DNR replikacijos licencijavimo faktorius cdc6 ir plk4 kinazė antagonistiškai reguliuoja centrosomų dubliavimą per sas-6 | gamtos komunikacijos

DNR replikacijos licencijavimo faktorius cdc6 ir plk4 kinazė antagonistiškai reguliuoja centrosomų dubliavimą per sas-6 | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Mitozinis verpstė

Anotacija

Centrosomų skaičius ląstelių ciklo metu yra griežtai kontroliuojamas, kad būtų užtikrintas tinkamas suklio surinkimas ir ląstelių padalijimas. Tačiau pagrindinis mechanizmas, kontroliuojantis centrosomų skaičių, išlieka neaiškus. Čia parodyta, kad DNR replikacijos licencijavimo faktorius Cdc6 yra pasamdytas proksimalinėje centrioolių pusėje per cikliną A, kad neigiamai sureguliuotų centrosomų dubliavimąsi, surišdamas ir slopindamas rato proteino Sas-6 formavimąsi stabiliu kompleksu su kitu centriole dubliuojančio šerdies baltymu - STIL. . Mes taip pat parodome, kad Cdc6 kolokalizuojasi su Plk4 centrosomoje ir sąveikauja su Plk4 S fazės metu. „Plk4“ sutrikdo Sas-6 ir Cdc6 sąveiką ir slopina slopinantį Cdc6 poveikį Sas-6, fosforilindamas Cdc6. Pernelyg didelis laukinio tipo Cdc6 arba Plk4 nesuformuoto Cdc6 mutanto 2A ekspresija sumažina centrosomų dubliavimąsi, atsirandantį dėl „Plk4“ perdėto ekspresijos ar gydymo hidroksiurėjos dariniu. Visi šie duomenys rodo, kad Cdc6 ir Plk4 antagonistiškai kontroliuoja tinkamą centrosomų dubliavimąsi ląstelių ciklo metu.

Įvadas

Centrosoma kartojasi vieną kartą per ląstelės ciklą, kad būtų užtikrintas tinkamas chromosomų atskyrimas ląstelių dalijimosi metu. Subrendusią centrosomą sudaro centrialų pora ir aplinkinė pericentriolarinė medžiaga, kurią sudaro keli baltymai, tokie kaip γ-tubulino žiedo kompleksas 1 . Centrosomos dubliavimo ciklą sudaro trys nuoseklūs etapai: centriole atsijungimas, kuriame suporuoti centriolai praranda savo ortogoninę konfigūraciją mitozinio išėjimo metu ir ankstyvojoje G1 fazėje; centriolas, dubliavimasis ir pailginimas, kuriame procentriolas yra susintetinamas ir pailginamas greta kiekvieno iš jau egzistuojančių pradinių centrioolių S ir G2 fazių metu; ir centrosomų brendimas ir atskyrimas vykstant G2 / M perėjimui, kuris suteikia dvi subrendusias poliarines centrosomas 2 . Taigi, centrosomų dubliavimasis turi būti sinchronizuotas su kitais ląstelių ciklo įvykiais, įskaitant DNR replikaciją.

G1-S fazės ciklinės priklausomos kinazės (CDK) CDK2-ciklinas E ir CDK2-ciklinas A, pagrindinės kinazės, kontroliuojančios DNR replikacijos inicijavimą, taip pat reikalingos suaktyvinti centrosomų dubliaciją 3, 4, 5, susiejant centrosomų dubliavimąsi ir DNR replikacija. Tačiau CDK2 vaidmuo centrosomų dubliavimosi metu nėra visiškai aiškus. Įdomu tai, kad keli DNR replikacijos inicijavimo baltymai, sąveikaujantys su ciklinu E ir ciklinu A, tiesiogiai dalyvauja centrosomų dubliavime. Norint inicijuoti DNR replikaciją, reikia nuosekliai komplektuoti prieš replikacijos komplekso (pre-RC) komponentus ORCs, Cdc6, Cdt1 ir Mcm2–7 kompleksą į replikacijos vietas, kad būtų galima licencijuoti DNR replikaciją, o tai užtikrina vieną DNR replikacijos ciklą ląstelių cikle 6, 7 ORC1 apsaugo nuo centrosomos dubliavimosi kontroliuodamas ciklino E lygį ir nuo ciklino E priklausomą centrioolio pakartotinį dubliavimąsi 8 . MCM5 yra įtraukiamas į centrosomą, sąveikaujant tiek su ciklinu E, tiek su ciklinu A, ir slopina centrosomų amplifikaciją S fazės sulaikytose CHO ląstelėse 9, 10 . Gemininas, DNR replikacijos inicijavimo inhibitorius, užkerta kelią centrosomų dubliavimui S fazės areštuoto žmogaus krūties vėžio ląstelių linijoje MDA-MB-231 (nuoroda 11). Tačiau neaišku, kaip DNR replikacijos inicijavimo reguliatoriai dalyvauja centrosomų dubliavime. Be to, nežinomas ryšys tarp DNR replikacijos inicijavimo reguliatorių ir pagrindinių centrioleinės biogenezės bei centrosomų dubliavimosi reguliatorių.

Ankstesnis darbas atskleidė konservuotą centrinio biogenezės kelią Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster ir žmogui. Norint įdarbinti ZYG-1 (žmonėms Plk4), esant C. elegans , reikia SPD-2 (Cep192), Asl (Cep 152 žmogui) reikia įdarbinti Sak (Plk4 žmogui) Drosophila , o Cep192 ir Cep152 yra. abu jie turėjo įdarbinti Plk4 iš 12 žmonių. „ZYG-1“ / „Sak / Plk4“ nuosekliai įdarbina vežimėlio ratų komponentus „SAS-6“ ir „SAS-5 / Ana2 / STIL“, kad surinktų centriole, ir, pagaliau, „SAS-4 / CPAP“ centriolei pailginti 13, 14, 15, 16 . Plk4 kinazė sukelia centriole biogenezės pradžią 13, 17, 18 . „Plk4“ baltymo lygis smailėja mitozės metu ir mažėja G1 19 fazės metu. Dėl per didelio Plk4 ekspresijos atsiranda centriole amplifikacija, o jo išeikvojimas sumažina centriole 13 skaičių. Todėl griežtas „Plk4“ lygio, taip pat jo aktyvumo, valdymas yra kritinis norint kontroliuoti 20, 21, 22, 23 centrosomų skaičių. Plk4 baltymų lygį griežtai kontroliuoja SCF / SLimb ubikvitino ligazės sukeltas skilimas, kad būtų užkirstas kelias centriole redukcijai 24, 25 . Centrosomos dubliavimasis yra inicijuojamas procentriole formavimo vietoje, vadinamoje vežimėlio ratu, kuriame yra devyni stipinai, kylantys iš centrinio stebulės. „Sas-6“ sudaro pagrindinį 26 ratuko pagrindą. Norint įdarbinti Sas-6 į vežimėlį, reikalingas Plk4 kinazės aktyvumas Drosophila ir žmonėms 27, 28 . Plk4 fosforilina STIL, kad palengvintų Sas-6 įsisavinimą į vežimo ratą žmogaus ir Drosophila ląstelėse . 15, 29, 30 . Kita vertus, Plk4 fosforilina F-box baltymą Fbxw5 ir stabilizuoja Sas-6 baltymo lygį, slopindamas nuo SCF-Fbxw5 E3 ligazės priklausomą Sas-6 ubikvitinaciją ir skaidymąsi, taip sukeldamas centrosomų dubliavimąsi 31 . Keli kiti Plk4 substratai, įskaitant centrosomos baltymą Cep152 (nuoroda 32) ir γ-tubulino komplekso baltymą GCP6 (nuoroda 33), taip pat svarbūs centrosomų dubliavimui. Tačiau nė vienas iš su DNR replikacija susijusių baltymų nebuvo identifikuotas kaip Plk4 kinazės substratai.

Mes čia identifikavome Cdc6 kaip naują „Plk4“ substratą. Cdc6, vienas iš prieš RC sudedamųjų dalių, inicijuoja DNR replikaciją, įdarbindamas Mcm2-7 helikazę į DNR replikacijos pradą, priklausomai nuo jos ATPazės aktyvumo 34 . Pradėjus DNR replikaciją, Cdc6 pašalinamas iš replikacijos vietos ir perkeliamas į citoplazmą S fazės metu nuo CDK2 fosforilinimo priklausomu būdu35. Ankstesnės ataskaitos rodo, kad Cdc6 aptinkamas centrosomose S ir G2 fazėse 36, 37 . Tačiau Cdc6 funkcija centrosomų dinamikoje vis dar nežinoma. Šiame tyrime parodyta, kad Cdc6 yra įdarbintas į centrikolių proksimalinę pusę ciklino A dėka ir užkerta kelią centrosomų dubliavimui, slopindamas sąveiką tarp Sas-6 ir STIL. Mes parodome, kad Cdc6 kolokalizuojasi su Plk4 centrosomoje ir sąveikauja su Plk4 S fazės metu. „Plk4“ fosforilina Cdc6 ir slopina Cdc6 slopinamąjį vaidmenį centrosomų dubliavimosi metu, atpalaiduodamas Sas-6 iš Cdc6, palengvindamas sąveiką tarp Sas-6 ir STIL, tokiu būdu inicijuodamas centrosomų dubliavimąsi. Apibendrinant, mūsų duomenys atskleidžia naują mechanizmą, kuriame Cdc6 ir Plk4 antagonistiškai kontroliuoja centrosomų skaičių ląstelių ciklo metu, reguliuodami šerdies centrosomų dubliavimo reguliatoriaus Sas-6 funkciją.

