Skirtinga matricos metaloproteinazių ir inhibitorių raiška žiurkių plaučių mezenchiminėse ir epitelinėse ląstelėse | vaikų tyrimai

Skirtinga matricos metaloproteinazių ir inhibitorių raiška žiurkių plaučių mezenchiminėse ir epitelinėse ląstelėse | vaikų tyrimai

Anonim

Anotacija

Plaučiai vystytis reikia tarpląstelinės matricos rekonstravimo. Tai apima matricos metaloproteinazes (MMP) ir jų endogeninius inhibitorius [metalo proteinkinazių (TIMP) audinių inhibitorius]. Kadangi jie paprastai buvo tiriami tik visame plautyje, mes sutelkėme dėmesį į mezenchimines ir epitelio ląsteles, šviežiai izoliuotas įvairiuose vystymosi etapuose. Fibroblastų srityje ryškiausias vystymosi pokytis buvo 1 tipo membranos (MT1) -MMP transkripto piko (keturis kartus didesnis nei prenatalinis lygis) alveoliarizacijos metu, atsižvelgiant į žinomą lemiamą MT1-MMP vaidmenį šiame procese. TIMP-1 ir -2 mRNR laikinai padidėjo pogimdyminiu d (pn) 3 metu. Alveolių epitelio ląstelėse (AEC) MMP-2 ekspresija buvo maksimali vaisiaus d (f) 19, kai diferencijuojasi II tipo alveolinės ląstelės (ATII) ir pn5. ; priešingai, MT1-MMP ekspresija mažai pasikeitė, o TIMP-1 ekspresija sumažėjo gerėjant nėštumui. Ląstelėse, ekspresuojančiose ATI fenotipą in vitro , TIMP-1 ir -2 aktyvumas buvo atitinkamai devynis ir penkis kartus didesnis nei ląstelėse, kurios išreiškė ATII požymius, tuo tarpu ATII turėjo didesnį MMP-2 aktyvumą ir buvo vienintelės ląstelių rūšys, išreiškiančios MMP-9. Tai rodo didesnį ATII rekonstravimo potencialą. Plaučių mezenchiminės ir epitelinės ląstelės turi gana skirtingus MMP / TIMP raiškos modelius. Ląstelių skyrių pokyčiai turėtų būti konkrečiai dokumentuojami, kai vystosi plaučių ligos, tokios kaip bronchų ir plaučių displazija, kai buvo pranešta apie MMP aktyvumo pokyčius.

Pagrindinis

Tarpląstelinė matrica (ECM) yra būtina plaučių morfogenezei ir ląstelių diferenciacijai, augimui ir judrumui (1). Paeiliui vykstantys pseudoglanduliniai, kanalų, saccular ir alveoliniai plaučių vystymosi etapai (2) apima ECM rekonstravimą (1). Nuo cinko priklausomos endopeptidazės, MMP, atlieka ECM proteolizę (3). Jų veiklą reguliuoja įvairūs mechanizmai, kuriuose TIMP vaidina svarbų vaidmenį (3).

Besivystančiame plautyje yra išreikšta daugybė MMP ir TIMP (4, 5). Nors epitelio ir mezenchiminės ląstelės pasižymi skirtingais MMP / TIMP ekspresijos požymiais (4, 6), MMP ir TIMP raiškos pokyčiai skirtinguose vystymosi etapuose paprastai tiriami tik visame plautyje (4, 5, 7, 8). Kai epitelio ir mezenchiminės ląstelės buvo tiriamos palyginti, tai buvo labai ribotas laikotarpis (6). Santykinio indėlio klausimas yra dar svarbesnis tuo, kad abipusė epitelio ir mezenchiminė sąveika yra nepaprastai svarbi visoms plaučių vystymosi stadijoms (9). Be to, iki šiol daugiau dėmesio buvo skiriama ankstyvajam vaisiaus plaučių vystymuisi, o ne vėlesnėms stadijoms. Tolesnis vėlyvosios raidos dokumentavimas gali padėti geriau suprasti su naujagimių lėtinėmis plaučių ligomis susijusių MMP aktyvumo pokyčių svarbą (10, 11). Šiame tyrime mes ištyrėme MMP / TIMP ekspresijos pokyčius fibroblastų ir AEC, ekstemporane išskirtų iš žiurkės plaučių, nuo pseudoglandulinės stadijos pabaigos iki alveolinės stadijos. Mes taip pat tyrėme palyginti ląsteles , kurios in vitro išreiškia ATI arba ATII fenotipą.

