Stafilokoko aureus ir pseudomonas aeruginosa diferencinis pritraukimas ir atstūmimas ant molekuliškai lygaus titano plėvelių | mokslinės ataskaitos

Stafilokoko aureus ir pseudomonas aeruginosa diferencinis pritraukimas ir atstūmimas ant molekuliškai lygaus titano plėvelių | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biofizika
  • Ląstelių biologija
  • Ląstelių mikrobiologija
  • Nanobiotechnologijos

Anotacija

Magnetrono dulkinimo metodai buvo naudojami paruošiant molekuliškai lygiąsias titano plonas plėveles, kurių vidutinis šiurkštumas buvo nuo 0, 18 iki 0, 52 nm, esant 5 μm × 5 μm AFM skenavimo sritims. Buvo nustatyta, kad plėvelės, kurių vidutinis šiurkštumas yra 0, 52 nm ar mažesnis, riboja P. aeruginosa ląstelių prisitvirtinimą, o paviršiuje lieka mažiau kaip 0, 5% visų turimų ląstelių. S. aureus ląstelių prisitvirtinimas taip pat buvo apribotas plėvelėse, kurių vidutinis paviršiaus šiurkštumas buvo 0, 52 nm, tačiau jos pasižymėjo puikiu polinkiu prisirišti prie nano lygesnių 0, 18 nm vidutinio paviršiaus šiurkštumo plėvelių, kurių tvirtinimo tankis buvo beveik dvigubai didesnis kaip kad pastebėta ant nano grubesnio filmo. Pririšimo elgsenos skirtumą galima priskirti dėl lazdelės formos P. aeruginosa morfologijos skirtumų, palyginti su sferinėmis S. aureus ląstelėmis.

Įvadas

Nuo tada, kai atsirado mikro / nanotechnologija, bakterijų sąveika su medžiagų paviršiais buvo daug intensyvių tyrimų programų, 1, 2, 3, 4, 5, dėmesio centre . Paaiškėjo, kad paviršinė mikro / nano-topografija vaidina lemiamą reikšmę bakterijų prisirišimui. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 . Bakterijų reakcijai į paviršius, turinčius skirtingas topografijas, ištirti yra daugybė skirtingų metodų, įskaitant tuos, kurie yra pagaminti iš įprastų raštų arba natūralių netaisyklingų medžiagų topografijų. 1, 7, 8, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 . Pavyzdžiui, buvo nustatyta, kad P. aeruginosa ir S. aureus ląstelės prisijungia prie paviršių, turinčių reguliariai išdėstytas 1 μm ir 2 μm duobes, bet ne prie paviršių, turinčių netaisyklingai išdėstytas 0, 2 μm ir 0, 5 μm duobes 16 dydžio. Díaz ir kt. pranešė, kad E. coli ląstelės sugebėjo sėkmingai prisitvirtinti ir sulyginti ant paviršių, kuriuose yra 1, 3 µm pločio ir 120 nm gylio mikrogranvos, tačiau nesugebėjo pritvirtinti ir sulyginti ant paviršių, kurių griovelio aukštis 50 nm ir periodas 1, 6 µm 1 . „Mitik-Dineva“ ir kt. nustatė, kad išgraviruotų optinių skaidulų paviršiuje esančios 2, 5 μm skersmens duobės riboja bakterijų prisirišimo laipsnį, palyginti su tuo, kuris gaunamas ant nemodifikuotų optinio pluošto paviršių, kuriuose yra netaisyklingos topografijos, kurių vidutinis aukštis yra 181 nm 13 . Keli tyrimai parodė, kad bakterijų prisirišimą keičia reguliarios submikronų ir mikronų masto paviršiaus topografijos, kai šių topografijų matmenys yra didesni nei maždaug 100 nm. 7, 8, 14, 16 . Rowan ir kt. pagaminti polietilenglikolio paviršių įprastų mikrometrų mastelio rinkiniai, kurių dydis 83 μm ir 12 μm, ir sugebėjo lokalizuoti E. coli ląsteles ant šių paviršių 7 . Rozhok ir kt. pagamintos 3 µm skersmens 0, 5 µm gylio skylės, kuriose sėkmingai lokalizuotos pavienės E. coli ląstelės 8 . Be to, keliuose tyrimuose buvo naudojama ne tik paviršiaus mikronų masto topografija, bet ir substrato paviršiaus chemija, kad būtų galima kontroliuoti bakterijų prisirišimą. Pavyzdžiui, Rowan ir kt. ir Rozhok et al. naudojami poli (etilenglikolio) ir poli-L-lizino substratai (atitinkamai), siekiant sustiprinti bakterijų prisirišimo laipsnį 7, 8 . Stiklo ir metalo oksido substratų (kurių vidutinis šiurkštumas Ra yra nuo 4, 1 iki 17, 6 nm) paviršiaus nanotopografijos įtaką bakterijų prisirišimui pranešė Li ir Logan 20 . Buvo nustatyta, kad tiek paviršiaus chemija, tiek topografija turėjo įtakos bakterijų prisirišimo laipsniui, tačiau nebuvo padaryta išvadų dėl santykinio šių paviršiaus savybių įtakos bakterijų prisirišimo laipsniui. Bakterijų sąveika su įvairių paviršiaus topografijų metaliniais paviršiais per pastaruosius kelis dešimtmečius taip pat sulaukė rimto dėmesio 16, 17, 18, 19, 21 . Tačiau nėra bendro sutarimo, ar padidėjęs paviršiaus šiurkštumas gali būti susijęs tiek teigiamai, tiek neigiamai su prisirišimo prie bakterijų laipsniu, dažnai dėl nenuoseklių rezultatų ir sistemingų tyrimų trūkumo 16, 17, 18, 19, 21 . Pavyzdžiui, vienas tyrimas pranešė, kad S. epidermidis ląstelės nesugeba efektyviai prisitvirtinti prie titano paviršių, kurių vidutinis paviršiaus šiurkštumas yra nuo 1, 25 μm iki 0, 43 μm 17 . Kitas tyrimas pranešė, kad ant nerūdijančio plieno paviršių, kurių vidutinis šiurkštumas svyruoja nuo 1, 04 µm iki 0, 01 µm 18, reikšmingų bakterijų prisijungimo nerasta. Vėlesnis tyrimas vis dėlto pranešė, kad ant metalinių paviršių, kurių vidutinis nelygumas yra 0, 6 μm, buvo pastebėtas tik minimalus bakterijų prisirišimas, tuo tarpu paviršiai, lygesni arba šiurkštesni nei šie, leido daugiau bakterijų ląstelių prisijungti 19 . Whitehead ir kt. tyrė bakterijų prisirišimą prie titano dioksido paviršių, turinčių skirtingą nanoskalės šiurkštumą 21 . Šis darbas pabrėžė, kad S. aureus ląstelės sugebėjo prisitvirtinti daugiau prie paviršių, kurių vidutinis šiurkštumas buvo 8, 7 nm, nei stebėtų paviršiai, kurių vidutinis šiurkštumas buvo 43, 6 nm, tačiau P. aeruginosa ląstelės elgėsi priešingai 21 . Keletas neseniai atliktų tyrimų parodė, kad bakterijų ląstelės sugebėjo efektyviau prisitvirtinti prie titano paviršių, kurių vidutinis paviršiaus šiurkštumas yra mažesnis nei 1, 2 nm, 22, 23 . Panašus padidėjęs tvirtinimo lygis taip pat buvo praneštas apie stiklinius paviršius, kurių vidutinis šiurkštumas yra 1, 3 nm, nei tuos, kurių vidutinis paviršiaus šiurkštumas yra 2, 1 nm, 12, 15 .

