Tiesioginė vėžio ir stromos sąveika padidina fibroblastų proliferaciją ir sustiprina invazines skirrozinio tipo skrandžio karcinomos ląstelių savybes | britų žurnalas apie vėžį

Tiesioginė vėžio ir stromos sąveika padidina fibroblastų proliferaciją ir sustiprina invazines skirrozinio tipo skrandžio karcinomos ląstelių savybes | britų žurnalas apie vėžį

Anonim

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Pagrindiniai faktai:

Scirrhous tipo skrandžio karcinoma (SGC) rodo plačią poodinio audinio fibrozę ir ypač prastą paciento prognozę. Mes ištyrėme vėžio ir stromos sąveikos svarbą SGC histogenezėje.

Metodai:

Skrandžio fibroblastai NF-25 ir žarnyno fibroblastai NF-j2 buvo kultivuojami kartu su SGC išvestomis (HSC-39) arba ne iš SGC išvestomis (HSC-57 ir HSC-64) ląstelėmis. Norint nustatyti genus, kurių NF-25 yra padidinta arba sumažinta, buvo atlikta papildomos DNR (cDNR) mikrotraumos analizė. Antikūnas prieš kraujagyslių ir ląstelių adhezijos molekulę-1 (VCAM-1) buvo naudojamas ląstelių augimo tyrimui ir imunohistochemijai. Be to, buvo tiriamas sąveikos su NF-25 fibroblastų poveikis HSC-39 ląstelėms, naudojant Western blot ir atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininę reakciją.

Rezultatai:

HSC-39 ląstelės stimuliavo NF-25 augimą, bet ne NF-j2 augimą, kai jos buvo kultivuojamos. Buvo nustatyta VCAM-1 indukcija NF-25 fibroblastuose, kurie buvo specifiški, kai buvo auginami kartu su HSC-39, bet ne su iš SGC neišvestomis HSC-57 ir HSC-64 ląstelėmis. Neutralizuojantis VCAM-1 antikūnas slopino NF-25 augimą priklausomai nuo dozės. Audinių mėginiuose teigiamas VCAM-1 imunoreaktyvumas SGC išvestiniuose fibroblastuose buvo žymiai didesnis nei ne iš SGC išvestų fibroblastų. Be to, sąveika su NF-25 fibroblastais ne tik sukėlė epitelio ir mezenchiminio pereinamojo tipo pokyčius, bet ir su matricos metaloproteinaze susijusių genų ekspresiją HSC-39 ląstelėse.

Išvada:

Tiesioginė SGC ląstelių ir skrandžio fibroblastų sąveika sukuria naviko mikroaplinką ir sustiprina SGC agresyvumą.

Pagrindinis

Scirrinės tipo skrandžio karcinoma (SGC), dar vadinama difuzinio tipo skrandžio karcinoma arba linito plastica, būdinga difuzinė infiltracija ir greitas vėžio ląstelių dauginimasis, lydimas ekstensyvios poodinės fibrozės ir dėl to susidarančios skaidulinės sienelės storėjimo (Otsuji ir kt., 2004). ). Pacientų, sergančių SGC, prognozė yra labai prasta, daugiausia dėl dažno limfmazgių metastazių ir vėžio ląstelių pasiskirstymo peritoniniu būdu; todėl tapo būtina suprasti šių SGC savybių molekulinį mechanizmą kuriant naujus gydymo metodus (Ikeguchi ir kt., 2004; Nakamura ir kt., 2006).

Sergant vėžiu, stromos pokyčiai invaziniame fronte yra pripažįstami „desmoplastiniu atsaku“, kuris gali turėti didelę įtaką vėžio ląstelių dauginimuisi ir invaziškumui (De Wever ir Mareel, 2003). Su vėžiu susiję fibroblastai (CAF), kuriuos sudaro fibroblastai ir miofibroblastai, sukuria vėžio ir stromos sąveiką dviem skirtingais mechanizmais: efektiniu keliu ir aferenciniu keliu (Hwang ir kt., 2008). Efektyviame kelyje rasta įvairių autokrininių ir paracrininių mediatorių, įskaitant augimo faktorius, citokinus ir interleukinus. Visų pirma, β augimo faktoriaus transformacija labai skatina ne tik CAF chemotaksę (Postlethwaite ir kt., 1987), bet ir neinvazinių pažeidimų virsmą invaziniais (Cui ir kt., 1996). Be to, buvo įrodyta, kad keli veiksniai, apimantys keratinocitų augimo faktorių (Nakazawa ir kt., 2003), hepatocitų augimo faktorių (Tendo ir kt., 2005) ir interleukino-1 β (Yashiro ir kt., 2007), yra svarbūs mediatoriai, aktyvuojantys paracriną arba autokrininę signalizaciją. tarp SGC ląstelių ir CAF, visa tai skatina naviko augimą ir progresavimą. Savo ruožtu afektiniame kelyje tiesioginė vėžinių ląstelių ir CAF sąveika sukelia įvairius tarpląstelinius signalizacijos kelius; pavyzdžiui, manoma, kad ląstelių adhezijos molekulė N-kadherinas vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant daugelį tarpląstelinių reakcijų, kurios suaktyvina vėžio ląstelių judrumą ir invaziją (Hazan ir kt., 2000). Taigi mikroaplinka, skirta pagreitinti vėžio ląstelių invaziją ir progresavimą, yra sudėtingai sudaryta sąveikaujant su CAF. Be to, buvo pasiūlyta organams būdingų fibroblastų reikšmė krūties vėžio ląstelių proliferacijai ir invazijai (Yashiro ir kt., 2005); tačiau mažai žinoma apie skrandžio fibroblastų, kaip CAF, vaidmenį SGC progresavimo metu.

