Ryžių nitrato nešiklio „osnpf2.2“ sutrikimas trukdo pernešti nitratą nuo šaknų iki šaudymo ir kraujagyslių vystymąsi | mokslinės ataskaitos

Ryžių nitrato nešiklio „osnpf2.2“ sutrikimas trukdo pernešti nitratą nuo šaknų iki šaudymo ir kraujagyslių vystymąsi | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Augalų veisimas
  • Augalų molekulinė biologija
  • Augalų fiziologija
  • Augalų pervežėjai

Anotacija

Augalai vystėsi taip, kad kai kurie nitratų pernešėjų 1 / peptido pernešėjų šeimos ( NPF ) nariai galėtų pasisavinti ir pernešti nitratą. Tačiau mažai žinoma apie fiziologinius ir funkcinius šios šeimos vaidmenis ryžiams ( Oryza sativa L.). Čia apibūdinome specifinį kraujagyslių pernešėją OsNPF2.2. Funkcinė analizė naudojant cDNR sušvirkštus Xenopus laevis oocitus parodė, kad OsNPF2.2 yra mažo afiniteto, nuo pH priklausomas nitratų pernešėjas. Naudojant žalią fluorescencinį baltymą, pažymėtą OsNPF2.2, paaiškėjo, kad transporteris yra ryžių protoplasto plazmos membranoje. Ekspresijos analizė parodė, kad OsNPF2.2 yra indukuojamas nitratų ir daugiausia ekspresuojamas parenchimos ląstelėse aplink ksilą. Nutraukus OsNPF2.2, padidėjo nitratų koncentracija ūglių ksilimo eksudate, kai nitratas buvo tiekiamas po nepriteklius; šis rezultatas leidžia manyti, kad OsNPF2.2 gali dalyvauti iškraunant nitratą iš ksilemo. Esant pastoviam nitratų tiekimui, osnpf2.2 mutantai palaikė aukštą nitratų kiekį šaknyse ir mažą ūglių santykį: šaknies nitrato santykis; šis pastebėjimas rodo, kad OsNPF2.2 yra susijęs su nitratų transportavimu nuo šaknies iki šaudymo. OsNPF2.2 mutacija taip pat sukėlė nenormalią kraujagyslių struktūrą ir sulėtino augalų augimą bei vystymąsi. Mūsų išvados rodo, kad OsNPF2.2 gali iškrauti nitratą iš ksilės ir taip paveikti nitrato transportavimą nuo šaknies iki šaudymo ir augalų vystymąsi.

Įvadas

Azotas (N) yra pagrindinis augalų augimo ir vystymosi mitybos elementas. N taip pat yra pagrindinis 1, 2 derlių ribojantis veiksnys. Tačiau jei augalai efektyviai neįsisavina į dirvožemį įpiltų N trąšų, jos gali sukelti didelę aplinkos taršą. Nitratas (NO 3 - ) ir amonis (NH 4 + ) yra du pagrindiniai N šaltiniai aukštesniems augalams. Kaip ir dauguma kalnuotų augalų, žemumoje auginamuose ryžiuose pagrindiniai N šaltiniai yra nitratai ir amoniai 3 . Ryžiuose nitratų įsisavinimas yra ne tik didelis pajėgumas ir efektyvumas, bet taip pat laikomas geresniu už amonio įsigijimą 4 . Be to, ryžių augimas ir derlius yra pranašesni už nitratų ir amonio mišinius nei tuo atveju, jei tiekiama tik su vienu N šaltiniu 3 . Auginant padidėja turimo nitrato dalis dirvožemyje, o NO 3 -N tampa vyraujančia forma vietoje NH 4 + -N, kuris tradiciškai laikomas geriausiu N šaltiniu žaliaviniams ryžiams 5 . Nitratų ir amonio koncentracijos dirvožemio tirpaluose svyruoja nuo mažiau kaip 100 μM iki daugiau kaip 10 mM, todėl augalų šaknys turi tiek NO 3, tiek NH 4 + įsisavinimo sistemas, turinčias skirtingą giminingumą 6, 7 .

Nitratų įsisavinimas ir paskirstymas yra pagrindiniai veiksniai, leidžiantys efektyviai naudoti N aukštesniuose augaluose 2, 6 . Transportuotojai, turintys membraną, reikalingi nitratams absorbuoti iš dirvožemio ir nitratų judėjimui tarpląsteliniu ir viduląsteliniu būdu augalams 6 . Arabidopsis tyrime mažiausiai penkios genų šeimos yra susijusios su 1, 6, 8, 9 nitrato įsisavinimu, paskirstymu ir jutimu . Tai apima NPF (anksčiau NRT1 / PTR ) 10 šeimą, skirtą mažo afiniteto nitratų ar di / tripeptidų pernešimui, NRT2 šeimą, skirtą didelio afiniteto nitratų pernešimui, CLC šeimą chloridų kanalams, SLAC1 / SLAH šeimą, kurioje yra genas. koduojantis lėtai su anijonų kanalu susietą 1 homologą 3 ir ALMT šeimą aliuminio suaktyvinto Malato pernešimui.

Tik nedidelė dalis iš 53 NPF genų, esančių Arabidopsis , buvo funkciškai apibūdinti kaip nitratų pernešimo aktyvumas 1, 10 . Kai kurie Arabidopsis NPF taip pat gali pernešti kitus substratus, tokius kaip auksinas, abscisinė rūgštis ir gliukozinolatai 11, 12, 13 . Dauguma NPF nitratų pernešėjų yra mažo afiniteto nitratų pernešėjai 1 ; tik AtNPF6.3 (AtNRT1.1, CHL1) 14, 15 ir MtNPF6.8 (MtNRT1.3) 16 yra dvigubo afiniteto nitratų pernešėjai.

Nitratą šaknys pasisavina iš dirvožemio ir perneša į ūglius ir sėklas saugojimui ir (arba) tolesniam įsisavinimui 1 . AtNPF6.3 yra susijęs su nitrato pasisavinimu iš dirvožemio 14, 17 ir yra dvikryptis pernešėjas perkeliant nitratą iš šaknų į ūglius 18 . AtNPF7.3 (AtNRT1.5) yra atsakingas už nitrato įkrovimą į ksilą, kad būtų galima pernešti nitratą 19 nuo šaknies iki šaudymo 19 . AtNPF7.2 (AtNRT1.8) ir AtNPF2.9 (AtNRT1.9) dalyvauja reguliuojant ksilemo ir floemo nitratų translokaciją nuo šaknies iki šaudymo, atitinkamai, 20, 21 . AtNPF6.2 (AtNRT1.4) reguliuoja lapų nitratų homeostazę ir lapų vystymąsi, o AtNPF2.13 (AtNRT1.7) tarpininkauja filmo apkrovai paskirstyti nitratą iš senesnių ir jaunesnių lapų 22, 23 . AtNPF2.12 (AtNRT1.6) dalyvauja tiekiant nitratą besivystančioms sėkloms 24 .

AtNPF6.3 taip pat veikia kaip nitratų jutiklis, kuris reguliuoja 25 transkripciją ir dalyvauja skatinant šoninę šaknies pailgėjimą terpėje, kurioje gausu NO 3 26 . Nesant nitrato, AtNPF6.3 palengvina fitohormono auksino 13 įsisavinimą. Šie tyrimai parodė, kad nuo nitratų reguliuojamas AtNPF6.3 priklausomas auksino transportas yra atsakingas už nitratų skatinamą šoninės šaknies pailgėjimą. Didelio afiniteto įsisavinimo kompleksas NRT2.1-NAR2.1 taip pat dalyvauja šoninių šaknų vystymosi reguliavime 27 ; šoninių šaknų augimo reguliavimas NRT2.1 ir NAR2.1 nepriklauso nuo jų įsisavinimo funkcijos 28 .