Kadangi negalėjo būti svarstomas visuotinis MMP ir TIMP tyrimas, mes sutelkėme dėmesį į baltymus, turinčius žinomą ypatingą reikšmę, įskaitant MMP-2 ir MT1-MMP (arba MMP-14), kurie dalyvauja alveolių formavime (12–14), TIMP- 1 (pagrindinis MMP inhibitorius) ir TIMP-2, kuris kontroliuoja MMP-2 aktyvavimą (15). Tai yra viena iš labiausiai išreikštų matricą rekonstruojančių molekulių plaučiuose, tai patvirtina įvairių besivystančių pelių organų profiliavimo tyrimas (5). Kadangi mes sutelkėme dėmesį į vėlyvą vystymąsi, nebuvo įtrauktas TIMP-3, kuris yra svarbus anksčiau vykstant šakojimosi morfogenezei (16).

MEDŽIAGOS IR METODAI

Plaučių ląstelių izoliacija.

Buvo naudojamos nėščios „Sprague-Dawley“ žiurkės (Charles River, Saint Germain sur l'Arbresle, Prancūzija). Gyvūnų procedūrą leido Prancūzijos žemės ūkio ministerija. AEC ir fibroblastai buvo išskirti diferenciniu sukibimu ir centrifugavimu, kaip aprašyta (17), ant f17 (pseudoglandulinė stadija), f19 (kanalų stadija), f21 ir pn1 ir 3 (saculiarinė stadija), pn5 ir 8 (alveolinė stadija, progresuojanti skilimas)., ir pn16 (alveolinė stadija, nutraukta septacija). Epitelio ląstelės, išskirtos šia procedūra, išreiškia būdingus ATII žymenis (17). Šviežiai išskirtos ląstelės buvo nedelsiant užšaldomos be jokios kultūros pakopos ir laikomos –80 ° C temperatūroje.

AEC kultūra.

Norint nustatyti, ar ląstelės, išreiškiančios ATI ar ATII požymius, turi skirtingą MMP / TIMP įrangą, ant pn21 išskirti AEC buvo pasėti ant substratų, apie kuriuos pranešama, kad jie palaiko bet kurį fenotipą. Engelbreth-Holm-Swarm pagrindinės membranos matrica [(EHS matrica], paruošta laboratorijoje] ir danga, žymima kolageno-fibronektino-laminino 5 danga (CFL), sudaryta iš I kolageno (8 μg / cm 2 ; BD Biosciences, Erembodegem, Belgija)., fibronektino (2, 1 μg / cm 2 ; „Sigma Chemical Co.“, L'Isle d'Abeau-Chesnes, Prancūzija) ir laminino 5 (0, 5 μg / cm 2 ; P. Rousselle dovana, Baltymų biologijos ir chemijos institutas, CNRS), Lione, Prancūzijoje), abu palaiko ATII fenotipą. Plastikinė ir kolageno-fibronektino danga (CF), sudaryta tik iš I kolageno ir fibronektino (tos pačios koncentracijos), skatina transdiferenciaciją į ATI (18, 19). Išgryninti AEC 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) turinčioje terpėje buvo pasėti (1, 5x106 ląstelės / ml) į daugialąsčius plastikinių kultūrų lėkšteles, nepadengtas arba padengtas vienu iš trijų matricos substratų. Nakčiai sukibus su substratu, naudojant oras-CO 2 (95–5%), apibrėžta terpė be serumo (17) buvo įvesta ir atnaujinta po 24 valandų. Po 30 val. Inkubavimo, kondicionuota terpė (CM) buvo surinkta ir laikoma –80 ° C temperatūroje MMP / TIMP tyrimams, o kultivuotų ląstelių fenotipas buvo nustatytas imunopakavimo būdu žymint specifinius žymenis.

Ląstelių imuninis žymėjimas.

Citokeratino / vimentino imuninis žymėjimas leido nustatyti abipusį AEC ir fibroblastų užterštumą. T1α ir paviršinio aktyvumo baltymas B (SP-B) apibūdino atitinkamai ATI ir ATII. Metanoliu fiksuotos ląstelės buvo inkubuojamos 1 valandą arba su monokloniniu anti-žiurkių pan-citokeratino antikūnu (Sigma Chemical Co.), monokloniniu anti-žiurkių vimentino antikūnu (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), triušio anti-žiurkės SP-B antikūnas (prof. JA Whitsett, Cincinnati OH dovana) arba monokloninis anti-žiurkės T1α antikūnas (prof. MC Williams dovana, Bostonas, MA). kaip antriniai antikūnai buvo naudojami fluoresceino izotiocianatai-konjuguoti anti-pelių imunoglobulino antikūnai (Jackson Immunoresearch Labs, Soham, Cambridgeshire, JK) arba Teksaso raudonai konjuguoti anti-triušių imunoglobulino antikūnai (GE Healthcare, Orsay, Prancūzija). Ląstelių branduoliai buvo pažymėti bisbenzimidu (Sigma Chemical Co.). Fluorescencija buvo stebima Zeiss Axioskop-40 mikroskopu.

