Diskriminacinių funkcijų analizė, kaip palaikomosios sistemos ūminei leukemijai diagnozuoti, naudojant mažiausiai keturių spalvų ekraną ir daugiaparametrų srauto citometrijos imunofenotipus | leukemija

Diskriminacinių funkcijų analizė, kaip palaikomosios sistemos ūminei leukemijai diagnozuoti, naudojant mažiausiai keturių spalvų ekraną ir daugiaparametrų srauto citometrijos imunofenotipus | leukemija

Anonim

Anotacija

Nepaisant kelių daugiaparametrų srauto citometrijos (MFC) standartizavimo rekomendacijų, reagentų, naudojamų diagnostinėse laboratorijose ūminei leukemijai diagnozuoti ir klasifikuoti (AL), skaičius, specifiškumas ir deriniai vis dar yra labai įvairūs. Be to, dabartiniam srauto citometrijos rodmenų diagnostiniam aiškinimui savavališkai daro įtaką individuali patirtis ir žinios. Mes nustatėme minimalią keturių spalvų 13 monokloninių antikūnų (mAb) keturių spalvų derinio plokštės vertę su CD45 / šoninės šviesos sklaidos strategija standartizuotam MFC imunofenotipų nustatymui kliniškai svarbiausiems AL pogrupiams. Kaulų čiulpų mėginiai iš 155 pacientų, sergančių ūmine mieloidine leukemija (AML, n = 79), B ląstelių pirmtako ūminės limfoblastinės leukemijos (BCP-ALL, n = 29), T ląstelių pirmtako ūminės limfoblastinės leukemijos (T-ALL, n = 12). ) išanalizuoti normalūs kaulų čiulpų donorai (NBMD, n = 35). Žiniomis grįstas mokymosi algoritmas buvo sukurtas palyginus minimalios grupės rezultatus su faktine diagnoze, naudojant diskriminacinę funkcijų analizę. Teisingas tiriamojo mėginio klasifikavimas pagal kilmę, tai yra, BCP-ALL, T-ALL, AML ir NBMD diferenciacija buvo pasiekta 97, 2% visų atvejų, tik šeši iš pradžių taikytų 13 mAb plokštės. Tai įrodo, kad diskriminuojančios funkcijos analizė gali būti panaudota kaip sprendimų palaikymo sistema srauto citometrijos rodmenų interpretavimui.

Įvadas

Pastaraisiais metais srauto citometrinis imunofenotipų nustatymas nuo netiesioginės imunofluorescencijos metodų tapo sudėtinga multiparametrine diagnostikos priemone, kuri yra būtina diagnozuojant ūminę leukemiją (AL). 1, 2 Naujausi srauto citometrijos technologijų, įskaitant skysčius, lazerius, optiką, analoginę ir skaitmeninę elektroniką, kompiuterius, programinę įrangą, fluoro chromus ir antikūnus, pokyčiai palengvino visapusišką daugiaparametrinio srauto citometrijos imunofenotipų naudojimą, leidžiančią objektyviai išanalizuoti didelį ląstelių skaičių vieno langelio lygis per palyginti trumpą laiką. 3, 4 Taikant trijų ir keturių spalvų imunofenotipus, diagnozuojant AL daugelyje klinikinių laboratorijų dabar reguliariai taikomi penkių ar šešių skirtingų parametrų matavimai. 5, 6 Penkių ir šešių parametrų analizės sudėtingumas ir duomenų aiškinimas didžiąja dalimi priklauso nuo prietaiso, reagentų ir procedūros standartizacijos ir patvirtinimo. 7, 8, 9 Be to, dabartinę diagnostinę tėkmės citometrijos rodmenų interpretaciją gali savavališkai paveikti individuali patirtis ir žinios. Vienas pagrindinių reagentų reikalavimų yra kruopštus antikūnų derinių pasirinkimas, kad būtų galima greitai, patikimai ir kliniškai naudingai įvertinti leukemijos ląstelių klonus. 10, 11, 12 Tačiau augant finansiniam spaudimui sveikatos priežiūros sistemoms, reikia atsižvelgti ir į ekonominius aspektus. Nors per pastaruosius metus buvo paskelbtos kelios rekomendacijos ir gairės, susijusios su antikūnų parinkimu AL srauto citometrinei analizei atlikti, reagentų deriniai, naudojami laboratorijose, atliekančiose AL imunofenotipizavimą, išlieka labai įvairūs. 10, 13 Atsižvelgiant į daugelio parametrų metodų sudėtingumą ir turimą daugybę monokloninių antikūnų (mAb), antikūnų pasirinkimo ir derinimo kriterijų neatitikimai nestebina. Pirmenybės gali priklausyti nuo kelių veiksnių, įskaitant laboratorijos specialisto patirtį ir mokymą, specifinius laboratorijos parametrus (pvz., Ligoninėje ar etaloninėje laboratorijoje), analizuojamo mėginio tūrį ir mėginio tipą (kaulų čiulpai (BM)). periferinis kraujas ar limfoidinis audinys). 12 Dauguma antikūnų grupių sudėčiai buvo daugiau ar mažiau paveikti šių veiksnių, ir daugiacentriame tyrime nė viena iš šių grupių nebuvo patvirtinta ar patikrinta dėl jos diagnostinio tikslumo.