Ryžiai yra pagrindiniai javų pasėliai, kurie pagrindinį maistą teikia daugiau nei pusei pasaulio gyventojų. Tačiau ryžių azoto panaudojimo efektyvumas yra mažesnis nei kitų augalų 29, o ryžių veislės, atsižvelgiant į reikiamą azoto tręšimo lygį, turi genetinių pokyčių30. Didžioji dalis mūsų žinių apie nitratų įsisavinimą ir perkėlimą yra iš Arabidopsis tyrimų , o apie šiuos procesus ryžiuose 1, 2 yra mažai. Todėl norint pagerinti azoto panaudojimo ryžiuose efektyvumą, labai svarbu suprasti nitratų įsisavinimo ir translokacijos ryžiuose molekulinius mechanizmus. Ryžių genome yra daugiau nei 93 NPF genai 10, 31, 32, o prognozuojami 5 NRT2 genai 33, 34 . Tačiau iki šiol buvo tiriami tik šeši ryžių NPF genų šeimos nariai, o tik OsNPF8.9 (OsNRT1) 35 ir OsNPF2.4 36 funkciškai įrodyta, kad jie gali pernešti nitratą. Čia apibūdinome ryžių NPF šeimos narį OsNPF2.2 ir parodėme, kad tai yra mažai afinitinis nitratų pernešėjas, kuris dalyvauja iškraunant nitratą iš ksilemo ir daro įtaką nitratų transportavimui nuo šaknų iki šaudymo ir augalų vystymuisi.

Rezultatai

OsNPF2.2 yra mažo afiniteto nitratų pernešėjas

Ryžiai OsNPF2.2 (LOC_Os12g44100) yra klasifikuojami į NPF šeimos 10 NPF2 pošeimį . Prognozuojama, kad tai mRNR (registracijos Nr. AK068351) koduojantis 589 aminorūgščių baltymą, turintį aukštą homologiškumo laipsnį su mažo afiniteto nitratų pernešėjais. Baltymas OsNPF2.2 yra 58%, 45%, 41% ir 47% homologiškas atitinkamai OsNPF2.4, AtNPF2.13, AtNPF2.12 ir AtNPF2.9, kurie visi yra susiję su nitratų pernešimu, ir 48 % ir 50% homologiški atitinkamai AtNPF2.10 (AtGTR1) ir AtNPF2.11 (AtGTR2), kurie abu yra susiję su gliukozinolatų pernešimu. Jame yra 12 tariamų transmembraninių domenų (TM) su ilga hidrofiline kilpa tarp TM6 ir TM7 (papildoma S1 pav.); ši struktūra yra panaši į tipinę NPF (NRT1 / PTR) gabentojų 37, 38 struktūrą .

Norint nustatyti, ar OsNPF2.2 yra nitratų pernešėjas, jo cDNR buvo heterologiškai ekspresuota Xenopus laevis oocituose. Mes ištyrėme aukšto ir mažo afiniteto nitratų pernešimo aktyvumą atitinkamai su 250 μM ir 10 mM 15 NO 3 . Kaip parodyta 1a pav., Palyginti su vandeniu įšvirkštais oocitais, OsNPF2.2 įšvirkšti oocitai, kurių pH buvo 5, 5, parodė žymiai padidintą 15 NO 3 - sugerties aktyvumą su 10 mM NO 3 - po 1, 5 ir 3 h inkubacijos. Norint patvirtinti, kad OsNPF2.2 veikė taip, kaip tikėtasi su protonų jungtu nitratų pernešėju, išmatuotas OsNPF2.2 įšvirkštų oocitų NO 3 - transportavimo aktyvumas, esant atitinkamai pH 5, 5 ir 7, 4 (1b pav.). Padidėjęs OsNPF2.2 įšvirkštų oocitų 15 NO 3 absorbcijos aktyvumas buvo nustatytas tik esant pH5, 5. Norint nustatyti OsNPF2.2 afinitetą NO 3 -, buvo išmatuotas OsNPF2.2 įšvirkštų oocitų, kurių pH 5, 5, absorbcijos aktyvumas, naudojant skirtingas 15 N pažymėto NO 3 koncentracijas, svyruojančias nuo 0, 5 iki 30 mM, ir NO m 3 Km, apskaičiuotas suderinus duomenis su Michaelio – Menteno lygtimi, buvo įvertintas kaip ~ 16, 6 ± 12, 9 mM (1c pav.). Xenopus oocitų funkcinių tyrimų rezultatai rodo, kad OsNPF2.2 yra nuo pH priklausomas, mažo afiniteto nitratų pernešėjas.

Image

a) OsNPF2.2 įšvirkštų oocitų nitratų pasisavinimo aktyvumas, kai pH 5, 5. Didelio afiniteto arba mažo afiniteto nitratų pasisavinimo aktyvumas buvo tiriamas inkubuojant oocitus su 0, 25 arba 10 mM K 15 NO 3 1, 5 h ir 3 h, tada išmatuojant 15 N lygį oocituose (n = 8–13 oocitų atitinkamai į vandenį ir OsNPF2.2 įšvirkštus oocitus). b) OsNPF2.2 nitratų įsisavinimo aktyvumo priklausomybė nuo pH. OsNPF2.2 įšvirkšti oocitai buvo inkubuojami su 10 mM K 15 NO 3, buferiu, kurio pH buvo 5, 5 arba 7, 4, 2 h, tada buvo išmatuotas 15 N kiekis oocituose (n = 10–13 oocitų vandeniui ir OsNPF2.2 - atitinkamai įšvirkšti oocitai). c) OsNPF2.2 absorbcijos kinetika. OsNPF2.2 įšvirkšti oocitai buvo inkubuojami su skirtingomis K 15 NO 3 koncentracijomis, esant pH 5, 5, 1, 5 val., Tada buvo nustatytas jų 15 N kiekis. K m, apskaičiuotas iš vieno eksperimento, pritaikius duomenis prie Michaelis – Menten lygties, naudojant netiesinius mažiausių kvadratų metodus programoje ORIGIN 5.0 („Microcal Software“; „GE Healthcare“), buvo ~ 16, 6 ± 12, 9 mM. Vertės yra vidurkis ± SE (n = 4–9 oocitai kiekvienai koncentracijai). * P <0, 05, palyginti su įpuršktu vandeniu; ** P <0, 01, palyginti su įpuršktu vandeniu.

Visas dydis

OsNPF2.2 yra lokalizuotas plazmos membranoje

Norint nustatyti OsNPF2.2 tarpląstelinę vietą, OsNPF2.2-GFP sulietas baltymas, kontroliuojamas CMV 35S promotoriaus 39, buvo pereinamuoju laikotarpiu ekspresuojamas kartu su plazminės membranos žymeniu pm-rk-mcherry 40 ryžių protoplastuose. Skirtingai nuo laisvojo GFP signalo (2f pav.), Kuris buvo rastas visoje ląstelėje, OsNPF2.2-GFP sulieto baltymo (2a pav.) Signalas buvo lokalizuotas plazmos membranoje ir sutaptas (2d pav.) žymeklio pm-rk-vyšnia signalas (2b pav.). Kartu su pastebėjimu, kad OsNPF2.2 turi 12 TM (papildomas S1 pav.), Šie duomenys rodo, kad OsNPF2.2 yra plazminės membranos nitrato pernešėjas.