Paprastai manoma, kad epitelinis – mezenchiminis perėjimas (EMT) ir tarpląstelinės matricos (ECM) degradacija yra ankstyvieji reiškiniai, keliantys daugiapakopę naviko invaziją ir metastazes. EMT yra morfogeninis procesas, kurio metu ląstelės praranda epitelio savybes, tokias kaip ląstelių poliškumas ir kontaktas su ląstelėmis, ir įgyja mezenchimines savybes, tokias kaip padidėjęs judrumas (Berx ir kt., 2007). Nors EMT iš pradžių buvo aprašytos vykdant embriogeninį vystymąsi (Duband ir kt., 1995; Shook ir Keller, 2003), sukaupti įrodymai rodo, kad jis vaidina lemiamą reikšmę naviko invazijai ir metastazėms, ypač atsiskyrimo ir vėžio ląstelių migracija iš pirminio naviko ir metastazavusių vietų nustatymas tolimuose organuose (Thompson ir kt., 2005). Vėžinių ląstelių EMT dažnai sukelia įvairūs transkripcijos veiksniai, tokie kaip sraigė, vytis ir šliužas (Lombaerts ir kt., 2006), dėl to sumažėja epitelio žymenų, tokių kaip E-kadherinas, ir padidėja mezenchiminių žymenų, tokių kaip vimentinas, reguliavimas. SGC buvo pranešta apie į mezenchiminius panašius genus, kuriuos sukelia ežys transkripcijos faktorius, išsilaikymą (Ohta ir kt., 2009). Kita vertus, pusiausvyra tarp matricinių metaloproteinazių (MMP) ir audinių metaloproteinazių inhibitorių gamybos lygių lemia ECM skilimo galimybes. Padidėjęs MMP ekspresijos lygis buvo užfiksuotas esant įvairiems žmogaus piktybiniams navikams (Liotta ir kt., 1991) ir MMP2 perdėtai ekspresijai ir yra glaudžiai susijęs su dideliu invazijos ir metastazių dažniu (Nomura ir kt., 1996), kurį suaktyvina membranos tipas. 1-MMP (MT1-MMP) (Sato ir kt., 1994). Taigi norint suprasti SGC biologines, histopatologines ir klinikines savybes, reikalingi įvairūs eksperimentiniai metodai.

Šiame tyrime mes bandėme nustatyti naujus specifinius veiksnius, kurie gali pakisti skrandžio fibroblastuose, kai jie inkubuojami kartu su SGC gautomis ląstelėmis. Genai, diferencijuoti skrandžio fibroblastų, esant arba neturint tiesioginės bendros kultūros su SGC ląstelėmis, buvo tiriami naudojant papildomos DNR (cDNR) mikrotraumos analizę. Be to, buvo įvertintas sąlyčio su ląstelėmis poveikis invazinėms SGC ląstelių savybėms, siekiant suprasti vėžio ir stromos sąveikos biologinę reikšmę SGC histogenezėje.

medžiagos ir metodai

Ląstelių linijos ir ląstelių augimo tyrimas

Žmogaus SGC ląstelių liniją HSC-39 (20 pasažas) ir ne SGC ląstelių linijas HSC-57 (10 pasažas) ir HSC-64 (10 passage) pateikė dr. Yanagihara (Nacionalinis vėžio instituto tyrimų centras, Tokijas, Japonija). HSC-39 ląstelės (kloninės) buvo gautos iš 54 metų vyro, sergančio SGC, pilvaplėvės ascito (žiedo ląstelių karcinoma; Yanagihara ir kt., 1991). HSC-57 (kloninės) ir HSC-64 (kloninės) ląstelės buvo gautos iš pacientų, sergančių gerai ir blogai diferencijuoto skrandžio adenokarcinoma, ascito (duomenys neskelbtini). NF-25 fibroblastai (heterogeniniai, 4 pasas) buvo nustatyti iš 77 metų vyro, sergančio ankstyva skrandžio karcinoma, kuriam atlikta distalinė gastrektomija. Skrandžio fibroblastai iš navikinės sienelės buvo kultivuojami ir išskirti. NF-j2 fibroblastai (heterogeniniai, 4 pasas) taip pat buvo išskirti iš kasos vėžiu sergančio vyro žandikaulio. Ligoniui buvo atlikta kasos kūnelių mazgo pašalinimo operacija, o fibroblastai buvo gauti iš vėžinės be žarnos sienos. Ląstelės buvo reguliariai palaikomos RPMI-1640, papildytame 10% vaisiaus galvijų serumu. NF-25 ir NF-j2 fibroblastai, pasėti 1, 0 × 105 ląstelių, kurių šulinėlių plokštelės −1 tankis, šešių šulinėlių plokštelėse, buvo inkubuojami, jei nebuvo arba nebuvo tiesioginio to paties skaičiaus HSC-39 ląstelių koekskubacinio inkubavimo. Netiesioginiam inkubavimui su HSC-39 ląstelėmis buvo naudojama 1 μm dydžio poros dydžio Boydeno kamera (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, JAV). Mes suskaičiavome ląstelių skaičių su ląstelių skaičiavimo kamera. HSC-39 ląstelėms atskirti nuo kartu inkubuotų NF-25 ir NF-j2 fibroblastų buvo naudojama „Dynabeads Epithelial Enrich“ sistema (Dynal Biotech ASA, Oslas, Norvegija). NF-25 fibroblastų skaičius buvo suskaičiuotas, jei nėra arba nėra neutralizuojančių antikūnų prieš kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulę-1 (VCAM-1) (Santa Krusas, Santa Krusas, Kalifornija, JAV) ir integrino- α 4 (Santa Krusas). .