Mes iškėlėme hipotezę, kad standartizuotas minimalus keturių spalvų ekrano skydelis kartu su CD45 / šoninio šviesos sklaidos (SSC) taikymo strategija gali būti panaudotas daugiacentriame bandyme, kad būtų sukurtas žiniomis grįstas prižiūrimas mokymosi algoritmas, palaikantis srauto citometrijos rodmenų interpretaciją. diagnozuojant AL.

Šiuo tikslu mes sukūrėme patikros skydą, sudarytą iš 13 mAb, kad būtų galima pateikti bendrą informaciją apie mėginį (AL palyginti su ne leukemija) ir atitinkamos leukemijos (ūminės mieloidinės leukemijos (AML), palyginti su B ląstelių pirmtaku, ūmine limfoblastine leukemija) priskyrimą linijai. (BCP-ALL) prieš T ląstelių pirmtaką ūminę limfoblastinę leukemiją (T-ALL)). Tolesni šio daugiacentrio tyrimo tikslai buvo nustatyti (1) kiekvieno „su linija susijusio“ žymens santykinę reikšmę mieloidinių, B ir T ląstelių linijoms apibrėžti (2), siekiant nustatyti geriausią žymenų derinį apibrėžimui. kiekvienos iš šių trijų linijų ir (3) apibrėžti poreikį naudoti papildomus žymenis, norint priskirti liniją AL. Mes panaudojome diskriminacinių funkcijų analizę kaip tiesinį laipsniškos regresijos modelį, kad sukurtume žiniomis pagrįstą mokymosi algoritmą, palygindami minimalios grupės rezultatus su faktine diagnoze, nustatyta sudėtingesniu ir išsamesniu diagnostikos metodu, įskaitant citomorfologiją ir citochemiją bei platų daugiaparametrą. imunofenotipas atliekamas atskirai kiekviename centre.

medžiagos ir metodai

Pacientai ir laboratorijos

Tyrime dalyvavo aštuonios Europos laboratorijos. Nuo 2000 m. Balandžio mėn. Iki 2001 m. Birželio mėn. Buvo ištirti 155 iš eilės imami suaugusiųjų ir vaikų mėginiai. Į juos buvo paimti mėginiai iš 29 pacientų, sergančių BCP-ALL, ir 79 pacientų, sergančių AML, įskaitant šiuos PSO potipius: penki pacientai su pasikartojančiais genetiniais anomalijomis, du su t (8; 21) ir trys su t (15; 17) ir vienas su daugialypė linija. displazija, atsirandanti po mielodisplastinio sindromo. Likę pacientai priklausė kitaip nepriskirtam PSO potipiui, įskaitant: 10 su minimaliu diferenciacija, 21 be brendimo, 13 su subrendimu, 15 su mielomonocitine AL, 10 su monoblastinėmis ir monocitinėmis leukemijomis, 2 su ūmiomis eritroidinėmis leukemijomis ir 2 su megakarioblastinėmis leukemijomis. Be to, buvo įdarbinta 12 pacientų, sergančių T-ląstelių pirmtakėmis (T-ALL) ir 35, turinčiais normalius kaulų čiulpų donorus (NBMD). Iš visų asmenų ar jų globėjų buvo gautas informuotas sutikimas pagal vietinių etikos komitetų reikalavimus. Sveikų donorų KM buvo gautas atliekant alogeninių kraujodaros ląstelių donorystę. Srauto citometrija buvo atlikta naudojant bet kurį „Beckman Coulter XL“ srauto citometrą (Beckman Coulter, Majamis, FL, JAV) (trys centrai; 70 asmenų, iš jų 17 pacientų, kuriems buvo BCP-ALL, 32 su AML, šeši su T-ALL ir 15 su NBMD). arba FACSCalibur srauto citometrai (BD Biosciences, San Chosė, CA, JAV) (penki centrai; 85 asmenys, iš jų 12 su BCP-ALL, 47 su AML, šeši su T-ALL ir 20 su NBMD).

Pavyzdžiai

BM aspiratai, kuriuose pagal morfologiją buvo daugiau kaip 30% sprogstamųjų ląstelių, buvo gauti diagnozuojant prieš bet kokį chemoterapinį gydymą. Mėginiai buvo antikoaguliuoti etilengndiamintetraacto rūgštimi arba heparinu. Visi mėginiai du kartus buvo perduoti per 25 μm dydžio švirkštą, kad būtų galima homogenizuoti BM sprogimo ląstelių pasiskirstymą mėginyje. Ląstelių skaičius buvo atliktas siekiant sureguliuoti ląstelių skaičių iki galutinio 107 ląstelių / ml. Visi mėginiai buvo apdoroti ir išanalizuoti per 24 valandas po BM aspiracijos, o prieš ruošiant mėginį, mėginio kokybė buvo įvertinta įprastine citomorfologija.