Image

(a – e) OsNPF2.2-GFP fluorescencija, ekspresuojama kartu su plazminės membranos žymekliu pm-rk-mCherry, laikinai transformuotuose ryžių protoplaztuose (baras = 5 μm). Transformuotų ryžių protoplastai pirmiausia buvo atpažinti pagal OsNPF2.2-GFP (a) žaliųjų fluorescencinių baltymų (GFP) fluorescenciją; tada šios ląstelės buvo patikrintos dėl mCherry fluorescencijos (b) ir pagaliau dėl chlorofilo autofluorescencijos (c). Atitinkamas ryškaus lauko vaizdas yra parodytas (e). d) a, b ir c punktų sujungti vaizdai. f) GFP fluorescencija iš laisvojo GFP, išreikšta 35S promotoriumi kaip kontrolė (bar = 5 μm).

Visas dydis

OsNPF2.2 ekspresiją sukelia išorinis nitratas

Arabidopsis NPF genai išreiškiami skirtingai, reaguojant į nitratų tiekimą ir N-badą 2 . Vežėjai taip pat dalyvauja nustatant nitratą 9 . Todėl mes atlikome qPCR, norėdami patikrinti OsNPF2.2 transkripcijos reakciją į apdorojimą nitratais ir amoniu (3a pav.). OsNPF2.2 ekspresija buvo sureguliuota lapų ašmenyse , reaguojant į 1–2 valandas 10 mM nitrato atsargų, po 1 d nitrato trūkumo (3a pav.). Be to, šaknų ir lapų apvalkaluose OsNPF2.2 raišką šiek tiek paskatino 10 mM nitratų atsargos. Priešingai, visuose tirtuose audiniuose OsNPF2.2 ekspresijai reikšmingo poveikio NH4 + gydymas nepadarė (3a pav.). Norėdami dar labiau patvirtinti, kad nitratai padidino OsNPF2.2 ekspresiją lapų peiliukuose, mes ištyrėme GUS dažymą pOsNPF2.2 - uidA transgeniniuose ryžiuose po NO 3 indukcijos (3e – g pav.). Iki NO 3 - nepritekliaus - tiek pOsNPF2.2 - uidA, tiek p35S-uidA transgeninių ryžių augalų lapuose buvo GUS dažymas (3b pav., E). Tačiau kai augalai 1 d. Buvo perkelti į NO 3 - nenaudotą tirpalą, GOS dažymas dingo iš pOsNPF2.2 - uidA augalų lapų (3f pav.), Bet liko p35S-uidA augalų lapuose ( 3c pav.). Tada, kai augalams buvo perduotas atgal NO 3 tirpalas, GOS dažymas pasirodė pOsNPF2.2 - uidA augalų lapuose (3g pav.). Šie rezultatai rodo, kad OsNPF2.2 ekspresiją sukelia išorinis nitratas arba slopina nitratų badas, skiriasi nuo OsNPF2.4 36, kurį sukėlė N badas senesniuose lapų peiliukuose.

Image

a) OsNPF2.2 ekspresijos laiko analizė po NO 3 - ir NH 4 + indukcijos, naudojant kiekybinį realaus laiko PGR. Ryžių daigai buvo auginami 1/2 Murashige ir Skoog kietoje terpėje 10 dienų; po to daigai buvo plaunami ir atimami NO 3 - 1 dieną ir po to subkultūruojami Tarptautinio ryžių tyrimų instituto (IRRI) tirpale, kurio N šaltinis yra atitinkamai 10 mM KNO 3 arba 10 mM NH 4 Cl, arba maketai apdoroti KCl. . Augalai buvo renkami RNR ekstrakcijai nurodytu laiku. Santykinė išraiška buvo normalizuota iki eEF-1a išraiškos lygio. Trijų mėginių mėginių vertės yra vidutinės ± SE, kiekviename pakartojime yra septyni daigai. (b – g) β-gliukuronidazės aktyvumo analizė transgeninių ryžių augalų, turinčių uidA geną, lapų peiliukuose, kuriuos varo žiedinių kopūstų mozaikos viruso 35S promotorius (b – d) arba 2, 5 kb OsNPF2.2 promotorius (e – g) po nitrato indukcija. Pirmiausia transgeniniai augalai buvo auginami 1, 4 mM NH4N03 (b, e) tirpale, o paskui jiems netaikomas NO3 - 1 d (c, f); galiausiai augalai 2 valandas buvo perkelti atgal į IRRI tirpalą, naudojant 10 mM KNO 3 kaip N šaltinį (d, g). Baras = 0, 25 cm.

Visas dydis

OsNPF2.2 daugiausia ekspresuojamas kraujagyslių parenchimos ląstelėse

Tiriant OsNPF2.2 raiškos modelį, buvo naudojami trys metodai. Pirma, „RiceXPro“ (//ricexpro.dna.affrc.go.jp/) mikrotraumų duomenys parodė, kad OsNPF2.2 daugiausia išreiškiamas lapuose, šaknyse, stiebuose, žiedynuose, skruzdėlynuose, žiuželiuose, lemmose, paleose ir kiaušidėse (Papildoma fig. . S2). Antra, dažytas GUS dažymas parodė, kad nors OsNPF2.2 yra ekspresuojamas visuose tirtuose organuose (4a – f pav.), Jis pirmiausia yra ekspresuojamas centrinėje skeleto šaknyse (4a, b pav.) Ir lapų venose ( 4e pav.). Trečia, norint nustatyti OsNPF2.2 specifinį audinio raiškos modelį, buvo atliktas GUS dažytų organų skersinis arba išilginis pjūvis (4g – l pav.). Pjaustymas patvirtino, kad OsNPF2.2 daugiausia išreiškiamas lapų venose (4g, h pav.), Kamienų kraujagyslėse (4i, j ir k pav.) Ir šaknies šakute (4l pav.). Tačiau kraujagyslių parenchimos ląstelėse pastebėtas stiprus GUS dažymas (4g – i pav., 4l pav.). Kamienų ir lapų skersinis ir išilginis pjūviai parodė, kad OsNPF2.2 yra ekspresuojamas parenchimos ląstelėse, besiribojančiose su ksileminiais indais (4g, j ir k pav.). Kartu su ankstesniais rezultatais šie stebėjimai rodo, kad OsNPF2.2 yra stipriai ekspresuojamas kraujagyslių parenchimos ląstelėse, reaguojant į nitratų panaudojimą.

Image

(a – f) OsNPF2.2 raiškos modeliai įvairiuose organuose atliekant β-gliukuronidazės dažymo analizę, baras = 1000 μm. Transgeniniai augalai, turintys uidA geną, varomi 2, 5 kb OsNPF2.2 promotoriaus, buvo auginami rėžiuose su įprasta azoto trąša. GUS aktyvumas buvo aptinkamas daiginančių sėklų šaknyse ir lapuose (a), senuose šaknyse (b), užpildytuose sėklose (c), jaunuose žiedynuose ir stiebuose (d), vėliavos lapuose (e) ir kamščiuose ( f). (g – l) GUS dažytų augalų, transgeninių pOsNPF2.2-uidA , augintų normaliomis nitratų sąlygomis, išilginio (g, j) ir skersinio (h, i, k ir l) pjūvių analizė. GUS dažymas parodė, kad OsNPF2.2 yra stipriai ekspresuojamas kraujagyslių parenchimos ląstelėse lapuose (g, h), stiebuose (i, j, k) ir šaknyse (l). X, xylem; P, phloem; PC, parenchimos ląstelė. Juosta = 5 μm (g), 100 μm (h), 50 μm (i, j ir l) ir 10 μm (k).