RNR ekstrahavimas.

Visa RNR buvo išskirta naudojant „Trizol“ reagentą („Invitrogen“, Cergy-Pontoise, Prancūzija), granuliuota, ištirpinta steriliame vandenyje ir kiekybiškai įvertinta absorbcija esant 260 nm (Biophotometras, Eppendorf). Vientisumas buvo patikrintas denatūravus gelio elektroforezę.

cDNR zondai ir Northern blot analizė.

Bendra žiurkės plaučių RNR buvo atvirkščiai transkribuota, naudojant Superscript II atvirkštinę transkriptazę ir atsitiktinius heksamerinius pradmenis (Invitrogen). Zondai buvo amplifikuoti polimerazės grandinine reakcija, naudojant tikslinių pradmenų sekas (1 lentelė), pažymėtas (α 32 P) deoksicitidino trifosfatu (NEN, Perkin Elmer), naudojant „Rediprime“ ženklinimo sistemą (GE Healthcare), ir išgrynintos G-50 kolonose ( „GE Healthcare“). Atliekant Northern blot analizę, 20 μg RNR buvo elektroforezuota ant 1, 2% agarozės, 2, 2-M formaldehido gelių ir perkelta į nailono membranas (Gene Screen, Perkin Elmer). Membranoms iš eilės buvo tiriama TIMP-1, TIMP-2, MT1-MMP, MMP-2 mRNR ir 18S rRNR buferiniame tirpale, kuriame yra 50% formamido, 50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 0, 8 M NaCl, 10% dekstrano sulfato., 0, 1% natrio pirofosfato, 5 x Denhardto tirpalo, 0, 1% natrio dodecilsulfato (SDS) ir 75 μg / ml denatūruotos lašišos spermos DNR. Hibridizacija buvo vykdoma per naktį 42 ° C temperatūroje. Blotai buvo veikiami „X-Omat AR Kodak“ plėvelėmis -80 ° C temperatūroje. Autoradiografiniai signalai buvo kiekybiškai įvertinti densitometrijos metodu (NIH Image, Bethesda, MD) ir normalizuoti iki 18S rRNR.

Pilno dydžio lentelė

Zimografija MMP-2 ir MMP-9 želatinazės aktyvumui nustatyti.

Iš vienodo skaičiaus ląstelių, surinktų iš vienodo skaičiaus ląstelių, buvo elektroforezuoti 8% SDS-poliakrilamido geliai, įmirkyti 0, 5 mg / ml želatinos, prieš liejant, nereaguojančiomis sąlygomis. Geliai 30 minučių buvo plaunami 2, 5% Triton X-100, kad būtų pašalintas SDS, po to inkubuojami per naktį 37 ° C temperatūroje virškinimo buferyje (50 mM Tris-HCl ir 10 mM CaCl2, pH 7, 4). Geliai buvo dažomi „Coomassie blue“ (R250), kad būtų atskleistos neapdailintos vietos, kuriose substratas buvo skaidomas proteazių. Veiklos priskyrimas MMP buvo patvirtintas slopinant, kai buvo etilendiamino tetraacto rūgšties (10 mM). Densitometrija buvo pasiekta naudojant „NIH Image“ programinę įrangą.

Atvirkštinė zimografija TIMP veiklai nustatyti.

Iš vienodo skaičiaus ląstelių surinktų CM tūrių elektroforezė buvo atlikta naudojant 13% SDS-poliakrilamido gelius, turinčius tiek želatinos (0, 5 mg / ml), tiek tirpalą, kuriame gausu želatinazės ir gautą iš žiurkių vaisiaus plaučių fibroblastų, stimuliuojamų forbolesterio 12-tetradekanoilforbol-13 acetato ( 20). Geliai buvo plaunami ir inkubuojami 10 val. Virškinimo buferyje 37 ° C temperatūroje, tada nudažomi, kaip nustatyta zimografijai. Dėl želatinazę slopinančio aktyvumo TIMP veikla buvo parodyta kaip tamsios juostos šviesiame fone. Juostos buvo identifikuotos pagal jų molekulinį svorį ir palyginimą su rekombinantiniu žmogaus TIMP-2 standartu (prof. G. Murphy dovana, Kembridžas, JK). Densitometrija buvo pasiekta naudojant „NIH Image“ programinę įrangą.

Statistinė analizė.

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SE. Keli vidutinių verčių palyginimai buvo atlikti analizuojant dispersijos (ANOVA) ir Fišerio apsaugoto mažiausio reikšmingumo skirtumą (PLSD) arba atliekant neparametrinę Kruskal-Wallis analizę ir Mann-Whitney U testą, atsižvelgiant į pritaikomumą. p = 0, 05 buvo laikoma statistinio reikšmingumo riba.