Rezultatai

Ciklinas A tarpininkauja Cdc6 lokalizavimui centriole

Neseniai pranešta, kad Cdc6 lokalizuojasi S ir G2 fazių centrosomose37. Imunofluorescenciniu žymėjimu mes patvirtinome Cdc6 centrosominę lokalizaciją S ir G2 fazėse (1a pav.; Papildomas 1a – c pav.). Kartu imuniniu būdu gaudami Cdc6 kartu su CP110 ir Cep97, dviem centriole esančiais distaliniais šonuose esančiais baltymais 38, 39, mes nustatėme, kad Cdc6 yra lokalizuotas centripolių proksimalinėje pusėje (papildomas 1d pav.). Cdc6 egzistavo kaip du taškai abiejų atjungtų tėvų centrialių proksimalinėje pusėje S ir G2 fazių metu (1a pav.). Mes pastebėjome, kad egzogeninis GFP pažymėtas Cdc6 taip pat lokalizuotas į centrioles, panašias į endogeninę Cdc6 (1b pav.). Norėdami ištirti, ar reikalingas Cdc6 ATPazės aktyvumas jo centriolariniam lokalizavimui, mes mutavome liziną ties 208 liekana, kad jo Walker A domene (K208E, žymimame WA mutantu) glutamatą, kad panaikintume jo ATP surišimo gebėjimą, ir mutavome glutaminą 285 liekanoje. glicinui jo Walker B srityje (E285G, žymimas WB mutantu), kad būtų panaikintas jo ATP hidrolizės gebėjimas 34 . Mes nustatėme, kad WA mutantui nepavyko lokalizuotis centrialuose. Priešingai, WB mutantas lokalizuotas į centrialus, panašius į WT Cdc6 (1b pav.; Papildomas 1e pav.; Papildomi filmai 1–3). Norėdami ištirti nuo Cdc6 ląstelių ciklo priklausomą centrosomų lokalizaciją, atlikome gyvų ląstelių, išreiškiančių GFP-Cdc6, vaizdavimą iš G2 fazės į kitą G1 fazę. Rezultatas parodė, kad Cdc6 lokalizuotas branduolyje, bet ne centriolai G1 fazės ląstelėse (papildomas 1f pav.; 4 papildomas filmas). Tai, kad Cdc6 lokalizuojasi centriole tik S ir G2 fazėse, bet ne G1 fazėje, rodo, kad centrosomose lokalizuotas Cdc6 veikia tik S ir G2 fazėse. Visi šie rezultatai rodo, kad Cdc6 lokalizuojasi proksimalinėje centrioolių pusėje, atsižvelgiant į jo ATP surišimo domeną S ir G2 fazėse.

Image

( a ) Cdc6 lokalizuojasi proksimalinėje centrialų pusėje S ir G2 fazių metu. Imunofluorescencija, rodanti endogeninių Cdc6 (žaliųjų) ir centrin1 (raudonųjų) lokalizaciją U2OS ląstelėse. Mes apibrėžėme ląsteles su keturiais gretimais centrininiu teigiamu taškais kaip S / G2 fazės ląsteles, o ląsteles su dviem poromis labai tolimų centrin teigiamų taškų kaip vėlyvosios G2 fazės ląsteles. ( b ) Cdc6 arba WB mutantas, bet ne WA mutantas, lokalizuojasi ant centrioolių. U2OS ląstelės buvo transfekuotos su GFP pažymėtais Cdc6 WT, WA arba WB mutantais ir dažytos centrin1 antikūnu. c ) Cdc6 tiesiogiai jungiasi su ciklinu A in vitro . Sefarozės granulės, sujungtos su išgrynintu GST arba GST pažymėtu Cdc6, buvo inkubuotos su in vitro transkribuotu ir translyčiu HA-pažymėtu ciklinu A ir analizuojamos atliekant Western blot analizę, naudojant HA antikūną. GST ir GST pažymėtų Cdc6 baltymų pakrovimas parodytas Coomassie mėlynu dažymu. ( d ) Citoplazmoje ir centrosominiame Cdc6 lokalizavime reikalinga Cdc6 ir ciklino A sąveika. U2OS ląstelės buvo transfekuotos GFP pažymėtu Cdc6 cy ir dažytos γ-tubulino antikūnais. e ) Cdc6 ir ciklino A centrosominio lokalizacijos signalo (CLS) domeno arba CLS delecijos mutanto (ΔCLS) sąveika sumažėja, palyginti su WT ciklinu A. HEK293 ląstelės buvo kartu transfekuotos su Myc ir CFc pažymėtu ciklinu A. WT, ΔCLS arba CLS sutrumpinti. Bendras ląstelių ekstraktas buvo panaudotas imunoprecipitacijai su GFP antikūnais ir Western blot tyrimui su Myc ir GFP antikūnais. f ) Cdc6 įdarbinti centrosominiu būdu reikia ciklino A lokalizacijos. U2OS ląstelės, ekspresuojančios GFP pažymėtus ciklino A kamienus (1-200 aminorūgštys, CLS arba CLS mutantas DWVE-A), buvo dažytos Cdc6 ir γ-tubulino antikūnais. g ) Ląstelių, turinčių centrosominį Cdc6, kiekis f . Viename mėginyje buvo suskaičiuota apie 300 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sd ** P <0, 01; NS, reikšmingo skirtumo nėra (studentų t- testas). DNR buvo dažyta DAPI. Svarstyklės, 10 μm. Įterpimai a, b, d ir f yra regionų, kuriuose nurodytas mažas padidinimas, vaizdai su dideliu padidinimu.

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme, kaip Cdc6 lokalizuojasi centrosomoje. Buvo pranešta, kad ciklinas A verbuoja Orc1 ir MCM5 į 10 centrosomą. Kadangi ciklinas A sąveikauja su Cdc6 ir skatina Cdc6 perkėlimą iš branduolio į citoplazmą 35, mes paklausėme, ar ciklinas A taip pat reguliuoja Cdc6 įdarbinimą į centrosomą. Pirmiausia mes patikrinome anksčiau praneštą Cdc6 ir ciklino A sąveiką in vitro atlikdami baltymų ir baltymų sąveikos tyrimą (1c pav.) Ir in vivo atlikdami bendrą imunoprecipitaciją (bendrą IP) (papildomas 1g pav.) 35 . Tada mes nustatėme Cdc6 mutanto (žymimo kaip Cdc6 cycy), kuriame ciklinis A jungiantis domenas (93–100 aminorūgštys) yra išbrauktas, lokalizaciją, panaikinant Cdc6 ir ciklino A 35 sąveiką. Buvo pranešta, kad Cdc6 cycy yra ribojamas branduolyje ir negali būti eksportuojamas į citoplazmą, tačiau Cdc6 Δcy transfekuotose ląstelėse DNR replikacija įtakos neturi 35 . Šiuo atveju mes išbandėme, ar Cdc6 6cy nėra centrosomų lokalizacijos vietoje. Mes pastebėjome, kad Cdc6 cycy mutantas nepavyko persikelti į citoplazmą, kaip buvo pranešta, ir taip pat negalėjo lokalizuotis centrosomoje (1 pav. D). Norėdami patikrinti, ar Cdc6 pasisavina cikliną A į centrosomas, mes sunaikinome Cdc6 siRNR transfekcijos būdu ir nustatėme, kad ciklino A lokalizavimas centrosomų vietose nepaveiktas (papildomas 1h pav.). Šie rezultatai rodo, kad norint nustatyti Cdc6 į centrosomą, reikalinga Cdc6 ir ciklino A sąveika.

Norėdami dar labiau išsiaiškinti, ar Cdc6 yra įtrauktas į centrosomą A ciklinu, mes siekėme stebėti Cdc6 centrosomų lokalizaciją, kai centrosomoje nėra endogeninio ciklino A. Buvo pranešta, kad pernelyg padidėjęs ciklino A centrosominio lokalizacijos signalo (CLS, 201–255 aminorūgščių ciklinas A) fragmentas gali pakeisti endogeninį cikliną A 40 centrosomoje. Pirmiausia palyginome Cdc6 sąveiką su ciklino A WT, CLS ar CLS delecijos mutantu (čia žymimu kaip ΔCLS) 40 . Mes nustatėme, kad ΔCLS ir Cdc6 sąveika buvo dramatiškai sumažinta, palyginti su viso ilgio WT ciklinu A (1e pav.), Rodančia, kad Cdc6 ir ciklino A sąveikai reikalingas CLS domenas ciklinyje A. Tačiau CLS domenas turėjo tik daug. silpnesnė sąveika su Cdc6, palyginti su WT ciklinu A, tai rodo, kad gali būti dar vienas domenas, reikalingas ciklino A prisijungimui prie Cdc6 (1 pav. e). Norėdami panaikinti endogeninio ciklino A centrosominę lokalizaciją, mes perdėm ekspresijavome GFP pažymėtą ciklino A CLS fragmentą (GFP-CLS) ir pastebėjome, kad šis fragmentas lokalizuotas centrosomoje ir panaikinome endogeninio ciklino A centrosominę lokalizaciją, kaip buvo pranešta anksčiau 40 (papildomas pav. 1i). Mes taip pat per daug ekspresijavome GFP pažymėtą CLS mutantą DWVE-A, kuriame aminorūgštys DWVE buvo mutavusios į AAAA, ir nustatėme, kad šiam mutantui nepavyko lokalizuotis centrosomoje ir jis nepaveikė endogeninio ciklino A lokalizacijos centrosomoje (papildomas 1i pav. ). Tada mes stebėjome Cdc6 centrosomų lokalizaciją GFP-CLS arba GFP-CLS DWVE-A mutantuose, išreiškiančiuose ląsteles. GFP pažymėtas ciklino A 1–200 fragmentas buvo išreikštas neigiama kontrole (1f pav.). Įdomu tai, kad, priešingai nei ciklino A CLS DWVE-A mutanto arba ciklino A 1–200 fragmento išraiška, ciklino A CLS ekspresija ląstelėse lėmė Cdc6 nebuvimą centrosomoje (1f pav., G). Šis rezultatas rodo, kad didelis endogeninio ciklino A praradimas centrosomose po ciklino A CLS perdėtos ekspresijos sukelia Cdc6 dislokaciją iš centrosomų. Visi kartu padarome išvadą, kad ciklinas A sąveikauja su Cdc6 ir tarpininkauja Cdc6 lokalizacijai centrosomoje.

