Skirtingos maišelio-1 izoformos turi aiškias funkcijas modifikuodamos chemoterapinės terapijos sukeltą apoptozę krūties vėžio ląstelėse | acta pharmaologica sinica

Skirtingos maišelio-1 izoformos turi aiškias funkcijas modifikuodamos chemoterapinės terapijos sukeltą apoptozę krūties vėžio ląstelėse | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

BAG-1 yra daugiafunkcinis antiapoptozinis genas, turintis keturias izoformas, o skirtingos BAG-1 izoformos turi skirtingas antiapoptozines funkcijas. Šiame tyrime mes transfekavome BAG-1 izoformas į žmogaus krūties vėžio ląstelių linijas Hs578T (ER neigiamas) ir MCF-7 (ER teigiamas), kad ištirtume jų poveikį apoptozei su estrogenais arba be jų.

Metodai:

Sukurti rekombinantiniai ekspresijos vektoriai, turintys atskiras BAG-1 izoformas, buvo naudojami žmogaus krūties vėžio ląstelių linijoms Hs578T (ER neigiamas) ir MCF-7 (ER teigiamas) transfekcijai. Padarius stabilias ląstelių linijas, šioms ląstelių linijoms gydyti su estrogenu ar be jo buvo naudojami įvairūs apoptozę sukeliantys agentai, įskaitant doksorubiciną, docetakselį ir 5-FU, kad būtų patikrintas BAG-1 vaidmuo. Mechanizmas, kuriuo BAG-1 paveikė Bcl-2 funkciją, buvo ištirtas naudojant cikloheksimido chase testą.

Rezultatai:

Remiantis srauto citometrijos analize, BAG-1 p50 ir p46 izoformos žymiai padidino atsparumą apoptozei abiejose ląstelių linijose. BAG-1 p33 ir p29 nesugebėjo apsaugoti transfekuotų ląstelių nuo apoptozės. Ląstelių gyvybingumo tyrimas parodė, kad tik BAG-1 p50, bet ne p46, p33 ar p29 padidino nuo estrogeno priklausančią funkciją ER teigiamų ląstelių linijoje MCF-7. Tik BAG-1 p50 dramatiškai padidino jo antiapoptozinį poveikį esant estrogenui, tuo tarpu estrogenas daro labai mažą poveikį kitų BAG-1 izoformų antiapoptoziniam gebėjimui. Aptikus K-ras, Hsp70, citochromo c , Raf-1, ER-α ir Bcl-2 ekspresiją MCF-7 ląstelėse, naudojant Western blot analizę, tik Bcl-2 baltymo ekspresija reikšmingai padidėjo MCF-7 ląstelės, perkeltos atitinkamai BAG-1 p50 ir p46. Be to, cikloheksimido chase tyrimas parodė, kad Bcl-2 baltymo skilimas buvo pratęstas BAG-1 p50 ir p46 transfekuotose MCF-7 ląstelėse.

Išvada:

Atskirtos BAG-1 izoformos turi skirtingas antiapoptozines funkcijas krūties vėžio ląstelėse ir tai, kad BAG-1 p50 izoforma gali sustiprinti estrogeno vaidmenį ER teigiamame krūties vėžyje.

Įvadas

Krūties vėžys yra labiausiai paplitęs vėžys, paveikiantis moteris. Manoma, kad 2007 m. JAV buvo diagnozuota apie 240 510 naujų krūties vėžio atvejų. Estrogenai vaidina svarbų vaidmenį plėtojant krūties vėžį. Krūties ląstelių augimą - tiek normalų, tiek nenormalų - skatina estrogenas. Estrogeną tarpininkauja estrogeno receptoriai per estrogeno atsako elementus (ERE) ir jis veikia kaip nuo ligando priklausantis transkripcijos faktorius. Hormoninė terapija yra labai efektyvus gydymas nuo krūties vėžio pacientams, kuriems yra hormonų receptoriai, blokuojantys estrogeno galimybes įjungti ir skatinti krūties vėžio ląstelių augimą. Todėl labai svarbu nustatyti veiksnius, darančius įtaką ER funkcijai, ir suprasti vaidmenis, kuriuos estrogenai gali atlikti vystant krūties vėžį.

