Diferencijuojant avių sarkomą nuo kitų apvaliųjų mėlynųjų ląstelių navikų, naudojant rt-pcr translokacijos skydą ant formalinu fiksuotų parafino įterptų audinių | šiuolaikinė patologija

Diferencijuojant avių sarkomą nuo kitų apvaliųjų mėlynųjų ląstelių navikų, naudojant rt-pcr translokacijos skydą ant formalinu fiksuotų parafino įterptų audinių | šiuolaikinė patologija

Anonim

Anotacija

Ewingo sarkoma yra dažnas kaulų ir minkštųjų audinių piktybinis navikas, dažniausiai pasireiškiantis vaikams ir jauniems suaugusiesiems. Atskirti Ewingo sarkomą nuo kitų apvaliųjų mėlynųjų ląstelių navikų gali būti diagnostinis iššūkis dėl jų panašumo histologijoje ir klinikiniame pavidale. Taigi, norint patvirtinti diagnozę, svarbu atlikti pagalbinius molekulinius tyrimus nustatant ligą apibrėžiančią translokaciją. Mes ištyrėme 65 apvalius mėlynųjų ląstelių navikus, įskaitant 53 Ewingo sarkomos pavyzdžius iš 50 unikalių atvejų. Mėginiai buvo apdoroti RNR iš archyvuotų formalinu fiksuotų parafino įterptų audinių blokų. Realaus laiko RT-PCR testai, būdingi Ewingo sarkomai ( EWS-FLI1 , EWS-ERG , EWS-ETV1 , EWS-ETV4 ir EWS-FEV ), sinovinei sarkomai ( SYT-SSX1 ir SYT-SSX2 ) ir rabdomiososarkomai ( PAW3). -FKHR ir PAX7-FKHR ) buvo tiriami mėginiuose. Translokacijos grupės jautrumas buvo 81% (43 iš 53 mėginių) diagnozuoti Ewingo sarkomą, kai histologiniai kriterijai buvo naudojami kaip „aukso“ standartas. Ne Ewingo mėginiuose nerasta nė vieno iš Ewingo specifinių perkėlimų (100% specifiškumas). Iš 43 mėginių, kuriuose buvo nustatyta translokacija, 26 (60%) buvo atlikta EWS-FLI1 1 tipo perkėlimas, 13 (30%) atlikta EWS-FLI1 2 tipo perkėlimas, 3 (7%) atlikta EWS-ERG perkėlimas, 1 EWS-ETV1 perkėlimas ir 1 mėginys turėjo tiek EWS-FLI1 1 tipo, tiek 2 tipo perkėlimą. Mūsų realiojo laiko RT-PGR tyrimas, skirtas aptikti sarkomos translokacijas, pasižymi dideliu jautrumu ir specifiškumu Ewingo sarkomai ir yra kliniškai naudingas diferencijuojant mažus apvalius mėlynųjų ląstelių navikus klinikinėje laboratorijoje.

Pagrindinis

Apvalieji mėlynųjų ląstelių navikai yra įvairi vėžio grupė, apimanti Ewingo sarkomos šeimą, rabdomiosarkomą, silpnai diferencijuotą sinovinę sarkomą, desmoplastinę sarkomą, neuroblastomą ir piktybinę limfomą. 1 Nors šių navikų histologija yra panaši, prognozė ir gydymas yra labai skirtingi. Dabar yra įvairių molekulinių metodų, kurie gali padėti atskirti šiuos navikų tipus. Pavyzdžiui, Ewingo sarkomos histologinę diagnozę galima patvirtinti imunohistochemija (CD99 teigiama, Fli1 teigiama) 2, 3 arba identifikuoti specifines chromosomų translokacijas, naudojant fluorescencinę in situ hibridizaciją arba RT-PGR. 4, 5, 6