Nepaisant gausėjančio skaičiaus įrodymų, kad bakterijų ląstelių prisitvirtinimo laipsnis padidėja ant paviršių, kurių nanometrinis skalės šiurkštumas yra 2, 9, 10, 12, 13, 15, 22, 23, ir kad atrodo, kad bakterijų ląstelės gali aptikti pokyčius Vidutinis paviršiaus šiurkštumas iki mažiausių kaip 1 nm, lieka neaišku, ar molekuliškai lygūs paviršiai, kurių paviršiaus šiurkštumas yra sub nanometrinėje skalėje, žymi ribą, žemiau kurios paviršiaus nanotopografija riboja bakterijų prisirišimą. Atrodo, kad trūksta darbo, aprašančio bakterijų prisirišimą prie sub nanometriškai lygių paviršių ir šios paviršiaus architektūros įtaką (jei tokia yra) pritvirtinimo procesui. Šis darbas buvo sukurtas kaip ankstesnio darbo „ 2, 12, 13, 15, 22, 23“ pratęsimas, kad būtų užpildyta ši esamų žinių spraga. Mes naudojame magnetrono dulkinimo metodą, norėdami gaminti titano plonas plėveles 24, 25 . Šis metodas leido kontroliuojamai titaniškai nusodinti titaną ant substrato, kad būtų galima gaminti plonas metalines plėveles, kurių paviršiaus nuboskopinis ir nanoskopinis šiurkštumas yra 24, 25 . Titano plonos plėvelės, kurių vidutinis paviršiaus šiurkštumas yra 0, 5 nm, 0, 2 nm ir 0, 18 nm, o atitinkamas plėvelės storis yra atitinkamai 150 nm, 12 nm ir 3 nm, buvo pagamintos iš silicio plokštelių, kurių pradinis vidutinis paviršiaus šiurkštumas buvo 0, 29 nm. Anksčiau mes parodėme, kad dvi bakterijų padermės, P. aeruginosa ir S. aureus, turi savybę atskirti paviršius, pasižyminčius labai mažais paviršiaus šiurkštumo skirtumais, o vidutinis paviršiaus šiurkštumas sumažėja nuo 1, 22 nm iki 0, 58 nm, todėl gaunami 2–3 kartus padidėjęs prijungtų ląstelių skaičius kartu su padidėjusiu tarpląstelinių polimerinių medžiagų sekrecijos lygiu paviršiuje. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti bakterijų prisirišimo prie molekuliškai lygaus (ty sub nanometrinio šiurkštumo) titano plonos plėvelės paviršių bandymą nustatyti paviršiaus šiurkštumo ribą, jei tokia yra, galinčią turėti įtakos bakterijų prisitvirtinimas prie paviršių.