Paviršinių antigenų dažymas

Du mėgintuvėliai buvo dažomi tik paviršiniams antigenams, naudojant šiuos antikūnų derinius, skirtus FACSCalibur vartotojams: fluoresceino izotiocinatas (FITC) / fikoeritrinas (PE) / PE-cianinas5 (PC5) / alofikocianinas (APC) - (1) CD7 (BD Biosciences; 10 μm). l neskiestas) / CD22 (BD Biosciences; 10 μl neskiesto) / CD45 (Immunotech Marselis, Prancūzija; 10 μl 1/10 praskiestas fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) / CD33 (Immunotech; 5 μl neskiesto) ir (2) ) CD15 (BD Biosciences; 10 μl neskiesto) / CD13 (BD ​​Biosciences; 10 μl neskiesto) / CD45 (Immunotech; 10 μl 1/10 praskiestas) / CD34 (BD Biosciences; 5 μl neskiestas). XL vartotojams, deriniai buvo šie: FITC / PE / PE-Texas red (ECD) / PC5 - (1) CD7 (BD Biosciences; 10 μl neskiesto) / CD22 (BD Biosciences; 10 μl neskiesto) / CD45 (Immunotech; 10 μl neskiesto / CD33 (Immunotech; 10 μl neskiesto) ir (2) CD15 (BDB; 10 μl neskiesto) / CD13 (BDB; 10 μl neskiesto) / CD45 (Immunotech; 10 μl neskiesto) / CD34 (Imunotech; 10 μl neskiestas). Trečiasis vamzdelis wa s apdorojami lygiagrečiai, norint išmatuoti sprogimo ląstelių autofluorescencijos lygius; šis vėlesnis mėgintuvėlis buvo dažytas tik CD45-PC5 (Immunotech; 10 μl 1/10 praskiestas) FACSCalibur vartotojams ir CD45-ECD (Immunotech; 10 μl neskiestas) XL vartotojams.

Antikūnų titravimo eksperimentai (PBS) buvo atlikti iš anksto, kad būtų galima apskaičiuoti reikiamą antikūnų kiekį kiekviename derinyje, kuris buvo apibrėžtas kaip maksimalaus soties ir minimalaus fono dažymo derinys. Antikūnai buvo dedami atskirai į kiekvieną mėgintuvėlį prieš pridedant 100 μl PBS praskiesto BM mėginio, kuriame yra 106 branduolių. Vamzdeliai švelniai maišomi 10 s ir inkubuojami kambario temperatūroje (RT) tamsoje 15 min. Pridėjus 2 ml mėgintuvėlio Quicklysis (Cytognos, Salamanka, Ispanija) ir švelniai sukratant, mėgintuvėliai antrą kartą inkubuojami 10 minučių tamsoje (RT). Tada jie vieną kartą buvo centrifuguoti 5 minutes 500 g, o supernatantas išmestas. Ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos 2 ml tūbelės filtruoto PBS ir vėl centrifuguotos 500 g 5 minutes; po to supernatantas buvo išmestas su „Pasteur“ pipete ir ląstelių nuosėdos buvo pakartotinai suspenduotos 0, 5 ml tūbelėje filtruoto PBS, turinčio 1% paraformaldehido. Mėginio srauto citometrinis paėmimas buvo atliktas iš karto arba per 24 valandas po laikymo 4 ° C temperatūroje. Visi mAb buvo gauti centralizuotai, padalinti į dalis ir paskirstyti kiekvienam dalyvaujančiam centrui.

Tuo pat metu paviršinių ir citoplazminių antigenų dažymas

Du mėgintuvėliai buvo dažomi tuo pačiu metu, kad būtų nustatyti paviršiniai ir citoplazminiai antigenai, naudojant šiuos antikūnų derinius FACSCalibur vartotojams (FITC / PE / PC5 / APC): (1) cyCD3 (Dako, Glostrup, Danija; 5 μl neskiesto) / cyCD79a (Dako; 10 μl neskiesto) / CD45 (Immunotech; 10 μl 1/10 praskiesto) / CD117 (BDB; 3 μl neskiesto) ir (2) CD19 (Dako; 10 μl neskiesto) / cyMPO (Dako; 3 μl neskiesto) / CD45 (imunitech; 10 μl 1/10 praskiestas) / CD5 (BD Biosciences; 5 μl neskiestas). XL vartotojams deriniai buvo šie (FITC / PE / ECD / PC5): (1) cyCD3 (Dako; 5 μl neskiesto) / cyCD79a (Dako; 10 μl neskiesto) / CD45 (Immunotech; 10 μl neskiestas) ) / CD117 („Immunotech“; 5 μl neskiesto) ir (2) CD19 (Dako; 10 μl neskiesto) / cyMPO (Dako; 3 μl neskiesto) / CD45 (Immunotech; 10 μl neskiesto) / CD5 (Immunotech; 5 μl neskiesto). Trečiasis mėgintuvėlis buvo apdorotas lygiagrečiai, norint išmatuoti sprogimo ląstelių autofluorescencijos lygius; šis vėlesnis mėgintuvėlis buvo dažytas tik CD45-PC5 (Immunotech; 10 μl 1/10 praskiestas) FACSCalibur vartotojams ir CD45-ECD (Immunotech; 10 μl neskiestas) Coulter XL prietaiso vartotojams. Visi mAb buvo gauti centralizuotai, padalinti į dalis ir paskirstyti kiekvienam dalyvaujančiam centrui. Ląstelių fiksavimui ir permeabilizavimui buvo naudojamas „Fix & Perm“ reagentų rinkinys („Caltag Laboratories“, San Franciskas, CA, JAV), griežtai laikantis gamintojo rekomendacijų, po dažymo paviršiaus žymekliais.