Visas dydis

Sutrikus OsNPF2.2 , sutrinka augalų augimas ir sėklų užpildymas

Norėdami ištirti OsNPF2.2 funkciją, mes nustatėme du japonikos ryžių ( Oryza sativa L.) mutantus, osnpf2.2-1 (3D- 02162 ) ir osnpf2.2-2 (3A-07557), kurie buvo T-DNR nokautai. sukurta iš Hwayoung ir Dongjin veislių, atitinkamai 41, 42 . Abiejų mutantų T-DNR įterpimo vietas ribojančio genomo fragmento sekos nustatymas patvirtino, kad T-DNR buvo įterpta į OsNPF2.2 koduojančią sritį osnpf2.2-1 (3D-02162) ir į OsNPF2.2 3. ′ -Neatverstas regionas osnpf2.2-2 (3A-07557; 5a pav.). T-DNR kopijų skaičiaus analizė parodė, kad osnpf2.2-1 yra vienas T-DNR lokusas, o osnpf2.2-2 - du (duomenys nepateikti). Nei viename mutante OsNPF2.2 transkriptų nebuvo aptikta (5b pav.). Kadangi dauguma iš dviejų osnpf2.2 mutantų sėklų buvo nenormalios, mums nepavyko gauti papildytų linijų iš mutantų. Tačiau keli homozigotiniai mutantai buvo identifikuoti atliekant PGR atranką ir naudojami analizei. Mūsų analizėje homozigotiniai osnpf2.2-1 ir osnpf2.2-2 mutantai turėjo panašius fenotipus. Be to, norėdami patvirtinti dviejų osnpf2.2 mutantų rezultatus, mes taip pat sukūrėme OsNPF2.2 numušimo mutantus RNR kontroliuodami ryžių OsNPF2.2 promotorių. Mes nustatėme, kad aštuonios nepriklausomos OsNPF2.2- RNAi transgeninės linijos parodė OsNPF2.2 transkripto lygio sumažėjimą (papildomas S3a pav.).

Image

(a) OsNPF2.2 ir perduodamosios DNR (T-DNR) įterpimo vietų į osnpf2.2-1 ir osnpf2.2-2 mutantus schema . Dėžutės žymi du egzonus, o jungianti juodoji linija žymi introną. Juodos spalvos langeliai žymi atvirą skaitymo rėmelį, o pilkos spalvos langeliai rodo 5–3 ir 3′ neišverstus regionus. T-DNR žymima trikampiu. Santrumpos LB ir RB nurodo atitinkamai T-DNR kairę ir dešinę. Rodyklės su raidėmis rodo pradmenų, naudojamų gretimų sekų žymenims sustiprinti ir homozigotiniams mutantams ekranuoti, vietas. (b) OsNPF2.2 raiškos osnpf2.2 mutantuose pusiau kiekybinė PGR analizė. Bendra RNR buvo išgaunama iš homozigotinių osnpf2, 2-1 ir osnpf2, 2-2 augalų lapų ir jų tėvų (WT) lapų. Genas eEF-1a buvo sustiprintas kaip vidinė kontrolė. (c – f) Sėklų daigumas palyginimas tarp osnpf2.2 mutantų ir WT augalų. Paviršiuje sterilizuotos sėklos sudygo 1/2 Murashige ir Skoog kietoje terpėje; baras = 2 cm. (g – n) Pagrindiniai osnpf2.2 mutantų, užaugintų rūsyje, naudojant įprastas azoto trąšas, fenotipai. (g, j) žemaūgiai augalai; baras = 5 cm; (h, k) trumpi kabliukai; baras = 1, 5 cm; (i, l) sėklų užpildymo iš osnpf2.2 mutantų sumažėjimas , palyginti su WT sėklomis; baras = 2 mm. m) osnpf2.2 mutantų ir WT augalų augalų aukščio statistika subrendusioje stadijoje; ** P <0, 01, palyginti su VT augalais. n) Visiškai užpildytų sėklų (FFS), neužpildytų sėklų su išsiplėtusiomis kiaušidėmis (UFS) ir tuščių spikeletų (ES) palyginimas su augalais tarp osnpf2.2 mutantų ir WT augalų. Reikšmės yra vidutinės ± SE iš 60 augalų per du sezonus.

Visas dydis

„ Osnpf2.2“ mutantai, augindami normaliomis N sąlygomis, visą gyvenimą išgyveno keletą fenotipinių pokyčių (5c – 5n pav.). Skirtingai nuo laukinio tipo sėklų, dauguma sėklų iš osnpf2.2 mutantų neišdygo ant šlapių audinių. Sudygus 1/2 MS terpėje, osnpf2.2-1 ir osnpf2.2-2 sėklų daigumas buvo akivaizdžiai mažesnis nei jų tėvų veislių (5c – f pav.). „ Osnpf2.2“ mutantiniai augalai buvo žemaūgiai (5g, j ir m pav.), O smegenėlės buvo trumpos (5h pav., K). Grūdų užpildymas osnpf2.2 mutantais buvo stipriai užblokuotas ( 5n pav.). Pakeisti dviejų osnpf2.2 mutantų fenotipai buvo panašūs, nors osnpf2.2-2 mutantas turėjo dvi T-DNR kopijas. Augimo sulėtėjimas taip pat pastebėtas augaluose, turinčiuose mažai ar daug nitratų, auginant mutantus (papildomas S4 pav.). Daugiausia osnpf2.2 mutanto fenotipo buvo pastebėta transgeniniuose OsNPF2.2- RNAi augaluose, įskaitant nykštukiškumą, trumpus pantelius ir žemą sėklų išsidėstymą (papildomas S3b – f pav.). Remdamiesi aukščiau pateiktais duomenimis, padarėme išvadą, kad fenotipinius pakitimus, pastebėtus osnpf2.2 mutantuose, sukėlė OsNPF2.2 mutacijos. Todėl tolesnei analizei mes panaudojome homozigotinius mutantus, osnpf2.2-1 ir osnpf2.2-2 augalus.

Toliau mes atidžiai patikrinome sėklų išsivystymą osnpf2.2 mutantuose ( 5n pav.). Norėdami nustatyti, ar žemą sėklų pasiskirstymo greitį osnpf2.2 mutantuose sukelia pusmėnulio žiedadulkės ar apvaisintos, bet nutrauktos kiaušidės, suskaičiavome visiškai užpildytų sėklų, neužpildytų sėklų su išsiplėtusiomis kiaušidėmis (UFS) skaičių ir tuščius augalų smulkius žiedus (5i, l pav.). Duomenys rodo, kad kiekvieno mutanto augalo UFS procentas yra daug didesnis nei laukinio tipo augalų (5n pav.). UFS yra sėklos, kuriose yra apvaisintų kiaušialąsčių, bet kurios nebuvo užpildytos. Be to, net visiškai užpildytos mutantų sėklos gali būti nenormalios, nes jos nevisiškai sudygo (5c – f pav.). Todėl OsNPF2.2 sutrikimas daro didelę įtaką ryžių sėklų vystymuisi.

Nors du osnpf2.2 mutantai ir OsNPF2.2- RNAi ryžiai turėjo panašius fenotipus, pastebėti ir kai kurie skirtumai (5 pav., Papildoma S3 pav.). Šiuos skirtumus gali sukelti dviejų veislių genetinio fono skirtumai ir (arba) skirtingas T-DNR įterpimo vietų išdėstymas (5a pav.).

