Motinos plazmos sekos nustatymas siekiant nustatyti sindromą: tarptautinis klinikinio patvirtinimo tyrimas | genetika medicinoje

Motinos plazmos sekos nustatymas siekiant nustatyti sindromą: tarptautinis klinikinio patvirtinimo tyrimas | genetika medicinoje

Anonim

Dalykai

  • Ligos genetika
  • DNR sekos nustatymas

Anotacija

Tikslas: Prenatalinė Dauno sindromo patikra pagerėjo, tačiau invazinių diagnostinių procedūrų skaičius išlieka problemiškas. Gali būti patobulintas matuojant cirkuliuojančią ląstelių neturinčią DNR motinos plazmoje.

Metodai: Aklinas, įdėtas atvejo ir kontrolės tyrimas buvo sukurtas atliekant 4664 nėštumų grupes, turinčias didelę Dauno sindromo riziką. Vaisiaus kariotipija buvo palyginta su vidiniu lygiu patvirtintu, laboratorijoje sukurtu tyrimu, pagrįstu naujos kartos sekos nustatymu 212 Dauno sindromo ir 1484 suderintų euploidinių nėštumų atvejais. Nė vienas iš jų nebuvo išbandytas anksčiau. Pirminis tyrimas buvo atliktas CLIA sertifikuotoje komercinėje laboratorijoje, o kryžminį patikrinimą atliko CLIA sertifikuota universiteto laboratorija.

Rezultatai: Dauno sindromo nustatymo dažnis buvo 98, 6% (209/212), klaidingai teigiamas rodiklis buvo 0, 20% (3/1471), o bandymai nepavyko 13 nėštumų (0, 8%); visi buvo euploidai. Prieš aklų naikinimą, pirminių tyrimų laboratorija taip pat pranešė apie kelias alternatyvias interpretacijas. Didesnį poveikį gerinimui turėjo 21 chromosomos skaičiaus pakoregavimas guanino citozino bazės kiekiui.

Išvada: taikant motinos plazmos DNR, nustatant didelės rizikos nėštumą, beveik visi Dauno sindromo atvejai nustatomi labai mažu klaidingai teigiamų rodiklių dažniu. Šis metodas gali iš esmės sumažinti invazinių diagnostinių procedūrų poreikį ir su tuo susijusius vaisiaus nuostolius. Nors reikia išspręsti diegimo problemas, įrodymai patvirtina šio bandymo klinikinį pagrindą.

Pagrindinis

Šiuo metu veiksmingiausi prenataliniai Dauno sindromo atrankos testai sujungia motinos amžių su informacija, gauta atliekant sonografinius matavimo nosies permatomumą per pirmąjį trimestrą ir matuojant kelis motinos serumo atrankos žymenis, gautus per pirmąjį ir antrąjį trimestrus. 1, 2 Šis metodas nustato iki 90% visų atvejų, kai klaidingai teigiamas procentas yra 2%. Atsižvelgiant į Dauno sindromo paplitimą, kiekvienai iš 16 teigiamai vertinamų moterų, kurioms buvo atlikti invaziniai diagnostiniai tyrimai (amniocentezės ar chorioninės villus mėginiai), nėštumas turės įtakos, o 15 - ne. 1 iš 200 tokių invazinių procedūrų yra susijusios su vaisiaus nykimu, pagrindine neigiama prenatalinės diagnozės pasekme. 3, 4 Tai paskatino pakoreguoti atrankos ribas, kad būtų sumažintas klaidingai teigiamų rodiklis. Praktikoje dažnai pasitaiko klaidingai teigiamų 5% procentų.