Standartinis prietaiso nustatymo ir spalvų kompensavimo protokolas 14, 15

Pirmiausia skysčiai buvo išplauti ir - FACSCalibur prietaisui - laiko delsos kalibravimas buvo atliktas pagal gamintojo instrukcijas. Stiprinimo režimai ir slenkstis buvo apibrėžti taip: priekinės šviesos sklaida (FSC) ir SSC buvo išreikšti tiesine amplifikacijos skale. Fluorescencijos (FL) intensyvumas buvo išreikštas santykiniais tiesiniais kanalais keturių dešimtmečių logaritminėje skalėje. FSC slenkstis buvo nustatytas 52 kanale tiesine 1024 histogramų kanalų skale. Norint tinkamai nustatyti FSC ir SSC analizės langą, buvo paleista reprezentatyvioji nespalvota ląstelių suspensija (pvz., Viso kraujo) ir FSC fotodiodo stiprintuvo padidėjimas bei SSC fotopultintuvo (PMT) parametrai buvo sureguliuoti taip, kad visos susijusios populiacijos (neutrofilai, monocitai), limfocitai ir sprogstamosios ląstelės) sumažėjo masteliu. Pasirinkus limfocitų populiaciją, kiekvieno FL parametro PMT parametrai buvo pakoreguoti taip, kad neišdažyti limfocitai būtų įdedami į pirmąjį žurnalo dešimtmetį, šiek tiek atokiau nuo ašių, o visos kompensavimo nuostatos būtų nulinės. Fluorescencinės etaloninės granulės (RFP-60-1, Spherotech (Libertyville, IL, JAV)) buvo naudojamos pagal gautus FL PMT parametrus, o elektroninės kompensacijos nuostatos vis dar buvo lygios nuliui, o vidutiniai keturių FL kanalų kanalai buvo užfiksuoti įsigijus 5000 pavieniai karoliukai. Šie kanalai reprezentuoja „taikytinus pradinius tikslinius kanalus“ tolesnėms prietaiso nustatymo procedūroms.

Spalvų kompensavimo parametrai buvo atlikti su keturiais vienspalviais vamzdeliais (ty, CD8-FITC, CD8-PE, CD8-PC5 ar ECD, CD8-APC ar PC5), dažytais pagal atitinkamą fluorochromo derinį FACSCalibur ar Coulter XL vartotojams. Limfocitai buvo parinkti vartojant FSC ir SSC, ir elektroninės kompensacijos parametrai buvo sureguliuoti taip, kad CD8 neigiamų ir CD8 ryškių limfocitų populiacijos vidutinis FL kanalas neaptiktuose FL kanaluose būtų identiški ± 10 kanalų. Po to buvo paleistas kontrolinis vamzdelis su CD3-FITC / CD19-PE / CD4-PC5 arba ECD / CD8-PC5 ar APC, skirtas atitinkamai 1–4 kanalų FL kanalams, kad būtų patikrinti šie tinkamų kompensavimo grandinių kriterijai: FL2 reiškia CD3-FITC teigiamas = FL2 reiškia CD3-FITC neigiamą ; FL1 reiškia CD19-PE teigiamą = FL1 reiškia CD19-PE neigiamą ; FL3 reiškia CD19-PE teigiamą = FL3 reiškia CD19-PE neigiamą ; FL2 vidutinis CD4-ECD / PC5 teigiamas = FL2 vidutinis CD4-ECD / PC5 neigiamas ; FL4 vidutinis CD4-ECD / PC5 teigiamas = FL4 vidutinis CD4-ECD / PC5 neigiamas ; FL3 vidutinis CD8-APC / PC5 teigiamas = FL3 vidutinis CD8-APC / PC5 neigiamas . Fluorescencinės etaloninės granulės buvo gautos dar kartą, kai buvo gauti prietaiso parametrai ir įjungti elektroniniai kompensavimo parametrai. Kiekvienam FL detektoriui gauti vidutiniai kanalai žymi „taikomiesiems ir konkrečiam prietaisui taikomus kanalus“, skirtus vėlesniam FL analizės lango padėties valdymui. Tolesniam prietaisų valdymui RFP-60-1 granulės buvo gautos prieš kiekvieną eksperimentą, o referencinių granulių vidutiniai FL kanalai buvo nubraižyti Levey – Jennings diagramose. PMT parametrai ir spalvų kompensacija buvo koreguojami tik tuo atveju, jei pagal Westgardo taisykles etaloniniai rutuliukai kelis kartus atsidūrė už tolerancijos zonų ribų. 16

Remiantis Europos klinikinių ląstelių analizės darbo grupės suformuluotomis gairėmis, prietaiso veikimas, atsižvelgiant į FL intensyvumo matavimus, buvo periodiškai tikrinamas atliekant kalibravimo granules (ty, naudojant „Spherotech RCP-30-1L“ 1: 1 mišinį (kuriame yra trys mažai intensyvumo smailės) ir RCP-30-1H (turinčios keturias aukšto intensyvumo viršūnes), taip pat tuščiasis rutuliukas (Spherotech BCP-60-1). Taikydami šią procedūrą, dalyvaujančios laboratorijos galėjo patikrinti, ar foninis FL yra mastelio, ir kad keturi prietaiso veikimo parametrai FL intensyvumui matuoti atitiko specifikacijas.