OsNPF2.2 poveikis nitratų pernešimui nuo šaknų iki šaudymo

Norint ištirti, ar osnpf2.2 mutantuose nėra ilgalaikio nitratų pernešimo, buvo tiriama nitratų koncentracija ksilės eksudatuose, bendra nitrato koncentracija ir nitrato pasiskirstymas tarp šaknų ir ūglių (6 pav.). Kai augalai buvo nuolat auginami su pakankamu nitrato tirpalu, osnpf2.2 mutantuose ksilemo sulčių nitratų koncentracija buvo žymiai mažesnė nei laukinio tipo augaluose (6a pav.). Be to, mutantų šaknyse susikaupė daugiau nitratų nei laukinio tipo augalų šaknyse (6b pav.), Ir nors laukinio tipo augalų ūglių: šaknų nitratų santykis buvo 1, 18 arba 0, 89, jis sumažėjo iki 1, 10 arba 0, 73 atitinkamai osnpf2, 2-1 ir osnpf2, 2-2 mutantuose augaluose (6c pav.). Šie stebėjimai rodo, kad osnpf2.2 mutantuose daugiau nitratų yra šaknyse ir mažiau nitratų perkeliama į ūglius nei laukinio tipo augaluose. Visi šie rezultatai leidžia teigti, kad OsNPF2.2 vaidina tam tikrą vaidmenį pernešant nitratą iš šaknų į ūglius.

Image

(a – c) Nitratų koncentracija ksilemo eksudate (a), bendrojo nitrato koncentracija šaknyse ir ūgliuose (b) bei ūglio ir šaknies nitrato santykis (c) laukinio tipo (WT) augaluose ir osnpf2. 2 mutantai. Augalai buvo auginami Tarptautinio ryžių tyrimų instituto (IRRI) tirpale, kuriame yra 1, 4 mM NH4N03, 8 savaites, kad būtų galima apdoroti nusistovėjusį nitratą. Kad būtų galima surinkti ksilės sula, augalai buvo supjaustyti 4 cm virš šaknų, o šaknys nedelsiant perkeltos į 10 mM nitrato IRRI tirpalą 2 valandas. Ksilemo sula buvo surinkta per 2 valandas. Norint išmatuoti bendrą nitratų koncentraciją šaknyse ir ūgliuose, mėginiai buvo imami tiesiai po kultivavimo. Trijų mėginių vertės yra vidutinės ± SE vertės; * P <0, 05, palyginti su VT augalais; ** P <0, 01, palyginti su VT augalais.

Visas dydis

Nutraukus OsNPF2.2, nitratai iškraunami iš ksilemo

Kadangi OsNPF2.2 yra ekspresuojamas parenchimos ląstelėse, besiribojančiose su ksilema, jis gali būti susijęs su nitratų įkrovimu į ksilemą, kaip AtNPF7.3 19, arba nitratų iškrovimu iš ksilės, kaip AtNPF7.2 20 ; todėl OsNPF2.2 suskaidymas turėtų paveikti nitrato kaupimąsi ksilimo suloje. Norint patikrinti šią hipotezę, po 2 val. Nitrato šėrimo po NO 3 - atėmimo buvo surinkti ir išanalizuoti augalų ksilės eksudatai (7a pav.) Taip. Augalai, užauginti turtingame nitrato tirpale, per savaitę buvo perkelti į tirpalą, kuriame nėra NO 3 (su NH šaltiniu kaip NH 4 SO 4 ), kad būtų pašalintas vidinis nitratas. Tada augalai, iš kurių trūksta NO 3, perkelti į 10 mM nitrato IRRI tirpalą 2 valandas, po to buvo surinkti ksilų eksudatai iš ūglių su šaknimis. Nitratų koncentracija ksilemo suloje buvo didesnė osnpf2.2 mutantuose nei laukinio tipo augaluose (7a pav.). Šie duomenys rodo, kad esant trumpalaikiam nitratų atsargų pasikartojimui po NO 3 - bado, osnpf2.2 mutanto ksilės induose susikaupia daugiau nitratų nei laukinio tipo augaluose, o tai rodo, kad OsNPF2.2 taip pat gali žaisti vaidmuo iškraunant nitratą iš ksilės. Tada buvo išmatuotas augalų, kurie 2 valandas buvo maitinami nitratu, šaknies ir šaudymo nitratų kiekis. Osnpf2.2 mutantų šaknyse ir ūglių nitratų koncentracija buvo didesnė nei laukinio tipo augaluose (7b pav.); šis pastebėjimas parodė, kad osnpf2.2 mutantų šaknyse ir ūgliuose buvo sulaikyta daugiau nitratų nei laukinio tipo augaluose. Tokio rezultato priežastis gali būti ta, kad šaknims ir ūgliams trumpam laikant maitinimą nitratais, pašalintais iš augalų su mutantais, po šaknies ir ūglių iškraunama mažiau nitratų, palyginti su laukinio tipo augalais. Atsižvelgiant į pOsNPF2.2- GUS dažymą kraujagyslių parenchimos ląstelėse (4 pav.), Šie rezultatai rodo, kad OsNPF2.2 sutrikimas gali užkirsti kelią nitratų išmetimui iš ksilemo .

Image

(a, b) Nitratų koncentracija ksylem eksudatuose (a) ir bendrojo nitrato koncentracija laukinio tipo (WT) augalų šaknyse ir ūgliuose (b) bei osnpf2.2 mutantuose per 2 val. trumpalaikį šėrimą nitratais. Augalai 8 savaites buvo auginami Tarptautinio ryžių tyrimų instituto (IRRI) tirpale, kuriame yra 1, 4 mM NH4N03; po to jie buvo perkelti į IRRI tirpalą, kuriame yra 1, 4 mM NH4S04, kad būtų pašalintas NO 3, 1 savaitę, po to perkeliami atgal į IRRI tirpalą su 10 mM KNO 3 2 h xylem sap rinkimui (a) arba matuojant bendrą nitratų koncentracija šaknyse ir ūgliuose (b). Trijų mėginių vertės yra vidutinės ± SE; * P <0, 05, palyginti su WT augalais; ** P <0, 01, palyginti su WT augalais.

Visas dydis

„ Osnpf2.2 “ mutantuose yra nenormali kraujagyslių struktūra

OsNPF2.2 yra labai išreikštas visų organų kraujagyslėse (4 pav.), O ksilė ir kraujagyslių floemas yra svarbūs nitratų transportavimui 2 . Norėdami nustatyti, ar OsNPF2.2 mutacijos veikia kraujagyslių vystymąsi, mes ištyrėme osnpf2.2 mutantų kraujagysles pjūviu . Visi tirti organai rodė nenormalius kraujagyslių pluoštus (papildomas S5 pav.). Pavyzdžiui, osnpf2.2 mutantų stiebų išoriniai kraujagyslių pluoštai turi nenormalią struktūrą (papildomas S5b, d pav.), Palyginti su laukinių augalų augalais, kurių stiebuose yra žiedų, turinčių įprastas išorines kraujagysles (papildomas S5a pav.), c). Priemonės ir šakos osnpf2.2-1 mutantiniuose augaluose taip pat sutrikdė sieto vamzdelius ir indus (8b pav., F). Tirdami osnpf2.2 mutantų ultrastruktūrą, mes nustatėme, kad keliose kraujagyslių ląstelėse osnpf2.2-1 lapuose vis dar buvo citoplazma (8d pav.); šis pastebėjimas parodė, kad užprogramuota ląstelių žūtis kai kuriuose ksilomų induose. Iš pjūvių padarėme išvadą, kad OsNPF2.2 sutrikdymas sutrikdo kraujagyslių vystymąsi ir taip paveikia nitratų ir kitų metabolitų tolimąjį transportą.