Imunofluorescencija

Dvidešimt keturias valandas po bendro auginimo HSC-39 ląstelės ir NF-25 fibroblastai kamerų stikleliuose buvo fiksuojami 4% formalinu ir inkubuojami blokuojančiu tirpalu, kuriame yra 1% galvijų serumo albumino. Ląstelės buvo inkubuotos su antikūnais prieš vimentiną (skiedimas santykiu 1: 1000; Dako, Glustrup, Danija), citokeratinu (skiedimas santykiu 1: 1000; Dako) ir VCAM-1. Po plovimo stikleliai buvo inkubuojami su antriniais antikūnais, su Cy2 konjuguotų antivirusinių pelių ir Cy3 konjuguotų anti-triušio IgG antikūnų mišiniu (skiedimas santykiu 1: 10 000).

cDNR mikrotraumos analizė

Visa RNR buvo ekstrahuota iš NF-25 fibroblastų (vienos kultūros ir kartu auginamų su HSC-39) naudojant RNeasy rinkinį (Qiagen, Hilden, Vokietija). „IntelliGene HS Human Expression CHIP“ („Takara Bio“, Otsu, Japonija) paruošė cDNR mikrotraumą, kuriame yra 16 600 apibūdintų žmogaus genų zondai ir išreikštos sekos žymės. In vitro transkripcija, oligonukleotidų matricos hibridizacija ir skenavimas buvo atlikti pagal „Takara Bio“ instrukcijas. Trumpai tariant, iš visos RNR buvo susintetinta dvigrandė cDNR ir buvo paženklinta RNR fluorescencijos ženklinimo šerdies rinkiniu (Takara Bio). Tada masyvai buvo nuskaityti naudojant „GeneArray“ skaitytuvą („Agilent Technologies“, Palo Alto, Kalifornija, JAV), norint gauti vaizdo ir signalo intensyvumą. Po duomenų normalizavimo buvo atlikta mikrotrauminio (SAM) grafiko analizės reikšmingumo analizė ir pagal gamintojo instrukcijas buvo identifikuoti reikšmingai pakitę genai (//chem.agilent.com).

Imunohistochemija

Iš viso buvo panaudoti 37 formalinu fiksuoti ir parafinu įterpti mėginiai iš sporadinių SGC ir ne SGC, chirurginiu būdu pašalinti Kobės universiteto ligoninėje (Kobė, Japonija). Nė vienu iš šių atvejų prieš operaciją nebuvo taikoma adjuvanto chemoterapija ar radioterapija. Iš visų pacientų buvo gautas informuotas sutikimas, o tyrimui pritarė Kobės universiteto institucinė apžvalgos taryba. Histologinis tyrimas buvo atliktas pagal Japonijos skrandžio karcinomos klasifikaciją (Japonijos skrandžio vėžio asociacija, 1999). Buvo naudojama modifikuota imunoglobulino fermento tilto metodo versija su LSAB rinkiniu (Dako). Trumpai tariant, parafinuoti ir rehidruoti 4 μm pjūviai buvo autoklavuojami, kad būtų gautas antigeniškumas. Užblokavus endogeninę peroksidazę ir nespecifines surišimo vietas, buvo taikomi antikūnai prieš VCAM-1 (skiedimas santykiu 1: 200), E-kadherinas (skiedimas santykiu 1: 200; Dako) ir sraigė (skiedimas santykiu 1: 100; Abcam, Cambrige, JK). į skyrius. Po to sekcijos buvo inkubuotos su biotiniluotu ožkų antivirusiniu pelės arba anti-triušio IgG (skiedimas santykiu 1: 10 000) ir streptavidinu konjuguotas su krienų peroksidaze (HRP). Chromogeninė fiksacija buvo atlikta panardinant sekcijas į 3, 3′-diaminobenzidino tirpalą. Skyriai buvo apdengti Mayerio hematoksilinu. Kiekvienos molekulės imunoreaktyvumo laipsniai buvo suskirstyti pagal nudažytų ląstelių skaičių ir dažymo intensyvumą atskirose ląstelėse: (-), beveik nėra teigiamų ląstelių arba 30% navikinių ląstelių, turinčių silpną imuninę reakciją, arba naviko ląstelių, pasižyminčių stipriu imunoreaktyvumu.