Ewingo sarkoma dažniausiai pasireiškia paauglystėje skeleto ar ekstraskeleto vietose, o diagnozės nustatymo metu dažnai būna metastazių. Ewingo sarkomai būdingos subalansuotos translokacijos tarp EWS geno ir ETS šeimos narių. Maždaug 85% atvejų įvyksta EWS-FLI1 geno susiliejimas, kuriame ETS nuorašo DNR surišantis domenas susilieja su FLI1 transaktyvacijos domenu (t (11; 22) (q24; q12)). 7, 8 ∼ 60% atvejų, kai įvyksta EWS-FLI1 perkėlimas, EWS 1–7 egzonai yra sulieti su FLI1 6–9 egzonais (1 tipo sintezė). Likę atvejai, susiję su FLI1, atsiranda dėl EWS 1–7 egzonų prisijungimo prie FLI1 5–9 egzonų (2 tipo susiliejimas). 9 EWS perkėlimai, kuriuose ERG yra sintezės partneris (t (22; 21) (q22; q12)), yra antras dažniausiai pasitaikantis perkėlimas Ewingo mieste, kuris sudaro ∼ 10% atvejų. 7, 10, 11 Susiliejimai tarp EWS ir kitų ETS šeimos narių įvyksta rečiau, tačiau taip pat būdingi ir Ewingams : EWS-ETV1 t (7:22), EWS-ETV4 t (17; 22), EWS-FEV t (2; 22). 12, 13, 14, 15 Kiti mezenchiminiai navikai su specifinėmis translokacijomis, į kuriuos reikėtų atsižvelgti atliekant diferencinę Ewingo diagnozę, yra alveolinė rabdomiosarkoma ir sinovinė sarkoma.

Rabdomiosarkoma dažniausiai yra vaikų ir paauglių liga, sukelianti 5–8% vaikų vėžio. Alveolinė rabdomiosarkoma yra agresyviausia rabdomiosarkomos rūšis ir ją galima atskirti nuo embrioninės rabdomiosarkomos ir kitų mezenchiminių navikų nustatant PAX-FKHR geno translokaciją. ∼ 55% alveolių rabdomiosarkomos atvejų PAX3 genas, esantis 2q35 chromosomoje, yra greta FKHR geno, esantis 13q14 chromosomoje. Susiliejimai tarp PAX7 1p36 chromosomos ir FKHR geno sudaro ∼ 22% atvejų. Specifinis translokacijos tipas, taip pat naviko tipas, turi prognostinę reikšmę - alveolinės rabdomiosarkomos, kuriose yra PAX7-FKHR translokacija, paprastai yra mažiau invazinės ir geriau prognozuojamos nei tos, kurios susilieja su PAX3-FKHR . 16

Sinoviniai sarkomai dažnai būna per antrąjį gyvenimo dešimtmetį ir turėtų būti vertinami atliekant diferencinę diagnozę kartu su kitais mezenchiminiais navikais, atsirandančiais paauglystėje. Sinovijos sarkomos metu SYT genas, esantis 18 chromosomoje, yra sulietas su SSX genų šeimos nariu (t (X; 18) (p11; q11)). SSX genų šeimoje yra devyni nariai, visi susitelkę ant X chromosomos, o SSX1 ir SSX2 dažniausiai dalyvauja sinovijos sarkomoje . Susiliejimas su SSX1 genu sudaro ∼ 64% sinovijos sarkomų, o SSX2 genas yra susijęs su daugeliu kitų atvejų. Ladanyi ir kt. 17 pranešė, kad atvejų, susijusių su SYT-SSX1 geno susiliejimu, prognozė yra blogesnė, nors naujausiame Guillou ir bendradarbių 18, 19 tyrime reikšmingos koreliacijos nenustatyta.

Šiame tyrime buvo ištirti 65 apvaliųjų mėlynųjų ląstelių navikai, naudojant realaus laiko RT-PCR perkėlimo grupę, kad būtų galima aptikti genčių sintezės nuorašus, būdingus Ewingo sarkomai ( EWS-FLI1 , EWS-ERG , EWS-ETV1 , EWS-ETV4 ir EWS). -FEV ), sinovijos sarkoma ( SYT-SSX1 ir SYT-SSX2 ) ir rabdomiosarkoma ( PAX3-FKHR ir PAX7-FKHR ). Kito padalijimo vietos buvo aptiktos naudojant dvigubai pažymėtus zondus arba dsDNA dažą SYBR Green ir po amplifikacijos fluorescencinio lydymosi kreivės analizę. Mūsų translokacijos skydelis tiksliai nustato Ewingo sarkomą ir yra klinikinėje laboratorijoje naudingas diferencijuojantiems apvaliesiems mėlynųjų ląstelių navikams.