REZULTATAI

Izoliuotų ląstelių apibūdinimas.

AEC ir fibroblastai turėjo būdingas morfologines savo ląstelių tipo savybes (1 pav. A ir C ) ir atitinkamai stipriai išreikštą citokeratiną (1 pav. B ) ir vimentiną (1 pav. D ). Abipusis užteršimas sudarė <5% AUC vimentinu teigiamų ląstelių ir <2% fibroblastų citokeratinu teigiamų ląstelių.

Image

Izoliuotų ir išaugintų plaučių ląstelių apibūdinimas. Dažant hematoksilino ir eozino sluoksnius, daugiagyslių AEC susidarė monosluoksniuose ( A ), tuo tarpu fibroblastai buvo verpstės formos ( C ). AEC, ženkliai pažymėti citokeratinu ( B ), ir fibroblastai, skirti vimentinui ( D ); branduolinis užteršimas bisbenzimidu. Ląstelės, auginamos CFL matricoje, teigiamai išlaikytos tiek ATII žymeniui SP-B ( E ), tiek ATI žymeniui T1α ( F ). Strypai = 20 μm.

Visas dydis

MT1-MMP raidos raiška.

Fibroblastų MT1-MMP-mRNR lygis mažai pakito iki gimimo (2 pav. A ir B ). Jis padidėjo nuo keturių iki penkių kartų, palyginti su pn3, išliko padidėjęs iki pn8, o vėliau grįžo į prenatalinį lygį, esant pn16. AEC ekspresijos lygis reikšmingai nepasikeitė nuo f17 iki pn1, tačiau priešingai nei fibroblastai, jis šiek tiek, bet reikšmingai sumažėjo pn3. Pereinamasis padidėjimas iki 2, 5 karto virš pn3 lygio ir 1, 3 karto iki f17 lygio įvyko pn5 (2 pav. C ir D ). Alveoliarizacijos metu palyginimas tuo pačiu blot parodė, kad plaučių fibroblastai ekspresuoja maždaug dvigubai daugiau MT1-MMP mRNR nei epitelio ląstelės (neparodyta).

Image

MT1-MMP mRNR raiška vaisiaus ir pogimdyminiuose plaučių fibroblastuose ( A , B ) ir AEC ( C , D ). ( A ir C ) reprezentaciniai šiauriniai blotai. ( B ir D ) santykinės mRNR gausos densitometrinė analizė, normalizuota pakraunant 18S rRNR. Penkių nepriklausomų nustatymų, gautų iš penkių skirtingų ląstelių preparatų iš skirtingų vadų, vidurkis ± SE. Daugybė ANOVA ir Fišerio PLSD palyginimų. Reikšmingas fibroblastų ( B ) skirtumas: * p <0, 05, palyginti su f17; ** p <0, 01 vs f17; † p <0, 05, palyginti su pn3 arba pn8, o AEC ( D ): * p <0, 05, palyginti su pn3; † p <0, 05, palyginti su f17.

Visas dydis

MMP-2 raidos raiška.

MMP-2 raiška fibroblastų tiriamu laikotarpiu reikšmingai nepakito (3 pav. A ir B ). AEC, priešingai, jis padidėjo 50% nuo f17 iki f19, kai jis buvo maksimalus sutapimas su ATII diferenciacijos pradžia; jis sumažėjo po F21 ir dar labiau sumažėjo po gimimo. Nežymiai ir laikinai padidėjo pn5 (3 pav. C ir D ).

Image

MMP-2 mRNR raiška vaisiaus ir pogimdyminiuose plaučių fibroblastuose ( A , B ) ir AEC ( C , D ). ( A ir C ) reprezentaciniai šiauriniai blotai. ( B ir D ) santykinės mRNR gausos densitometrinė analizė, normalizuota pakraunant 18S rRNR. Penkių nepriklausomų nustatymų, gautų iš penkių skirtingų ląstelių preparatų iš skirtingų vadų, vidurkis ± SE. Daugybė ANOVA ir Fišerio PLSD palyginimų. Reikšmingi AEC skirtumai ( D ): * p <0, 05 palyginti su pn1; ** p <0, 001 vs pn1; † p <0, 05, palyginti su f19. Fibroblastų pokyčiai reikšmingumo lygio nepasiekė.

Visas dydis

TIMP-1 ir TIMP-2 raidos išraiška.