Srauto citometrinė duomenų analizė

Kiekvienoje vietoje iš eilės tyrimui buvo imami leukemijos ir neleukemijos mėginiai ir sugeneruoti šių mėginių sąrašo režimo duomenys (LMD). LMD buvo analizuojami centralizuotai, naudojant programinę įrangą EXPO32 (Beckman Coulter). Duomenų analizei mes panaudojome CD45 / SSC duomenų rinkimo strategiją. 17, 18 Protokolą sudarė dvimačiai taškiniai brėžiniai, skirti dažyti paviršinius ir tarpląstelinius dažus, įskaitant (1) FSC / SSC; (2) CD45 / SSC buvo naudojamas ląstelių populiacijai apibūdinti (1 lentelė) CD45 žemų / SSC žemų vartų, tai yra, leukemijos sprogimo populiacijoje, arba NBMD atveju, normalūs pirmtakai (BL), limfocitai (LY) ir granulocitai. (GR); (3) CD7 / CD22; (4) CD15 / CD13; (5) CD45 / CD33; (6) CD45 / CD34; (7) CD3 / CD79a; (8) CD19 / MPO; (9) CD45 / CD117 ir (10) CD45 / CD5 (1 paveikslas) ir kiekvieno FL kanalo neigiami kontroliniai elementai po BL, LY ir GR priskyrimo naudojant CD45 vs. SSC (nerodyta). Kvadranto sritys buvo nustatytos pagal neigiamą kontrolę, o kiekvienam fluorochromui, kaip parodyta 1 paveiksle, užfiksuota teigiamų ląstelių procentinė dalis CD45 žemo / SSC žemo dažymo dažuose virš nustatytos ribos.

Pilno dydžio lentelė

Image

CD45 / SSC nustatymo strategija ir kiekvieno antigeno teigiamų ląstelių procentinio dydžio nustatymas CD45 žemų / SSC žemų vartų ląstelių populiacijoje. Pavaizduota BCP-ALL su maža CD45 ekspresija ir 88% blastinių ląstelių, 6% likusių limfocitų ir 4% likusių granulocitų.

Visas dydis

Statistiniai metodai

Diskriminacinių funkcijų analizė (DFA) yra linijinis laipsniškos regresijos modelis, skirtas numatyti grupės narystę iš prognozuojamųjų rinkinio. Pagrindiniai DFA tikslai yra surasti dimensiją ar dimensijas, kuriomis skiriasi grupės, ir surasti klasifikavimo funkcijas, kad būtų galima numatyti narystę grupėje. 19 Kalbant apie šį tyrimą, kyla klausimas, ar diferencinė diagnozė pacientų, sergančių BCP-ALL, T-ALL, AML, grupe ir normaliai kontroliuojančių asmenų grupei, gali būti patikimai nustatyta remiantis prognozavimo priemonių rinkiniu, ty CD išraiškos reikšmėmis. (teigiamų ląstelių procentas) per žemą CD45 / SSC vartą. Antrame etape DFA buvo naudojamas apibrėžti specifiškumą ir mažiausią skaičių diskriminuojančių prognozatorių.

Visi statistiniai skaičiavimai ir skaičiavimai buvo atlikti naudojant SPSS (12.0.1 versija, SPSS Inc., Čikaga, IL, JAV). Klasifikacija buvo atlikta paliekant 72 atsitiktinai paskirstytų atvejų grupę - tiriamąją imtį (2 lentelė). DFA buvo atlikta likusiems 83 atvejams - mokymosi imčiai . Išvestos trys kanoninės diskriminuojančios funkcijos, sukuriant nesuderintus diskriminacinius koeficientus (c j ), naudojamus 1 lygtyje klasifikuojant.

Pilno dydžio lentelė

Taikant j -osios grupės pagrindinę tiesinės klasifikacijos lygtį ( j = 1, 2, …, k ) kiekvienu atveju buvo apskaičiuoti keturi klasifikavimo balai, po vieną kiekvienai grupei.

Image
J grupės (C j ) klasifikavimo formulės balas randamas padauginus kiekvieno nuspėjamojo elemento ( X ) neapdorotą rezultatą iš jo susijusio diskriminacijos koeficiento (c j ), sudėjus visus prognozuotojus ir pridedant pastovią c j0 .

Buvo apskaičiuoti kiekvieno atvejo ir kiekvienos iš keturių diagnostinių grupių klasifikavimo balai ir kiekvienas tiriamojo mėginio atvejis buvo priskirtas tai grupei, kuriai jis turėjo aukščiausią klasifikavimo balą. Numatoma klasifikacija ir faktinė mėginio diagnozė palyginami klasifikavimo lentelėje (3 lentelė). Be to, kiekvienu atveju ir kiekvienai iš trijų diskriminacinių funkcijų buvo apskaičiuoti diskriminaciniai balai, padauginus iš nestandartinių diskriminacijos koeficientų iš kiekvieno prognozuojančiojo signalo pirminio balo, susumavus šiuos produktus ir sudėjus konstantą. Kiekvieno atvejo padėtis DFA trimatėje erdvėje yra apibrėžta pagal tris kiekvienos bylos diskriminavimo balus, kaip parodyta diskriminuojančios funkcijos diagramoje (2 paveikslas).

