Po keturių savaičių po injekcijos pelės, turinčios apčiuopiamą naviką, atsitiktine tvarka buvo priskiriamos HFD arba LFD grupei ( n = 12 kiekvienoje grupėje). HFD sudarė 59, 9% kalorijų iš riebalų, 21, 4% iš angliavandenių ir 18, 6% iš baltymų. LFD sudarė 9, 5% riebalų kalorijų, 67, 7% angliavandenių ir 22, 8% baltymų (papildoma S1 lentelė). Kūno svoris, naviko tūris ir maisto suvartojimas buvo matuojami kas savaitę, o naviko tūris buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: 5 ilgis (cm) × plotis (cm) × ūgis (cm) × 0, 5236. 14 savaitę pelės buvo nužudytos uždusus CO 2, ksenografiniai navikai išpjauti ir pelės serumas atskirtas.

Serumo analizė

Ksenografinių pelių FASN koncentracija serume buvo išmatuota dviem egzemplioriais, naudojant sumuštinių fermentų susieto imunosorbento tyrimo (ELISA) rinkinį (Uscn Life Science Inc., Hiustonas, TX, JAV). Rinkinys buvo specifinis žmogui ELISA, kuris nereaguoja su pelės FASN. Insulino kiekis serume buvo matuojamas naudojant insulino fermento imunologinio tyrimo rinkinį (Morinaga Biologinio mokslo institutas, Tokijas, Japonija), o IGF-1 serumas buvo matuojamas naudojant pelės / žiurkės IGF-1 ELISA rinkinį (R&D Systems, Minneapolis, MN, JAV). Trumpai tariant, 100 μl standartų ir praskiesto serumo pavyzdžiai 2 valandas buvo inkubuojami žmogaus FASN, pelės insulino ar pelės IgG dengtose 96 šulinėlių plokštelėse. Po plovimo buvo atliekamas 1 valandos inkubacijos periodas su antruoju biotiniluotu anti-žmogaus FASN, antivirusiniu insulinu ar anti-pelės IGF-1 antikūnu, o po to 30 minučių inkubacinis periodas su streptavidino peroksidaze (krienų peroksidaze). Po plovimo, kad būtų pašalintas visas nesusietas fermentas, spalva buvo sugeneruota pridedant tetrametilbenzidino ir reakcija buvo sustabdyta sustabdymo tirpalu (2 NH2SO4). FASN, insulino ir IGF-1 serumo koncentracijos buvo apskaičiuotos standartinėmis kreivėmis.

siRNR konstrukcijos

FASN siRNA1 (SI00059752), siRNA2 (SI0059759), siRNA3 (SI3082261) ir luciferazės siRNA (SI03650353) buvo nupirkti iš Qiagen (Valensija, Kalifornija, JAV), o AMPK siRNA1 ir siRNA2 buvo nupirkti iš „Cell Signaling Technology“. Kaip kontrolė buvo naudojama luciferazės siRNR. SiRNR transfekcija buvo atlikta naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Ląstelės buvo kultivuojamos 35 mm lėkštelėje ir apdorotos siRNR (50 nM) sumažintame serume Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje. FASN ir AMPK smūgiai buvo patvirtinti atliekant Western blotting.

Kiekybinė atvirkštinė transkripcija - PGR

Iš kultivuotų ląstelių arba ksenografinių naviko audinių visa RNR buvo ekstrahuota naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen). Buvo naudojami šie atvirkštinės transkripcijos PGR pradmenys: FASN , priekinė 5′-CAG CCA TGG AGG AGG TGG TGA TT-3 ′, atvirkštinė 5′-CGA AGA AGG AGG CAT CAA ACC TA-3 ′; SREBP-1 , į priekį 5′-ACG GCA GCC CCT GTA ACG ACC ACT GTG A-3 ′, atvirkštinė 5′-TGC CAA GAT GGT TCC GCC ACT CAC CAG G-3 ′; AMPK į priekį 5′-GAC AGC CGA GAA GCA GAA AC-3 ′, atvirkštinė 5′-AGG ATG CCT GAA AAG CTT GA-3 ′; ir beta-aktinas , priekinės 5′-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TA-3 ′, atvirkštinės 5′-CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3 ′. Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais.

Ląstelių proliferacijos tyrimas

Iš viso 1 × 104 ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokštelę ir kultivuojamos Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje, kurioje yra 5% galvijo vaisiaus serumo be antibiotikų. Tada ląstelės buvo apdorotos siRNR (50 nM) arba ceruleninu (10 μM) su PA arba be jo (75 μM) ir buvo auginamos nurodytą laiką. Ląstelių proliferacija buvo įvertinta naudojant neradioaktyvų 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromido (MTT) pagrįstą ląstelių proliferacijos tyrimo rinkinį (Roche, Bazelis, Šveicarija). Trumpai tariant, į kiekvieną duobutę buvo įpilta 10 μl MTT (5 mg / ml: 1XPBS; komponentas A) ir inkubuota 4 valandas 37 ° C temperatūroje, po to į kiekvieną duobutę įpilama 100 μl natrio dodecilsulfato (B komponentas) ir inkubuotas 24 valandas 37 ° C temperatūroje. Absorbcija buvo matuojama esant 570 nm, naudojant ELISA skaitytuvą (Bio-Rad, Tokijas, Japonija). Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais.