Fibroblastų (4 pav. A ir B ), TIMP-1 ir TIMP-2 mRNR buvo gana silpnai ekspresuojamos f17, palyginti su vėlesniais etapais; jie padidėjo atitinkamai du ir tris kartus, tarp f17 ir f19, tada išliko stabilūs iki pn1. Abiejuose TIMP pn3 smarkiai ir nepaprastai padidėjo (nuo keturių iki penkių kartų virš pn1 lygio). Išraiškos lygis po to palaipsniui mažėjo, kad būtų nustatytas pn8 prenatalinis lygis. Abiejų TIMP išraiškos modeliai buvo stulbinamai panašūs. AEC (2 pav. C ir D ) TIMP-1 mRNR lygis sumažėjo maždaug 75% vykstant nėštumui, tuo tarpu TIMP-2 mRNR išliko pastovus. Abi TIMP mRNR padidėjo tarp pn3 ir pn5, kad pasiektų dvigubą F17 lygį, tada išliko pastovios per pn16. Fibroblastų ir AEC palyginimas tuose pačiuose blotuose parodė panašų lygį, išskyrus pn3, kai fibroblastų koncentracija buvo didesnė (neparodyta).

Image

TIMP-1 (□) ir TIMP-2 (▪) mRNR raiška vaisiaus ir pogimdyminiuose plaučių fibroblastuose ( A , B ) ir AEC ( C , D ). ( A ir C ) reprezentatyvūs TIMP-1 ir TIMP-2 mRNR šiauriniai blotai atitinkamai fibroblastų ir AEC. ( B ir D ) santykinės mRNR gausos densitometrinė analizė, normalizuota pakraunant 18S rRNR. Penkių nepriklausomų nustatymų, gautų iš penkių skirtingų ląstelių preparatų iš skirtingų vadų, vidurkis ± SE. Daugybė ANOVA ir Fišerio PLSD palyginimų. Reikšmingas fibroblastų ( B ) skirtumas: * p <0, 05; ** p <0, 01; § p <0, 001 vs pn3, o AEC ( D ): * p <0, 05 palyginti su f17; † p <0, 05, palyginti su f21 ir pn1, ‡ p <0, 01, palyginti su f21 ir pn1.

Visas dydis

Diferencinė MMP / TIMP gamyba ląstelėse, išreiškiančiose ATI arba ATII fenotipą.

AEC, kultivuojami EHS matricoje, masiškai ekspresuoja SP-B ir nesugeba ekspresuoti T1α, tuo tarpu AEC, kultivuoti ant plastiko ar CF, teigiamai parodo T1α, bet ne SP-B (nepavaizduota). Todėl jie buvo laikomi atitinkamai ATII ir ATI. Ląstelės, išaugintos CFL, tuo pačiu metu išreiškė SP-B ir T1α (1 pav. E ir F ), todėl parodo ATI-ATII tarpinį fenotipą. Kaip parodyta 5 A ir B paveiksluose, ląstelės gamino panašius MMP-2 kiekius ant visų substratų, išskyrus EHS matricą, kur aktyvumas buvo 45% didesnis. Tik ląstelės, išaugintos EHS matricoje arba CFL, išleido MMP-9, nors ir daug mažesne dalimi nei MMP-2. Ląstelės, kurių CFL rodo sekreciją, yra tarpinės tarp ląstelių, esančių CF ir EHS matricoje. Kaip pavaizduota 5 pav. C ir D , TIMP-1 ląstelių, esančių ant plastiko ar CF, aktyvumas buvo maždaug devynis ir penkis kartus didesnis nei ląstelių, esančių atitinkamai CFL ir EHS matricoje, ir TIMP-2 buvo pastebėtas tris kartus didesnis aktyvumas. Plastiko ir CF, TIMP-1 aktyvumas buvo maždaug dvigubai didesnis nei TIMP-2, tuo tarpu EHS matricoje arba CFL abu TIMP rodė panašų lygį (5 pav. D ). Todėl atrodo, kad MMP / TIMP balansas skatina didesnį ląstelių proteolitinį aktyvumą CFL ar EHS matricoje.

Image

Skirtingų substratų kultūrose AEC išskiriamos CM želatinazės (MMP-2 ir -9) ir TIMP-1 bei -2 aktyvumų palyginimas. ( A ir B ) Želatinazės veikla įvertinta zimografijos būdu. ( A ) Reprezentatyvi CM zimograma iš ląstelių plastikinėje, CF, CFL ar EHS matricoje ir iš EHS matricos be ląstelių. Želatinolitinis aktyvumas pasireiškia kaip stiprios MMP-2 juostos (