Cdc6 neigiamai reguliuoja centrosomų dubliavimąsi

Norėdami ištirti Cdc6 funkciją centrosomoje, mes pašalinome endogeninį Cdc6 RNR interferencija su dviem skirtingais siRNR (papildomas 2a pav.). Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad abi Cdc6 siRNR skatino centrosomų dubliavimąsi (daugiau nei dvi centrosomas kiekvienoje ląstelėje atskleidžiamas γ-tubulino dažymu) ir centriole amplifikaciją (daugiau nei keturi centriolai kiekvienoje ląstelėje atskleidžiami dažant centrin1) (2a, b pav.; Papildomas pav.) 2b pav.). Mes taip pat nustatėme, kad dėl Cdc6 sumažėjimo G2 / M fazių sustojimas rodo, kad Cdc6 išeikvojimas sukėlė centrosomų dubliavimąsi nebuvo netiesioginis G1 / S fazės sustabdymo poveikis (papildomas 2c, d pav.). Norėdami ištirti Cdc6 išsekimo sukeltą centriole amplifikacijos priežastį, Cdc6 nusodintose ląstelėse dažėme motinos centriole Cep164 antikūnu ir procentriole su Sas-6 antikūnu. Mes nustatėme, kad 24, 9% ląstelių buvo nenormaliai sustiprinti Sas-6 teigiami taškai, supantys vieną Cep164 teigiamą tašką (papildomas 2e, f pav.), Kas rodo, kad Cdc6 išeikvojimo sukeltas centriole amplifikacija atsirado dėl daugybinio procentriolo susidarymo. Atitinkamai, 22, 3% Cdc6 ardančių mitozinių ląstelių stebėjome daugiapolius mitozinius suklus, kurie greičiausiai atsirado dėl amplifikuotų centrialų, kuriuos sukėlė Cdc6 išeikvojimas (papildomas 3a, b pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad Cdc6 apsaugo nuo centriole amplifikacijos.

Image

a ) Cdc6 išeikvojimas sukelia centriole ir centrosomos dubliavimasi. Cdc6 (žalia), centrin1 (raudona) ir γ-tubulino (raudona) imunofluorescencija U2OS ląstelėse, transfekuotose kontroline arba Cdc6 siRNR. b ) Ląstelių, turinčių> 2 centrosomas arba> 4 centrioles, kiekis a . Viename mėginyje buvo suskaičiuota apie 300 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. ( c ) Cdc6 WT, bet ne WA ar WB mutantas, slopina HU sukeltą centrosomų dubliavimąsi. U2OS ląstelės buvo transfekuotos GFP, GFP-Cdc6, GFP-WA arba GFP-WB ir 52 valandas buvo apdorotos 16 mM HU, kad būtų galima padauginti centriole. Tada ląstelės buvo nudažytos centrin1 antikūnu. d ) Ląstelių, turinčių> 4 centrioles, kiekis c . Viename mėginyje buvo suskaičiuota apie 300 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. e ) Norint slopinti HU sukeltą centrosomų dubliavimąsi, Cdc6 reikia lokalizuoti centrosomiškai. U2OS ląstelės buvo transfekuotos GFP, GFP pažymėtu Cdc6, GFP pažymėtu Cdc6 cy arba GFP pažymėtu Plk4 CTS -Cdc6 cy, ir 52 valandas buvo apdorotos 16 mM HU, kad būtų galima atlikti centriole amplifikaciją. Tada ląstelės buvo nudažytos centrin 1 antikūnu. f ) Ląstelių, turinčių> 4 centrioles, kiekis e . Viename mėginyje buvo suskaičiuota maždaug 100 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. g ) Per didelis Cdc6 ekspresija slopina centriole dubliavimąsi įprasto ląstelių ciklo metu. U2OS ląstelės buvo laikinai transfekuotos GFP arba GFP pažymėtu Cdc6 50 h ir dažytos centrin1 antikūnu. Suskaičiuotas centrin1 teigiamų taškų skaičius transfekuotose ląstelėse. Viename mėginyje buvo suskaičiuota apie 300 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. Statistiniai duomenys ( b, d, f, g ) pateikiami kaip vidurkiai ± sd * P <0, 05, ** P <0, 01 ir *** P <0, 001; NS, reikšmingo skirtumo nėra (studentų t- testas). DNR buvo dažyta DAPI. Svarstyklės, 10 μm. Įterpimai a, c ir e yra regionų, kuriuose nurodytas mažas padidinimas, vaizdai su dideliu padidinimu.

Visas dydis

Norėdami dar labiau patvirtinti slopinantį Cdc6 vaidmenį centrosomų dubliavimosi metu, mes apdorojome ląsteles hidroksiurėjos dariniu (HU), kuris sukelia pailginamoje S fazėje S fazės pailgėjimą ir kelis centrosomų dubliavimosi ciklus. Per daug išryškindami GFP pažymėtą Cdc6 esant HU, mes pastebėjome, kad ląstelių, kurių centrosomų perteklius dubliuotas, gydymas HU, procentas žymiai sumažėjo nuo 33, 9 iki 8, 5% dėl Cdc6 WT perraiškos (Studento t- testas), tačiau abu WA ir WB mutantai nerodė slopinamojo vaidmens centrosomų dubliavimosi metu (2c pav., d). Norėdami papildomai ištirti, ar centriolar Cdc6, ar necentriolar / kitur rastas Cdc6 yra atsakingas už centrosomų dubliavimosi slopinimą, mes perdėtai išaiškinome branduolyje lokalizuotą Cdc6 cy mutantą esant HU ir nustatėme, kad šis mutantas nepajėgus slopinti HU sukeltos centrosomos per daug. kopijavimas (2e pav., f; papildomas 3c, d pav.). Tačiau sulietas Cdc6 Plcy ir Plk4 CTS- 41 domeno baltymas, kuris yra priverstinai nukreiptas į centrosomą, atgavo galimybę slopinti HU sukeltą centrosomų dubliavimąsi (2e pav., F; papildomas 3c, d pav.), nurodant, kad centrosominis Cdc6 slopina centrosomų dubliavimąsi. Taip pat mes išbandėme slopinantį Cdc6 poveikį centrosomų dubliavimui fiziologiškai neapdorotose ląstelėse. Ląstelėse 50 valandų (ilgiau nei du ląstelių ciklus) per daug ekspresijavome GFP-Cdc6 arba GFP vektorių, tuo tarpu ląstelių ciklui Cdc6 padidinta raiška nepadarė įtakos (papildomas 6a, b pav.) Ir suskaičiavome ląsteles su 2, 3–4 ir > 4 centriolai (2g pav.). Rezultatai parodė, kad tarp Cdc6 per daug ekspresuojančių ląstelių, palyginti su GFP per daug ekspresuojančiomis ląstelėmis (2g pav.), Sumažėjo procentas ląstelių, turinčių 3 ar 4 centrioles, (2g pav.), Rodančios, kad Cdc6 per daug ekspresuojantis riboja centrosomų dubliavimąsi. Apskritai, darome išvadą, kad centrosominis Cdc6 neigiamai reguliuoja centrosomų dubliavimąsi.

Cdc6 kolokalizuojasi su Plk4 ir rato baltymais

Po to mes ištyrėme, kad Cdc6 dalyvauja tame centrosomų dubliavimosi reguliavimo etape. Kadangi prognozuojama, kad Cdc6 sąveikauja su Plk4 (nuoroda 42) (//www.mitocheck.org), o Plk4 sukelia centriole biogenezę 17, mes išbandėme tikslią Cdc6 ir Plk4 centrosominę lokalizaciją. Bendrai ekspresuodami Cdc6 ir Plk4, mes nustatėme, kad jie buvo lokalizuoti centrosomose (3a pav.). Norėdami tiksliau pastebėti bendrą lokalizaciją, mes panaudojome didelės skiriamosios gebos trijų matmenų struktūrinio apšvietimo (3D-SIM) mikroskopiją, kad aptiktume Cdc6 ir Plk4 bendrą lokalizaciją centrinio distalinio šoninio lokalizacijos žymeklio CP110 kontekste (3 pav. 3b). Rezultatas parodė, kad Cdc6 kolokalizuojasi su Plk4, bet ne su distaliniu šoniniu lokalizuotu centriole baltymu CP110 (3b pav., G). Norėdami gauti didesnę skiriamąją gebą, atlikdami superresoliucinę stimuliuotos emisijos išeikvojimo (STED) mikroskopiją, mes patvirtinome, kad endogeninis Cdc6 kolokalizuojasi su endogeniniu Plk4 arba GFP pažymėtu Plk4 (3c pav., D). Kaip jau buvo pranešta anksčiau, „Plk4“ lokalizuotas taško pavidalu procenttriole formavimosi vietoje S fazėje ir kolokalizuojasi su ratuko komponentais Sas-6 ir STIL 29 . Mes toliau tyrėme, ar Cdc6 yra lokalizuotas kartu su Sas-6 ir STIL. Sas-6 lokalizuojasi centriniame vežimėlio ratu ir inicijuoja centriole biogenezę 26 . STIL ir Sas-6 yra abipusiai priklausomi nuo centriolarinio lokalizacijos ir kolokalizacijos S ir G2 fazėse 16, 29 . Mes nustatėme, kad Cdc6 buvo colocalized su GFP-Sas-6 tiek SIM (3b pav., G), tiek STED mikroskopija (3f pav., G). Mes pastebėjome, kad Cdc6 taip pat buvo kolokalizuotas su STIL mikroskopu naudojant STED (3e pav., G). Visi šie rezultatai rodo, kad Cdc6 kolokalizuojasi su Plk4, Sas-6 ir STIL centriole S fazės metu, ir tai rodo Cdc6 funkcinį vaidmenį procentriole biogenezėje.