BAG-1 yra neseniai nustatytas daugiafunkcinis antiapoptozinis baltymas, jungiantis su Bcl-2 1 ir RAF-1 serino / treonino kinaze 2 . BAG-1 bendradarbiauja su Bcl-2, norėdamas slopinti apoptozę, kurią sukelia įvairūs apoptoziniai agentai. Iki šiol buvo pranešta apie keturias BAG-1 baltymo izoformas, kurių kiekviena turi skirtingas antiapoptozines funkcijas skirtingose ​​ląstelių linijose. Pastebėta, kad BAG-1 jungiasi su baltymais iš keturių skirtingų tarpląstelinių skyrių: citozolinės tirozinkinazės HGF / PDGF receptorių domenai išorinėse ląstelių membranose, Bcl-2 ant vidinių ląstelių membranų, citozoliniai Hsps, RAF-1 ir branduolinių hormonų receptoriai. Tačiau šių asociacijų reikšmė reguliuojant apoptozę yra menkai suprantama. BAG-1 ir Bcl-2 sąveika tikriausiai vaidina esminį vaidmenį BAG-1 reguliuojamoje apoptozėje, nors kiti BAG-1 sąveikaujantys baltymai taip pat gali būti svarbūs. Neseniai tyrimai taip pat parodė, kad priverstinė BAG-1 ekspresija gimdos kaklelio vėžio ląstelėse padidina Bcl-2 gamybą, o sumažinus BAG-1 ekspresiją antisense BAG-1, gaunami atvirkščiai 3, 4 . BAG-1 sustiprina Bcl-2 gebėjimą slopinti apoptozę, tačiau tikslus mechanizmas, kuriuo BAG-1 kartu išreiškia Bcl-2, nėra žinomas. BAG-1 gali paveikti Bcl-2 funkciją, moduliuodamas jo išraišką transkripcijos arba posttransliacijos lygiu. Padidėjusi Bcl-2 ekspresija ląstelėse, perkeltose BAG-1, rodo, kad norint užkirsti kelią Bcl-2 baltymo skaidymui, gali prireikti nepažeistos BAG-1 funkcijos. Be to, neseniai buvo atliktas retrospektyvus tyrimas, naudojant 185 parafinu įterptus krūties naviko audinius. Tyrimas parodė, kad dauguma (86, 0%) krūties vėžių per daug išreiškė BAG-1 ir kad dauguma (85, 5%) teigiamų BAG-1 dažymo atvejų buvo citoplazminiai. Įdomu tai, kad statistinė analizė parodė, kad BAG-1 ekspresija buvo koreliuojama su Bcl-2, p53, estrogeno receptorių (ER) ir progesterono receptorių 5 ekspresija. Be to, BAG-1 sąveika su estrogeno receptoriais (ER) stimuliuoja ERa ir ERβ 6 transkripcinį aktyvumą. Gali būti, kad BAG-1 gali paveikti krūties vėžio vystymąsi moduliuodamas ER funkciją, todėl labai svarbu atkreipti dėmesį į BAG-1 funkciją krūties vėžio estrogeno receptoriuose.

Šiame tyrime mes panaudojome sukonstruotus rekombinantinius ekspresijos vektorius, turinčius atskiras BAG-1 izoformas, kad transfekuotų žmogaus krūties vėžio ląstelių linijas Hs578T (ER neigiamas) ir MCF-7 (ER teigiamas). Padarę stabilias ląstelių linijas, mes panaudojome įvairius apoptozę sukeliančius agentus, įskaitant doksorubiciną, docetakselį ir 5-FU, kad galėtume patikrinti BAG-1 vaidmenį šioms ląstelių linijoms esant arba be estrogeno. Be to, mes ištyrėme mechanizmą, kuriuo BAG-1 paveikė Bcl-2 funkciją, naudodamas cikloheksimido chase testą.

medžiagos ir metodai

Rekombinantinių plazmidžių, turinčių keturias BAG-1 izoformas, konstravimas

Buvo aprašytos visos žmogaus BAG-1 izoformų struktūros, ir plazmidės, turinčios BAG-1 p50, p46, p33 ir p29, buvo sukonstruotos, kaip aprašyta anksčiau 3, 7 .

Ląstelių kultūra ir transfekcija

Žmogaus krūties vėžio ląstelių linijos MCF-7 ir Hs578T buvo įsigytos iš „Cell Line Service“. MCF-7 ląstelės buvo auginamos minimalioje būtinoje terpėje (MEM, Gibco), o Hs578T ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM, Gibco), papildytoje penicilinu / streptomicinu (180 TV / ml) 10% ( v / v ). termiškai inaktyvuotas vaisiaus veršelio serumas (FCS) ir 1% (tūrio / tūrio) L- glutaminas. Jie buvo inkubuojami drėgnoje atmosferoje su 5% CO 2 ore, esant 37 ° C. DNR transfekcija buvo atlikta naudojant Effectene Transfection Kit (Qiagen) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, ląstelės (5x104 ląstelių / duobutėje) buvo pasėtos į 6 šulinėlių plokšteles ir inkubuotos 37 ° C temperatūroje 5% CO 2 per naktį. Kitą dieną 0, 5 μg plazmidės DNR buvo sumaišyta su Effectene Transfection reagentu ir pridėta prie ląstelių monosluoksnio. Tada ląstelės buvo inkubuojamos dar 48 valandas. Stabilūs transfektantai buvo atrinkti selektyvioje terpėje, kurioje yra 0, 6 mg / ml G418 (Gibco BRL), ir buvo palaikomi toje pačioje terpėje naudojimui.

Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Ląstelės buvo sėjamos (5x10 3 ląstelės / duobutėje) į 96 šulinėlių plokšteles ir inkubuojamos 24 valandas, po to ląstelės buvo apdorojamos 10 pmol / L 17-β estradioliu 24 valandas. Ląstelių gyvybingumas buvo apibrėžtas kaip BAG-1 skirtingai izoforminiu būdu transfekuotų ląstelių padidėjimas, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, esant 17-β estradioliui, naudojant CellTiter 96 ® vandeninio vieno tirpalo reagento testą. Kaip standartas buvo naudojamas kontrolinis transfektantas. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas trimis egzemplioriais ir pakartotas mažiausiai tris kartus.

Norėdami sumažinti endogeninį į estrogenus panašų aktyvumą, buvo naudojama fenolio neturinti DMEM terpė (Gibco BRL.), Papildyta 5% dekstranu dengtos medžio anglies nuimtu FBS (Hyclone, Logan, UT, JAV) (estrogeno neturinti terpė).

Apoptozinių ląstelių srauto citometrija

Norint nustatyti atskirų BAG-1 baltymo izoformų poveikį apoptozei, 1x105 ląstelės / duobutėje buvo sėjamos į 6 duobučių plokšteles ir inkubuojamos 24 val., Tada ląstelės buvo apdorotos doksorubicinu (0, 5 μmol / L). docetakselio (0, 1 μmol / L) ir 5-FU (150 μmol / L) 48 valandas. Ląstelės buvo nudažytos naudojant aneksino V-FITC apoptozės analizės rinkinį (PharMingen) ir patektos į FACStar Plus srauto citometrą (Becton Dickinson), kad būtų galima atskirti aneksino V-FITC dažytas apoptozines ląsteles. Duomenys buvo analizuojami naudojant WIMDI 2.8 programinę įrangą. Apoptozinės ląstelės (M1) buvo apskaičiuotos kaip apoptotinių ląstelių procentas iš apdorotų ląstelių populiacijos, atėmus neapdorotų kontrolinių ląstelių populiacijos procentą.

Western blot analizė

Ląstelių baltymų ekstrahavimas ir Western blot analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau 3 . Trumpai tariant, 20 μg baltymų buvo suskaidyti naudojant 10–12% SDS-PAGE ir pernešti į Hybond Enhanced Chemiluminescence (ECL) nitroceliuliozės membranas puslaidininkio sąlygomis. Imunodetection buvo atliktas naudojant ECL sistemą (Amersham Pharmacia Biotech). Monokloniniai antikūnai prieš K-ras, Hsp70, citochromą c , Raf-1, ER-α, Bcl-2, BAG-1 ir β-aktiną buvo įsigyti iš „Santa Cruz“.

Cikloheksimido chase tyrimas

Norint nustatyti Bcl-2 baltymo stabilumo pokyčius BAG-1 transfekuotose ląstelių linijose, buvo atliktas cikloheksimido chase tyrimas. Trumpai tariant, 100 μg / ml cikloheksimido (Biomol, Plymouth Meeting, PA) buvo įpilta į maždaug 60% pusiau jungimosi ląsteles 100 mm plokštelėse 24 valandas. Įvairiais laiko momentais buvo surinktas vienodas ląstelių skaičius. Bcl-2 kiekis kiekvienu laiko momentu buvo analizuojamas atliekant Western blot analizę su anti-Bcl-2 antikūnu.