1997 m. Atradimas, kad 3–6% ląstelių neturinčios DNR motinos kraujyje buvo vaisiaus kilmės, paskatino atlikti tyrimus, siekiant nustatyti, ar Dauno sindromą galima nustatyti neinvaziškai. 5 2008 m. Dvi grupės nustatė vaisiaus Dauno sindromą, naudodamos masiškai lygiagrečią šautuvo seką (MPSS). 6, 7 Šis metodas seka pirmąsias 36 milijonų DNR fragmentų bazes, kad būtų galima nustatyti jų specifinę chromosominę kilmę. Jei vaisius turi trečiąją 21 chromosomą, 21 chromosomos fragmentų procentas yra šiek tiek didesnis nei tikėtasi. Vėlesnėse ataskaitose šie pastebėjimai buvo išplėsti ir teigiama, kad mažiausiai 98% aptikimo laipsnį galima pasiekti klaidingai teigiamu 2% ar mažesniu laipsniu. 8–10 Nors šie tyrimai buvo daug žadantys (13–86 Dauno sindromo atvejai ir 34–410 euploidų kontroliniai mėginiai), DNR seka nebuvo atlikta CLIA sertifikuotose laboratorijose, o apyvarta ir apyvartos laikas nesimuliavo klinikinės praktikos. Dabartinis nepriklausomas bendradarbiaujantis tyrimas pašalina šiuos ir kitus trūkumus.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Išsamios informacijos ieškokite „Išplėstiniai metodai“, A priedėlis, 1 papildomas skaitmeninis turinys, //links.lww.com/GIM/A213.

Bendras studijų dizainas

Mūsų tyrime (clintrials.gov NCT00877292) dalyvavo pacientai, kurie buvo įtraukti į 27 prenatalinės diagnostikos centrus visame pasaulyje (registracijos vietos). Moterys, turinčios didelę Dauno sindromo riziką, atsižvelgiant į motinos amžių, šeimos istoriją ar teigiamą serumo ir (arba) sonografinio patikrinimo testą, pateikė sutikimą, plazmos mėginius ir demografinę bei nėštumo informaciją. Kiekvienoje vietoje buvo gautas Institucinės peržiūros valdybos patvirtinimas (arba lygiavertis). Identifikacija buvo vykdoma pagal tyrimo kodą. Mėginiai buvo imami prieš pat invazinį testavimą, apdoroti per 6 valandas, laikyti –80 ° C temperatūroje ir vežami ant sauso ledo į koordinavimo centrą. Šioje kohortoje mes sukūrėme įdėtą atvejo ir kontrolės tyrimą su aklųjų DNR tyrimais Dauno sindromui nustatyti. Kiekvienu atveju mes suderinome septynis euploido mėginius, atsižvelgiant į nėštumo amžių (artimiausia savaitė; tas pats trimestras), registracijos vietą, rasę (savęs deklaruotą) ir laiką šaldiklyje (per 1 mėnesį). Darant prielaidą, kad nėra klaidingai neigiamų rezultatų, 200 Dauno sindromo atvejų (atvejų) turėjo 80% galią atmesti 98% kaip mažiausią pasitikėjimo intervalą (PI). Atvejai buvo paskirstyti vienodai tarp pirmojo ir antrojo trimestrų. Šiam tyrimui Dauno sindromą apibrėžėme kaip 47, XY, + 21 arba 47, XX, + 21; nebuvo įtrauktos mozaikos ir dvynių nėštumai su Dauno sindromu.

Tyrimų koordinavimas ir mėginių saugojimas buvo pagrįsti nepriklausomame akademiniame medicinos centre (Moterų ir kūdikių ligoninėje). Sušaldyti, užkoduoti mėginiai (4 ml) buvo nusiųsti į Sequenom molekulinės medicinos centrą (SCMM, San Diegas, CA) išbandyti. SCMM neturėjo žinių apie kariotipą ir imitavo klinikinius tyrimus, įskaitant apyvartos laiko kiekybinį įvertinimą. Mėginių pogrupis buvo išsiųstas tyrimui į Našlaičių ligų tyrimo centrą Kalifornijos universitete Los Andžele (UCLA; Los Andželas, CA), nepriklausomoje akademinėje laboratorijoje, turinčioje DNR sekos nustatymo patirtį. Abi laboratorijos buvo sertifikuotos CLIA, ir abi pateikė klinikines interpretacijas, naudodamos standartizuotą rašytinį protokolą, kurį iš pradžių sukūrė SCMM.