Image

(a, b) laukinio tipo (WT) augalo (a) ir osnpf2, 2-1 mutanto (b) skerspjūvis ; sieto vamzdeliai (St) ir indai (Ve) osnpf2.2-1 mutante yra sutrinka; baras = 2 µm. (c, d) WT augalo lapų ašmenų (c) ir osnpf2.2-1 mutanto (d) ultrastruktūra ; keletas kraujagyslių, esančių mutantiniame augale, parodė, kad miršta, palyginti su kraujagyslėmis, esančiomis WT gamykloje; baras = 5 µm. (e, f) Pirminių šakų išskyrimas iš WT augalo (e) ir osnpf2, 2-1 mutanto (f), strypas = 50 μm. Aplink kraujagyslių pluoštą (Vb) osnpf2.2-1 mutante nebuvo akivaizdaus kraujagyslių apvalkalo, o jo sieto vamzdeliai ir indai buvo netaisyklingai pasiskirstę kraujagyslių pluoštuose.

Visas dydis

Diskusija

Tvarus maisto produktų tiekimas, kad būtų galima maitinti pasaulio gyventojus, yra nepaprastai svarbus tiek žmonių, tiek aplinkos sveikatai, todėl augalų membranų pernešėjų tyrimas gali būti naudingas norint padidinti kukurūzų derlių 43 . Didelėje NPF transporterių šeimoje keletas narių buvo apibūdinti kaip nitratų, peptidų, gliukozinolatų, indol-3-acto rūgšties ir abscisinės rūgšties 10, 18 pernešėjai ; tačiau dauguma duomenų apie šiuos nešiotojus buvo gauti atlikus Arabidopsis tyrimus. Ryžiai yra vienas iš svarbiausių javų 30 ir išreiškia 93 NPF šeimos narius 10 . Tačiau žinoma, kad tik OsNPF8.9 ir OsNPF2.4 perneša nitratus 35, 36, o fiziologinis OsNPF8.9 vaidmuo ryžiuose vis dar nežinomas. Čia mes parodėme, kad OsNPF2.2 yra mažo afiniteto nitratų pernešėjas, ekspresyvuodamas OsNPF2.2 Xenopus laevis oocituose , ir parodydami, kad dėl OsNPF2.2 funkcijos praradimo mutacijos nitratas kaupiasi ksilimoje , nitratų transportavimo nuo šaknų iki ūglių mažinimas ir ryžių augimo sulėtėjimas. Kartu su pastebėjimu, kad OsNPF2.2 yra ekspresuojamas parenchimos ląstelėse aplink ksileminius indus, duomenys rodo, kad OsNPF2.2 iš ksilemo iškrauna nitratą, norėdamas pernešti nitratą iš šaknų į ūglius.

Ryžių genome yra 93 NPF nariai, tai yra daugiau nei Arabidopsis 10 . Ankstesniame tyrime mes nustatėme, kad OsNPF2.2 raiška sukelia nitratus ir kad OsNPF2.2 negalėjo pernešti peptidų 44 ; OsNPF2.2 mutacija sukėlė rimtą nenormalų augimą. Šie duomenys parodė, kad OsNPF2.2 gali būti svarbus ryžių nitrato transportavimui. Todėl šiame tyrime OsNPF2.2 buvo analizuojamas pagal ekspresiją Xenopus laevis oocituose, kad būtų patikrintas jo nitratų pernešimo pajėgumas. Xenopus laevis oocituose OsNPF2.2 parodė, kad nitratai yra įsisavinami esant dideliam nitratų kiekiui, ir šis nitratų pasisavinimo aktyvumas priklausė nuo pH (1 pav.). Įvairūs Arabidopsis NPF nitratų pernešėjai veikia kaip antplūdžio, ištekėjimo ar dvikrypčiai nitratų pernešėjai 18 . Mūsų duomenys rodo, kad OsNPF2.2 turi nitratų antplūdžio pajėgumą, tačiau mes nežinome, ar jis taip pat turi nitratų ištekėjimo pajėgumą. OsNPF2.2 yra klasifikuojamas NPF šeimos 10 NPF2 pošeimyje. Šiame klode taip pat yra AtNPF2.10 ir AtNPF2.11, kurie yra gliukozinolatų pernešėjai 11 . Todėl bus svarbu toliau analizuoti, ar ryžiuose yra gliukozinolatų, ir ar OsNPF2.2 gali pernešti gliukozinolatus.

Transporteriai, skirti nitratams krauti į ksileminius indus ir iškrauti iš ksileminių indų, anksčiau buvo identifikuoti Arabidopsis 2, 19, 20 . Šiame tyrime mes nustatėme, kad OsNPF2 .2 yra stipriai ekspresuojamas kraujagyslių parenchimos ląstelėse (4 pav.) Ir kad, nutraukus OsNPF2.2 , nitratai kaupėsi osnpf2.2 mutantų ksileminėje suloje (7a pav. ), kai nitratų atsargos papildomos po NO 3 - bado. Kai po N bado buvo atstatytas nitratų kiekis, laukinio tipo augalų šaknyse ir ūgliuose nitratų koncentracija išliko palyginti nedidelė (<10 μM; 7b pav.), Palyginti su palyginti aukštu (> 25 μM; 6b pav.), esant pastoviam turtingam nitratui. Šio stebėjimo priežastis gali būti tokia: kai nitratai buvo papildyti po NO 3 - bado, dėl santykinai žemo nitratų lygio laukinio tipo augale didžioji dalis nitrato galėjo būti iškrauta iš ksilės indų ir įsisavinti šaknis, kad į šaudymo ksilimą būtų gabenama mažiau nitratų. Taigi, nitrato kiekis ūglių ksilės eksudate būtų žemas (7a pav.). Atvirkščiai, osnpf2.2 mutantuose tokiomis pačiomis sąlygomis nitratas būtų buvęs nepakankamai iškrautas iš ksilės, taigi nitratas būtų susikaupęs osnpf2.2 mutantų ksilės suloje, šaknyse ir ūgliuose (7 pav.). Šie stebėjimai, kartu su OsNPF2.2 nitratų pernešimo aktyvumu, rodo, kad OsNPF2.2 yra atsakingas už nitrato iškrovimą iš ksilemos į parenchimos ląsteles.

Tačiau kai nitratų atsargos buvo atstatytos po NO 3 - bado arba esant pastovioms turtingoms nitratų sąlygoms, osnpf2.2 mutantų ksilimo sulos nitrato koncentracijos pokyčiai buvo priešingi tiems, kurie pastebimi laukinio tipo augaluose (6a pav., Palyginti su 7a.) ). Todėl kokie duomenys galėtų būti naudojami paaiškinti ksilemo pakrovimą ir iškrovimą? Auginant augalus, kurių išorinė nitratų koncentracija maža, didžioji dalis nitratų įsisavinimo vyksta šaknyje, tuo tarpu esant didelėms išorinių nitratų koncentracijoms, vis svarbesnė tampa ūglių įsisavinimas45. Tačiau norint nustatyti OsNPF2.2 poveikį nitrato pasiskirstymui tarp organų, jo funkcija turėtų būti toliau tiriama esant pastoviam turtingam nitratų būviui.