Vakarų pūtimas

Ląstelės buvo lizuotos buferiniame tirpale, kuriame yra 50 mM Tris-HCl (pH 7, 4), 125 mM NaCl, 0, 1% Triton X-100 ir 5 m M etilengndiamintetraacto rūgšties, turinčios 1% proteazės inhibitoriaus kokteilio (Sigma, St Louis, MO, JAV). Baltymai (20 μg ) buvo atskirti natrio dodecilsulfato ir poliakrilamido gelio elektroforeze, po to elektrotransportu perduodant ant Hybond C membranos (Millipore, Bedford, MA, JAV). Po kraujo aptikimo antikūnais prieš VCAM-1 (skiedimas santykiu 1: 1000), integrino- α 4 (skiedimas santykiu 1: 1000), FAK (skiedimas santykiu 1: 1000; Santa Krusas), paksilinu (skiedimas santykiu 1: 1000; BD transdukcija, Lexington, KY), JAV), E-kadherinas (skiedimas santykiu 1: 1000), vimentinas (skiedimas santykiu 1: 1000), sraigė (skiedimas santykiu 1: 500) ir β- aktinas (skiedimas santykiu 1: 10000; Sigma), HRP konjuguota antivirusinė pelė arba - triušio IgG (skiedimas santykiu 1: 10000, „GE Healthcare“, Little Chalfont Buckinghamshire, UK) buvo naudojami kaip antriniai antikūnai. Signalai buvo vizualizuoti sustiprinta chemiliuminescencija.

RT – PGR

Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (RT – PGR) buvo atlikta naudojant „OneStep RT – PCR“ analizės rinkinį (Qiagen). Šiame tyrime naudojami pradmenų rinkiniai buvo parodyti 1 lentelėje. Kiekvienas 25 μl reakcijos mišinys, kuriame yra 10 ng visos RNR, buvo amplifikuotas 30 ciklų tokiu režimu: atvirkštinė transkripcija 50 ° C temperatūroje 30 minučių; denatūracija 94 ° C temperatūroje 30 s; atkaitinimas 58 ° C temperatūroje 30 s ir ilginimas 72 ° C temperatūroje 1 min. Produktams buvo atlikta elektroforezė su 2% agarozės geliu.

Pilno dydžio lentelė

Rezultatai

Bendro inkubavimo su SGC ląstelėmis poveikis fibroblastų dauginimuisi

Norint ištirti SGC ląstelių poveikį skrandžio fibroblastų proliferaciniam aktyvumui, buvo suskaičiuotas NF-25 skrandžio fibroblastų, kultivuotų esant arba iš SGC išvestų HSC-39 ląstelių, skaičius. HSC-39 ląstelės iš pradžių buvo sukurtos iš paciento, turinčio SGC, ascito, ir ląstelės, todėl nepasižymi tipiška prigludusių ląstelių forma, bet sudaro kolonijas, kai nėra NF-25 fibroblastų; nepaisant to, HSC-39 ląstelės tiesiogiai prisitvirtino ir surinko su NF-25 fibroblastų auginimo indo apačioje, nors šių linijų morfologiniai pokyčiai nepastebėti (1A pav.). Be to, NF-25 fibroblastų skaičius dramatiškai padidėjo, kai ląstelės buvo kultivuojamos kartu su HSC-39 ląstelėmis ( P <0, 001; 1B paveikslas). Norint ištirti galimą tirpių veiksnių poveikį auginimo terpėje, NF-25 fibroblastai ir HSC-39 ląstelės buvo atskirai prižiūrimi naudojant 1 μm porų dydžio „Boyden Chamber“ intarpus; tačiau reikšmingo ląstelių proliferacijos padidėjimo nenustatyta (1B paveikslas).

Image

Ląstelių ir ląstelių kontaktas su SGC gautomis HSC-39 ląstelėmis padidino NF-25 skrandžio fibroblastų augimą. ( A ) NF-25 fibroblastų, auginamų kartu su HSC-39 ląstelėmis, imunofluorescencija. NF-25 fibroblastai ir HSC-39 ląstelės buvo dažytos vimentinu (žaliu) ir citokeratinu (raudonu) (× 200). ( B ) NF-25 skrandžio fibroblastų ir NF-j2 žarnyno fibroblastų augimo kreivės, esant arba neinvestuojant kartu su HSC-39 ląstelėmis. Prieš suskaičiuojant NF-25 ir NF-j2 fibroblastų skaičių, HSC-39 ląstelės, kultivuojamos kartu, buvo išskirtos atskiriant jas magnetinių granulių metodu. Tiriant tirpių veiksnių poveikį, NF-25 fibroblastai ir HSC-39 ląstelės buvo atskirai prižiūrimi naudojant 1 μm poros dydžio „Boyden Chamber“ įdėklus. * <0, 01.

Visas dydis

Yanagihara ir kt. (2004) anksčiau pranešė, kad ortotopinis HSC-44PE SGC ląstelių implantavimas sukėlė ksenografą skrandyje, pasireiškiantį plačia fibroze, turinčia tik nedidelę naviko ląstelių infiltraciją; tačiau toks fibroblastų plitimas nebuvo pastebėtas metastazavusiose vietose, įskaitant odą, limfmazgį ir plaučius, ir tai rodo, kad šis reiškinys yra ortotopinis. Taigi, mes tada įvertinome NF-j2 žarnyno fibroblastų proliferacinį aktyvumą, norėdami išsiaiškinti, ar bendros kultūros su HSC-39 ląstelėmis poveikis yra specifinis audiniams, ar ne. HSC-39 ląstelės neparodė ląstelių-ląstelių kontakto su NF-j2 fibroblastų, kai jos buvo auginamos kartu ir auginamos virš NF-j2 fibroblastų. NF-j2 fibroblastų ląstelių augimas nebuvo indukuotas (1B paveikslas).