Studijų vientisumas

Mes skyrėme aukščiausią prioritetą šio pramonės finansuojamo tyrimo vientisumo, patikimumo ir nepriklausomumo užtikrinimui. Mes sukūrėme trijų asmenų priežiūros komitetą (žr. Padėkos), kuriam pavesta įvertinti ir pateikti rekomendacijas dėl studijų planavimo, vykdymo, analizės ir aiškinimo. Tyrimo protokolas apėmė registracijos vietos patikrinimus, įtraukimo vietų izoliavimą nuo tyrimo rėmėjo, patvirtinamuosius tyrimus nepriklausomoje akademinėje laboratorijoje, diagnostinių tyrimų rezultatų apakinimą keliais lygmenimis, nuotolinę kompiuterio prieigą prie rezultatų duomenų, akademinių atstovų prieigą prie visų neapdorotų duomenų. testavimo vieta, sekos sekos ir aiškinimo rezultatų nedelsiant perdavimas rinkmenai į koordinavimo centrą ir failų kontrolinių sumų panaudojimas vėlesniems pakeitimams nustatyti. SCMM pateikė nepriklausomą laboratoriją su panašia įranga, mokymais, aiškinamąja programine įranga ir standartiniais darbo protokolais.

Laboratorijoje sukurtas testas

MPSS buvo aprašytas anksčiau. 9 Trumpai tariant, cirkuliuojantys ląstelių neturintys DNR fragmentai yra išskirti iš motinos plazmos ir kiekybiškai įvertinami atliekant tyrimą, kuris nustato vaisiaus indėlį (vaisiaus frakcija). 11 Likusius izoliatus panaudojome sekos sudarymo bibliotekoms generuoti, normalizuodami ir multipleksuodami, kad keturis mėginius būtų galima paleisti vieno srauto ląstelių juostoje (aštuonios juostos kiekvienoje srauto ląstelėje). 9 DNR bibliotekas kiekybiškai įvertinome naudodamiesi mikrofluidics platforma (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) ir sukūrėme grupes naudodami cBot platformą (Illumina, Inc, San Diegas, CA). Mes sekame srauto langelius „Illumina HiSeq 2000“ platformoje ir analizuojame gautus duomenis naudodami „Illumina“ programinę įrangą. Kompiuterinis aiškinimas davė patikimą SD vertę, didesnę ar mažesnę už centrinę sąmatą ( z- rezultatas); Manoma, kad z- balai, esantys 3 ar daugiau, atitinka Dauno sindromą. Pirminės CLIA laboratorijos (SCMM) direktorius apžvelgė rezultatus, inicijavo kvietimus ištirti antrą alikvotą ir pateikė galutinį visų ištirtų nėštumų aiškinimą „pasirašyta“. Nepriklausomos CLIA laboratorijos (UCLA) direktorius padarė tą patį, tačiau negalėdamas iškviesti antrojo mėginio alikvotų. Kiekviena laboratorija turėjo prieigą tik prie savo rezultatų.

Statistinė analizė

Tyrimas bus pristabdytas, jei tarpinė analizė parodys, kad daugiau nei 3 iš 16 atvejų arba 6 iš 112 kontrolių buvo neteisingai klasifikuotos. Nors tyrimas buvo suderintas, planavome, kad analizė bus neprilygstama. Mes ištyrėme skirtumus tarp grupių ir asociacijų, naudodami test 2 testą, t- testą, dispersijos analizę (ANOVA) ir tiesinę regresiją (atlikę atitinkamas transformacijas), naudodami SAS (Cary, NC) ir True Epistat (Richardson, TX). Mes apskaičiavome proporcijų CI, naudodami binominį pasiskirstymą. P reikšmės buvo dvipusės, o reikšmingumas buvo 0, 05.