Image

( a ) Cdc6 kolokalizuojasi su Plk4. U2OS ląstelės buvo kartu transfekuotos su „mCherry“ pažymėtu „Cdc6“ (viršutinis skydelis) arba „Myc“ pažymėtu „Cdc6“ (apatinis skydas) su „GFP“ pažymėtu „Plk4“. „Myc“ pažymėtas Cdc6 buvo dažytas „Myc“ antikūnu. ( b ) „Cdc6“ kolokalizuojasi su „Plk4“ ir „Sas-6“, žiūrint 3D-SIM. U2OS ląstelių 3D-SIM vaizdai, perkrauti naudojant „GFP“ pažymėtą „Plk4“ (viršutinis skydelis) arba „GFP“ pažymėtas „Sas-6“ (apatinis skydas) ir nudažyti, kad būtų endogeniniai Cdc6 ir CP110. ( c - f ) Cdc6 kolokalizuojasi su Plk4, STIL ir Sas-6, žiūrimais STED. Endogeninių Cdc6 (žalia) ir Plk4 (raudona) arba Cdc6 (žalia) ir STIL (raudona) imunofluorescencija U2OS ląstelėse ( c, e ). Endogeninio Cdc6 (raudonos) imunofluorescencija U2OS ląstelėse, transfekuotose GFP pažymėtu Plk4 arba GFP pažymėtu Sas-6 ( d, f ). g ) Schemos, iliustruojančios baltymų lokalizaciją b - f centrosomoje. Skirtingi baltymai žymimi dažymo spalvomis b - f . DNR buvo dažyta DAPI. Mastelio juostos, a, c - f, 10 μm. Masto juosta, išreikšta b, 0, 2 μm. Įterpimai a, c - f yra regionų, kuriuose nurodytas mažas padidinimas, vaizdai su dideliu padidinimu.

Visas dydis

„Plk4“ suriša Cdc6 S fazėje ir fosforilina Cdc6

Norėdami patvirtinti numatomą Cdc6 ir Plk4 sąveiką (nuoroda 42) (//www.mitocheck.org), mes nustatėme ir patvirtinome tiesioginę Plk4 ir Cdc6 sąveiką in vitro baltymų ir baltymų sąveikos tyrime, naudodami išgrynintą GST-Plk4 ir His. -Cdc6 baltymas (4b pav.) Ir atitraukiamasis tyrimas (papildomas 4b pav.). Taip pat mes parodėme endogeninio Cdc6 ir Plk4 sąveiką in vivo kartu su Cdc6 antikūnu (4a pav.). Taip pat buvo patvirtinta sąveika tarp per daug išreikšto Cdc6 ir Plk4, naudojant abipusį bendrą IP, naudojant masalą GFP-Cdc6 arba GFP-Plk4 (4c pav.; Papildomas 4a pav.). Tačiau kinazėje negyvas mutantas Plk4 K41M nesijungia su Cdc6, nors Cdc6 baltymo lygiui įtakos neturėjo Plk4 K41M mutantų per didelis ekspresas (4c pav.; Papildomas 4c pav.), Rodantis, kad Plk4 kinazės aktyvumas reikalingas Cdc6 ir Plk4 sąveika. Toliau mes ištyrėme, ar Cdc6 ir Plk4 sąveika priklauso nuo ląstelių ciklo. Atlikę bendrą IP HEK293 ląstelėse, kartu transfekuotose su GFP-Plk4 ir Myc-Cdc6, ir sinchronizavę jas su G1 / S perėjimo, S arba G2 faze, mes nustatėme, kad Plk4 ir Cdc6 sąveika apsiriboja S faze (4d pav. ), teigdamas, kad funkcinis „Plk4“ ir „Cdc6“ sąveika egzistuoja tik S fazės metu. Norėdami nustatyti, kuris Cdc6 regionas jungiasi su Plk4, per bendrą IP HEK293 ląstelėse, kartu transfekuotose su GFP pažymėtais Cdc6 kamienais ir „Myc“ pažymėtais Plk4, pastebėjome, kad N-galas sutraukia aminorūgštis 1–179 ir 179–407 iš Cdc6, bet ne C-galo sutrumpintos aminorūgštys 407–560, sąveikauja su Plk4 (4e pav.). Visi šie duomenys rodo, kad Cdc6 jungiasi su aktyviąja Plk4 kinaze per Cdc6 N-galą S fazės metu.

Image

( a ) Endogeninis Cdc6 ląstelėse sąveikauja su Plk4. Visas HEK293 ląstelių ekstraktas buvo imuniškai nusodintas naudojant Cdc6 antikūną ir zonduotas Cdc6 ir Plk4 antikūnais. ( b ) Plk4 tiesiogiai jungiasi su Cdc6 in vitro . Sefarozės granulės, sujungtos su išgrynintu GST arba GST-Plk4, buvo inkubuotos su išgrynintu His-Cdc6 ir analizuojamos naudojant His antikūną. Nurodytų baltymų apkrova parodyta Coomassie mėlynu dažymu. c ) Plk4 kinazėje negyvas mutantas K41M ląstelėse nesieja Cdc6. HEK293 ląstelės buvo kotransfekuotos su Myc-Cdc6 ir GFP-Plk4 WT arba K41M mutantais. Iš visų ląstelių ekstraktų imuninis nusėdimas buvo atliktas naudojant GFP antikūnus ir tiriami Myc ir GFP antikūnai. ( d ) Cdc6 sąveikauja su Plk4 S fazės metu. HEK293 ląstelės buvo kartu transfekuotos su GFP-Plk4 ir Myc-Cdc6 ir sinchronizuotos pereinant G1 / S. Tada ląstelės buvo išleistos nurodytam laikotarpiui, surinktos imunoprecipitacijai naudojant GFP antikūną ir analizuojamos Western blot analize naudojant Myc, GFP, ciklino B ir GAPDH antikūnus. ( e ) Cdc6 N-galas, bet ne Cdc6 C-galas, sąveikauja su Plk4. GFP, su GFP pažymėtu Cdc6 WT arba Cdc6 trunkatu imunoprecipicuota su GFP antikūnu iš bendro HEK293 ląstelių ekstrakto, bendrai transfekuoto su Myc-Plk4. Imuninės sistemos baltymai buvo analizuojami naudojant Myc ir GFP antikūnus. ( f ) Cdc6 ląstelėse fosforilinamas ant S30 ir T527. HEK293 ląstelės buvo transfekuotos GFP pažymėtais Cdc6 arba Cdc6 mutantais, o ląstelių lizatai buvo tirti su GFP antikūnais, naudojant Phos-Tag akrilamido testą (viršutinė panelė). ( g ) Plk4 fosforilina Cdc6 S30 ir T527 in vitro . Išgrynintas GST-Plk4 buvo inkubuotas su išgrynintais His-paženklintais Cdc6 arba Cdc6 mutantų baltymais, esant [γ- 32 P] -ATP, po to atlikta autoradiografija. „Coomassie“ mėlynas dažymas rodo nurodytų baltymų susikaupimą. Žvaigždutė nurodo fosforilintą Cdc6. ( h ) Cdc6 WT, S30A, T527A arba 2A fosforilinimas ( g ) iš keturių nepriklausomų eksperimentų. Kiekvieno baltymo fosforilinimo signalo santykinis intensyvumas buvo normalizuotas iki jo baltymo lygio „ImageJ“. Cdc6 WT fosforilinimo signalo intensyvumas buvo savavališkai nustatytas kaip 1, 0. Statistiniai duomenys h pateikiami kaip vidurkis ± sd *** P <0, 001 (studento t- testas).

Visas dydis

Kadangi kinazėje aktyvus WT Plk4, bet ne kinaze negyvas mutantas, sąveikauja su Cdc6, mes toliau ištyrėme, ar Cdc6 fosforilinamas Plk4. Naudodamiesi GPS 3.0 (grupine prognozavimo sistema, 3.0 versija) Plk4 fosforilinimo vietų prognozavimui, mes nustatėme, kad serinas 30 ir treoninas 527, esantys Cdc6, parodė aukščiausius balus kaip Plk4 fosforilinimo vietos (papildomas 4d pav.) 43 . Pirmiausia ląstelėse išbandėme Cdc6 WT fosforilinimą, pavienę 30-ojo serino mutaciją su alaninu (S30A), vieną treonino 527 mutaciją alaninu (T527A) ir dvigubą S30A ir T527A (žymimų 2A) mutaciją, naudojant „Phos“. -Tag akrilamido tyrimas. Kaip parodyta 4f pav., Lėtesnė judėjimo poslinkio juosta žymi fosforilintą Cdc6, greitesnė judumo poslinkio juosta reiškia fosforilintą Cdc6. Cdc6 S30A arba T527A mutantas iš dalies sumažino Cdc6 fosforilinimą, palyginti su Cdc6 WT, o Cdc6 2A dvigubas alanino mutantas dar labiau sumažino Cdc6 fosforilinimą (4f pav.). Šis rezultatas rodo, kad Cdc6 ląstelėse fosforilinamas S30 ir T527. Tada mes atlikome in vitro kinazės testą, inkubuodami išgrynintus Plk4 ir Cdc6 baltymus, esant [γ- 32 P] -ATP. Rezultatas atskleidė, kad Cdc6 fosforilinamas Plk4, o S30A mutantas arba Cdc6 mutantas T527A sumažino, bet nevisiškai panaikino Cdc6 fosforilinimą, o dviguba mutacija 2A panaikino Cdc6 fosforilinimą Plk4 būdu (4g pav., H; papildomas pav.) .4e – g). Visi šie rezultatai rodo, kad Plk4 jungiasi ir fosforilina Cdc6 prie 30 serino ir treonino 527.

Cdc6 2D mutacija negali slopinti centrosomų dubliavimosi

Norėdami ištirti Cdc6 fosforilinimo, kurį sukelia Plk4, įtaką centrosomų dubliavimui, palyginome Cdc6 WT, 2A mutanto arba dvigubos S30D ir T527D (žymimos 2D) mutacijos gebėjimą slopinti HU sukeltą centrosomų dubliavimąsi (2 pav. 5a, b; Papildomas 5a, b pav. Mes nustatėme, kad nefosforilinamas Cdc6 2A mutantas veiksmingai slopino HU sukeltą centrosomų dubliavimąsi, panašų į WT Cdc6. Priešingai, fosforilinimą imituojančiam Cdc6 2D mutantui buvo nepakankamai slopinamas HU sukeltas centrosomų dubliavimasis, panašiai kaip neigiama GFP vektoriaus kontrolė (5a pav., B; papildomas 5a, b pav.). HU sukeltam S fazės sulaikymui ląstelių cikle nepadarė įtakos Cdc6 WT, 2A ar 2D mutantų ekspresija (papildomas 5f pav., G). Šie rezultatai rodo, kad nefosforiluotas Cdc6 slopina centrosomų dubliavimąsi, o jo fosforilinimas Plk4 panaikina slopinantį vaidmenį. Toliau mes analizavome centrosomų dubliavimąsi fiziologiškai neapdorotose ląstelėse, ekspresuojančiose GFP-Cdc6 WT, 2A ar 2D mutantą 50 h tomis sąlygomis, kuriose ląstelių ciklui nepadarė įtakos per didelis ekspresas (papildomas 6a, b pav.). Kiekybiškai įvertinę ląstelių, turinčių 2, 3–4 ar daugiau kaip 4 centrioles, proporcijas po Cdc6 ekspresijos 50 h (ilgiau nei du ląstelių ciklai), mes taip pat nustatėme, kad 2A efektyviai slopino centrosomų dubliavimąsi, panašų į WT Cdc6, bet ne 2D mutantą (2 pav. 5c). Apibendrinant, darome išvadą, kad Cdc6 fosforilinimas Plk4 panaikina jo slopinamąjį vaidmenį centrosomų dubliavimosi metu.