Statistinė analizė

Ląstelių srauto citometrijai atlikti kiekvienas eksperimentas buvo padarytas trimis egzemplioriais ir pakartotas tris kartus. Ląstelių gyvybingumo tyrimui kiekvienas eksperimentas buvo atliktas trimis egzemplioriais ir pakartotas mažiausiai tris kartus. Duomenys buvo analizuojami naudojant Studento t- testą. Statistiškai reikšmingu buvo laikomas P ≤0, 05.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Atskirų BAG-1 izoformų ekspresija MCF-7 ir Hs578T ląstelėse

BAG-1 turi keturias izoformas (p50, p46, p33 ir p29), turinčias skirtingus N-galus 8 . Didžiausioje izoformoje, p50, yra branduolio lokalizacijos seka N-gale ir ji yra branduolyje, tuo tarpu izoforma p46 turi tik nedidelę dalį branduolio lokalizacijos sekos ir yra randama tiek branduolyje, tiek citoplazmoje. Gausiausia izoforma yra p33, o mažiausia izoforma yra p29, abu iš jų neturi jokios branduolio lokalizacijos sekos ir yra daugiausia citoplazmoje. Kadangi keturios izoformos yra generuojamos iš vieno mRNR 7 transkripto, manoma, kad transliacijos reguliavimas vaidina pagrindinį vaidmenį kontroliuojant jų išraišką. Gimtoji BAG-1 mRNR turi keturis baltymų transliacijos pradžios kodonus, o kiekvienam pradiniam kodonui trūksta tobulos Kozak 7 sekos. Įrodyta, kad keturių BAG-1 izoformų sintezė inicijuojama alternatyviu mechanizmu 7 . Kaip aprašyta 3 anksčiau, mes sukūrėme rekombinantines plazmides, turinčias atskirą BAG-1 cDNR, su kiekvienu pradiniu kodonu, apsuptu tobulos Kozak sekos. Mes panaudojome žmogaus krūties vėžio ląstelių linijas Hs578T (ER neigiamas) ir MCF-7 (ER teigiamas), kurios abu išreiškia žemą BAG-1 kiekį. Po stabilios transfekcijos ir kolonijų atrankos, ląsteliniai baltymai buvo ekstrahuojami, siekiant patikrinti atskirų BAG-1 izoformų ekspresiją transfektantuose Western blot būdu. Transfekcija BAG-1 izoformomis p50, p46, p33, p29 sukuria norimas izoformas, nes egzistuoja tobula Kozako seka (1 pav.).

Image

BAG-1 baltymų viso ilgio ir delecijos mutantų ekspresija po transfekcijos MCF-7 ir Hs578T. ląstelės Visos BAG-1 baltymo struktūros buvo aprašytos anksčiau. Vektorių kontrolinė plazmidė pCR3.1 ir plazmidės, turinčios viso ilgio BAG-1, p50K, p46K, p33K ir p29K cDNR, buvo stabiliai perkeltos į MCF-7 ir Hs578T ląsteles. MCF-7 ir Hs578T ląstelės, ekspresuojančios skirtingą cDNR, buvo lizuotos baltymų lizės buferiu, o 20 μg baltymų buvo išanalizuotos Western blot būdu su 12% SDS-PAGE. -: pirminės ląstelės, c: kontrolinės ląstelės.

Visas dydis

BAG-1 p50 ir p46, bet ne p33 ir p29, slopina apoptozę krūties vėžio ląstelių linijose

BAG-1 apsaugo ląsteles nuo įvairių apoptozinių stimulų 9, 10 . Pranešama, kad skirtingos BAG-1 izoformos daro skirtingą poveikį šilumos šoko baltymo 11 funkcijai ir turi skirtingą transkripcijos aktyvumą 12, 13 . Tolesni tyrimai parodė, kad skirtingos BAG-1 izoformos turi skirtingas antiapoptozines funkcijas žmogaus gimdos kaklelio karcinomos ląstelėse. BAG-1 p50 ir p46 izoformos sustiprino atsparumą apoptozei transfekuotose ląstelėse, tuo tarpu BAG-1 p29 nesugebėjo apsaugoti transfekuotų ląstelių nuo 3 apoptozės. Vis dar neaišku, ar vien BAG-1 ekspresijos pakanka, kad būtų slopinama apoptozė, ar jo antiapoptozinei funkcijai reikia Bcl-2, taip pat, ar skirtingų BAG-1 izoformų funkcijos skirtinguose audiniuose yra skirtingi.