Rezultatai

Titano paviršių fizikinis ir cheminis apibūdinimas

Buvo nustatyta, kad titano plonų plėvelių paviršiai yra hidrofobiniai ir rodo vandens kontakto kampus nuo 96 o iki 104, 5 o (pagalbinė informacija: S1 lentelė). Paaiškėjo, kad paviršiaus hidrofobiškumas padidėjo padidėjus plėvelės storiui (statistiškai reikšmingas; t- testas: t = 0, 03 ( p <0, 05)), kai išmatuoti kontaktiniai kampai buvo maždaug 96 o –97 o 3 nm ir 12 nm plėvelėms ir 104, 5 o 150 nm juostoms. Buvo nustatyta, kad paviršiaus energija be energijos (dėl didelės dispersinių komponentų dalies) yra nuo 36 mN m −1 3 nm ir 12 nm filmuose iki 39, 5 mN m −1 150 nm juostose.

XPS analizė patvirtino, kad titano plėvelių, kurių bangos ilgis 12 nm ir 150 nm, paviršiai buvo vienodai padengti titanu, o koncentracija padidėjo nuo 17, 7% 3 nm plėvelėse iki 21, 7%% 150 nm plėvelėse. 3 nm storio plėvelėse buvo nustatyta iki 8, 5% silicio, nes XPS analizės gylis buvo nominaliai apie 3–5 nm. Apskritai buvo nustatyta, kad titanas ir deguonis yra gausiausi elementai plėvelių paviršiuje. Aukštos skiriamosios gebos titano XPS spektrai rodė tris smailes, kuriose titano paviršių rišamosios energijos smailės, esant ∼ 458, 0 eV ir ∼ 463 eV, yra priskirtinos TiO 2, patvirtinančios anksčiau praneštus panašius stebėjimus 22, 26, 27, 28 .

TiO 2 molekulės pavienė elektroninė būsena (X1A 1 ) turi C 2V taškų grupės simetriją, kuri pateikta 1 pav. TiO 2 geometrinės ir elektroninės savybės pateiktos 1 lentelėje. TiO 2 turi du vienodus Ti. -O Ryšio ilgis 1, 641 Å, o O-Ti-O kampas yra 111, 9 °, užtikrinant gerą teorijos ir eksperimento suderinimą. Pavyzdžiui, „B3LYP / LANL2DZ“ modelis sukuria Ti-O jungties ilgį ir O-Ti-O jungties kampą, atitinkamai atitinkamai 1, 685 Å ir 110, 8 ° 29, o CCSD (T) / LANL2DZ modelis nurodomas kaip 1, 672 Å ir 112, 6 ° 29., atitinkamai. Eksperimentuojant yra tik apskaičiuotas O-Ti-O kampas (110 ± 5 °) pavienės žemės elektroninėje būsenoje. Elektroninis erdvinis mastas 2> pasiekia 193, 95 au, o tai atitinka maždaug 10 nm; molekulinis elektrostatinis potencialas (MEP) parodytas 1 pav.

Image

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Titano plonų plėvelių paviršiaus topografija ir morfologija

Silikoninių plokštelių ir 3 nm, 12 nm ir 150 nm titano plonų plėvelių AFM paviršiaus šiurkštumo analizės rezultatai dviejuose nuskaitymo plotuose - 10 μm × 10 μm ir 5 μm × 5 μm - parodyti 2 lentelėje ir 1 pav. 2. Paviršiams apibūdinti buvo naudojami penki parametrai: vidutinis šiurkštumas ( R a ), šaknies vidurkio (RMS) šiurkštumas ( R q ), maksimalus aukštis ( R max ), įdubimas ( R skw ) ir kurtozė ( R kur ). 22, 31, 32 . Titano plonų plėvelių paviršiaus topografijai įvertinti buvo naudojami trys parametrai, įskaitant Ra , Rq ir Rmax, o paviršiaus morfologijai apibūdinti buvo naudojami paslankumas ir kurtozė. 3 ir 12 nm plėvelių paviršiaus topografija pasirodė panaši ir nepaprastai lygi sub nanometrų skalėje, ty 0, 18 nm ir 0, 20 nm Ra a, o R q 0, 20 nm ir 0, 24 nm, esant 10 μm × 10. µm nuskaitymo plotai; ir Ra yra atitinkamai 0, 19 nm ir 0, 20 nm, o Ra yra 0, 20 nm ir 0, 24 nm, atitinkamai 5 μm × 5 μm nuskaitymo srityse (2 lentelė). 3 ir 12 nm titano plonų plėvelių šiurkštumo parametrų skirtumai abiejuose nuskaitymo plotuose nebuvo statistiškai reikšmingi ( t = 0, 24 R a ir 0, 20 R q esant 10 μm × 10 μm; t = 0, 19 R a ir 0, 09, kai Rq yra 5 μm × 5 μm, p > 0, 05). Silikoninių plokštelių paviršių Ra ir Rq parametrai abiejose nuskaitymo vietose buvo nuo 0, 27 iki 0, 37 nm. 150 nm plonų plėvelių paviršiaus šiurkštumas išliko sub nanometrinėje skalėje; tačiau parodytas šiurkštumas buvo maždaug 2–2, 5 karto didesnis nei nepadengto pagrindo. Statistinė R max duomenų, gautų 10 μm × 10 μm ir 5 μm × 5 μm nuskaitymo plotams, analizė parodė, kad reikšmingo skirtumo tarp didžiausio nepadengto silicio plokštelės aukščio ir 3 nm, 12 nm ir 150 nm ilgio nebuvo. titano plėvelės ( p > 0, 05).