Image
) ir silpnesnės „Pro-MMP-2“ juostos (
Image
), pro-MMP-9 (□) ir MMP-9 (▪). ( B ) densitometrinė analizė (savavališki vienetai, aU); vien tik EHS matricos aktyvumas buvo atimtas iš bendro aktyvumo, kad būtų galima nustatyti dalį dėl šiame substrate kultivuotų AEC. ( C ir D ) TIMP veikla, įvertinta atvirkštine zimografija. ( C ) Tipiškos atvirkštinės CM zimogramos iš ląstelių, esančių CF, plastike, EHS ir CFL. MW, molekulinio svorio žymekliai; IC, vidinė kontrolė (Dulbecco modifikuota Eagle terpė - 10% FBS); rhTIMP-2, rekombinantinis žmogaus TIMP-2, naudojamas kaip teigiama kontrolė. Želatinolitikus slopinantis aktyvumas pasireiškė kaip teigiamos dažymo zonos su Coomassie mėlyna spalva; jos pagrindinės sritys yra 28 (TIMP-1: □) ir 21 kD (TIMP-2: ▪). ( D ) Densitometrinė analizė. Duomenys yra trijų nepriklausomų nustatymų (skirtingų ląstelių kultūros eksperimentų) vidurkis ± SE. Daugybė palyginimų atlikus Kruskal-Wallis analizę ir Mann-Whitney U testą. Reikšmingas B skirtumas: * p <0, 001 palyginti su pro-MMP-9 ant plastiko; ** p <0, 001 palyginti su MMP-9 ant plastiko; † p <0, 001 palyginti su pro-MMP-2 ant plastiko; ir ‡ p <0, 01 palyginti su MMP-2 ant plastiko. Reikšmingas D skirtumas: * p <0, 001 vs TIMP-1 ant plastiko; ** p <0, 01 palyginti su TIMP-1 CF; † p <0, 01 palyginti su TIMP-2 CF.

Visas dydis

DISKUSIJA

MMP / TIMP sistema vaidina pagrindinį vaidmenį epitelio ir mezenchiminės sąveikos metu, kuri yra būtina plaučių vystymuisi. Mes profiliavome pagrindinių MMP ir TIMP šeimų narių raišką įvairiuose etapuose išskirtuose plaučių fibroblastuose ir AEC ir preliminariai koreliavome variacijas su morfologiniais pokyčiais. Mes parodėme gana skirtingus ląstelių tipų modelius, kurie rodo, kad anksčiau pranešti viso plaučio pokyčiai nebuvo pakankamai informatyvūs, kad būtų galima suprasti visus padarinius vystymuisi.

Izoliuotų ląstelių naudojimas yra galimas šio tyrimo apribojimas, nes negalime atmesti galimybės, kad ląstelių išskyrimas galėjo tam tikru mastu pakeisti transkripcijos lygį. Tačiau tyrimas leido įrodyti vystymosi pokyčius, kurie greičiausiai nevyksta dėl ląstelių perdirbimo. Panašiai ir mažai tikėtina, kad mažas abipusis fibroblastų ir AEC užteršimas nepakeis rezultatų, nes vienos ląstelės tipo pokyčiai neatspindėjo kitos. Pavyzdžiui, ryškus MT1-MMP arba TIMP mRNR lygio padidėjimas fibroblastų ant pn3 metu nepakito ar sumažėjo AEC. Tokio galimo šališkumo iš tikrųjų būtų galima išvengti hibridizavus in situ arba imunohistochemija, tačiau šie metodai vargu ar gali tiksliai nustatyti kiekybinį nustatymą ir jiems nebetaikomi apribojimai. Taigi, kartais jie atnešė prieštaringų rezultatų: MMP-9 nebuvo išreikštas žiurkių vaisiaus plaučiuose (12) ir TIMP-1 vaisiaus triušio vaisiaus plaučiuose (7), arba, atvirkščiai, MMP-9 nebuvo išreikštas žiurkių vaisiaus vaisiuose (21). ) arba beždžionės (11) plaučių ir TIMP-1 beždžionės (11) arba žmogaus ir pelės (8) plaučiuose. Kitas apribojimas yra negalėjimas nustatyti MMP / TIMP aktyvumo šviežiai izoliuotose ląstelėse, nes terpės surinkimas su išleista medžiaga reikalauja kelių valandų auginimo, o tai galėjo sukelti dar didesnius pokyčius nei ląstelių izoliacija. Taigi, išskyrus ATI / ATII palyginimo atvejį, mes turėjome apsiriboti savo tyrimais tik prieš transliaciją ir daryti išvadą apie išraiškos pokyčius dėl numanomų aktyvumo pokyčių. Galiausiai, nors mes anksčiau parodėme, kad AEC, išskirti šia procedūra, ekspresuoja specifinius ATII žymenis (17), mes negalime atmesti galimybės, kad čia esančių ląstelių dalis, pažymėta AEC, iš tikrųjų buvo „Clara“ ląstelės, kurios taip pat ekspresuoja SP-B. Tačiau tai vargu ar turėjo įtakos mūsų pirminiam skirtumų tarp epitelio ląstelių ir fibroblastų radimui.