Image

( a ) Cdc6 WT arba 2A mutantas, bet ne 2D mutantas, slopina HU sukeltą centrosomų dubliavimąsi. U2OS ląstelės buvo transfekuotos GFP, GFP pažymėtu Cdc6 WT, GFP pažymėtu Cdc6 2A arba 2D mutantu ir 52 valandas buvo apdorotos 16 mM HU, kad būtų galima atlikti centriole amplifikaciją. Tada ląstelės buvo nudažytos centrin1 antikūnu. b ) Ląstelių, turinčių> 4 centrioles, kiekis a . Viename mėginyje buvo suskaičiuota maždaug 100 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. c ) Cdc6 WT arba 2A mutanto, bet ne 2D mutanto, ekspresija slopina centrosomų dubliavimąsi ląstelių ciklo metu. U2OS ląstelės buvo transfekuotos GFP, GFP pažymėtu Cdc6 WT ir GFP pažymėtu Cdc6 2A arba 2D mutantu 50 valandų. Tada ląstelės buvo nudažytos centrin1 antikūnu. Suskaičiuotas centrin1 teigiamų taškų skaičius transfekuotose ląstelėse. Viename mėginyje buvo suskaičiuota apie 300 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. ( d ) Cdc6 WT arba 2A mutantų, bet ne 2D mutantų, ekspresija slopina Plk4 sukeltą centriole amplifikaciją. U2OS ląstelės buvo transfekuotos GFP pažymėtu Plk4 ir mCherry pažymėtu Cdc6 WT, 2A arba 2D mutantu 40 h. Tada ląstelės buvo nudažytos centrin1 antikūnu. e ) Ląstelių, turinčių> 4 centrioles, kiekis per d . Viename mėginyje buvo suskaičiuota maždaug 100 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. Statistiniai duomenys b, c ir e pateikiami kaip vidurkiai ± sd ** P <0, 01 ir *** P <0, 001; NS, reikšmingo skirtumo nėra (studentų t- testas). DNR buvo dažyta DAPI. Svarstyklės, 10 μm. Įterpimai a ir d yra regionų, kurie nurodyti mažo padidinimo vaizduose, padidinimo vaizdai.

Visas dydis

Kadangi dėl „Plk4“ perdėtos ekspresijos atsiranda centriole 13 amplifikacija, o Cdc6 slopina centriole amplifikaciją, kaip aptarta aukščiau, mes išbandėme, ar Pld4 tarpininkaujama centriole amplifikacija gali būti slopinama Cdc6 (nuoroda 17). Šiuo tikslu „mCherry“ pažymėti Cdc6 WT, 2A arba 2D mutantai buvo ekspresuojami kartu su GFP-Plk4 U2OS ląstelėse ir buvo išanalizuotos ląstelių proporcijos su centriole amplifikacija. Palyginti su 52, 7% kontrolinių ląstelių, kurios kartu išreiškia mCherry ir Plk4, parodydamos centriole amplifikaciją, tik 26, 6% ląstelių, kurios kartu ekspresuoja mCherry-Cdc6 WT ir Plk4, parodė centriole amplifikaciją (5d, e pav.), Tai rodo, kad Cdc6 perdėtai išreikšta. reikšmingai slopino Plk4 sukeltą centriole amplifikaciją (Studento t- testas). Be to, mes nustatėme, kad 2A veiksmingai slopino Plk4 sukeltą centriole amplifikaciją, panašią į WT Cdc6, bet ne 2D mutantą (5d pav., E), laikydamasis scenarijaus, kad ne fosforilintas Cdc6, o ne fosforilintas, slopina centrosomų dubliavimąsi (pav. 5a – c). Mes taip pat išbandėme ir patvirtinome, kad ląstelių ciklui įtakos neturėjo mCherry pažymėto Cdc6 WT, 2A ar 2D mutanto kartu su GFP-Plk4 raiška U2OS ląstelėse (papildomas 6c, d pav.). Norėdami patikrinti, ar Cdc6 slopina centrosomų dubliavimąsi slopindamas Plk4, mes atlikome dvigubą Cdc6 ir Plk4 numušimą (papildomas 5e pav.). Rezultatas parodė, kad tuo pačiu Cdc6 ir Plk4 išeikvojimas atkūrė centrozių skaičių mitozėje, kuri sumažėjo tik po Plk4 išeikvojimo (papildomas 5c pav., D), nurodant, kad Cdc6 nėra Plk4 inhibitorius ir kad Cdc6 slopina centrosomų dubliavimąsi pasroviui arba lygiagreti Plk4. Apibendrinant, darome išvadą, kad Cdc6 fosforilinimas Plk4 silpnina jo funkciją slopinant centrosomų dubliavimąsi ir centrosomų dubliavimąsi, kurį sukelia HU gydymas arba Plk4 perdėta ekspresija.

Cdc6 sulaiko centrosomų dubliavimąsi slopindamas Sas-6

„Plk4“ suaktyvina centrioleto biogenezę fosforilindamas jo substratus, tokius kaip karterio baltymas STIL 28, 29 ir F dėžutės baltymas Fbxw5 (nuorodos 28, 29, 31), ir palengvindamas „Sas-6“ įkėlimą į vežimėlį. Kadangi Plk4 fosforilina Cdc6 ir Cdc6 kartu su Sas-6 ant vežimėlio (3b pav., F), mes išbandėme ryšį tarp Cdc6 fosforilinimo ir Sas-6. Pirmiausia mes ištyrėme, ar Cdc6 sąveikauja su Sas-6. Atliekant abipusį bendrą IP, naudojant masalą Cdc6 arba Sas-6, mes nustatėme, kad endogeninis Cdc6 sąveikauja su endogeniniu Sas-6, bet ne su kitais centrosomų baltymais CPAP, Cep164 ar STIL (6a pav.), Išskyrus galimybę, kad Cdc6 sąveikauja su Sas -6, Plk4 arba ciklinas A paprasčiausiai nuleidžiant visą centrosomą. Sąveika tarp per daug išreikšto Cdc6 ir Sas-6 taip pat buvo patvirtinta abipusiu bendra IP, naudojant masalą GFP-Cdc6 arba GFP-Sas-6 (papildomas 7a, b pav.). Taip pat mes atlikome baltymų ir baltymų prisijungimo testą in vitro, naudodami Cdc6 ir Sas-6 baltymų transkribuotus ir perkeltus in vitro (6b pav.). Po to His-Cdc6 buvo nusodintas Cdc6 antikūnu ir buvo aptiktas Cdc6 surištas His-Sas-6. Šis rezultatas parodė, kad Cdc6 tiesiogiai jungiasi su Sas-6 in vitro (6b pav.).

Image

( a ) Endogeninis Cdc6 sąveikauja su Sas-6 ląstelėse. Visas HEK293 ląstelių ekstraktas buvo imuniškai nusodintas naudojant Cdc6 antikūną ir zonduotas Cdc6, Sas-6, Cep164, CPAP ir STIL antikūnais. ( b ) Cdc6 tiesiogiai jungiasi su Sas-6 in vitro . In vitro transkribuota ir išversta His-pažymėta „Sas-6“ buvo inkubuota su in vitro transkribuota ir neinvestuota ir išversta His-pažymėta „Cdc6“. Po to His-Cdc6 buvo nusodintas naudojant Cdc6 antikūną. Susieti baltymai buvo analizuojami naudojant Cdc6 ir Sas-6 antikūnus. c ) tuo pačiu metu imant Sas-6, sumažėja Cdc6 sukeltas centriole amplifikacija. U2OS ląstelės buvo transfekuotos kontroline siRNR, Cdc6 siRNR arba Sas-6 siRNR; arba kartu transfekuota su Cdc6 siRNR ir Sas-6 siRNR. Tada ląstelės buvo nudažytos centrin1 (raudonais) ir Sas-6 (žaliaisiais) antikūnais, kad būtų galima identifikuoti ląsteles efektyviai sunaikinant Sas-6. d ) Ląstelių, nurodytų centrin1 teigiamais taškais, skaičius c . Viename mėginyje buvo suskaičiuota maždaug 100 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. ( e ) Cdc6 WT arba Cdc6 2A mutantas, bet ne Cdc6 2D mutantas, slopina Sas-6 sukeltą centriole amplifikaciją. „Myc“ pažymėtas „Sas-6“ buvo 28 h kartu transfekuotas su GFP, GFP pažymėtu Cdc6 WT arba GFP pažymėtu Cdc6 2A arba 2D mutantu. Tada ląstelės buvo nudažytos „Myc“ ir „centrin1“ antikūnais. f ) Ląstelių, turinčių> 4 centrioles, kiekis e . Viename mėginyje buvo suskaičiuota maždaug 100 ląstelių ir atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. Statistiniai duomenys, pateikiami d ir f, pateikiami kaip vidurkiai ± sd ** P <0, 01 ir *** P <0, 001; NS, reikšmingo skirtumo nėra (studentų t- testas). DNR buvo dažyta DAPI. Svarstyklės, 10 μm. Intarpai c ir e yra regionai, kuriuose yra mažas padidinimas, nurodytas didelis padidinimas.