Skrandžio fibroblastų SGC ląstelės specifiškai indukuoja VCAM-1 ekspresijos reguliavimą

Norėdami nustatyti molekules, kurių aukščiau ir aukščiau yra reguliuojami NF-25 fibroblastai, mes atlikome cDNR mikrotraumos analizę, naudodami bendras RNR iš NF-25 fibroblastų, auginamų esant arba neturint HSC-39 ląstelių (2A pav.). NF-25 fibroblastų, inkubuotų su HSC-39 ląstelėmis, genų ekspresijos profilio pokyčiai, palyginti su NF-25 fibroblastų, kurie nebuvo ko-kultivuoti su HSC-39 ląstelėmis, pokyčiams, nedalyvavo daug genų: po normalizacijos ir Neapdorotų duomenų patikslinimas nustatė, kad statistiškai reikšmingus skirtumus rodo 233 genai (> 2, 5 karto padidinto reguliavimo, 107 genai ir <0, 4 karto labiau sureguliuoti, 126 genai) (2B paveikslas). Mikrorajono analizės tikslumas buvo patvirtintas realiu laiku atlikus šešių atsitiktinai parinktų diferencijuotai išreikštų genų ekspresijos RT – PCR analizę, nes rezultatai parodė gerą atitikimą mikrotrauminio duomenims, atsižvelgiant į genų raiškos pokyčius kartų (duomenys nepateikti). . Iš 13 paveiktų su adhezija susijusių genų (padidinto, aštuonių ir žemai sureguliuotų, penki genai; 2 lentelė), mes galiausiai nusprendėme sutelkti dėmesį į VCAM-1 geno nuorašą (GDB prisijungimo Nr. NM_001078.2), kuris parodė 4.60- kartų padidintas NF-25 fibroblastų, auginamų kartu su HSC-39 ląstelėmis, reguliavimas.

Image

Genų, diferencijuotų NF-25 skrandžio fibroblastų atžvilgiu, identifikavimas, esant arba nesant ląstelių-ląstelių kontaktui su HSC-39 ląstelėmis. ( A ) cDNR mikrotraumos strategijos iliustracija. NF-25 fibroblastai (1 × 105 ląstelių lėkštelėje –1 ) buvo palaikomi 48 valandas, esant HSC-39 ląstelėms ar jų neturint (1 × 105 ląstelių lėkštelėje –1 ). HSC-39 ląstelės buvo atskirtos praturtinus magnetines granules epitelio ląstelėmis. ( B ) SAM grafiko analizės rezultatai. Cy5 teigiami (šviesiai mėlyni), genai, padidinti NF-25 fibroblastų kartu auginamose HSC-39 ląstelėse; Cy3 teigiami (žali), genai, kurių padidėjęs reguliavimas yra NF-25 fibroblastuose; teigiami (mėlyni), vienodai išreikšti genai ir neigiami (raudoni), genai, kurie nebuvo išreikšti.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Toliau mes patvirtinome, ar VCAM-1 indukcija NF-25 fibroblastuose yra specifinis SGC įvykis ar gali būti matomas su ne SGC ląstelėmis. VCAM-1 indukcija tiek mRNR, tiek baltymų lygiu buvo dramatiškai stebima, kai NF-25 fibroblastai buvo inkubuojami su HSC-39 ląstelėmis (3A ir B paveikslai). NF-25 fibroblastų VCAM-1 baltymas, ekspresuojamas ląstelės membranoje, su specifine verpstės morfologija (3C pav.). Vis dėlto NC-25 fibroblastų VCAM-1 ekspresijos lygio indukcija nebuvo rasta, kai jie buvo auginami kartu su HSC-57 ir HSC-64 ląstelėmis, kurios abi buvo nustatytos iš pacientų, turinčių ne SGC.

Image

VCAM-1 ekspresijos indukcija skrandžio fibroblastų NF-25 metu yra tiesiogiai sukeliama tiesioginės sąveikos su HSC-39 ląstelėmis. NF-25 fibroblastai 48 valandas buvo inkubuojami su HSC-39 (gauta iš SGC), HSC-57 (nepatenka iš SGC) ir HSC-64 (nepatenka iš SGC). Vėžio ląstelės buvo atskirtos magnetinių granulių epitelio praturtinimu. ( A ) RT – PGR analizės rezultatai. Β-aktino ekspresijos lygiai buvo naudojami kaip kontrolė. ( B ) Vakarų balinimo rezultatai. Kaip kontrolė buvo naudojami β - aktino ekspresijos lygiai. ( C ) NF-25 fibroblastų imunofluorescencija ir morfologiniai pokyčiai, jei yra arba nėra kultūrų su HSC-39 ląstelėmis (× 200). NF-25 fibroblastai buvo vizualizuoti antikūnais prieš vimentiną (raudoną) ir VCAM-1 (žalią).