Rezultatai

Iš pradžių buvo 69 Ewingo sarkomos mėginiai, išgauti RNR iš formalinu fiksuoto parafino įterpto audinio. Dvylika (17%) nepavykusių RNR ekstrahavimo ir 4 (6%) buvo išskirtos dėl prastos mėginių kokybės, kurią nustatė vėlyvas Cp (> 35) namų tvarkymo kontroliniam genui. Nepavykus išgauti ar PGR nebuvo susijęs su mėginio amžiumi. Keturiasdešimt trim iš 53 (81%) Ewingo mėginių buvo aptinkama EWS translokacija, naudojant RT-PGR (2 lentelė). Iš 43 mėginių, kuriuose buvo nustatyta translokacija, 26 (60%) buvo atlikta EWS-FLI1 1 tipo perkėlimas, 13 (30%) atlikta EWS-FLI1 2 tipo perkėlimas, 3 (7%) atlikta EWS-ERG perkėlimas, 1 EWS-ETV1 perkėlimas ir 1 mėginys turėjo tiek EWS-FLI1 1 tipo, tiek 2 tipo perkėlimą. 2 paveiksle parodyti tipiniai EWS-FLI1 variantų aptikimo su sintezės specifiniais dvigubais ženklais pažymėti zondai ir EWS-ERG bei SYT-SSX genų susiliejimų aptikimas fluorescencinio lydymosi kreivės analize.

Image

Ewingo ir sinovijos sarkomos translokacijų aptikimas ir diferenciacija amplifikacijos kreivėmis ir T m . Kiekvienas mėginys paleidžiamas dviem egzemplioriais. a ) Fluorescencijos ir ciklo skaičiaus diagrama rodo amplifikacijos kreives, būdingas 1 tipo EWS-FLI1 ląstelių linijoje (A673) ir paciento mėginyje (03–344), tuo tarpu RDES ląstelių linijoje, kurioje yra tipas, amplifikacija nematoma. 2 translokacija. ( b ) Ląstelių linijos RDES ir paciento mėginio 02-060 amplifikacijos kreivės būdingos EWS-FLI1 2 tipo translokacijai, tuo tarpu A673 ląstelių linijoje, kurioje yra 1 tipo translokacija, amplifikacija nematoma. c ) Mėginiai amplifikuojami PGR, naudojant dsDNA dažą SYBR Green, ir atliekama lydymosi kreivės analizė po amplifikacijos. DF / dT ir fluorescencijos diagrama parodo būdingą kontrolinės plazmidės (pERG) ir paciento mėginio (EWS39) Tm, kuriame yra EWS-ERG translokacija. Ne Ewingo sarkomos mėginiai yra neigiami. ( d ) SYT-SSX genai yra atvirkščiai perrašomi, naudojant įprastus pradmenis, ir amplifikuojami naudojant SSX1 ir SSX2 specifinius pradmenis. Fluorescencinio lydymosi kreivės analizė išskiria SYT-SSX1 (FUSY1) nuo SYT-SSX2 (03–556) tuo, kad atkuriama T m pamaina yra 0, 5 ° C.

Visas dydis

Buvo 50 unikalių Ewingo atvejų, nes du pacientai turėjo kelis mėginius. Iš 50 pacientų, kuriems diagnozuota Ewingo liga, 41 (82%) pacientų EWS translokacija buvo nustatyta bent viename iš jų mėginių. Vienam iš tiriamųjų, iš kurio buvo gauti pakartotiniai mėginiai, atlikta EWS-FLI1 2 tipo translokacija pirminėje (šlaunikaulio) ir EWS-FLI1 1 tipo translokacija metastazėse (krūtinės ląstos sienelėje). Kitas tiriamasis asmuo turėjo tris mėginius, iš kurių du blokai buvo teigiami EWS-FLI1 2 tipo translokacijai, o kitas blokas neturėjo aptinkamų nuorašų.