Norint ištirti BAG-1 izoformų vaidmenį antiapopotiniame aktyvume krūties vėžio ląstelių linijose, BAG-1 transfekuotos Hs578T ir MCF-7 ląstelės buvo gydomos įvairiais apoptozę sukeliančiais agentais, įskaitant doksorubiciną (0, 5 μmol / L)., docetakselio (0, 1 μmol / L) ir 5-FU (150 μmol / L). Po 48 valandų inkubacijos ląstelių apoptozė buvo įvertinta naudojant aneksino-V FITC ląstelių srauto citometrijos metodu. FITC teigiamos apoptozinės ląstelės buvo išreikštos procentine apoptozinių ląstelių procentine dalimi nuo viso apdorotų ląstelių skaičiaus, atėmus neapdorotų ląstelių apoptozinių ląstelių procentą, kaip parodyta 2 paveiksle. Palyginti su NEO perkeltomis kontrolinėmis ląstelėmis, MCF- 7 ląstelės, transfekuotos BAG-1 p50 ir p46, parodė reikšmingą atsparumą apoptozei, kai buvo gydomos doksorubicinu (32, 77%, 28, 98%, palyginti su 58, 76%, P <0, 05), docetakseliu (31, 68%, 32, 77%, palyginti su 56, 38%, P <0, 05) ir 5-FU (47, 37%, 40, 47% vs 63%, P <0, 05). Hs578T ląstelės, perkeltos BAG-1 p50 ir p46, taip pat parodė panašų padidėjusį atsparumą apoptozei, kai buvo gydomos doksorubicinu (17, 7%, 14, 8% vs 38, 98%, P <0, 05), docetakseliu (18, 7%, 23, 48% vs 41, 68%, P < 0, 05) ir 5-FU (26, 08%, 23% vs 39, 77%, P <0, 05). Abi ląstelių linijos, transfekuotos BAG-1 p33 ir p29, nepasižymėjo reikšmingu jų jautrumo apoptozės pokyčiui, palyginus su NEO transfekuotomis kontrolinėmis ląstelėmis, apdorotomis doksorubicinu (MCF-7: 50, 68%, 56, 74% vs 58, 76%, P > 0, 05; Hs578T: 31, 1%, 34, 8% vs 38, 98%, P > 0, 05), docetakselis (MCT-7: 51, 76%, 54, 76% vs 56, 38%, P > 0, 05; Hs578T: 30, 01%, 39, 8% vs 41, 68%, P > 0, 05). ir 5-FU (MCF-7: 57, 64%, 54, 77% vs 63%, P > 0, 05; Hs578T: 38, 8%, 36, 8% vs 39, 77%, P > 0, 05). Šie rezultatai rodo, kad skirtingos BAG-1 izoformos turi skirtingas antiapoptozines funkcijas krūties vėžio ląstelių linijose MCF-7 ir Hs578T. BAG-1 p50 ir p46 pasižymėjo reikšmingu anti-apoptoziniu aktyvumu ( P <0, 05), tuo tarpu BAG-1 p33 ir p29 turėjo mažai įtakos. Šie rezultatai buvo labai panašūs į mūsų ankstesnių tyrimų su žmogaus gimdos kaklelio vėžiu 3 ląstelių linijas.

Image

BAG-1 izoformos transfekcijos poveikis MCF-7 (A) ir Hs578T (B) ląstelių mirčiai, kurią sukelia chemoterapiniai vaistai. Ląstelės (5 × 10 3 ląstelės / duobutėje) buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles ir inkubuojamos 48 valandas, tada ląstelės buvo apdorotos skirtingais vaistais (0, 5 μmol / L doksorubicino, 0, 1 μmol / L docetakselio, 150 μmol / L 5). -FU) 48 h. Ląstelių apoptozė rodo apoptozinių ląstelių procentinę dalį apdorotų ląstelių populiacijoje, atėmus neapdorotų kontrolinių ląstelių populiacijos apoptozinių ląstelių procentą, nustatytą naudojant Annexin V-FITC apoptozės analizės rinkinį (PharMingen) ir FACStar plius srauto citometrą (Becton Dickinson). rūšiuoti aneksino V-FITC dažytas apoptozines ląsteles. n = 3. Vidurkis ± SD. b P <0, 05 palyginti su NEO kontrole.

Visas dydis

BAG-1 p50, bet ne p46, p33 ir p29, padidina MCF-7 ląstelių gyvybingumą esant estrogenams