Visas dydis

Integruoto α -4-VCAM-1 signalizacijos kelio reikšmė skrandžio fibroblastų proliferacijai

Neutralizuojančio antikūno poveikis VCAM-1 buvo ištirtas siekiant įvertinti, ar VCAM-1 ekspresijos indukcija, auginant kartu su HSC-39 ląstelėmis, gali skatinti NF-25 ląstelių augimo aktyvumą. Anti-VCAM-1 antikūnų pridėjimas prie kultūrinės terpės veiksmingai slopino ląstelių-ląstelių kontakto su HSC-39 augimą skatinantį poveikį priklausomai nuo dozės (4A pav.). Adhezijos molekulės integrinas-α4 gali jungtis su VCAM-1 ir vėliau suaktyvina tarpląstelinį signalizavimą, kuris skatina ląstelių-ląstelių sukibimą ir padidina ląstelių migracijos aktyvumą (Bogetto ir kt., 2000; Klemke ir kt., 2007). Panašiai NF-25 fibroblastų skaičius sumažėjo, kai ląstelės buvo kultivuojamos kartu su HSC-39 ląstelėmis terpėse, turinčiose anti-integrin-α4 antikūnus, priklausomai nuo dozės (4B paveikslas).

Image

Neutralizuojančių antikūnų prieš VCAM-1 ir integrin- α 4 poveikis NF-25 fibroblastų augimui, esant ko-kultūrai su HSC-39 ląstelėmis. NF-25 fibroblastai (1 × 105 ląstelių lėkštelėje –1 ) buvo palaikomi kartu su HSC-39 ląstelėmis (1 × 105 ląstelių lėkštelėje –1 ) ir įvairūs kiekvieno antikūno kiekiai buvo dedami į terpę. NF-25 fibroblastų skaičius buvo suskaičiuotas praėjus 48 valandoms po šių neutralizuojančių antikūnų pridėjimo. ( A ) anti-VCAM-1 antikūnų (0–10 μg ml –1 ) poveikis. ( B ) antiintegrino- α 4 antikūnų (0–10 μg ml –1 ) poveikis. Kaip neigiama kontrolė buvo naudojamas nespecifinis pelės IgG (5 μg ml −1 ). Eksperimentai buvo atlikti tris kartus.

Visas dydis

Remdamiesi šiais in vitro eksperimentų rezultatais, mes ištyrėme VCAM-1 ekspresiją sporadiniais SGC ir ne SGC atvejais. Imunohistochemijos rezultatai apibendrinti 3 lentelėje, o reprezentatyvios iliustracijos parodytos 5 paveiksle. Apskritai VCAM-1 ekspresija CAF buvo nustatyta 14 (38%) iš 37 tirtų SGC ir ne SGC atvejų. VCAM-1 ekspresija buvo nustatyta 11 (61%) iš 18 SGC atvejų, kai ekstensyvus CAF augimas apėmė vėžio ląsteles, ir trijuose (15%) atvejų iš 17 ne SGC atvejų, kai vėžio ląstelėse buvo vamzdelinis formavimasis su desmoplastika. CAF pokyčiai. VCAM-1 ekspresijos dažnis CAF reikšmingai skyrėsi SGC ir ne SGC atvejais ( P = 0, 004).

Pilno dydžio lentelė

Image

VCAM-1, sraigių ir E-kadherino raiškos imunohistochemija esant VCAM-1 teigiamoms SGC (signalo žiedo ląstelių karcinomai) ir VCAM-1 neigiamoms ne SGC sąlygoms (vidutiniškai diferencijuota kanalėlių adenokarcinoma). Histologinis tyrimas buvo atliktas dažant hematoksilinu ir eozinu (H&E). Originalus regėjimas: × 200.

Visas dydis

Ląstelių ir ląstelių kontaktas su skrandžio fibroblastais skatina į EMT panašius pokyčius ir skatina MMP gamybą SGC ląstelėse

Buvo išanalizuotos pakitusios HSC-39 ląstelių charakteristikos, inkubuojant jas su NF-25 fibroblastais. FAK ir paxillino, VCAM-1-integrino- α 4 signalizacijos keliu susijusių molekulių (Liu ir Ginsberg, 2000; Liu ir kt., 2002) baltymų lygis buvo padidintas NF-25 fibroblastų, kai jie buvo auginami kartu su HSC- 39 ląstelės; tačiau reikšmingų pokyčių integrin- α 4 ekspresijos lygiuose nebuvo (6 pav.). Kita vertus, HSC-39 ląstelėse nebuvo rasta pokyčių šių baltymų, dalyvaujančių integrin- α -4-VCAM-1 signalizacijos kelyje, lygiuose. Įdomu tai, kad buvo nustatyta sraigės, su EMT susijusios transkripcijos faktoriaus, indukcija, lydima sumažėjusio E-kadherino ekspresijos lygio ir padidėjusio vimentino ekspresijos lygio (6 pav.). Iš tiesų, intensyvus sraigės imuninis reaktyvumas buvo nustatytas VCAM-1 teigiamais SGC atvejais, kuriuos lydėjo maža E-kadherino ekspresija (5 pav.).

Image

Ląstelių ir ląstelių kontakto poveikis ląstelių adhezijos molekulių NF-25 fibroblastų sulėtėjimui ir EMT tipo pokyčių indukcijai HSC-39 ląstelėse. Western blot rezultatai. Praėjus 24 valandoms po NF-25 ir HSC-39 ląstelių inkubacijos, ląstelės buvo atskirtos magnetinių granulių metodu. Kaip kontrolė buvo naudojami β- aktino ekspresijos lygiai.

Visas dydis

Panašiai mes toliau tyrėme pakitusias MMP išraiškas HSC-39 ląstelėse, kurios veikia kaip ECM skaidymą ir leidžia vėžio ląstelėms įsiskverbti į audinius (Sato ir kt., 1994). Buvo nustatyta, kad MMP-2 , MT1-MMP ir MMP7 mRNR lygis HSC-39 ląstelėse yra žymiai padidėjęs (7 paveikslas).