Visas dydis

„Sas-6“ sudaro ratuko stuburą, o jo išeikvojimas slopina daugelį centriole amplifikacijos formų 12 . Pirmiausia išbandėme, ar Sas-6 išeikvojimas slopina Cdc6 išeikvojimo sukeltą centriole amplifikaciją. Mes atlikome dvigubą Cdc6 ir Sas-6 numušimą ir išsiaiškinome, kad tuo pat metu Sas-6 ir Cdc6 numušimas pašalino Cdc6 išeikvojimo sukeltą centriole amplifikaciją ir netgi lėmė didelį ląstelių procentą su viena centriole, panašią į Sas-6 numušimą (pav. 6c, d; papildomas 7e pav.) Šie rezultatai leido manyti, kad Sas-6, kaip būtino centrosomų dubliavimo iniciatoriaus, jo išeikvojimas viršija Cdc6 sukeltos centriole amplifikaciją. Kadangi buvo pranešta, kad Sas-6 perdėta ekspresija sukelia centriole amplifikaciją 14, 44, mes kartu padidėjome GFP-Cdc6 ir Myc-Sas-6 ląstelėse, norėdami patikrinti, ar Cdc6 neigiamai reguliuoja centriole amplifikaciją slopindamas Sas-6. Rezultatai parodė, kad kartu su Cdc6 WT ekspromtu su Sas-6 slopindamas centriole amplifikaciją, suaktyvintą per daug ekspresuodamas Sas-6 (6e pav., F; papildomas 7c pav., D), ir kad Cdc6 2A mutantas, bet ne Cdc6 2D mutantas, slopino Sas-6 sukeltą centriole amplifikaciją, panašią į WT Cdc6 (6e pav., f; papildomas 7c pav., d).

Cdc6 fosforilinimas, kurį sukelia Plk4, sutrikdo Cdc6-Sas-6 sąveiką

Norėdami ištirti, kaip Plk4 tarpininkaujantis fosforilinimas slopina Cdc6 slopinimą Sas-6, pirmiausia sunaikinome Plk4 Plk4 siRNR ir nustatėme, kad tai pablogino Cdc6 ir Sas-6 sąveiką, atskleisdami, kad Plk4 reikalingas Cdc6 ir Sas- sąveikos sąveikai. 6 (7a pav.; Papildomas 7f pav.). Tada mes išbandėme, ar Plk4 fosforilinamas Cdc6 reguliuoja sąveiką tarp Sas-6 ir Cdc6. Bendrai atlikdami IP nustatėme, kad sąveika tarp Sas-6 ir Cdc6 2A mutantų buvo stipresnė nei tarp Sas-6 ir Cdc6 WT arba Cdc6 2D mutantų. Tai rodo, kad Plk4 fosforilinimas Cdc6 neigiamai reguliuoja sąveiką tarp Cdc6 ir Sas-6. (7b pav.; Papildomas 7g pav., H). Norėdami patvirtinti tai in vitro , His pažymėti Cdc6, 2A mutantai arba 2D mutantai, transkribuoti ir perkelti in vitro, buvo inkubuojami su Plk4 kinaze arba be jos, esant His-Sas-6 kinazės reakcijos buferyje (7c pav.). Po to His-Cdc6 buvo nusodintas Cdc6 antikūnu ir buvo analizuotas su Cdc6 surištas His-Sas-6 (7c pav.). Laikantis in vivo bendro IP eksperimento, tiek fosforilintas Cdc6 (inkubuotas su Plk4), tiek fosforilinimą imituojantis 2D mutantas slopino sąveiką tarp Cdc6 ir Sas-6 (7c pav.), Tuo tarpu nefosforiluotas Cdc6 (be inkubacijos su Plk4) ir nefosforilinamas. Cdc6 2A mutantas turėjo stiprią sąveiką su Sas-6 (7c pav.).

Image

( a ) Cdc6 ir Sas-6 sąveiką apsunkina Plk4 išeikvojimas ląstelėse. Visas HEK 293 T ląstelių, transfekuotų kontroline siRNR arba Plk4 siRNR, ekstraktas buvo imunopresipiduotas Cdc6 antikūnu ir zonduotas Cdc6 ir Sas-6 antikūnais. ( b ) Cdc6 fosforilinimas slopina Cdc6 ir Sas-6 sąveiką ląstelėse. HEK293 ląstelės, kartu transfekuotos su „Myc“ pažymėtu „Sas-6“ ir „GFP“ pažymėtais Cdc6, 2A arba 2D mutantais, buvo imuniniu būdu nusodintos naudojant GFP antikūną ir analizuojamos atliekant „Western blot“, naudojant „Myc“ ir GFP antikūnus. Sas-6 ir Cdc6 WT, 2A ar 2D mutantų sąveikos kiekybinis įvertinimas buvo analizuotas iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Santykinė sąveika tarp Sas-6 ir Cdc6 buvo normalizuota „ImageJ“ imuniteto nusodintam Cdc6. The interaction between Myc-Sas-6 and GFP-Cdc6 WT was arbitrarily set at an intensity of 1.0. ( c ) Cdc6 phosphorylation inhibits the interaction between Cdc6 and Sas-6 in vitro . His-tagged Cdc6, 2A or 2D mutant protein transcribed and translated in vitro was incubated with or without Plk4 kinase in the presence of in vitro transcribed and translated His-Sas-6 in kinase reaction buffer. His-Cdc6 was then immunoprecipitated by Cdc6 antibody, and the bound proteins were analysed with Cdc6 and Sas-6 antibodies. The loadings of GST and GST-tagged Plk4 proteins are shown by Coomassie blue staining. ( d ) Cdc6 phosphorylation by Plk4 suppresses the inhibition of Cdc6 on Sas6-STIL complex formation. HA-tagged Sas-6 protein transcribed and translated in vitro was incubated with indicated purified proteins in the presence of in vitro transcribed and translated HA-tagged STIL in kinase reaction buffer. HA-Sas-6 was then immunoprecipitated by Sas-6 antibody, and the bound proteins were analysed with Sas-6 and STIL antibodies. The loadings of GST, GST-tagged Plk4, His tagged Cdc6, 2A and 2D mutant proteins are shown by Coomassie blue staining. The statistical data in b is presented as means±sd ** P <0.01 and *** P <0.001 (Student's t -test).

Visas dydis

We further investigated how Cdc6 phosphorylation regulates centrosome duplication through Sas-6. It was reported that Sas-6 interacts with another procentriole formation core protein STIL in a Plk4 phosphorylation-dependent manner on procentriole formation site to induce centrosome duplication 15, 29 . Herein we tested whether Cdc6 phosphorylation regulates the stability of the interaction between Sas-6 and STIL (Fig. 7d). Through an in vitro protein–protein binding assay, we showed that only phosphorylated STIL could interact with Sas-6 (Fig. 7d; Supplementary Fig. 7i), and the interaction between Sas-6 and STIL is regulated by Cdc6 phosphorylation. Both the phosphorylated Cdc6 (incubated with Plk4) and the phosphorylation-mimic Cdc6 2D mutant facilitated a strong interaction between Sas-6 and STIL, while the unphosphorylatable Cdc6 2A mutant inhibited the interaction between Sas-6 and STIL (Fig. 7d), indicating that Cdc6 phosphorylation by Plk4 promotes the release of Sas-6 from its inhibition and results in the stable interaction between Sas-6 and STIL.

Taken altogether, we demonstrated that Cdc6 negatively regulates the centriole duplication by inhibiting the interaction between Sas-6 and STIL, and that this inhibitory role of Cdc6 on centriole duplication is negatively regulated by Plk4 phosphorylation. Cdc6 phosphorylation by Plk4 disrupts the binding of Sas-6 to Cdc6, facilitates the interaction between Sas-6 and STIL, and thus centrosome duplication.

Diskusija

Centrosome duplication is strictly regulated, occurring only once per cell cycle to avoid multipolar spindle assembly and genome instability 45 . Altogether with centrosome duplication during the cell cycle, DNA replication also occurs only once per cell cycle via the pre-RC licensing mechanism 6, 7 . Three DNA replication pre-replicative complex (pre-RC) components, Orc1, MCM5 and geminin, have been reported to restrain centrosome over-duplication 8, 9, 10, 11, 46, indicating that a linkage exists between the initiation of centrosome duplication and DNA replication. However, the functional association of DNA replication initiators with centrosomal proteins involved in centrosome duplication is still unknown. In this study, we identified DNA replication initiator Cdc6 as a substrate of Plk4 kinase. Cdc6 negatively regulates centrosome duplication by binding and inhibiting Sas-6 from forming a stable complex with STIL, and this inhibitory function on centrosome duplication was antagonistically regulated by Plk4 phosphorylation during S phase. The identification of Cdc6 as a substrate of Plk4 kinase and the inhibition of Cdc6 on the Sas-6-STIL interaction, as well as the regulation of Cdc6-Sas-6 interactions by Cdc6 phosphorylation, prompted us to further explore the underlying mechanism of centrosome duplication and the involvement of DNA replication initiators in this process in future studies.

On the basis of our present and previous reported results, we propose a working model to depict the function of Cdc6 in centrosome duplication (Fig. 8). During G1 phase, Plk4 localizes in a ring-like manner surrounding the parental centrioles, while the procentriole formation core protein Sas-6 and STIL are degraded 16, 44 . Cdc6 localizes in the nucleus and is absent at the centrosomes during G1 phase. Centrosome duplication cannot initiate at this time (Fig. 8a). When cells progress to S phase, Cdc6 is recruited to the centrosomes by cyclin A to inhibit untimely centrosome duplication. To trigger centrosome duplication, Plk4 phosphorylates Cdc6 and thus attenuates the inhibitory role of Cdc6 on Sas-6, facilitating the interaction between Sas-6 and STIL, and triggering centrosome duplication during S phase (Fig. 8b). Constant phosphorylation of Cdc6 by Plk4 abolishes its inhibitory activity on Sas-6 to allow Sas-6 to initiate centrosome over-duplication (Fig. 8d). By contrast, unphosphorylated Cdc6 exerts a stronger inhibitory role on Sas-6 and attenuates the interaction between Sas-6 and STIL, and thus restrains the procentriole growth (Fig. 8c). Therefore, to ensure normal centrosome duplication during the cell cycle, the expression and activity of both Plk4 and Cdc6 must be tightly balanced to prevent over-duplication of the centrosome. In summary, our results reveal a novel mechanism in which the opposing activities of Plk4 and Cdc6 ensure the centrosome duplicate once per cell cycle via regulating the interaction of Sas-6 with STIL.