RT-PGR translokacijos grupės jautrumas (TP / (TP + FN)) ir specifiškumas (TN / (TN + FP)) buvo nustatyti Ewingo sarkomai, naudojant histologinę diagnozę kaip aukso standartą. Ewingo mėginiai, kurie neturėjo aptinkamo EWS translokacijos, buvo tiriami išplėstiniame translokacijos skydelyje, nė vienas neturėjo kito tipo perkėlimo. Be to, translokacijos grupė buvo išbandyta su kitais apvaliųjų mėlynųjų ląstelių mėginiais (dviem neuroblastomais, viena leiomyosarcoma, viena desmoplastine sarkoma, trimis sinovijos sarkomomis ir keturiais rabdomyosarcomos mėginiais) ir klaidingų teigiamų rezultatų nebuvo. Apskritai, perkėlimo skydelyje buvo 81% jautrumas ir 100% specifiškumas Ewingui.

Diskusija

Apvalieji mėlynųjų ląstelių navikai gali labai sutapti epidemiologijoje, histologijoje ir imunofenotipuose. Pavyzdžiui, rabdomiosarkomas, kurioms trūksta mioblastinės diferenciacijos, gali būti sunku atskirti nuo kitų apvalių ląstelių neoplazmų, tokių kaip Ewingas. Be to, sinoviniai sarkomai gali turėti morfologijų spektrą nuo verpstės formos iki apvalių į epitelį panašių ląstelių, kurios gali priminti kitus mezenchiminius ir nemezenchiminius navikus. Imunohistocheminiai žymekliai gali padėti atlikti diferencinę diagnozę, tačiau dabartinių plokščių specifiškumas yra ribotas. Dėl šios priežasties fluorescencinė in situ hibridizacija buvo naudinga sudėtingais atvejais. Pavyzdžiui, buvo pranešta apie kelis sarkomų, įtariamų kaip desmoplastiniai mažų apvalių ląstelių navikai, ar osteosarkomų atvejus, kai atlikus translokacijos analizę buvo nustatyta, kad būdingi Ewingo EWS-FLI1 perkėlimai. 26, 27, 28, 29 Nors fluorescenciniai in situ hibridizacijos zondai, naudojami skylant, yra naudojami kliniškai, dauguma tyrimų neatskiria specifinio sintezės tipo (pvz., EWS-FLI1 1 ir 2 tipo). 5, 30

Naudodamiesi RT-PCR translokacijos skydeliu, mes nustatėme, kad 81% Ewingo mėginių buvo atlikta EWS translokacija, ir tai atitinka ankstesnes ataskaitas, įvertinančias 85% dažnį. 7, 8 Buvo papildomų 16 Ewingo mėginių, kurie buvo atmesti dėl žemos RNR kokybės ar kiekio. Šie mėginiai pašalinami iš analizės iš anksto, kad jie nepaveiktų tyrimo jautrumo. Nors daugumoje Ewingo mėginių buvo atlikta EWS-FLI1 translokacija, mes taip pat nustatėme EWS-ERG geno sintezę trijuose mėginiuose ir EWS-ETV1 geno sintezę viename mėginyje. Nei viename mėginyje nebuvo persikėlimų, susijusių su EWS-FEV ar EWS- ETV4 perkėlimais, kuriuos kiti aptiko tik retai. 12, 13, 14, 15, 31 Galiausiai nė viename iš 11 ne Ewing mėginių nebuvo EWS sintezės.

Vienu atveju radome EWS-FLI1 1 ir 2 tipo sintezės transkriptus, egzistuojančius tame pačiame pavyzdyje. Anksčiau buvo pranešta apie tai, kad Ewingo ir sinovijos sarkoma sergantys pacientai gali apibrėžti translokacijas. 1, 32 Skirtingi to paties paciento identifikuoti suliejimo nuorašai gali būti paaiškinti nepriklausomais chromosomų suliejimo įvykiais arba pakaitomis įvykstančiais sujungimo atvejais, vykstančiais tose pačiose arba skirtingose ​​ląstelėse. Bielack ir kt. 33 pranešė apie dviejų pirminių Ewingo sarkomų, susijusių su tuo pačiu pacientu, apibūdinamą skirtingais perkėlimais, atvejį, kas rodo, kad perkėlimai buvo nepriklausomi įvykiai, atsirandantys dėl skirtingų klonų. Čia pateikiamas atvejis, kai pirminio tipo 2 tipo translokacija ir metastazė yra 1 tipo. Darant prielaidą, kad metastazės atsirado dėl pirminės, tai rodo, kad įvyko arba kitas chromosomų suliejimo įvykis, ir pirmoji translokacija buvo prarasta iš ląstelės, arba splaisinge įvyko jungiklis. Nežinia, ar 5 egzono praradimas prisidėjo prie metastazavimo potencialo, ar buvo atsakingi kiti pakitimai.