Image

Ląstelių ir ląstelių kontakto poveikis MMP reguliavimui HSC-39 ląstelėse. RT – PGR rezultatai. Praėjus 24 valandoms po NF-25 fibroblastų ir HSC-39 ląstelių inkubacijos, ląstelės buvo atskirtos magnetinių granulių metodu. Β-aktino ekspresijos lygiai buvo naudojami kaip kontrolė.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes įvertinome NF-25 skrandžio fibroblastų ir iš SGC gautų HSC-39 ląstelių kartu auginimo reikšmę kaip įnašą SGC patogenezei išaiškinti, paprastai lydintį nepaprastą skrandžio sienelės sustorėjimą, kliniškai greitą progresavimą ir rezultatą. bloga pacientų prognozė. Palaikydamas šias SGC savybes, bendras inkubavimas su iš SGC gautomis ląstelėmis smarkiai padidino skrandžio fibroblastų augimą ir, savo ruožtu, padarė įtaką invaziniam / metastaziniam pačių SGC ląstelių potencialui. Be to, mes nustatėme, kad kontaktinis tarp VCAM-1 indukuojamas NF-25 ląstelių ryšys padidina jo proliferacijos aktyvumą, o neutralizuojantys antikūnai prieš VCAM-1 ir integrin-α4 sumažino ląstelių augimą atitinkamai nuo dozės. . Tai yra pirmoji ataskaita, parodanti galimą VCAM-1-integrino- α 4 signalizacijos kelio aktyvavimą skatinant skrandžio fibroblastų proliferaciją. Ankstesni tyrimai parodė, kad integruotas α 4, ekspresuojamas leukocituose, veikia kaip VCAM-1 receptorius, kuris yra ekspresuojamas endotelio ląstelėse ir ECM fibronektine (Chan ir Aruffo, 1993; Postigo ir kt., 1993); todėl manoma, kad VCAM-1 vaidina lemiamą vaidmenį palaikant leukocitų, esančių kraujyje, gavimą ir imobilizavimą kaip pastolius. Nepaisant to, didelėje SGC atvejų dalyje aptikome VCAM-1 ekspresiją, patvirtindami VCAM-1 tarpininkavimą kuriant SGC. Žmogaus T-limfoblastinėje limfomoje VCAM-1 ekspresuojamas ne tik limfomos ląstelėse, bet ir ant endotelio ląstelių tiek viršūninio, tiek bazolaterinio paviršiaus, todėl suaktyvinama nuosekli limfomos ląstelių transmigracija ir intravazacija (Bogetto ir kt., 2000). Panašiai, didelis afiniteto sąveika tarp α- 4 ir VCAM-1 skatino melanomos ląstelių trans-endotelio migraciją (Klemke et al, 2007). Gausioji VCAM-1 ekspresija CAF gali padėti skatinti SGC ląstelių agresyvumą, o šis reiškinys gali prisidėti prie greito SGC ląstelių plitimo ir kraujagyslių infiltracijos in vivo . Priešoperacinės tirpios VCAM-1 formos koncentracijos serume skrandžio vėžiu serumu buvo žymiai didesnės, palyginti su sveikų kontrolinių grupių pacientais; Be to, buvo reikšmingas padidėjusio VCAM-1 lygio ryšys su ligos stadija, skrandžio sienelių invazija, limfmazgių įsitraukimu ir tolimų metastazių buvimu (Alexiou ir kt., 2002). Nors išlieka nežinoma, kokia VCAM-1 cirkuliacijos funkcija tolimų metastazių išsivystymo vietoje, tačiau išvados rodo, kad VCAM-1 lygio įvertinimas serumo ar biopsijos mėginiuose gali būti naujas žymeklis prognozuojant paciento karcinomos metastazių ir pasikartojimo riziką po operacija. Be to, VCAM-1 daugiausia ekspresuojamas iš CAF skrandžio karcinomos audiniuose, o ne vėžinėse ląstelėse. VCAM-1 lygio padidėjimas skrandžio fibroblastų ląstelių paviršiuje ir jo sekrecija į stromą gali turėti didelę įtaką SGC ląstelių dauginimuisi ir migracijai.