Estrogenai vaidina svarbų vaidmenį plėtojant krūties vėžį ir skatina krūties vėžio ląstelių dauginimąsi bei išgyvenimą. Estrogenų veikimą skatina estrogeno receptoriai (ER). Pagalbiniai hormonų terapijos metodai, tokie kaip tamoksifenas, slopina estrogenų poveikį ir sumažina mirties ir pasikartojimo tikimybę tiems, kuriems vėžys yra teigiamas dėl estrogeno receptorių. BAG-1 yra daugiafunkcis anti-apoptotinis baltymas, o mūsų ankstesni tyrimai parodė, kad BAG-1 raiška buvo koreliuojama su ER krūties vėžio audiniuose 5 . Norėdami patikrinti estrogeno vaidmenį su BAG-1 izoformomis, į MCF-7 ir Hs578T ląstelių linijas, transfekuotas skirtingomis BAG-1 izoformomis, mes pridėjome 10 pmol / L 17-β estradiolio, o po 24 valandų atlikome ląstelių gyvybingumo testus. Rezultatai, parodyti 2 paveiksle, rodo, kad esant estrogenui, ląstelių gyvybingumas MCF-7 ląstelėse, perkeltose BAG-1 p50 (3, 18 karto), bet ne su p46 (1, 614 karto), p33 (1, 085 karto) ir p29 (0, 9985 karto), buvo žymiai padidintas, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, tuo tarpu Hs578T ląstelėse, transfekuotose skirtingomis BAG-1 izoformomis, reikšmingų pokyčių nebuvo (3 paveikslas). Šis rezultatas parodė, kad tik BAG-1 p50 sustiprino nuo estrogeno priklausomą signalo kelią ir sustiprino estrogeno funkciją ER teigiamų ląstelių linijoje MCF-7. Be to, norint patikrinti estrogeno vaidmenį stimuliuojant, MCF-7 ląstelės, perkeltos skirtingomis BAG-1 izoformomis, buvo gydomos chemoterapiniais preparatais, esant 10 pmol / L 17-β estradiolio. Kaip parodyta 4 paveiksle, palyginus su NEO transfekuotomis kontrolinėmis ląstelėmis, BAG-1 p50 transfekuotos MCF-7 ląstelės, gydydamos doksorubicinu, pasižymėjo stipriausiu atsparumu apoptozei esant estrogenui (4, 77%, palyginti su 49, 9%, P <0, 05). ), docetakselio (9, 68%, palyginti su 51, 67%, P <0, 05) ir 5-FU (28, 76%, palyginti su 54, 76%, P <0, 05), kurie parodė, kad jo vaidmuo atsparumui apoptozei esant estrogenui buvo daug stipresnis nei estrogeno. Palyginti su NEO transfekuotomis kontrolinėmis ląstelėmis, ląstelės, perkeltos BAG-1 p46, žymiai padidino atsparumą apoptozei esant estrogenams, kai buvo gydomos doksorubicinu (22, 76% vs 49, 9%, P <0, 05), docetakselio (29, 76% vs 51, 67%)., P <0, 05) ir 5-FU 34, 77%, palyginti su 54, 76%, P <0, 05), tačiau BAG-1 vaidmuo estrogeno atžvilgiu buvo labai panašus kaip ir be estrogeno. MCF-7 ląstelės, transfekuotos BAG-1 p33 ir p29, net esant estrogenams, neparodė jokio jų jautrumo apoptozės pokyčiams, palyginti su NEO transfekuotomis kontrolinėmis ląstelėmis, kai buvo gydomos doksorubicinu (46, 74%, 50, 74% vs 49, 9%)., P <0, 05), docetakselio (51, 76%, 52, 76% vs 51, 67%, P <0, 05) ir 5-FU (53, 76%, 54, 76% vs 54, 76%, P <0, 05). Šie rezultatai rodo, kad tik BAG-1 p50 gali sustiprinti estrogeno vaidmenį ER teigiamų ląstelių linijoje MCF-7, ir yra panašūs į kitų pranešimų išvadas, kad BAG-1 p50 gali sąveikauti su ER ir padidinti nuo estrogeno priklausomą transkripciją 6. .

Image

BAG-1 izoformos transfekcijos poveikis MCF-7 (A) ir Hs578T (B) ląstelių augimui, kurį sukelia 17-β estradiolis. Ląstelės (5x103 ląstelių / duobutėje) buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles ir inkubuojamos 24 valandas, po to ląstelės buvo apdorojamos 10 pmol / L 17-β estradioliu 24 valandas. Ląstelių gyvybingumas parodo, kad BAG-1 atskiros izoformos transfekuotos ląstelės padidėja kelis kartus, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, esant 17-β estradioliui, naudojant CellTiter 96 ® vandeninio vieno tirpalo reagento testą. Kontrolinis transfektantas buvo naudojamas kaip standartas. n = 3. Vidurkis ± SD. b P <0, 05 palyginti su NEO kontrole.