Pilno dydžio lentelė

Image

Nanografinų susidarymas gali būti matomas ant plonų Ti plėvelių. Interaktyvūs 3 matmenų duomenų vaizdai pateikiami papildomame S4 ​​paveiksle: Skaitytojai, naudojantys „Acrobat Reader“ 8.0 ar naujesnę versiją, gali įgalinti interaktyvius vaizdus spustelėdami paveikslėlių skydelius. Įjungęs 3-d režimą skaitytojas gali pasukti ir padidinti vaizdą naudodamas kompiuterio pelę. (II) Paviršiaus šiurkštumo kitimas po nuoseklaus Ti nusodinimo ant silicio plokštelių. Paveikslas buvo sudarytas iš tipiškų paviršiaus profilių, nubraižant tą patį ašių rinkinį, kiekvieno profilio vidutinę liniją nustatant pagal atitinkamos plėvelės storį. Pradėjimas - tai scheminis apytikslis paaiškinimas, kaip nusėdusios TiO 2 molekulės sudaro 3 nm ploną plėvelę. Silicis (8, 5%) buvo aptiktas atliekant 3 nm plėvelių XPS nuskaitymus dėl XPS lauko gylio, kaip parodyta, kaip tam tikrose plėvelės dalyse galima aptikti apatinį substratą.

Visas dydis

Kaip jau buvo pranešta anksčiau, paviršiaus simetrijai apibūdinti paprastai naudojamas skepnumas, o paviršiaus aukščio 22, 31, 32 matavimui naudojama kurtozė . Visų tirtų titano paviršių R skw buvo artimas 0 ir R kur buvo artimas 3, tai rodo, kad paviršiai simetriškai pasiskirstė maždaug varpo formos smailėmis ir slėniais (2 lentelė) 22, 31, 32 . Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp trijų titano plonų plėvelių R kur abejose nuskaitymo vietose nenustatyta ( p > 0, 05), tuo tarpu R skw statistiškai reikšmingai skyrėsi tik 10 μm × 10 μm nuskaitymo srityse. 3 nm ir 12 nm filmų R skw ir R kur vertės statistiškai reikšmingai nesiskyrė 5 μm × 5 μm nuskaitymo srities mėginiuose (atitinkamai t = 0, 69 ir 0, 44, p > 0, 05), priešingai nei 150 nm ilgio plėvelės, patvirtinančios, kad 150 nm paviršiaus paviršiai buvo didesni ir aštresni, o šių paviršių slėniai buvo seklesni ir platesni nei kitų mėginių.

P. aeruginosa ir S. aureus sąveika su molekuliniu lygiu titano plonos plėvelės paviršiais

Bakterijų sulaikymo modelių, kurie buvo vizualizuoti naudojant skenavimo elektronų mikroskopiją (SEM) ir konfokalinio skenavimo lazerio mikroskopiją (CSLM), analizė parodė, kad P. aeruginosa ir S. aureus ląstelės skirtingai reagavo į paviršių, lygų sub nanometriniu būdu. skalė. P. aeruginosa ląstelių tankis titano plėvelės paviršiuose buvo žemas ir statistiškai reikšmingai nesiskyrė kiekviename iš trijų plėvelės paviršių ( t = 0, 84, p > 0, 05). Nors P. aeruginosa pasirodė esąs prastas paviršių kolonizatorius, S. aureus sugebėjo sėkmingai kolonizuoti kiekvienos titano plėvelės paviršius (pagalbinė informacija: S3 lentelė, 3–4 pav.). Ląstelių dalis, likusi ant 3 nm ir 12 nm plėvelių paviršiaus, kai Ra yra maždaug 0, 20 nm, buvo beveik lygiavertė (statistiškai reikšmingo skirtumo nėra t = 0, 28, p > 0, 05) ir daugiau nei dviguba, nei gauta 150 nm bangoje. plėvelės, kurių Raa yra maždaug 0, 52 nm ( t = 0, 01 ir 0, 04, p <0, 05). Pažymėtina, kad iš abiejų bakterijų padermių padidėjo tarpląstelinių polimerinių medžiagų (EPS) kiekis, kaip nustatyta iš COMSTAT CSLM vaizdų analizės tiek 3 nm, tiek 12 nm filmuose (3 pav.), Bet ne ant 150 nm plėvelių. ( t = 0, 003, p <0, 05).

Image

Reprezentacinių P. aeruginosa (I) ir S. aureus (II) bandinių trimatis vizualizavimas (CSLM vaizdų projekcijos) (dešinėje) ant titano plonos plėvelės paviršių, kurių bangos ilgis 3 nm (a), 12 nm (b) ir 150 nm. c) storis po 18 valandų inkubacijos ir tinkamas gyvybingų ląstelių (raudonos spalvos) kiekybinis įvertinimas paviršiuose.