Augalai derina savo vystymąsi, atsižvelgdami į turimus maistinių medžiagų šaltinius 46 . Nors OsNPF2.2 daugiausia išreiškiamas kraujagyslėse (4 pav.), OsNPF2.2 sutrikimas lėmė didelę nitratų koncentraciją osnpf2.2 mutantų šaknyse (6b pav.) Normaliomis pastoviomis, turtingomis nitratų sąlygomis. Tačiau Osnpf2.2 mutantuose sumažėjo nitratų ūglių ir šaknų santykis (6c pav.), Kai augalai buvo nuolat auginami normaliomis nitrato sąlygomis. Šis pastebėjimas rodo, kad OsNPF2.2 reguliuoja nitratų paskirstymą nuo šaknų iki ūglių. Nitratų transportavimo į lapų ašmenis ir besivystančias sėklas osnpf2.2 mutantuose slopinimas gali paaiškinti jų lėtą augimo greitį ir sėklų užpildymo nepakankamumą (5 pav. Ir papildoma S4 pav.). Nitratų įsisavinimą ir perkėlimą augalų viduje reguliuoja ne tik išoriniai nitratai, bet ir vidiniai veiksniai 2 . Didelės nitratų koncentracijos augaluose, esančiuose osnpf2.2 mutantuose, gali neigiamai atsiliepti apie nitratų pasisavinimo kelią, kaip tai vyksta vykstant baltymų, tokių kaip OsNPF8.9 35, OsNAR2.1 47 ir kt., Reguliavimui. specialiųjų transporterių, reguliuojančių maistinių medžiagų įsisavinimą, reguliavimas 48, 49 . OsNPF2.2 raišką skatina nitratas (3 pav.), Jis taip pat dalyvauja reaguojant į ryžių nitratą. „ Osnpf2.2“ mutantai turėjo rimtesnių nenormalių fenotipų (5 pav.) Nei „ sp1“ mutantas, kurio pagrindinis fenotipas buvo trumpi pūsleliai 50 . OsNPF2.2 išmušimo mutantai ir OsNPF2.2- RNAi transgeniniai augalai turėjo panašius fenotipus (5 pav. Ir papildoma S3 pav.). Šie rezultatai rodo, kad OsNPF2.2 yra svarbus nitratų paskirstymui ryžių augaluose ir normaliam ryžių augimui.

OsNPF2.2 taip pat dalyvauja kuriant kraujagyslių ryšulius (8 pav. Ir papildomas S5 pav.). Kraujagyslių sistema yra ląstelių tinklas, sujungiantis visus pagrindinius augalo organus. Kraujagyslių audinių formavimasis augaluose yra plačių vystymosi ir fiziologinių padarinių sukeliantis procesas. Arabidopsis AtNPF6.3 gali būti nitratų jutiklis, kuris reguliuoja šaknų vystymąsi 13 . Nutraukus OsNPF8.20 ( OsPTR9 ), buvo prarastos kai kurios išorinės kamieninės kraujagyslės 51 . Tačiau nenormalūs kraujagyslių pluoštai osnpf2.2 mutantuose skiriasi nuo mutantų osnpf8.20 , nes kraujagyslių pluoštai osnpf2.2 mutantuose (8 pav. Ir papildoma S5 pav.) Buvo daug rimčiau sutrikdyti nei osnpf8.20 mutantas 51 . Iš osnpf2.2 mutantų kamienų visos išorinės kraujagyslės turėjo nenormalią struktūrą (papildomas S5 pav.). Nenormalūs kraujagyslių pluoštai osnpf2.2 mutantuose pasirodė visuose organuose, įskaitant šaknis, apvalkalus, lapus, stiebus, kamienų šakas ir skruzdėlynus (papildomas S5 pav.). Visų pirma, kai kurios ksilemo ląstelės nebuvo tinkamai suskaidytos osnpf2.2 mutantuose (8d pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad OsNPF2.2 taip pat veikia normalų kraujagyslių pluoštų vystymąsi. Nenormalūs osnpf2.2 mutantų kraujagyslių pluoštai taip pat gali trukdyti transportuoti nitratus ir kitus metabolitus. Žinoma, nenormalius kraujagyslių pluoštus pati gali sukelti didelis nitratų kaupimasis osnpf2.2 mutantuose .

Arabidopsis tyrime įrodyta, kad keli mažo afiniteto nitratų pernešėjai (AtNPF6.3 – AtNPF2.9) vaidina įvairius nitratų pernešimo skirtingose ​​augalo dalyse vaidmenis 2 . Skirtingai nuo OsNPF8.9 , kuris konstituciškai yra išreikštas pačiame išoriniame šaknų sluoksnyje, ty epidermyje ir šaknų plaukuose 35, 36, OsNPF2.2 yra konstituciškai ekspresuojamas daugumoje organų, net senų šaknų pluošte (3 pav. 4), ir jį indukuoja nitratas (3 pav.). Be to, individuali OsNPF2.4 36 ir OsNPF2.2 mutacija (5 pav.) Gali sukelti akivaizdų fenotipą. Tai rodo, kad OsNPF8.9, OsNPF2.4 ir OsNPF2.2 vaidmenys ryžiuose skiriasi, o trys OsNPF gali pernešti nitratą. OsNPF2.2 yra labai išreikštas lapuose ir šakose (4 pav. Ir papildomas S1 pav.); šis pastebėjimas rodo, kad OsNPF2.2 reguliuoja nitratų transportavimą į lapų ašmenis ir reprodukcinius organus.

Nitratas gali kauptis sėklose ir taip paveikti ramybę 52 sėklose, įskaitant ryžių sėklas 53 . Arabidopsis metu AtNPF2.12 24 ir NRT2.7 54 tarpininkauja nitratų judėjimui sėklose. OsNPF2.2 yra labai išreikštas reprodukciniuose organuose ir jauname žiedyne (4 pav.), O osnpf2.2 mutantuose yra didelis neužpildytų sėklų procentas (5 pav. Ir papildomas S3 pav.). Šie rezultatai rodo, kad OsNPF2.2 vaidina svarbų vaidmenį kontroliuojant nitratų judėjimą į smaigalį ir daro įtaką reprodukcinių organų vystymuisi. Pirminės ir antrinės šakos yra pagrindiniai nitratų transportavimo į smaigalį keliai , o OsNPF2.2 yra labai išreikštas kameros šakose (4 pav.). Be to, osnpf2.2 mutantai turėjo nenormalias šakas su sutrikusiomis kraujagyslėmis (8 pav. Ir papildoma S5 pav.). Šie rezultatai rodo, kad OsNPF2.2 gali kontroliuoti nitratų pernešimą į smaigalį.

Metodai

Augalinės medžiagos, augimo sąlygos

Japonikos ryžių ( Oryza sativa L.) mutantai, osnpf2.2-1 (3D- 02162 ) ir osnpf2.2-2 (3A-07557), buvo pernešimo DNR (T-DNR) nokautai, sukurti iš Hwayoung ir Dongjin veislių, atitinkamai Korėjos augalų funkcinės genomikos laboratorijoje 41, 42 . Kita šiame tyrime naudojama transgeninė ryžių veislė yra japoninių ryžių veislė „Zhonghua 11. Hidroponiniam augimui augalai buvo auginami 20 litrų hidroponinėje dėžutėje su Tarptautinio ryžių tyrimų instituto (IRRI) ryžių maistiniu tirpalu 55 augimo kambariuose (28 ± 2). 2 ° C, 14 h šviesos, 10 h tamsos). Atliekant eksperimentus su dirvožemiu, augalai buvo auginami ryžių žieve iš Pietų Kinijos botanikos sodo, Kinijos mokslų akademijos, Guangdžou, Kinija (SCBG).

Funkcinė OsNPF2.2 analizė Xenopus laevis oocituose

1, 8 kb OsNPF2.2 cDNR buvo klonuotas į oocitų ekspresijos vektorių pGEMHE ir linearizuotas Nhe I. Uždengta mRNR buvo transkribuota in vitro, naudojant „mMESSAGE mMACHINE“ rinkinius („Amion“). Oocitai buvo išskirti ir įpurškiami 50–100 ng OsNPF2.2 kRNR 50 nL vandens; kiti procesai buvo aprašyti anksčiau 21 .