Pilno dydžio lentelė

Image

Trimatis diskriminuojančios funkcijos grafikas, skirtas paskirstyti kiekvieną atvejį diskriminuojančiosios funkcijos erdvėje pagal kiekvienos diferencinės funkcijos 1–3 (DF1-3) diskriminuojančių balų vertes. Kiekvienas atvejis pavaizduotas kaip spalvotas taškas ir spindulys, spinduliuojantis iš grupės centroido.

Visas dydis

Norint parinkti kuo mažesnį skaičių prognozatorių, kurie patikimiausiai atskiria keturias diagnostines grupes, buvo atliktas laipsniškas DFA ir kiekviename žingsnyje buvo apskaičiuotas Wilkso λ, siekiant įvertinti klasifikavimo pagerėjimą. Kiekviename žingsnyje į analizę buvo įtrauktas kintamasis su mažiausiu Vilko λ . Taikant šį metodą kintamieji, kurie nemažina bendro Wilks λ , nepagerina klasifikavimo ir buvo pašalinti iš analizės (4 lentelė). Kitas būdas išsiaiškinti kiekvieno kintamojo naudingumą atliekant diskriminacines funkcijas yra pateiktas struktūros matricoje, kurioje yra kiekvieno prognozuojančio kintamojo koreliacijos grupėse su kiekviena kanonine funkcija (5 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Rezultatai

Vidutinis sprogstamųjų ląstelių procentas, apibrėžtas CD45 / SSC-dot diagramoje, kaip žemų CD45 / SSC ląstelių dalis, buvo 83% BCP-ALLL, 77% AML, 81% T-ALL ir 4% normaliems BM donorams. (1 lentelė).

Linijos ribojami antigenai CD19, CD79a, CD22, skirti BCP-ALL; CD3, CD5, CD7 T-ALL ir CD13, CD33, MPO AML parodė stiprią ir selektyvią atitinkamų leukemijų blastinių ląstelių populiacijos ekspresijos schemą, tuo tarpu NBMD blastų populiacija parodė heterogeniškesnę ir neaiškios kilmės liniją. ribota šių žymenų išraiška. Kai kurių ALL atvejų atvejais mieloidinių antigenų ekspresija blastinėse ląstelėse atspindi vidutiniškai teigiamą CD13 ląstelių procentinę dalį 20% BCP-ALL ir 5% T-ALL. Pirmtako žymens CD34 išraiška nebuvo ribojama. Pažymėtina, kad sprogstamųjų ląstelių populiacijoje NB45 CD45 / SSC sprogdinimo vartuose buvo didesnis CD34 teigiamų ląstelių procentas nei T-ALL pacientuose. CD117, antrojo pirmtakų žymens, raiška skydelyje buvo beveik apribota AML, kai teigiamų ląstelių procentas buvo 38%. Vidutinis procentas CD45 teigiamų blastinių ląstelių buvo santykinai žemas BCP-ALL su 96%, bet 100% - AML, T-ALL ir NBMD.

Norėdami įrodyti tyrimo grupės sugebėjimą teisingai klasifikuoti keturias faktines diagnostikos grupes, duomenų rinkinys atsitiktine tvarka buvo padalintas į mokymosi rinkinį, kuriame buvo 83 atvejai, įskaitant kiekvieno atvejo tikrąją diagnozę ir tiriamąjį imtį, apimančią likusius atvejus be informacijos apie faktinė diagnozė (2 lentelė). DFA pirmiausia buvo atliktas remiantis mokymosi duomenų rinkiniu. SPPS nustatė tris diskriminuojančias funkcijas, pateikdamas klasifikavimo funkcijos koeficientus. Tada kiekvienas tiriamojo mėginio atvejis buvo nuspėjamai klasifikuojamas pagal klasifikavimo lygtis (1), o kryžminis stabilios faktinės diagnozės palyginimas su numatoma klasifikacija parodė, kad 97, 2% pirminių sugrupuotų atvejų buvo klasifikuoti teisingai (3 lentelė). Buvo prognozuojama, kad tik du faktinio AML atvejai yra normalūs.

Toliau mes ištyrėme, ar mAb skaičių skydelyje galima sumažinti neprarandant diskriminuojančios funkcijos ir diagnostinio tikslumo. Testo skydą sudarė 13 skirtingų mAb. Jie buvo naudojami generuoti 14 nuspėjamųjų dalelių: ląstelių procentas CD45 žemo / SSC žemuose vartuose ir teigiamų ląstelių procentas šiuose vartuose kiekvienam iš 13 mAb. Kiekvieno nuspėjamojo indėlis į klasifikavimo gerinimą buvo įvertintas nuosekliu DFA, naudojant Wilkso λ . Į modelį buvo įtraukti tik tie kintamieji, kurie sumažino bendrą Wilks λ (4 lentelė). Į analizę neįtraukti kintamieji, kurie nesumažino bendro Wilks λ . Pagal šį metodą buvo įtraukti tik kintamieji CD22 ir CD3, ląstelių procentas per CD45 žemus / SSC žemus vartus, CD7, CD13, CD45 ir CD5. Taigi tapo akivaizdu, kad pradinį 14 numatančiųjų rinkinį galima sumažinti tik iki 6 mAb, o „atitikties koeficientas“ (teisinga klasifikacija) yra 97, 2% bandinyje.