Visas dydis

Image

S. aureus ląstelės didesnėmis proporcijomis tvirtinasi ant 0, 2 nm šiurkštumo titano plėvelių dėl jų sugebėjimo išlaikyti didesnius kontaktinius plotus. Tai parodyta skirtingo šiurkštumo kontaktinių regionų tarp S. aureus ir P. aeruginosa ląstelių ir modelio paviršių (generuotų naudojant Avizo 6.3) schemose (apačioje kairėje). Grubesniame paviršiuje tarp smailių, esančių po S. aureus ląstele, lieka tarpai, o lygesniame paviršiuje kontaktas yra nenutrūkstamas. Išorinė P. aeruginosa ląstelių membrana remiasi ant nanopelių, kurių vidutinis šiurkštumas yra nuo 0, 18 iki 0, 52 nm, 5 μm × 5 μm AFM skenavimo srityse. Maksimalus aukštis schematiškai perdėtas, palyginimui pateikti 3 nm ir 150 titano plėvelių faktiniai paviršiaus linijų profiliai (apačioje dešinėje).

Visas dydis

Diskusija

Silikoniniai plokštelės, kurių sub nanometrinė skalė buvo lygi, buvo naudojamos kaip substratas titano plonųjų plėvelių nusėdimui, o susidarančių plėvelių paviršiaus morfologijos raida parodyta 2 pav. (II). Plėvelių paviršiaus morfologijos pokyčius lemia šešėlio poveikis, atsirandantis dėl dulkinimo proceso 33 . Kadangi dėl atominio nusėdimo susidaro auganti plėvelė, kurios aukštis h (x, t) , šešėlio efekto paaiškinimas buvo suformuluotas pagal 33 :

Image

kur

Image
yra bendras paviršiaus difuzijos srovės kiekis, kai D yra proporcinga paviršiaus difuzijai; R yra nusodinimo greitis esant ekspozicijos kampui
Image
.

Iš pradžių dulkinimasis sumažino silicio plokštelių paviršių šiurkštumą ( Ra = 0, 29 nm) iki 0, 18 nm ant 3 nm plonos titano plėvelės. Padidėjus plėvelės storiui iki 12 nm, gaunamas paviršius buvo homogeninis, išlaikant panašią topografiją visame paviršiuje ( Ra = 0, 20 nm) (2 pav.). Toliau didėjant titano plėvelės storiui iki 150 nm, paviršiaus topografija toliau vystėsi iki taško, kur jis tapo nanoskopiškai grubesnis ( Ra = 0, 52 nm), tiesiogiai dėl šešėlio efekto, kaip aprašyta anksčiau. Tai reiškia, kad mažo aukščio vietose dėl jų geometrinių ypatybių yra mažiau nusodintų dalelių nei aukštesnėse vietose (tokiose kaip smailės). Taip pat pastebėtas nanograinų susidarymas (2 pav.). Šis pastebėjimas atitinka anksčiau aprašytą darbą, kuriame aprašomas nanografinų susidarymas titano paviršiuose, kurių storis yra nuo 100 nm iki 300 nm 33 .

Pabrėžtina, kad paviršiaus struktūros raidai vystantis plėvelėms, R skw ir R kur parametrai reikšmingo skirtumo neparodė (1 lentelė), nukritus atitinkamai iki 0 ir 3; taip nurodant, kad paviršiai matė simetrišką varpo viršūnių ir slėnių pasiskirstymą.

XPS analizė patvirtino, kad aplinkos aplinkoje titanas yra titano dioksido (TiO 2 ) pavidalu 27, 28 . Kadangi jungties ilgis TiO2 molekulėje buvo įvertintas kaip maždaug 0, 16 nm (1 lentelė, 1 pav.), Tai yra maždaug lygus 3 nm ir 12 nm titano plėvelių vidutiniam šiurkštumui, galima daryti išvadą, kad šie paviršiai ypač yra molekuliškai lygūs.

Titano plėvelių evoliucijos metu buvo nustatyta, kad paviršiaus hidrofobiškumo laipsnis yra teigiamai koreliuojamas su paviršiaus šiurkštumo laipsniu, o šiurkščiausias 150 nm plėvelės paviršius pasižymi aukščiausiu paviršiaus hidrofobiškumo laipsniu (ekrano kontaktinio kampo apytiksliai 104, 5 °). ). Ši koreliacija atitinka Wenzel modelį, kuris paaiškina šiurkštumo sukeltą hidrofobiškumą 34 :

Image
kur
Image
ir
Image
yra skysčio kontaktiniai kampai ant šiurkščių ir lygių paviršių, o r yra šiurkštumo koeficientas. Jei kontaktinis kampas ant lygaus paviršiaus yra didesnis nei 90 °, remiantis Wenzelio lygtimi, galima tikėtis, kad „šiurkštesnis“ 150 nm titano paviršius turės didesnį vandens sąlyčio kampą (θ W = 104, 5 °) nei nustatytas. ant lygesnių 3 nm ir 12 nm plonų titano plėvelių paviršių (atitinkamai θ W = 97, 4 ° ir 96, 7 °), kaip buvo šio tyrimo atveju.