Vakarų pūtimas

Baltymai buvo ekstrahuojami iš auginamų ląstelių, supernatantų ir ksenografinių navikų, naudojant pilną Lysis-M buferį (Roche). Equal amounts of protein were incubated with anti-FASN (BD Bioscience), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnologies, Dallas, TX, USA), anti-AKT, anti-phospho-AKT (P-AKT, Ser 473 ), anti-ERK1/2, anti-phospho-ERK1/2 (P-ERK1/2, Thr202/Tyr204), anti-AMPK, anti-phospho-AMPK (P-AMPK, Thr172) or anti-beta-actin (Cell Signaling Technology) antibody.

Semiquantified estimation of AMPK activity

We seeded 2 × 10 5 cells in a 35-mm dish and cultured them with LY294002 or U0126 in a dose-dependent manner for 1 h to maximum concentrations of 10 and 1 μ M with or without 10 μ M compound C, respectively. Then, the cells were washed and lysed, and the AMPK enzymatic activity in the lysates was measured by the CycLex AMPK Kinase Assay Kit (MBL, Nagoya, Japan). Briefly, 100 μl of cell lysates were incubated in the 96-well plates coated IRS-1-S789-peptide as AMPK substrate for 30 min at 30 °C. The wells were washed, and incubated with a anti-phospho-mouse IRS-1 S789 monoclonal antibody for 30 min, and followed with horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG at room temperature. After washing, colour was developed by adding tetramethylbenzidine and the reaction was stopped with a stop solution, and the absorbance was measured at 450 nm. The AMPK activity of each sample was measured and compared with that of the untreated control cells. The experiments were performed in triplicate.

Imunohistochemija

Slides containing tissue samples from 164 radical prostatectomy specimens were obtained from Akita University Hospital. The mean age, body mass index and preoperative prostate-specific antigen level of the patients with PCa were 66.4±4.5 years, 22.5±1.5 kg/m 2 and 12.1±6.9 ng/ml, respectively. The Institutional Review Board and Ethics Committee of the Akita University Graduate School of Medicine approved all experiments in this study and we obtained written informed consent for the use of all human sample regarding this study project. The FASN mouse monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnologies) was used as the primary antibody at a dilution of 1:100. Immunohistochemical staining was performed as previously described. 33 Evaluation and scoring were performed with the investigators (MH and HN) blinded to the patients' background and clinicopathological information. The FASN staining intensity in the cancer epithelium was scored on a semiquantitative scale, as follows: 0, negative; 1, low; 2, moderate; and 3, strong. The FASN staining area was also scored semiquantitatively, as follows: 0, negative (no staining); 1, low (50%). The FASN staining score was determined by the FASN intensity and area scores. Sections of formalin-fixed paraffin-embedded xenograft tumours were stained with anti-FASN (1:100; BD Bioscience), anti-AKT (1:100; Cell Signaling Technology), anti-P-AKT (Ser 473, 1:100; Cell Signaling Technology), anti-ERK1/2 (1:100; Cell Signaling Technology), anti-P-ERK1/2 (Thr202/Tyr204, 1:100; Cell Signaling Technology), anti-AMPK (1:100; Cell Signaling Technology) and anti-P-AMPK (Thr172, 1:100; Cell Signaling Technology) antibodies. After overnight incubation, the tissue sections were incubated with horseradish peroxidase-labelled anti-mouse or anti-rabbit antibody (1:5000). The staining intensity in the xenograft cancer cells was scored on a semiquantitative scale as follows: 0, negative; 1, low; 2, moderate and 3, strong. The xenograft tumour sections were probed with anti-Ki67 (1:800; Cell Signaling Technology), and the Ki67 expression levels were evaluated by counting of the Ki67-positive cells in 400–500 tumour cells in the area containing the highest density of Ki67-labelled tumour cells of the slides.

Statistinė analizė

Statistical analyses were performed using Microsoft Excel and SPSS version 12 (IBM Japan, Tokyo, Japan). All values are presented as mean±standard error. Differences between two groups in each experiment were evaluated using unpaired Student's t- tests. The Pearson correlation coefficient ( r ) was calculated to investigate the relationship between the serum FASN concentration and the tumour volumes of xenograft mice. A positive correlation was considered when r was >0.5. Differences were considered statistically significant if the P -value was <0.05.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

„Powerpoint“ failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

    Supplementary Information accompanies this paper on the Oncogenesis website (//www.nature.com/oncsis)