Pagrindinė išvada buvo reikšmingų MT1-MMP raiškos pokyčių lokalizavimas fibroblastuose alveoliarizacijos metu, o tai nebuvo akivaizdu ankstesniuose pasauliniuose profiliavimo tyrimuose (5) ar raiškos tyrimuose, įskaitant in situ hibridizaciją pelėse (13, 14). Be to, remiantis ankstesniais viso plaučių profiliavimo duomenimis (5), buvo netikėtas ryšys tarp MMP-2, TIMP ir MT1-MMP. Alveoliarizacija apima alveolinio maišelio proliferacijos periodą, kuris vyksta prieš gimimą, antrinio atsiskyrimo periodą, kuris vyksta nuo 4 iki 14 pn žiurkėje, ir galiausiai sienelių retinimo ir mikrovaskulinio brendimo periodą susiliejant dvigubam kapiliarų tinklui. vienas tinklas (2). Didžiausia MT1-MMP išraiška fibroblastuose tarp pn3 ir pn8, po to sumažėjus pn16, rodo ryšį su septacijos procesu. Be to, nors ir daug mažiau ryškus, tuo pačiu laikotarpiu maksimalus AEC lygis buvo pasiektas ir pn5. Ankstesnės pelių in situ hibridizacijos išvados , rodančios piko ekspresiją alveolių sienelėse aplink d 10, taip pat atitinka šią hipotezę (14). Didelė MT1-MMP išraiška šiuo laikotarpiu atitinka jos svarbų vaidmenį alveolių vystymuisi, kurį neseniai įrodė MT1-MMP turinčių pelių, kurioms trūko septacijacija (13, 14). Nors kiti ląstelių tipai, įskaitant endotelio ląsteles, taip pat galėtų prisidėti, mūsų išvados teigia, kad didelis fibroblastų indėlis gaminant MT1-MMP alveoliarizacijos metu. Kalbant apie jo veikimo mechanizmą, nors žinoma, kad MT1-MMP aktyvina pro-MMP-2 (22), atrodo, kad jo vaidmuo alveoliarizacijoje beveik nepriklauso nuo šio sugebėjimo (13, 14). Nuoseklios pelių, turinčių MMP-2, alveoliarizacijos trūkumai buvo tik riboti (12, 13), o plaučių vystymosi metu neradome reikšmingų MMP-2 ekspresijos pokyčių fibroblastuose. Atsižvelgiant į MT1-MMP ląstelių judrumą skatinančią ir invaziją skatinančią veiklą (23) ir, kita vertus, miofibroblastų migracijos reikalavimą elastinų nusėdimui ir alveoliarizacijai (24), iš kitos pusės, esminį MT1- MMP miofibroblastų migracijoje į vietas, kur antrinis septa viršįtampis yra tikėtina hipotezė. Kadangi MT1-MMP skatina neovessel susidarymą (25), jis taip pat gali būti lemiamas mikrovaskuliniam vystymuisi (13), kuris yra svarbus alveolarizacijos komponentas.

Priešingai nei fibroblastai, MMP-2 ekspresija AEC svyravo su raida, kuri greičiausiai turės funkcinę reikšmę. Pirmasis išraiškos pikas ant f19 greičiausiai koreliuoja su pamatinės membranos (BM) pertraukimų susidarymu po ATII, per kurias pėdos procesai išsikiša ir užmezga ryšį su lipofibroblastų (26, 27). ATII brendimas koreliuoja su padidėjusiu tų BM pertraukimų dažniu, kurie atrodo esminiai epitelio ir mezenchiminės sąveikos atvejais (26, 27). Įdomu tai, kad mūsų tyrimas taip pat parodė, kad ATII turi didesnį matricos proteolitinį potencialą nei ATI, o tai greičiausiai yra susiję su membranos nepertraukiamumo pirmuoju ryšiu su pirmuoju. Sutikdami su mūsų išvadomis, ant plastiko išauginti AEC pasižymėjo didesniu kolagenolitiniu aktyvumu po 2 d auginimo nei po 7 d (28), o tai greičiausiai atspindi ATII virsmą ATI fenotipu šiame substrate. Be to, sumažėjusi MMP-2 raiška, nustatyta AEC tarp f19 ir f21 (4 pav.), Gali atspindėti padidėjusią ATI proporciją tarp abiejų stadijų (2). Mažėjant gimimo momentui, pn5 buvo pastebėtas antrasis MMP-2 ekspresijos pikas. Jos reikšmė neaiški. Atrodo, kad tai nesusiję su BM netolygumais, kurie reguliariai mažėja po gimimo (27), ir, priešingai nei MT1-MMP ekspresijos pliusai fibroblastuose, jis nebuvo palaikomas per visą alveolių septaciją. Nepaisant to, buvo pranešta, kad kūdikiams, sergantiems bronchų ir plaučių displazija, sumažėjo MMP-2 ir padidėjo MMP-9 aktyvumas trachėjos nutekėjime (10, 11). Šie pokyčiai greičiausiai reiškia pakitusį epitelio ląstelių išsiskyrimą. Dėl ligos sutrikus alveolarizacijai, jie rodo padidėjusios epitelio MMP-2 ekspresijos svarbą, kai prasideda alveolarizacija, nors tikslus jos vaidmuo nežinomas.