Bakterių prisirišimo reakcijų ant titano paviršių, kurių vidutinis paviršiaus šiurkštumas yra nuo 0, 2 iki 0, 5 nm, santrauka pateikta 4 pav. Nepaprastai skirtingas atsakas pastebėtas tarp P. aeruginosa ir S. aureus ląstelių. Keletas turimų teorijų, skirtų paaiškinti diferencinį ląstelių adheziją, pagrįstą ląstelių paviršiaus krūviu ir hidrofobiškumu, šiuo atveju negali tinkamai numatyti bakterijų adhezijos tendencijų - 20, 35, 36, o kiekvienas iš šių modelių prognozuoja priešingą rezultatą, nei stebėta šiame tyrime. . S. aureus yra neigiamai įkrauta bakterija iš dviejų tiriamųjų ( ζ = –35, 2 ± 0, 2 mV, papildoma S3 lentelė), todėl tikimasi, kad ji turės silpniausią prisirišimo polinkį, remiantis vien paviršiaus krūviu. Kita vertus, kadangi P. aeruginosa ląstelių paviršius buvo šiek tiek hidrofiliškesnis, o vandens sąlyčio kampas ( θ ) 43 °, palyginti su S. aureus , kurio hidrofiliškumas buvo mažesnis ( θ = 72 °). ), galima tikėtis, kad S. aureus ląstelės pasižymės stipresniu prisirišimo prie labai hidrofobinių paviršių, pastebėtų šiame tyrime, polinkiu. Mes nustatėme, kad ant titano plėvelių S. aureus ląstelės buvo tvirtesnės nei P. aeruginosa ląstelės. Be to, nustatyta, kad S. aureus ląstelės daugiau prisitvirtina prie molekuliškai lygių titano paviršių, kurių sąlyčio su vandeniu kampas yra 97 °, nei tų, kurių kontaktinis vandens kampas yra 104, 5 ° . Taip pat pažymėtina, kad S. aureus ląstelės ankstesniame tyrime nepavyko pritvirtinti prie lygaus (nanodalelio masto) ( Ra = 181 nm) optinio pluošto paviršiaus, turinčio panašias hidrofobines savybes (sąlyčio su vandeniu kampas, θ = 106 °) 13 .

Atrodo, kad P. aeruginosa ląstelių prisitvirtinimas yra labai apribotas ant titano paviršių, kurių vidutinis šiurkštumas yra lygus 0, 5 nm ar mažesnis, kai paviršiuje liko mažiau kaip 0, 5% ląstelių. S. aureus ląstelės, atvirkščiai, pasižymėjo ryškiu patvarumu prie prisirišimo, ypač ant 3 nm ir 12 nm plėvelių, todėl pritvirtintų ląstelių tankis padidėjo beveik dvigubai, palyginti su 150 nm plėvelės paviršiais. Atsižvelgiant į tai, kad titano plonųjų plėvelių fizikinės ir cheminės paviršiaus charakteristikos abiejų tipų ląstelėms buvo vienodos, tikėtina, kad tvirtinimo savybių skirtumai atsiranda dėl membranos standumo ir tempimo skirtumų - savybės, kuri priklauso nuo ląstelių morfologijos. 37, 38 . Ląstelių morfologija yra netiesioginis turgorinio slėgio, esančio bakterijų ląstelėse, nurodymas, atliekantis svarbų vaidmenį vietoje citoskeleto 37 . Įrodyta, kad sferinės ląstelės, tokios kaip S. aureus, turi didesnį turgorinį slėgį nei lazdelės formos ląstelės, pvz., P. aeruginosa 39, 40 . Šis poveikis gali paaiškinti skirtingą abiejų tipų ląstelių prisirišimo polinkį prie molekuliškai lygių plėvelių. Mažas turgorinis slėgis leidžia labai pakeisti ląstelių formas, nes jų ląstelių membrana yra atsipalaidavusi, todėl ji gali pakeisti formą ir svyruoti beveik nenaudodama energijos. Be to, atsipalaidavusios membranos svyravimai šalia patrauklaus paviršiaus sukuria atstumiančiąją jėgą, vadinamą Helfricho atmetimu, galinčią sukelti neįpareigojantį perėjimą 41 . Šiluminius svyravimus galima padidinti, jei yra patrauklus paviršius 42, 43 . Neseniai buvo įrodyta, kad monocitinės ląstelių membranos gali svyruoti, kai amplitudė yra 5 nm 44 . Ląstelės sugeba aptikti pašalinius paviršius, kai atstumas 50 nm, ir gali nustatyti molekulinį kontaktą 30–40 nm diapazone 44, 45 . Savo ruožtu, didelis turgorinis slėgis bakterijos ląstelėje gali sukelti membranos tempimą (kaip aprašyta Laplaso išraiškoje, siejančioje paviršiaus įtempį su slėgiu). Dėl to ištemptos membranos šiluminiai svyravimai sumažėja 39, 43, 46 . Todėl S. aureus ląstelių sferinė ląstelių geometrija galėjo leisti kiekvienai prisijungiančiai bakterijai užmegzti didesnį sąlyčio plotą ant lygiausių paviršių 39, 43 . Remiantis šia hipoteze, buvo sudarytas scheminis modelis, kuris parodė, kad viršutinis S. aureus ląstelių paviršiaus kontaktas sąlygoja jų sugebėjimą išlaikyti prisirišimą prie molekuliškai lygių paviršių (4 pav.).