Siekiant įvertinti kiekvieno kintamojo naudingumą kiekvienai iš trijų diskriminacinių funkcijų, buvo ištirta struktūros matrica, parodanti kiekvieno prognozuojančio kintamojo koreliacijas grupės viduje su kiekviena iš trijų kanoninių funkcijų (5 lentelė). Kiekvienas lentelės kintamasis yra pažymėtas žvaigždute pagal jo didžiausią koreliaciją su viena iš trijų kanoninių funkcijų. Stipriausios CD3, CD5 ir CD7 koreliacijos yra susijusios su 1 funkcija. CD22 ir CD13 yra stipriausiai koreliuojamos su 2 funkcija, tuo tarpu ląstelių procentas CD45 žemų / SSC žemų vartų srityje geriausiai koreliuoja su 3 funkcija (5 lentelė).

Kiekvienu atveju buvo apskaičiuoti trys diskriminaciniai balai pagal kiekvieną iš trijų diskriminacinių funkcijų. Šios diskriminuojančios balų vertės buvo naudojamos kiekvienam atvejui išdėstyti trimatėje DFA matricoje scat schemoje (2 pav.). Kiekvienas atvejis vaizduojamas kaip spindulys, pasibaigiantis spalvotu tašku, gaunamu iš aiškiai atskirtų grupės centroidų.

Toliau išsamiau apsvarstėme du klaidingai klasifikuotus tiriamosios imties atvejus. Abu atvejai buvo iš tikrųjų diagnozuoti kaip AML pagal morfologiją ir imunofenotipus, tačiau ląstelių procentas CD45 žemų / SSC žemų vartų srityje yra vos didesnis nei 20%. Vienu atveju buvo nustatyta nevienalytė CD7, CD22 ir CD13 raiška, o kitu atveju - tik stipri CD13 raiška. Atsižvelgiant į šiuos du neteisingus klasifikavimus, reikia atsiminti, kad pagal PSO klasifikaciją būtinas AML sprogimo procentas yra 20% pagal morfologiją. Įpūtimo procentai, nustatyti atliekant srauto citometrijos imunofenotipizavimą, nėra nustatomi nustatant AL pagal PSO klasifikaciją. Abiem atvejais buvo daugiau kaip 30% blastinių ląstelių pagal morfologiją, bet tik 23 ir 24% pagal srauto citometriją. Kadangi ląstelių procentas CD45 žemų / SSC mažų vartų srityje yra stipriausias visų prognozuojančių rodiklių koreliacija grupės viduje - 0, 784 atliekant 3 funkciją (6 lentelė), tai gali paaiškinti, kad šie du pacientai, kurių ląstelių skaičius yra mažas arba slenkstinis, yra nuo 20 iki 20 Prognozuojama, kad 30 proc. Bus NBMD.

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

Ankstesnėms pastangoms standartizuoti srauto citometrijos rodmenų aiškinimą klinikinės srauto citometrijos srityje kliudė priešanalizės ir poanalitinės metodikos sudėtingumas ir įvairovė. Vienas iš kertinių standartizuotos poanalitinės koncepcijos akmenų yra CD45 / SSC vartų nustatymo strategija. 18, 20 Nepaisant to, vis dar egzistuoja didžiulė skirtingų metodų įvairovė, kurią dar sunkiau suprasti, įvedus trijų ar keturių spalvų ar daugiaparametrų srauto citometriją (MFC).

Iš esmės yra trys skirtingi srauto citometrijos duomenų aiškinimo metodai: (1) supaprastintas dvimatis rankinis vartojimas naudojant Boolean derinius srauto citometrijos rodmenims ir mėginių klasifikavimas, pagrįstas individualiomis žiniomis ir patirtimi; (2) Mėginių klasifikavimas naudojant kompiuterinį automatizuotą daugiamatį mokymosi algoritmą, sugeneruotą pagal dvimatį sprendimo priėmimo taškų nustatymo procedūrą, ir (3) Prižiūrimas klasifikavimas naudojant atraminius vektorinius aparatus (SVM) ir automatizuotas daugiamatės tėkmės citometrijos rodmenų vidinis silikavimas.