Neseniai atlikti tyrimai užfiksavo, kad CAF yra susiję su svarbiais epitelio kietų navikų biologijos aspektais, tokiais kaip vėžio progresavimas, naviko augimas, angiogenezė ir metastazės, palaikant raišką iš stromos gauto faktoriaus-1 (SDF-1), dar žinomo kaip CXCL12 (Yang). et al., 2008). Iš tiesų, SDF-1 sekrecija kaulų morfogenetiniu baltymu-2 padidino mikrovaskulinių endotelio ląstelių susidarymą kanalėliuose ir verbuoti endotelio pirmtakų ląsteles (Orimo et al., 2005) ir tiesiogiai stimuliavo naviko augimą veikdama per CXCR4, kurį išreiškia karcinomos ląstelės. Taigi manoma, kad SDF-1 vaidina pagrindinį vaidmenį nustatant vėžio progresavimo ir metastazių nišą. Nepaisant to, šiame tyrime nebuvo pasiūlyta jokio tirpaus faktoriaus, kuris skatintų NF-25 fibroblastų augimą, kai kartu auginamos kartu su HSC-39 ląstelėmis, o padidėjusio SDF-1 ekspresijos mRNR lygio nenustatyta NF-25 fibroblastų, auginamų kartu su HSC-39 ląstelės atliekant cDNR mikrotraumos analizę (duomenys nepateikti). Atvirkščiai, mes nustatėme, kad NF-25 fibroblastų proliferacija buvo pagreitinta tiesiogine ko-kultivacija su HSC-39 ląstelėmis, reikšmingai indukuojant VCAM-1 raišką. Be to, ši VCAM-1 indukcija buvo aptikta tik NF-25 skrandžio fibroblastų, o ne NF-j2 žarnyno fibroblastų - tai buvo specifinis poveikis, kurį sukėlė sąveika su SGC gautomis ląstelėmis. Šie duomenys rodo tiesioginės SGC ir skrandžio fibroblastų sąveikos svarbą kuriant nišą, kuri galėtų skatinti skrandžio sienos fibrozę ir padidinti piktybinį vėžio ląstelių elgesį. Šiame tyrime mes neišsaminome galimo tirpių veiksnių, išskiriamų iš HSC-39 ląstelių ir NF-25 fibroblastų, tarpininkavimo tiesioginės bendros kultūros pagalba. Norint išsiaiškinti tokių tarpląstelinių dirgiklių dalyvavimą progresuojant ir nustatant distancinę metastazę pacientams, sergantiems SGC, reikės atlikti papildomus tyrimus.

Daugelyje ataskaitų buvo ištirtas vėžio ir stromos sąveikos poveikis žmogaus piktybiniams navikams ir parodyta ląstelių-ląstelių kontakto svarba nustatant naviko mikroaplinką, kuri gali turėti įtakos vėžio ląstelių judrumui ir invaziškumui, EMT, angiogenezei ir tolimai metastazei (De Wever ir Mareel, 2003). Žinoma, EMT klinikinio vėžio mėginiuose yra apibrėžiamas kaip jungiamojo E-kadherino netekimas; pereiti prie kitų kadherinų (pvz., N-kadherino); ląstelių ir ląstelių adhezijos pablogėjimas; apikobazinis poliškumas ir audinių architektūra; pleiotropinės ląstelės forma; branduolinis β-kateninas , sraigių ar šliužų ekspresija; ir kitaip netikėta mezenchiminių žymenų, tokių kaip vimentinas, išraiška (Thompson ir kt., 2005). Tačiau šiame tyrime stebėtiems biologiniams reiškiniams mes nenaudojame termino „EMT“, nes netvarkingas diferenciacija, ląstelių poliškumo praradimas ir linijai būdingų ar audiniams būdingų citologinių ypatybių apibūdinimas yra karcinomų aspektai, išskyrus „vadinamuosius“. karcinosarkoma. Tarin (2005) rekomendavo nenaudoti žodžio „EMT“ vėžinėse ląstelėse, ypač kai išreiškiama išsklaidyta vienos ląstelės infiltracija difuzine skrandžio karcinoma (arba signalo žiedo ląstelėmis). Todėl šią HSC-39 ląstelių reakciją mes išreiškėme kaip „į EMT panašų pokytį“ SGC ląstelėse. Remiantis mūsų eksperimentu, naudojant NF-25 fibroblastų ir HSC-39 ląstelių kultūrą, tiesioginė sąveika su skrandžio fibroblastais sukėlė sraigės ekspresiją, o tai lemia E-kadherino slopinimą ir vimentino indukciją HSC-39 ląstelėse. Mes darėme prielaidą, kad vimentino ir E-kadherino ekspresijos lygiai tirtose HSC-39 ląstelėse dėl tam tikrų priežasčių buvo modifikuoti, ir tai buvo atkurta, kai ląstelės buvo kultivuojamos kartu su NF-25 fibroblastų. Tačiau HSC-39 ląstelės iš pradžių ekspresuoja aukštą E-kadherino kiekį (Oyama ir kt., 1994), ir mes galiausiai padarėme išvadą, kad į EMT panašūs pokyčiai buvo sukelti HSC-39 ląstelėse kontaktuojant su NF-25 fibroblastu. Ankstesniame tyrime buvo tiriami SGC diferenciniai genų ekspresijos profiliai, naudojant cDNR mikrotraumą, ir nustatyta, kad E-kadherino ir integrin- β 4 ekspresijos sumažėjimas SGC išvestose ląstelių linijose susijęs su didele metastazių galimybe pilvaplėvės ir limfmazgiuose (Hippo et. al., 2001), taip pat palaikydamas tokį į EMT panašių pokyčių indukciją, turėdamas ląstelių-ląstelių kontaktą su NF-25 fibroblastų, gali skatinti vėžio agresyvumą, kurį, tikriausiai, skatina sraigė. Neseniai atliktame Ohta ir kt. (2009) tyrime teigiama, kad EMT gali atlikti lemiamą vaidmenį progresuojant ir plėtojant SGC; todėl norint suprasti naują chemoterapinį požiūrį į SGC ateityje, būtina suprasti šio į EMT panašaus SGC ląstelių pokyčio mechanizmą.

Pokyčių istorija

Prisijungimai

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • NM_001078.2

INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriai teigia, kad interesų konflikto nėra.

Papildoma informacija pridedama prie dokumento „British Journal of Cancer“ svetainėje (//www.nature.com/bjc)