REZULTATAI

Imties populiacija

Balandžio mėn. Iki 2011 m. Vasario mėn. 27 registracijos vietose (1 lentelė) buvo nustatytos nėščios moterys, atitinkančios reikalavimus, gautas informuotas sutikimas ir paimti mėginiai. Tarp 4664 mokinių buvo 218 singleton Downo sindromas ir 3930 singleton euploidiniai nėštumai. 1 paveiksle pateikiama išsami informacija apie vaisiaus būklę, plazmos mėginių būklę ir priežastis, kodėl 279 moterys (6%) buvo išskirtos. Nė vienas iš pavyzdžių nebuvo įtrauktas į ankstesnes publikacijas ar tyrimus. Iš viso 4385 moterys (94 proc.) Turėjo vienintelį nėštumą, turėjo bent du tinkamus plazmos mėginius ir diagnostinių tyrimų rezultatus. Iš jų 97% buvo nuo 11 iki 20 nėštumo savaitės, imtinai; Pirmąjį trimestrą buvo 34 proc. Kiekviename trimestre buvo diagnozuotas panašus Dauno sindromo vaisiaus (atvejų) skaičius, o pirmieji 212 buvo įtraukti tyrimui. Kiekvienam atvejui buvo pasirinkti septyni sutapti euploidiniai nėštumai (1484). Vėliau buvo nustatyta, kad viena kontrolė yra 18-osios trisomijos, tačiau ji buvo įtraukta kaip „euploido“ kontrolė.

Pilno dydžio lentelė

Image

Diagrama, rodanti informaciją apie įtrauktus pacientus ir jų nėštumus. Vaisiaus kariotipai (arba lygiaverčiai) buvo prieinami visoms moterims, išskyrus 51. 116 moterų plazmos mėginiai nebuvo laikomi tinkamais tyrimams (pvz., Atšildyti tranzito metu, daugiau kaip 6 valandas prieš sušaldymą, tik vienas alikvotas ir nepakankamas tūris). Papildomos 112 moterų buvo pašalintos dėl daugybinio nėštumo ar vaisiaus mirties. Tarp likusių 4385 perspektyvių pavienių nėštumų 34% buvo gauti vėlyvą pirmąjį trimestrą ir 66% ankstyvą antrąjį trimestrą. Iš viso buvo išbandyti 212 Dauno sindromo atvejai ir 1484 suderinti euploido kontroliniai tirpalai (7: 1). Tarp 237 kitų rezultatų buvo papildomos autosominės aneuploidijos, lytinės chromosomų aneuploidijos, mozaikos ir kiti chromosomų anomalijos.

Visas dydis

2 lentelėje palyginama demografinė ir su nėštumu susijusi informacija tarp atvejų ir kontrolės. Rungtynės buvo sėkmingos. Abiejose grupėse vidutinis amžius buvo apie 37 metai; visi buvo 18 metų ar vyresni. Diagnostinių tyrimų indikacijos skyrėsi, kai kuriais atvejais ultragarso anomalija ar kelios indikacijos buvo labiau tikėtinos. Mėginiai buvo surinkti, apdoroti ir užšaldyti vidutiniškai per 1 valandą; viskas per 6 valandas. Rezultatai buvo pagrįsti kariotipizavimu, išskyrus du pirmojo trimestro atvejus (kiekybinė polimerazės grandininė reakcija viename ir fluorescencinė in situ hibridizacija kitame - pastojimo produktų pasibaigus gyvybingam vaisiui, turinčiam rimtų ultragarso anomalijų).