Image

During G1 phase, Plk4 localizes in a ring-like manner surrounding the parental centrioles, while the procentriole formation core protein Sas-6 and STIL are degraded. Cdc6 localizes in the nucleus and is absent at the centrosomes during G1 phase. Centrosome duplication cannot initiate at this time ( a ). When the cells progress into S phase, Cdc6 is recruited to the cartwheel of the centrosome by cyclin A to inhibit untimely centrosome duplication. To trigger centrosome duplication during S phase, Plk4 gradually phosphorylates Cdc6 and attenuates the interaction of Cdc6 with Sas-6, facilitating Sas-6 to form a stable complex with STIL, which then triggers centrosome duplication ( b ). Unphosphorylated Cdc6 exerts a stronger inhibitory role on Sas-6 and attenuates the interaction between Sas-6 and STIL, and thus restrains the procentriole growth ( c ). By contrast, constant phosphorylation of Cdc6 by Plk4 abolishes its inhibitory activity on Sas-6 to allow Sas-6 forming a stable complex with STIL to initiate the centrosome over-duplication ( d ). Therefore, the balance of Cdc6 and Plk4 activities is crucial for the normal centrosome duplication. In summary, we propose that Cdc6 is a novel negative regulator of centrosome duplication, controlling the timely and proper centrosome duplication during the cell cycle.

Visas dydis

Several other proteins have been reported to be involved in controlling centrosome amplification. Cdc14B associates with the centrosomes and inhibits centriole amplification in S phase-arrested cells 47 . Cep76, a centriolar protein, limits centrosome duplication to once per cell cycle 48 . PIPKIγ restrains centriole duplication by interacting with Plk4 and negatively regulating its kinase activity 49 . Cdkn3 prevents Mps1 kinase-mediated centrosome over-duplication by regulating Mps1 protein stability 50 . In addition, KLF14 represses centrosome amplification by transcriptionally inhibiting the Plk4 protein level 51 . The DNA replication pre-replicative complex (pre-RC) components, Orc1, MCM5 and geminin, restrain centrosome over-duplication in S phase-arrested cells 8, 9, 10, 11, 46 . Orc1 localizes to the centrosome via cyclin A and prevents cyclin E-dependent re-duplication of the centrosome 8 . However, the downstream targets of MCM5 and geminin are unknown. In this study, we demonstrate that the DNA replication pre-RC component Cdc6 is a Plk4 kinase substrate that restrains centrosome duplication by binding and inhibiting Sas-6 from interacting with STIL. The significance of our findings is three-fold. First, we identified a new regulatory member that restrains centrosome duplication. Second, we revealed a DNA replication pre-RC component Cdc6, in addition to Orc1, MCM5 and geminin, that represses centrosome duplication, thus reinforcing the association of DNA replication with centrosome duplication. Third, and the most important, our results enhances the mechanistic understanding of the roles of DNA replication regulators in centrosome duplication. These findings that Cdc6 takes a negative role in centrosome duplication and that Plk4 phosphorylates Cdc6 and suppresses the inhibitory role of Cdc6 establish an interplay between DNA replication initiators and centrosome duplication trigger proteins. Moreover, we have identified Cdc6 as a novel negative regulator on Sas6-STIL interaction that is regulated by Plk4, indicating Plk4 had a dual role on promoting the onset of procentriole formation. Our results also provide insights for further studies on the underlying mechanisms that prevent centrosome over-duplication and DNA re-duplication during the cell cycle. In conclusion, this work has provided a clue for the further studies on the underlying mechanisms coupling centrosome duplication and DNA duplication initiation during the cell cycle.

Metodai

Cell culture and cell cycle synchronization

HEK293, HeLa and U2OS cells were from American Type Culture Collection (ATCC) and were confirmed without mycoplasma contamination. Cells were grown at 37 °C in Dulbecco's modified Eagle medium (GIBCO) supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 U ml −1 penicillin and 100 μg ml −1 streptomycin in the presence of 5% CO 2 .

Cells synchronized at the G1/S transition were obtained via a double-thymidine-block-and-release approach. Briefly, HeLa cells were treated with 2.5 mM thymidine (Sigma) for 16 h and then released for 10 h in fresh medium. The cells were treated and blocked at the G1/S transition by a second treatment with 2.5 mM thymidine for 16 h. After the double-thymidine block, the cells were released for 3 or 6 h in fresh medium to acquire the early or late S phase cells, or for 8 or 10 h to acquire the early or late G2 phase cells.

Plazmidės ir antikūnai

Human Cdc6 was cloned from a cDNA library by RT-PCR, and inserted into pEGFP-C3, pCMV-Myc, pmCherry-C2 or pGEX 4 T-1 vector. The Cdc6 WA (K208E), WB (E285G), 2A (S30A, T527A), 2D (S30D, T527D) and Cdc6 Δcy mutants were generated by PCR site-directed mutagenesis and then inserted into pEGFP-C3 or pET28a vector. GFP, mCherry and Myc tags are N-terminal to the Cdc6 WT or mutant. Human cyclin A and cyclin A 1-200 fragments were cloned from a cDNA library by RT-PCR and inserted into pEGFP-C2 or pcDNA3.1-HA vector. The cyclin A ΔCLS mutant was generated by PCR site-directed mutagenesis and then inserted into pEGFP-C2 vector. GFP-tagged cyclin A CLS and GFP-tagged cyclin A CLS DWVE-A were kindly provided by Dr Gaetan Pascreau (University of Colorado). GFP tag is N-terminal to cyclin A WT or mutant, and HA tag is C-terminal to cyclin A. Human Plk4 was cloned from a cDNA library by PCR and inserted into pEGFP-N3, pET28a or pGEX 4 T-1 vector. GFP tag is C-terminal to Plk4 WT or mutant, and GST and His tags are N-terminal to Plk4. Human Sas-6 was cloned from a cDNA library by PCR, and inserted into pEGFP-C1, pCMV-Myc, pET28a or pcDNA3.1-HA vector. GFP, Myc and His tags are N-terminal to Sas-6, and HA tag is C-terminal to Sas-6. Human STIL was cloned from a cDNA library by PCR, and inserted into pcDNA3.1-HA vector. HA tag is C-terminal to STIL.

The anti-GFP antibody used for immunoprecipitation (4 μg per sample) was generated by immunizing rabbits with bacterial expressed recombinant GFP tagged with His. The anti-Plk4 antibody used for western blotting (1:500) was generated by immunizing mice with bacterially expressed recombinant Plk4 (amino acids 1-100 at N-terminus) tagged with GST. The anti-Plk4 antibody used for immunofluorescence (1:500) was kindly provided by Dr Monica Bettencourt-Dias (Instituto Gulbenkian de Ciencia, Oeiras, Portugal). For immunofluorescence, mouse anti-Cdc6 (sc-13136, Santa Cruz Biotechnology, 1:50) and anti-Sas-6 (sc-81431, Santa Cruz, 1:100); and rabbit anti-centrin1 (12794-1-AP, Proteintech, 1:200), anti-γ-tubulin (T3559, Sigma, 1:200), anti-CP110 (sc-136629, Santa Cruz, 1:50), anti-Cep97 (A301-945A, Bethyl, 1:50), anti-STIL (ab89314, Abcam, 1:100) and anti-Cep164 (22227-1-AP, Proteintech, 1:100) antibodies were used. For immunoprecipitation, agarose beads conjugated anti-HA mouse antibody (AT0079, CMCTAG) were used. For western blotting, mouse anti-GFP (sc-9996, Santa Cruz, 1:3, 000), anti-Myc (M4439, Sigma, 1:1, 000) and anti-GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, 1:3, 000); and rabbit anti-cyclin A (sc-751, Santa Cruz, 1:500), anti-HA (H6908, Sigma, 1:1, 000), anti-γ-tubulin (T3559, Sigma, 1:1, 000), anti-STIL (ab89314, Abcam, 1:2, 000), anti-GST (sc-459, Santa Cruz, 1:1000) and anti-phosphoserine (ab9332, Abcam, 1:1, 000) antibodies were used.

HU induced centriole amplification assay

U2OS cells were grown to 40% confluency on coverslips housed in 35-mm dishes before transfection with plasmid DNA. After transfection for 4 h, the transfected U2OS cells were treated and arrested in S phase with 16 mM hydroxyurea (HU, H8627, Sigma) for 52 h to promote centriole amplification. The cells were then stained with γ-tubulin or centrin1 antibodies for centrosome or centriole visualization, respectively, and the numbers of the centrioles and centrosomes in the transfected cells were counted.

Plasmid DNA transfection and RNA interference

U2OS cells at 40% confluency were transfected with plasmid DNA using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). For each 35-mm dish, 2 μg of plasmid DNA and 5 μl of Lipofectamine 2000 were added to DMEM (final volume, 500 μl), and the mixture was incubated for 20 min. The mixture was then added to U2OS cells with 2 ml medium for 4 h, and then the medium was replaced with fresh medium.

Cdc6 siRNA (5′-AACUUCCCACCUUAUACCAGA-3′), Cdc6 siRNA-2 (5′-AAGAAUCUGCAUGUGUGAGAC-3′), Sas-6 siRNA (5′-UUAACUGUUUGGUAACUGCCCAGGG-3′), Plk4 siRNA (5′- CTCCTTTCAGACATATAAG-3′) and a non-targeting negative control siRNA (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′) were synthesized by GenePharma. U2OS cells at 30–40% confluency were transfected with Lipofectamine 2000 following the manufacturer's instructions. For each 35-mm dish, 0.2 μM siRNA and 5 μl of Lipofectamine 2000 were added to DMEM (final volume, 500 μl), and the mixture was incubated for 20 min. The mixture was then added to cells with 1.5 ml of medium. The medium was replaced with fresh medium after 24 h. At 72 h after siRNA transfection, the cells were fixed and processed for immunofluorescence.