Tyrimai rodo, kad EWS sintezės tipas gali turėti prognostinę reikšmę, nes 1 tipo pacientams, sergantiems lokalizuota liga, yra mažesnis proliferacija ir geresni rezultatai. 34, 35, 36 Tačiau statistiškai sunku įrodyti Ewingo pacientų rezultatų skirtumus pagal sintezės tipą dėl ligos retumo ir ankstesnių techninių iššūkių sprendžiant skirtingus sintezės tipus. Reikės atlikti didelio masto retrospektyvius tyrimus, kad būtų galima nustatyti, ar mūsų tyrimas turi ir prognozinę, ir diagnostinę reikšmę.

Hematologinių piktybinių navikų ir minkštųjų audinių navikų translokacijų identifikavimui buvo naudojamos įvairios realaus laiko PGR metodikos. Pavyzdžiui, dvigubai pažymėti zondai buvo naudojami aptikti translokacijas lėtinėje mieloidinėje leukemijoje ( BCR-ABL nuorašas) ir sinovijos sarkomoje ( SYT-SSX nuorašai), siekiant nustatyti MBR buvo naudojama 37, 38, 39 ir fluorescencinio lydymosi kreivės analizė. -JH translokacija folikulo limfomos atvejais. 40 Sprendimas, ar naudoti kaip zondą sekos specifinius zondus, ar dsDNR dažus, priklauso nuo sintezės partnerių sekų ir nuo skiriamosios gebos, reikalingos norint atskirti skirtingus sintezės tipus. Apskritai, dsDNR zondai yra pigesni ir techniškai lengvesni, todėl jie yra patraukli alternatyva sekos specifiniams zondams. Mes nustatėme, kad mes galime atskirti skirtingus SYT-SSX susiliejimus, naudodami fluorescencinio lydymosi kreivės analizę ir dsDNA dažą SYBR Green. Tai buvo įmanoma, nes SSX1 ir SSX2 sekos buvo pakankamai skirtingos, kad būtų sukurtas charakteringas T m kiekvienam suliejimo tipui. Priešingai, EWS-FLI1 susiliejimus geriausiai išskyrė sekai būdingi zondai.

Realaus laiko PGR naudojimo pranašumai, palyginti su įprasta PGR su gelio elektroforeze, yra tai, kad padidėja jautrumas, mažiau manipuliuojama mėginiu, spartesni rezultatai ir galimybė kiekybiškai įvertinti. Pavyzdžiui, BCR-ABL nuorašo kiekio kraujyje ir kaulų čiulpuose stebėjimas buvo naudingas nustatant lėtinės mieloleukemijos atkrytį. 37, 38 Taigi, mūsų translokacijos testai taip pat galėtų būti kiekybiškai naudojami stebint minimalią liekamąją ligą sarkomose.

Apibendrinant, mes sukūrėme translokacijos grupę, skirtą tiksliai nustatyti Ewingo sarkomą, sinovinę sarkomą ir rabdomisarkomą. Mūsų realiojo laiko RT-PGR tyrimai leidžia greitai nustatyti šių sarkomų specifinius translokacijas. Skirtingų genų sintezės partnerių identifikavimas gali suteikti esamų fluorescencijos in situ hibridizacijos tyrimų prognostinę vertę. RT-PGR skydą galima panaudoti klinikinėje laboratorijoje diagnozuojant sarkomus iš formalinu fiksuoto parafino įterpto audinio ir galėtų būti naudojama stebint minimalią likutinę ligą.