Pilno dydžio lentelė

Vaisiaus indėlis į cirkuliuojančią laisvą DNR

Prieš MPSS buvo ištirta ekstrahuota DNR, siekiant nustatyti laisvos vaisiaus kilmės DNR dalį motinos plazmoje (vaisiaus frakcija). Beveik visų (1687/1696; 99, 5%) galutinė vaisiaus frakcija buvo neviršijant priimtinų ribų (4–50%) 9 ; geometrinis vidurkis buvo 13, 4%. Apatinis ribas buvo pasirinktas siekiant sumažinti klaidingai neigiamus rezultatus. Viršutinis kirtis buvo pasirinktas įspėti laboratorijos direktorių, kad tai retas įvykis. Devyni turėjo nepriimtiną lygį; šeši žemiau slenksčio ir trys aukščiau. Kadangi MPSS sėkmė nustatant Dauno sindromą labai priklauso nuo vaisiaus frakcijos, buvo ištirta 16 galimų kovariatorių (eFigs. B1 – B16, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/GIM/A213) (). apdorojimo laikas, hemolizė, geografinis regionas, indikacijos diagnostiniams tyrimams, įtraukimo vieta, nėštumo amžius, motinos amžius, motinos svoris, kraujavimas iš makšties, motinos rasė, kaukazo etninė priklausomybė, vaisiaus lytis, laikymas šaldiklyje ir vaisiaus frakcijos poveikis DNR bibliotekos koncentracijai, suderintų sekų skaičius ir vaisiaus baigtis). Buvo pastebėtas stiprus neigiamas vaisiaus frakcijos ryšys su motinos svoriu moterims ir kontrolinėms moterims (pvz., B8 pav., B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/GIM/A213), kai kūno svoris buvo 100, 150, ir 250 svarų, susijusių su prognozuojamomis vaisiaus frakcijomis, atitinkamai, 17, 8%, 13, 2% ir 7, 3%. Nebuvo rasta jokio nėštumo amžiaus, motinos giminės ar testų indikacijos. Kitos asociacijos buvo nedidelės ir paprastai nebuvo reikšmingos.

Masiškai lygiagretus Dauno sindromo sekos testavimas

Testavimą per 9 savaites (2011 m. Sausio – kovo mėn.) Atliko 30 mokslininkų, molekulinės technikos specialistų / technologų, mokę tyrimo metodus ir susijusius prietaisus. Interpretacijai turėjo būti naudojami istoriniai atskaitos diapazonai 9, o reikalavimas - realaus laiko peržiūra. Laboratorijos direktoriaus atliktas pirmųjų kelių srauto elementų peržiūra (prieš atsijungiant) parodė, kad būtina koreguoti pamatinius duomenis (išplėstiniai metodai, A priedas ir eFig. B17 – B19, B priedėlis, 1 papildomas skaitmeninis turinys, // nuorodos). lww.com/GIM/A213). Sugeneravus duomenis iš šešių srauto elementų, Priežiūros komitetas įvertino rezultatus pagal tarpinius kriterijus ir buvo priimtas konfidencialus sprendimas leisti bandymą tęsti. Baigęs bandymą, bet prieš aklindamas, SCMM paprašė antrojo alikvoto, skirto 85 iš 90 bandymų nesėkmių tarp 1696 mokinių (5, 3%; 95% CI, 4, 3–6, 5) (pvz., B36 brėžinys, B priedėlis, Papildomas skaitmeninis turinys 1)., //links.lww.com/GIM/A213). Antrasis rezultatas buvo naudojamas galutiniam aiškinimui.