Imuninis nusėdimas

Approximately 2 μg of the indicated or control antibody was incubated with 25 μl of protein A conjugated-Sepharose beads (Amersham) in 500 μl of phosphate-buffer saline (PBS) for 1.5 h at 4 °C. The antibody-conjugated protein A beads were then washed with immunoprecipitation buffer (20 mM Tris, 125 mM NaCl, 0.5% NP-40, 10 mM NaF, 0.5 mM EGTA, 1 mM Na 3 VO 4 and 1 mM PMSF, pH 7.5). Cells were lysed in immunoprecipitation buffer supplemented with a protease inhibitor cocktail for 15 min at 4 °C and then centrifuged at 13, 680 g for 15 min. The supernatant was collected and incubated with the antibody-conjugated protein A conjugated-Sepharose beads for 2 h at 4 °C. After extensive washing, the proteins were eluted from the beads and analysed by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) and western blotting.

„Western blot“ tyrimai

Protein samples were separated using SDS–PAGE and transferred to nitrocellulose filters, then blocked with 3% milk in TTBS (20 mM Tris–HCl [pH 7.4], 500 mM NaCl and 0.1% Tween 20) for 30 min, and incubated with primary antibody overnight at 4 °C. After washing three times with TTBS buffer, membrane was incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (Jackson, diluted 1:5, 000 in 3% milk) for 1 h at room temperature and then washed with TTBS. The filter was developed for visualization by enhanced chemiluminescence and X-ray films.

All uncropped western blots and gels can be found in Supplementary Figs 8–11.

Imunofluorescencija

For immunofluorescence, the cells were grown on coverslips, fixed in −20 °C precooled methanol for 5 min. Alternatively, in Figs 1a and 2a and Supplementary Fig. 1d, cells were permeabilized with 0.5% Triton X-100 in PBS for 40 s, fixed by 4% paraformaldehyde in PBS for 15 min and permeabilized in 0.5% Triton X-100 in PBS for 15 min. The fixed cells were incubated with primary antibodies overnight at 4 °C, washed three times with PBS and then incubated with the indicated secondary antibody for 1 h at room temperature. The coverslips were mounted with mowiol containing 1 μg ml −1 DAPI and then examined under a DeltaVision Elite microscope. The images are the maximum intensity projections of image stacks of 1.2 μm interval from six scanning layers, with a distance between the single images of 0.2 μm. The images in Supplementary Fig. 1a, b and h are the maximum intensity projection of an image stack of 8 μm interval from eight scanning layers. The images were analysed using Velocity (ver. 6.1.1) software. Alternatively, in Figs 1a and 2a, the coverslips were examined under a Zeiss LSM 710NLO confocal microscope and projection images of confocal image stacks of 0.6 μm interval were taken. For live-cell imaging of GFP-tagged Cdc6, GFP-tagged WA and GFP-tagged WB mutants, the images are projection images of confocal image stacks of 7.5 μm interval from six scanning layers every 20 min. For live-cell image acquisition and processing, an Ultra View Vox spinning disc confocal microscope (PerkinElmer Inc.) with Velocity (ver. 6.1.1) software was used.

Super resolution microscopy

Three-dimensional structured illumination (3D-SIM) images were performed on an N-SIM imaging system (Nikon) equipped with a × 100/1.49 NA oil-immersion objective (Nikon) and four laser beams (405, 488, 561 and 640), with a 120 nm highest resolution of captured images. Laser lines at 405, 488 and 561 nm were used for excitation. Images stacks with 0.84 μm interval were acquired and computationally reconstructed to generate super-resolution optical serial sections with two-fold extended resolution in all three axes. The reconstructed images were further processed for maximum-intensity projections and 3D-rendering with NIS-Elements AR 4.20.00 (Nikon). The image resolution measured following a Gaussian distribution with a full width at half maximum was 130±3 nm in the 3D-SIM images. Centriole dots shown in these 3D-SIM images are approximately same to the highest resolution and co-localization can be concluded.

Image acquisition of STED (Stimulated Emission of Depletion microscopy) was acquired using a gated STED (gSTED) microscope (Leica TCS SP8 STED 3 ×, Leica Microsystems, Germany) equipped with a HCX PL APO × 100/1.40 NA oil objective, with a 50 nm highest resolution of captured images. The image of green channels were obtained using 488 nm excitation and 592 nm depletion. The image of red channels were acquired using 592 nm excitation and 775 nm depletion. The detection wavelength range was set to 502–568 nm for green channel and 603–700 nm for red channel. All images were acquired using the LAS AF software (Leica). The deconvolution processing was performed with Huygens Professional software (Scientific Volume Imaging, Hilversum, the Netherlands). The image resolution measured following a Gaussian distribution with a full width at half maximum was 90±5 nm in our images. Centriole dots shown in these STED images are approximately same to the highest resolution and co-localization can be concluded.

Baltymų išraiška ir gryninimas

His-tagged Cdc6, Cdc6 2A and 2D mutants were expressed and purified from E. coli strain BL21 cells. His-tagged Plk4 was expressed and purified from the baculovirus/insect Sf9 cell expression system. Briefly, bacterial pellets (induced with 0.2 mg IPTG for 14 h at 16 °C) or Sf9 cells were lysed by sonication with extraction buffer (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl and 10 mM imidazole, pH 8.0). The supernatant was then incubated with His60 Ni Superflow resin at 4 °C for 1 h. Nonspecific binding to the resin was eliminated by washing with a three-fold resin-bed-volume of washing buffer (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl and 20 mM imidazole, pH 8.0). The purified proteins were then eluted from the resin with elution buffer (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl and 250 mM imidazole, pH 8.0) and dialysed with PBS.

GST-tagged Plk4 and GST-tagged Cdc6 were expressed and purified from E. coli strain BL21 cells with PBS. Briefly, the bacterial pellet was lysed by sonication, and the supernatant was incubated with glutathione Sepharose 4B beads (GE Healthcare) at 4 °C for 1 h. Nonspecific binding to the resin was eliminated by washing with a three-fold resin-bed-volume of PBS. The purified proteins were eluted with elution buffer (50 mM Tris–HCl and 10 mM reduced glutathione, pH 8.0) and dialysed with PBS.

His-tagged Cdc6, Cdc6 2A, Cdc6 2D, Sas-6 and HA-tagged cyclin A, Sas-6, STIL proteins in Figs 1c and 6b, h, i were generated using quick coupled transcription/translation system (L1170, Promega).

In vitro protein interaction assay

For determination of Cdc6–Sas-6 interaction in vitro , His-tagged Cdc6 or its mutant protein and His-tagged Sas-6 protein were incubated with purified GST or GST-Plk4 in kinase reaction buffer (20 mM Tris–HCl, 10 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 1 mM DTT, 5 μM Na 3 VO 4 and 200 μM ATP, pH 7.5) for 30 min in 30 °C. Reactions were then supplemented with 700 μl immunoprecipitation buffer (20 mM Tris, 125 mM NaCl, 0.5% NP-40, 10 mM NaF, 0.5 mM EGTA, 1 mM Na 3 VO 4 and 1 mM PMSF, pH 7.5) and incubated with the antibody-conjugated protein A conjugated-Sepharose beads in immunoprecipitation buffer for 2 h at 4 °C. For determination of Sas-6-STIL interaction in vitro , HA-tagged Sas-6 protein and HA-tagged STIL protein were incubated with purified GST or GST-Plk4 and indicated proteins in kinase reaction buffer (20 mM Tris–HCl, 10 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 1 mM DTT, 5 μM Na 3 VO 4 and 200 μM ATP, pH 7.5) for 30 min in 30 °C. Reactions were then supplemented with 700 μl immunoprecipitation buffer (20 mM Tris, 125 mM NaCl, 0.5% NP-40, 10 mM NaF, 0.5 mM EGTA, 1 mM Na 3 VO 4 and 1 mM PMSF, pH 7.5) and incubated with the antibody-conjugated protein A conjugated-Sepharose beads for 2 h at 4 °C.

In vitro kinase activity assays

For in vitro kinase activity assay, ∼ 2 μg of Cdc6 or its mutant protein was mixed with 1 μg of GST-tagged Plk4 in kinase buffer (20 mM Tris–HCl, 10 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 1 mM DTT, 5 μM Na 3 VO 4, 200 μM ATP and 10 μCi γ- 32 P ATP, pH 7.5), and incubated at 30 °C for 30 min. The samples were then resolved by SDS–PAGE and exposed to KODAK film.

Statistinė analizė

Approximately 100–300 cells were counted per sample, and three independent experiments were conducted. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism software. P values were calculated by Student's t -test from the mean values of the indicated data. Significant differences were marked with asterisks (* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; NS, no significant difference).

Duomenų prieinamumas

The authors declare that all data supporting the findings of this study are available within the article and its Supplementary information files or from the corresponding author on reasonable request.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi skaičiai

  2. 2.

    Tarpusavio apžvalgos byla

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas filmas

    Time-lapse live-cell imaging of HeLa cells transfected with GFP-tagged Cdc6 WT (related to Figure 1). Live-cell imaging was started from the G1/S transition time point. Note that Cdc6 WT localizes on the centrosome during S and G2 phases. The arrowhead indicates centrosome. Svarstyklės, 10 μm.

  2. 2.

    2 papildomas filmas

    Time-lapse live-cell imaging of HeLa cells transfected with GFP-tagged Cdc6 WA mutant (related to Figure 1). Live-cell imaging was started from the G1/S transition time point. Note that Cdc6 WA does not localize on the centrosome during S and G2 phases. Svarstyklės, 10 μm.

  3. 3.

    3 papildomas filmas

    Time-lapse live-cell imaging of HeLa cells transfected with GFP-tagged Cdc6 WB mutant (related to Figure 1). Live-cell imaging was started from the G1/S transition time point. Note that Cdc6 WB localizes on the centrosome during S and G2 phases. The arrowhead indicates centrosome. Svarstyklės, 10 μm.

  4. 4.

    4 papildomas filmas

    Time-lapse live-cell imaging of HeLa cells transfected with GFP-tagged Cdc6 WT from G2 phase to the next G1 phase (related to Figure 1). Live-cell imaging was started from the late G2 phase. Note that Cdc6 WT localizes in the nucleus during G1 phase. The arrowhead indicates centrosome. Svarstyklės, 10 μm.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.