Kelios tyrimo grupės įrodė, kad kompiuterinės klasterinės analizės metodai arba daugiamatės projekcijos metodai duomenų matricos, kuriamos atliekant ūminės mieloidinės ar ūminės limfoblastinės leukemijos MFC imunofenotipų nustatymą, tyrimui yra tinkama priemonė fenotipiniams pogrupiams identifikuoti, koreliuojantiems su biologinėmis, klinikinėmis ar prognostinėmis savybėmis. liga. 21, 22, 23, 24, 25 De Zen et al. Sėkmingai atliko netiesinę skaičiavimo daugiamatę srauto citometrijos antigeno ekspresijos profilių analizę . nustatyti pacientus, kuriems MLL / AF4 persitvarkymas pasireiškė ūmine limfoblastine leukemija vaikystėje. 23 Taikant panašų metodą, naudojant daugiamatę klasterinę šešių parametrų srauto citometrijos duomenų analizę. Zamir et al. ištyrė normalios BM ląstelių įvairovę ir išsprendė 23 skirtingų ląstelių populiacijų poklasius, neatskiriamus iš dviejų parametrų sklaidos brėžinių. 24 Valet et al. pristatė kraujo mėginių klasifikavimo metodą srauto citometrijoje, vadinamą algoritminiu duomenų sijojimu. 26 Kiekvienai mėginių klasei iš treniruočių duomenų rinkinio gaunamas diskredituotas atstovas. Nauji pavyzdžiai klasifikuojami pagal jų panašumą su šiais atstovais. Neseniai atliktame tyrime Toedling ir kt. taikė daugiamatį klasifikavimo metodą, naudodamas SVM. 27 klasifikatoriai buvo sukurti remiantis tradiciškai diagnozuotais treniruočių duomenimis. Naudojant automatinį ląstelių populiacijų aptikimą in silico, buvo įvertintas nepriklausomo duomenų rinkinio aptikimo tikslumas ir analizuota nestabiliai klasifikuotų ląstelių žymenų išraiška. Ši SVM pagrįsta klasifikacija atkuria rankiniu būdu nustatytas leukemijos ląsteles, kurių jautrumas 99, 78% ir 98, 87% specifiškumas. Apskritai šie tyrimai nedviprasmiškai parodo, kad daugiamatės analizės procedūros yra tinkamas įrankis palaikyti diagnostinį sprendimą ir mėginių klasifikavimą remiantis srauto citometrijos duomenų interpretacija. Šių metodų panaudojimas skaičiuojamai LMD analizei siekiant minimaliai nustatyti likutinę ligą, be abejo, yra intriguojantis, tačiau reikalinga plati ir kruopščiai kontroliuojama žinių bazė su pakankamai ilga klinikine stebėsena rezultatų analizei.

Šiame tyrime įvertinome skaičiavimo pakopinio DFA naudingumą srauto citometrijos rodmenų klasifikavimui pagal minimalų keturių spalvų atrankos skydą su CD45 / SSC-gating strategija, kuris bus naudojamas kaip sprendimų palaikymo sistema tikslesniam duomenų tikslumui. ir patikima AL diagnostinė analizė.

Tuo tikslu mes atlikome daugiacentrį tyrimą su standartizuota minimalių keturių spalvų antikūnų plokšte, kuris buvo patikrintas dėl jo naudingumo nustatant AL srauto citometrijos diagnozę, palyginti su faktine diagnoze, padaryta derinant citomorfologiją, išsamesnį imunofenotipą, citogenetiką ir molekuliniai tyrimai. Pirmiausia buvo nurodyti grupės reikalavimai atskirti NBMD ir pacientų, sergančių AL, mėginius, ir, antra, atskirti tris pagrindinius AL priklausomybės ryšius: BCP-ALL, T-ALL ir AML.

Šiuo metu taikytu duomenų analizės metodu buvo gauta duomenų matrica, kurioje yra teigiamų ląstelių procentas 13 antigenų ir keturioliktas kintamasis, ląstelių procentas CD45 žemo / SSC mažai surištų ląstelių populiacijoje (1 paveikslas). Ši duomenų matrica buvo naudojama apskaičiuojant laipsnišką DFA, siekiant nustatyti žiniomis pagrįstą mokymosi algoritmą, taikomą numatant nežinomo bandinio pavyzdžio klasifikavimą. Be to, DFA buvo naudojamas mažiausiai kintamųjų skaičiui nustatyti, kurie aiškiausiai išskiria keturias diagnostines grupes: BCP-ALL, T-ALL, AML ir NBMD. Taikant šį metodą paaiškėjo, kad ši grupė sugebėjo teisingai klasifikuoti 97, 2% visų atvejų iš tiriamosios imties. Be to, kintamieji buvo atrinkti pagal Wilksso λ metodą, o tolesnė analizė parodė, kad klasifikavimui iš tikrųjų reikėjo tik 7 (šeši mAb ir ląstelių procentas CD45 žemų / SSC žemų vartų ribose) iš 14 kintamųjų. Importantly, the described approach for sample classification does not depend on arbitrarily chosen cutoff values, for example, 20% for surface markers and 10% for intracytoplasmic markers, commonly used to discriminate between positive and negative markers in leukemia classification. 28

In contrast to the panel proposal by the EGIL-group in 1995, mAbs for antigens like CD117, CD79a, MPO and CD15 are not considered to be necessary, although CD79a and MPO are lineage specific markers with an EGIL score value of two. 28, 29 This difference might be due to different prerequisites like the CD45/SSC-gating strategy utilized in the current study which is not part of the EGIL recommendations. We are aware of the fact that biphenotypic acute leukemias and subtypes of AML, BCP-ALL and T-ALL are not represented in this model. This is not only due to the relatively small sample size of 155, but also to the antibody composition of the panel which is, for example, not designed to diagnose CD1a positive cortical T-ALL or pre-B-ALL due to the lack of cytoplasmic IgM in the panel. To extend the current algorithm to map different subtypes of AL, a much larger knowledge-based learning sample with a more composite antibody panel would be needed.

In conclusion, we have shown proof of principle that DFA is an adequate method with the potential to be utilized as a decision support system for the diagnosis and classification of AL by MFC. Six mAbs and the CD45/SSC-gating strategy are sufficient to classify 97% of all patients with AL correctly in regard to lineage determination and differentiation of normals. Besides, the economical implication might also influence future recommendations for a universal strategy to select antibodies and antibody combinations applicable to the analysis of hematological neoplasias.