Apibendrinant galima pasakyti, kad šioje ataskaitoje gauti duomenys parodė, kad dviejų rūšių bakterijų padermės, naudojamos šiame tyrime, skiriasi bakterijų prisirišimo prie molekuliniu lygiu paviršiumi. Kadangi vidutinis paviršiaus šiurkštumas sumažėjo nuo 0, 52 nm iki 0, 18 nm, rutulinių S. aureus ląstelių polinkis prisijungti prie paviršiaus padidėjo beveik dvigubai, tuo tarpu lazdelės formos P. aeruginosa ląstelės vienodai menkai prisitvirtino prie kiekvienos molekuliškai lygios titano. filmai. Mes siūlome, kad bakterijų ląstelių (sferinės ar lazdelės formos) morfologija yra netiesioginis membranos gebėjimo deformuotis požymis. Dėl to sferinės ląstelės mažiau deformuojasi ir efektyviau prilimpa prie lygesnių paviršių. Manome, kad mūsų tyrimas pabrėžia skirtingų ląstelių morfologijų membranų deformacijų reikšmę tvirtinimo procese prie molekuliškai lygaus paviršiaus, kai anksčiau žinomi mechanizmai, tokie kaip sąveika su žiogeliais ir fimbrijomis ar EPS, negalėjo skatinti bakterijų sukibimo.

Metodai

Titano paviršių apdirbimas

3, 12 arba 150 nm storio titano plonos plėvelės (toliau - 3, 12 arba 150 nm plėvelės) buvo paruoštos naudojant iš anksto išvalytus silicio plokšteles („NOVA Electronic Materials, Inc.“) naudojant Kurt J Lesker CMS-18 kaip aprašyta aukščiau, magnetrono dulkinimo plonasluoksnių nusodinimo sistema 22 .

Titano plonos plėvelės paviršiaus apibūdinimas

Titanu dengtų silicio plokštelių paviršiaus kompozicijos buvo nustatytos naudojant rentgeno fotoelektrono spektrą, naudojant Kratos Axis Ultra DLD spektrometrą (Kratos Analytical Ltd, JK) pagal anksčiau aprašytą metodiką 22 . Įvairių tirpiklių kontaktiniai kampai ant titano plonų plėvelių buvo matuojami naudojant kritimo kritimo metodą 47 . Norint gauti paviršiaus morfologijos vaizdus ir kiekybiškai išmatuoti bei išanalizuoti metalinių paviršių paviršiaus šiurkštumą nanometrų skalėje, buvo naudojamas nuskaitymo zondo mikroskopas (SPM) (Solver P7LS, NT-MDT). Analizė buvo atlikta, kaip aprašyta kitur 22 . Visi mėginiai (po keturis kiekvienos būklės) pirmiausia buvo nuskaityti 10 μm × 10 μm matymo lauku, kad būtų galima įsitikinti, ar paviršius yra lygus, ir išvengti pažeistų ir (arba) užterštų vietų (duomenys nepateikti), prieš pasirinkdami 5 μm × 5 μm plotai skenavimui ir analizei. Visi čia pateikti šiurkštumo duomenys yra vidutiniškai keturi nuskaitymai.

Statistinis duomenų apdorojimas buvo atliktas naudojant SPSS 18.0 programą (SPSS Inc., Čikaga, Ilinojus, JAV). Paviršiaus šiurkštumo parametrų nuoseklumui įvertinti buvo atlikti poriniai bandymai.

Titano paviršiaus interaktyvi trimatė (3D) vizualizacija buvo atliekama naudojant pasirinktinį C kodą ir S2PLOT grafikos biblioteką 48 . Įvesties duomenų failai buvo NT-MDT formato ir buvo įtraukti į peržiūros įrankį (mdtview), naudojant Davidui Necasui ir Petrui Klapetekui pritaikytą atviros programinės įrangos „Gwyddion“ NT-MDT modulio modifikaciją (//gwyddion.net/, 2.12 versija). ). NT-MDT failai buvo paversti trimačiu paviršiumi, nuspalvintu pagal aukštį ir parodyti naudojant funkciją „S2PLOT s2surpa“. Vizualizacijos buvo eksportuotos iš „mdtview“ į tarpinį VRML formatą su ašių etikečių tekstūromis TGA formatu. Tekstūros buvo konvertuotos į PNG formatą, o VRML modelis buvo importuotas į „Adobe Acrobat 3D 8“ versiją, kad būtų sukurta interaktyvi figūra, naudojant Barneso ir Fluke 49 aprašytą metodą. Norint suteikti papildomą funkcionalumą, buvo naudojamos „JavaScript“ komandos. Internetinėje šio darbo versijoje interaktyvųjį paveikslą S4 galima peržiūrėti spustelėjus pele ant keturių skydų, jei bus naudojama „Adobe Reader 8.0“ ar naujesnė versija. Tai atveria langą, kuriame paviršių galima interaktyviai ištirti naudojant pelę, kad būtų galima valdyti fotoaparato orientaciją ir mastelį.