Nustatyta, kad TIMP-1 ekspresija buvo minimali tiek fibroblastų, tiek AEC nėštumo pabaigoje ir sumažėjo subręstant AEC. Atitinkamose kanalų ir sakalų stadijose atsiranda ir vystosi oro-kraujo barjerai, sumažėja matricos medžiaga, padaugėja pėdų procesų. Darant prielaidą, kad atspindi aktyvumo pokyčiai, žemas TIMP-1 lygis gali skatinti proteolitinį aktyvumą, būtiną ECM suskaidyti šių procesų metu. Nors ir stulbinantys, pn3 fibroblastų TIMP-1 ir -2 išraiškos smailė, priešingai, gali būti nesusiję su konkrečiu vystymosi įvykiu, nes įvyksta tuo metu, kai plaučiuose nedaug pasikeičia po prenatalinės paviršiaus aktyviosios medžiagos kaupimosi ir prieš pradedant. alveoliarizacijos. Minoo ir kt. (29) anksčiau pranešė apie panašų TIMP-1 mRNR padidėjimą naujagimių babuinų visuose plaučiuose po priešlaikinio ar gimusio gimimo. Dėl jo buvimo neišnešiotiems naujagimiams buvo galima manyti, kad šis padidėjimas atsirado dėl kvėpavimo deguonimi pasekmės (29). Mūsų išvados greičiausiai atspindi tą patį reiškinį. Šio trumpalaikio padidėjimo reikšmė nėra aiški, tačiau, ar tai atsispindėjo didesniame TIMP aktyvume, panašu, kad tai gali būti siejama su ribotu ECM perstatymu po gimdymo. Pogimdyminiu būdu tiek TIMP-1, tiek -2 nuorašai AEC laipsniškai didėjo ir išliko maksimalūs tarp pn5 ir pn16. Fibroblastų, atvirkščiai, TIMP-1 ir -2 ekspresija sumažėjo nuo pn5 iki pn8 ir pasiekė ypač žemą pn16 lygį. Aukštas AEC lygis gali atitikti KM progresavimą ir stabilizavimąsi, kai rečiau pasitaiko pertraukimų (27). Santykinai aukštas TIMP ekspresijos lygis abiejuose skyriuose septavimo metu taip pat gali palengvinti antrinio apvalkalo susidarymą, ribodamas tirpaus elastino (tropoelastino) skilimą prieš stabilizuojantis kryžminiu ryšiu. Galiausiai, kadangi TIMP skatina ląstelių augimą nepriklausomai nuo jų MMP slopinančio poveikio (30, 31), aukštas TIMP lygis pogimdyminėmis savaitėmis gali prisidėti prie intensyvaus ląstelių dauginimo, stebimo visų tipų ląstelėms šiuo metu (2). Atitinkamai sumažėjęs TIMP ekspresija fibroblastuose, pasibaigus septacijai, gali koreliuoti su intersticinio skyriaus retinimu, kuris įvyksta šiame paskutiniame vystymosi etape (2).

Apskritai šis tyrimas suteikia naujų įžvalgų apie MMP / TIMP raišką besivystančiame plautyje, pabrėžiant skirtingų ląstelių atskyrimo svarbą. Siekiant užkirsti kelią ligoms, apimančioms MMP aktyvumo pokyčius, ypač bronhopulmoninei displazijai, turėtų būti užfiksuoti įvairių ląstelių skyrių pokyčiai.

Žodynas

AEC

alveolių epitelio ląstelės

ATI (II)

alveolinių I tipo (II tipo) ląstelių

CF

kolageno-fibronektino danga

CFL

kolageno-fibronektino-laminino 5 danga

CM

kondicionuota terpė

EHS matrica

Engelbreth-Holm-Swarm rūsio membranos matrica

f

vaisiaus diena

MMP

matricos metaloproteinazė

pn

pogimdyminė diena

SP-B

paviršinio aktyvumo baltymas B

TIMP

audinių metaloproteinazių inhibitorius