Visas dydis

Image

BAG-1 izoformos transfekcijos poveikis MCF-7 ląstelių mirčiai, kurią sukelia chemoterapiniai vaistai, esant 10 pmol / L 17-β estradiolio. Ląstelės (5 × 10 3 ląstelės / duobutėje) buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles ir inkubuojamos 24 valandas, tada ląstelės buvo apdorojamos skirtingais vaistais (0, 5 μmol / L doksorubicino, 0, 1 μmol / L docetakselio, 150 μmol / L 5). -FU) 48 h. n = 3. Vidurkis ± SD. b P <0, 05 palyginti su NEO kontrole.

Visas dydis

Skirtinga antiapopotinė BAG-1 izoformų funkcija gali kilti dėl jų struktūrinių skirtumų. Visos keturios BAG-1 izoformos turi bendrą C-galą, kuriame yra BAG domenas 14, kuris sąveikauja su Hsp70 15, 16, Bcl-2 17 ir hepatocitų augimo faktoriaus (HGF) receptoriais 9 . BAG-1 p50 turi visą branduolio lokalizacijos seką, tuo tarpu BAG-1 p46 turi tik dalinę branduolio lokalizacijos seką (NLS), paaiškinančią bendrą ir retkarčiais atitinkamai BAG-1 p50 ir BAG-1 p46 branduolio ekspresiją. BAG-1 p46 gaminamas daugiausia kaip citozolinis baltymas, o BAG-1 p33 ir BAG-1 p29 visada gaminamas citozolyje 7 . Tikslus BAG-1 dalyvavimo antiapoptoziniame darbe mechanizmas nežinomas. Kaip aprašyta ankstesniuose pranešimuose, skirtingų BAG-1 izoformų diferencinė anti-apoptotinė funkcija rodo, kad baltymo N-galas yra svarbus jo funkcijai. Ankstesnėse ataskaitose nurodoma, kad N-galas buvo svarbus BAG-1 prisijungimui prie 18, 19 hormonų receptorių, transkripcijos faktorių, tokių kaip c-Fos 20, ir tam tikrų DNR promotorių, tokių kaip CMV promotorius 21 . BAG-1 N-gale yra heksapeptido pakartojimo sritis. BAG-1 p50 ir p46 dalijasi visa seka, BAG-1 p33 dalijasi dalinė seka, o p29 visai nėra šios srities 22 . Nors šio heksapeptido pakartojimo regiono funkcija nėra aiški, kyla pagunda spėlioti, kad šis heksapeptido pakartojimo regionas yra susijęs su anti-apoptotine BAG-1 funkcija, nes BAG-1 p50 ir p46 su visu heksapeptido pakartojimu turi stiprų anti- apoptozinė funkcija. Dėl šio regiono ištrynimo baltymai tampa labai nestabilūs 22 . Padidėjęs antiapopotinis BAG-1 p50 gebėjimas, kai ER teigiamose ląstelėse yra estrogeno, gali būti susijęs su BAG-1 p50 ir ER sąveika, atsižvelgiant į tai, kad BAG-1 p50 yra vienintelė izoforma, tiesiogiai sąveikaujanti su ER ir sustiprina nuo estrogeno priklausomą transkripciją 6 .

Padidėjusi Bcl-2 ekspresija MCF-7 ir Hs578T ląstelėse, transfekuotose BAG-1 p50 ir p46, bet ne p33 ir p29

Norėdami ištirti, kodėl dėl per daug ekspresuotų BAG-1 izofermentų skirtingas atsparumas apoptozei, kurį transfekuotose ląstelėse sukelia skirtingi chemoterapiniai vaistai, ištyrėme apoptozės reguliuojančių baltymų-K-ras, Hsp70, citochromo c , Raf-1 grupės raišką., ER-α ir Bcl-2 - MCF-7 ląstelėse, stabiliai transfekuotose BAG-1 izoformomis, naudojant Western blot analizę. Palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, perkeltomis NEO, transfekcija BAG-1 p50 ir p46, bet ne p33 ir p29, padidino Bcl-2 ekspresiją. Visų kitų apoptotinių baltymų, įskaitant K- ras, Hsp70, citochromo c , Raf-1 ir ER-α, ekspresija išliko reikšmingų pokyčių (5 pav.). Kiekvieno eksperimento metu β-aktinas buvo naudojamas kaip vidinė baltymų kiekio kontrolė. Ankstesni mūsų tyrimai parodė, kad padidėjusi Bcl-2 ekspresija greičiausiai atsirado dėl sumažėjusio Bcl-2 baltymo skilimo, o ne dėl padidėjusios mRNR transkripcijos, nes Bcl-2 mRNR iš esmės nepakito po transfekcijos su natūraliu BAG-1 ir BAG- 1 izoformos, palyginti su NEO transfekuotomis kontrolinėmis ląstelėmis atliekant Northern blotting 3 . Po to, norint ištirti BAG-1 izoformų poveikį Bcl-2 baltymo transliacijos lygiui ir jo baltymo stabilumui, buvo naudojamas impulsų tyrimas. Kaip parodyta 6A – B paveiksle, Bcl-2 baltymo stabilumas buvo padidintas BAG-1 aukštos raiškos ląstelių linijoje MDA-MB231, bet ne BAG-1 žemos ekspresijos ląstelių linijoje MCF-7. Be to, padidėjo Bcl-2 stabilumas MCF-7 ląstelėse, perkeltose BAG-1 p50 ir p46, bet ne p33, p29 ir NEO kontrolėje. Rezultatai parodė, kad BAG-1 p50 ir p46 izoformos paveikė Bcl-2 baltymo stabilumą ir padidino Bcl-2 baltymo lygį (6C pav.).