Kompiuterinis modeliavimas

Atskiro neutraliojo titano dioksido (TiO 2 ) geometrija buvo visiškai optimizuota hibridinio tankio funkcinės teorijos (DFT) lygmeniu, naudojant B3LYP / cc-pVTZ modelį, įtrauktą į GAUSSIAN09 skaičiavimo chemijos paketą 50 . Vėlesnė harmoninių virpesių dažnio analizė buvo naudojama siekiant nustatyti optimizuotų nejudančių taškų prigimtį kaip realius vietinius minimumus (be jokio įsivaizduojamo dažnio), perėjimo būsenas (tik su vienu įsivaizduojamu dažniu) arba aukštesnės eilės balno taškus (su daugiau nei vienu įsivaizduojamu dažniu).

Trimatis modelio paviršius buvo sukonstruotas generuojant dvimatį aukščio duomenis naudojant „Microsoft Excel“ ir „Avizo Software“, versija 6.3.

Bakterijų augimas ir mėginių paruošimas

Buvo naudojamos dvi bakterijų padermės: Staphylococcus aureus CIP 65.8 ir Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 . Bakterijų padermės buvo gautos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC, JAV) ir Pasteur instituto (CIP, Prancūzija) kultūros kolekcijos. Bakterijų kamienų atsargos buvo paruoštos 20% glicerolio maistiniame sultinyje (Merck) ir laikomos –80 ° C temperatūroje. Abi padermės buvo kultivuojamos maistiniame agare (Oxoid) ir maistiniame sultinyje (Oxoid) kambario temperatūroje ( maždaug 22 ° C). Be to, buvo patikrinta inkubacija 37 ° C temperatūroje, kad būtų galima įsitikinti, ar nepaveikta bakterijų prisitvirtinimo trafaretas. Statistiškai reikšmingų skirtumų nerasta (duomenys nepateikti).

Prieš kiekvieną eksperimentą buvo paruošta šviežia bakterijų suspensija, kaip buvo pranešta anksčiau 22 . Atlikti bent du nepriklausomi eksperimentai su trimis egzemplioriais ir su atitinkamomis kontrolėmis.

Gyvų ląstelių ir EPS vizualizacija ir kiekybinis įvertinimas

Norint vizualizuoti gyvybingas bakterijas ir EPS, buvo naudojami standartiniai dažymo būdai. Bakterijos buvo nudažytos SYTO ® 17 raudona (Molecular Probes TM, Invitrogen), o EPS nudažytos žalia spalva su Alexa Fluor ® 488 (Molecular Probes TM, Invitrogen), succinilinto konkanavalino A 22 konjugatu. Bakterijų, pritvirtintų prie titano paviršių, ir EPS vaizdai buvo užfiksuoti konfokaliniu lazeriniu skenavimo mikroskopu (CSLM) „Olympus Fluorview FV1000 Spektroskopinė konfokalinė sistema“. Sistemą sudarė apverstas mikroskopas OLYMPUS IX81 [su 20 ×, 40 × (alyva), 100 × (aliejiniais) UIS objektyvais] ir buvo valdomas keliomis Ar, He ir Ne lazerio linijomis (458, 488, 515, 543, 633 nm). „Concanavalin A Alexa® 488“ dažams vaizduoti buvo naudojamas 488 nm lazeris, o „SYTO ® 17 Red“ - 543 nm lazeriu. CSVM vaizdams apdoroti ir 3D vizualizacijai buvo naudojamas „Avizo“ paketas, 6.3 versija.

Norint įvertinti 3D biopofilių vaizdų krūvas, buvo naudojama specializuota kompiuterinė programinė įranga COMSTAT 51 . Nuskaitytos sritys buvo eksportuotos į „pilkos spalvos“ 8 bitų vaizdų krūvą „Fluoview FV 7.0“. Titano paviršiuose pritvirtintų bakterijų ląstelių struktūrai apibūdinti buvo naudojami du kiekybiniai biomasės tankio parametrai: (i) biologinis tūris, apimantis ir ląsteles, ir EPS, ir (ii) vidutinis bioplėvelės storis. Both parameters have the dimension of length: the biovolume represents the overall volume of the cells and EPS per unit area of substrate and the average biofilm thickness provides a measure of depth size of the cells and EPS. For the purposes of statistical analysis twenty five fields of view were examined.

In all scanning electron microscopy experiments, titanium surfaces with attached bacteria were gold-coated as previously reported 22 . High-resolution images of titanium thin films with the retained bacterial cells were taken using an FESEM (ZEISS SUPRA 40VP) at 3 kV at 1, 000×, 5, 000× and 20, 000× magnification. Images at 1, 000× and 5, 000× magnification were used to calculate the number of bacteria attaching to the titanium surfaces; the results were statistically analyzed. Each of attachment experiments were repeated twice and five data points of each repeat were collected.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Article File

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.