Vektorių konstravimas ir augalų transformacija

OsNPF2.2 promotoriaus β-gliukuronidazės konstruktui gauti 2, 5 kb OsNPF2.2 geno promotorius buvo amplifikuotas PGR. Amplifikacijai buvo naudojami šie pradmenys: 5′-CCCAAGCTTATGAACAGTTGAGAAGAC-3 ′ (į priekį) ir 5 ′ - CATGCCATGGATTTATGTAAGATTAGGC-3 ′ (atvirkščiai). Gautas PGR fragmentas buvo įterptas į Hind III / NocI vietas uIDA reporterio geno 5 ′ gale pCAMBIA1301 (//www.cambia.org).

To generate the hairpin RNAi construct, a highly specific 114 bp fragment of OsNPF2.2 was amplified by PCR using the forward primer O25F (5′-GGTACCACTAGTCTAATCTTACATAAAT-3′), and the reverse primer O25R (5′-GGATCCGAGCTCGAGATGTGCTGCTGCTTC-3′). The resulting PCR fragment was cloned in the sense orientation into the Spe I/ Sac I sites of pTCK303 56 to generate pTCK-114i and then, cloned in the antisense orientation into the Kpn I/ BamH I sites of pTCK-114i to obtain the OsNPF2.2 -RNAi construct. Finally, the OsPTR2 promoter was inserted into the Hind III/ BamH I sites of the OsNPF2.2 -RNAi construct, replacing the UBI-1 promoter, to obtain the final vector (pTCK- pOsNPF2.2 -114bp- OsNPF2.2 Sense-Intron-114bp- OsNPF2.2 Antisense). The construct was transformed into Agrobacterium tumefaciens (strain EHA105) and used to transform calli developed from Zhonghua 11 seeds to obtain the transgenic rice, as previously described 51 .

To generate a green fluorescent protein (GFP)-tagged OsNPF2.2 fusion protein construct ( p35S-OsNPF2.2-GFP ) for transient expression, OsNPF2.2 cDNA was amplified by PCR using the forward primer 5′- GGATCCGCCTAATCTTACATAAAT-3′ and the reverse primer 5′- GGATCCGACCGCCATGGCCGGCGG-3′. The amplified fragment was then subcloned in front of the GFP coding region in the vector pUC18-GFP.

Semi-quantitative RT-PCR and quantitative real-time PCR

Total RNA was extracted using TRIzol reagent (TaKaRa, China). The first strand cDNAs were synthesized using oligo (dT) primers and MML reverse transcriptase (Promega. China). Specific semi-quantitative RT-PCR primers used to amplify OsNPF2.2 and eEF-1a were as follows: OsNPF2.2 forward, 5′-GCCGTCGCAGGAGCAAACT-3′; OsNPF2.2 reverse, 5′-CGAGGAGGAGGCACAAGGTG-3′; eEF-1a forward, 5′-AGCCGCTGAGATGAACAA-3′; and eEF-1a reverse, 5′-GAGATGGGAACGAAGGGA-3 ′. Quantitative real-time PCR (qPCR) was performed using SYBR Green Premix (TaKaRa) and monitored with the 7500 RT-qPCR system (Applied Biosystems, USA). The primers used for qPCR were as follows: OsNPF2.2 forward, 5′-GCAGGAGCAAACTAAGCT-3′; OsNPF2.2 reverse, 5′-TGGGGATGTGGAAGACGGT-3′, eEF-1a forward, 5′ -GCACGCTCTTCTTGCTTTC-3′; and eEF-1a reverse, 5′-AGGGAATCTTGTCAGGGTTG -3′.

Identification of the T-DNA-generated mutants osnpf2.2-1 and osnpf2.2-2

Flanking sequence tags (FSTs) for osnpf2.2-1 and osnpf2.2-2 were amplified by PCR, and the resulting products were sequenced to confirm the presence of the T-DNA in OsNPF2.2 . The following primers were used to screen the mutant lines: a, 5′-TGGACTGTGCCACGTGTAAT-3′; b, 5′-CCAGTTGATGTTGCTCTGGA-3′; c, 5′-TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC-3′; d, 5′-ACGGTGTTCCAGGTGATG-3′; and e, 5′-CAGGGTGAAGGTTTAGCAAT-3′. Homozygous lines were screened by PCR using a combination of primers a, b, and c for osnpf2.2-1 or a combination of primers d, c, and e for osnpf2.2-2 . Gene expression was confirmed by RT-PCR as described above. Southern blotting was used to examine the T-DNA copy number in the two mutants. Their genomic DNAs were digested with Xba I, Bam HI and Hin dIII and hybridized with a digoxigenin-DNA-labeled hygromycin-resistance gene probe.

Phenotypic analysis in a paddy field

Rice seeds were surfaced sterilized and germinated in 1/2 Murashige and Skoog media for 10 days; then the seedlings were transferred into an SCBG paddy field for 30 days. Finally, the seedlings were transplanted in the paddy field under normal rice growth conditions and fertilized as for normal rice growth.

GUS staining for plants grown under normal N conditions or with nitrate induction

Homozygous T 3 transgenic plants with pOsNPF2.2-uidA or with p35S-uidA were used for GUS staining. The protocols for GUS staining and section analysis have been described previously 51 . To determine OsNPF2.2 expression under normal N conditions, plants were grown in a paddy field under normal fertilizer application. For nitrate induction, the rice seedlings were grown in IRRI solution with 1.4 mM KNO 3 for 10 d and then transferred to IRRI solution with 1.4 mM NH 4 SO 4 as the N source for NO 3 - deprivation for 1 d. Finally, the plants were transferred back into IRRI solution with 10 mM KNO 3 to induce GUS activity within 2 h.

Semi section and transmission electron microscopy analysis

Sample preparation was carried out according to the procedures described by Park et al . 57, Ultra-sections were examined under transmission electron microscopy (JEM-1010 electron microscope; JEOL, Tokyo, Japan). For semi section observation, the 2 µm thick sections were stained with 0.5% toluidine blue and then observed and photographed using a fluorescence microscope (AXIOPLAN 2; Zeiss, Jena, Gemany).

Transient expression of OsNPF2.2 in rice protoplasts

To determine the subcellular localization of OsNPF2.2, p35S-OsNPF2.2-GFP and p35S-GFP were introduced into rice protoplasts. The protocols for rice protoplast preparation and transformation have previously been described 58 . Protoplasts were observed using a confocal laser-scanning microscope (Leica TCS 5 SP5 AOBS), a Leica Microsystem LAS AF, or a Leica DMI6000B inverted fluorescence microscope, as previously described 40 .

Nitrate content analysis by high-performance liquid chromatography

Rice xylem sap collection was performed according to the protocol described by Tang et al 59, as follows. The rice plants were grown in IRRI solution containing 1.4 mM NH 4 NO 3 for 8 weeks; then, seedlings were transferred to IRRI solution containing 1.4 mM NH 4 SO 4 as the N source for NO 3 deprivation for 1 week. Next, the plants were cut 4 cm above the ground level, the roots were immediately transferred to 10 mM NO 3 , and a preweighed absorbent cotton ball used to collect the xylem exudate was attached to the cut surface and covered with plastic film for 2 h. Next, the collected xylem sap was squeezed from the cotton by using a syringe, and the volume of the exudate was calculated based on the increase in the weight of the cotton. For extraction of total nitrate, the roots and shoots were collected separately, and the nitrate was extracted in boiling distilled H 2 O for 30 min. Nitrate concentration was determined by high-performance liquid chromatography 60 using a PARTISIT 10 SAX (strong anion exchanger) column (Waterman), with 50 mM KH 2 PO 4 buffer, pH 3.0, as the mobile phase.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.