Image

Apoptozės ir su vaistais susietų baltymų ekspresija MCF-7 ląstelėse, stabiliai transfekuotose vektoriaus kontrolės plazmidėje pCR3.1 (C) ir plazmidėse, turinčiose atitinkamas keturias BAG-1 izoformų cDNR. Western blot analizė buvo atlikta naudojant 20 μg baltymų iš skirtingų ląstelių. β-aktinas buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė.

Visas dydis

Image

(A) BAG-1 ekspresija MDA-MB231 ir MCF-7. (B) Bcl-2 baltymo stabilumas atliekant cikloheksimido sekimo testą MDA-MB231 ir MCF-7 ląstelėse. Vienodas ląstelių skaičius buvo analizuotas atliekant Western blot analizę. (C) Bcl-2 baltymo stabilumas atliekant cikloheksimido chase testą MCF-7 ląstelėse, transfekuotose skirtingomis BAG-1 izoformomis. Vienodas ląstelių skaičius buvo analizuotas atliekant Western blot analizę.

Visas dydis

Išskyrus Bcl-2, BAG-1 transfekcija nekeičia su juo susijusių baltymų, tokių kaip Hsp70, K-ras, citochromo c , ER-α ir Raf-1, ekspresijos. Bcl-2 baltymo ekspresija padidėjo ląstelėse, perkeltose BAG-1 p50 ir p46, bet ne p33 ir p29 ar NEO, o tai atitinka mūsų ankstesnius duomenis. Kadangi mūsų ankstesnis tyrimas parodė, kad Bcl-2 mRNR išraiška nepasikeitė po transfekcijos su BAG-1, mes pasiūlėme, kad Bcl-2 baltymo skaidymas gali sumažinti priverstinę tam tikrų BAG-1 izoformų ekspresiją. Šiame tyrime patvirtinta, kad impulsų tyrimu padidėjo Bcl-2 baltymo stabilumas MCF-7 ląstelėse, perkeltose BAG-1 p50 ir p46, bet ne p33, p29 ir Neo kontrolėje. Visos BAG-1 izoformos turi bendrą C-galą, kuris jungiasi su Hsp, Bcl-2 ir proteasoma. Padidėjusi Bcl-2 ekspresija ląstelėse, perkeltose BAG-1 p50 ir p46, bet ne BAG-1 p33 ir p29, rodo, kad nepažeistos BAG-1 funkcijos reikia norint slopinti Bcl-2 baltymo skilimą, kurį sukelia BAG-1 . Buvo pranešta, kad BAG-1 bendradarbiauja su Bcl-2 slopindamas 1 apoptozę.

Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad skirtingos BAG-1 izoformos turi skirtingas antiapoptozines funkcijas krūties vėžio ląstelių linijose ir kad BAG-1 p50 ir p46 izoformos padidina atsparumą apoptozei. BAG-1 p50 yra vienintelė izoforma, galinti sustiprinti nuo estrogeno priklausomą ER funkciją. Antiapoptotinė BAG-1 izoformų funkcija gali būti koreliuojama su padidėjusia Bcl-2 ekspresija, kurią gali sąlygoti sumažėjęs Bcl-2 baltymo skilimas.

Autoriaus indėlis

Hong-yu LIU atliko tyrimus, analizavo duomenis ir rašė darbą; Zhuo-min WANG atliko tyrimus, išanalizavo duomenis; Yun BAI, Min WANG, Ying LI ir Sen WEI atliko tyrimus; Qing-hua ZHOU sukūrė tyrimą, išanalizavo duomenis ir parašė darbą; Jun CHEN suprojektavo tyrimą, atliko tyrimą, išanalizavo duomenis ir parašė rankraštį.