2A paveiksle pavaizduota visų 212 Dauno sindromo ir 1471 iš 1484 euploidų mėginių (išskyrus 13 nepavykusių pavyzdžių) chromosomos 21 z- rezultatas, palyginti su vaisiaus frakcija. Tarp atvejų (po logaritminės transformacijos, nuolydis = 0, 676, P <0, 001), bet teigiamas vaisiaus frakcijos ir z rezultato ryšys egzistavo, bet ne kontrolinėms grupėms (nuolydis = 0, 0022, P = 0, 50). Keturių Dauno sindromo mėginių z- balai buvo mažesni nei 3; visų vaisiaus frakcijų buvo ≤7%. Vieno iš jų pradinis „ z“ balas buvo 5, 9 su viena ribine kokybės nesėkme; pakartotinis mėginio z rezultatas buvo 2, 9 (ribinė vertė atitinka pradinį teigiamą rezultatą). Laboratorijos direktorius aiškindamas įvertino abu rezultatus. Todėl pasirašyti rezultatai (2B pav.) Teisingai nustatė 209 iš 212 Dauno sindromo vaisiaus (aptikimo laipsnis 98, 6%; 95% PI, 95, 9–99, 7). Tarp 1471 euploido pavyzdžių 3 turėjo z- balus> 3 pagal vaisiaus frakcijas ir buvo neteisingai klasifikuojami kaip Dauno sindromas, todėl klaidingai teigiamas procentas buvo 0, 2% (95% PI, <0, 1–0, 6). 13 moterų (13/1696 arba 0, 8%; 95% PI, 0, 4–1, 3) aiškinimas nebuvo pateiktas dėl pradinio ir pakartotinio mėginių kokybės kontrolės klaidų (šešiose buvo 50% vaisiaus frakcijų), nors jų tyrimų rezultatai buvo ir paprastai „normalus“ (2B pav.). Neteisingai klasifikuotų nėštumų laboratoriniai rezultatai, mėginių apdorojimas ir nėštumo rezultatai buvo išsamiai tikrinami, ar nėra galimų klaidų; nė vienas nebuvo atpažintas („eTable B1“, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/GIM/A213).

Image

MPSS rezultatai dėl Dauno sindromo ir suderintų euploidų mėginių. A, parodyta vaisiaus frakcija ( x- ašis), palyginti su kompiuterine interpretacija, išreikšta z- rezultatu ( y- ašis) 212 Dauno sindromo mėginiams (dideli apskritimai) ir 1471 atitikmenų euploido mėginiams (mažiems apskritimams). Šiame paveiksle nėra 13 pavyzdžių, kurių kokybės rodikliai pasikartoja. Plonoji horizontali linija nubrėžta pagal z -rezultatą 0, apytikslį euploido rezultatų centrą, ir parodo, kad šie rezultatai nesiskiria pagal vaisiaus dalį. Brūkšniuota horizontali linija ties 3 rodo ribos lygį, virš kurio kompiuteris praneša, kad rezultatas atitinka Dauno sindromą. Trys euploido rezultatai nukrenta virš šio ribinio lygio. Dauno sindromo mėginiai rodo aiškų ir reikšmingą teigiamą ryšį su vaisiaus frakcija; 208 mėginiai yra virš ribos, o keturi - žemiau. Visų žemiau esančių vaisiaus frakcijų yra palyginti nedaug (7%, 7%, 5% ir 4%). B, visų tyrimo Dauno sindromo ir euploido mėginių klinikinis aiškinimas. Interpretacijos yra teigiamos Dauno sindromo (DS +), neigiamos (Dauno) (DS−) ir nesėkmės (nesėkmės). Užpildyti simboliai nurodo pavyzdžius, kurie buvo išbandyti du kartus dėl nesugebėjimo suprasti pradinio mėginio. Tarp euploidinių nėštumų 1468 buvo neigiami, 3 - teigiami, 13 - antruoju alikvotu taip pat nepavyko. Tarp Dauno sindromo nėštumų 209 buvo teigiami, o 3 - neigiami. Viena teigiama interpretacija buvo susijusi su „ z“ balu žemiau 3 (2, 9). Laboratorijos direktorius sujungė šią informaciją iš pakartotinio mėginio su 5, 9 balais iš pradinio mėginio (su ribine linija), kad būtų galima teisingai paskambinti. Visos kitos klinikinės interpretacijos sutiko su kompiuterine interpretacija.

Visas dydis

Atlikta pirmųjų 15 kovariatorių, palyginti su „ z -core“, analizė („eFigs“. B20 – B34, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/GIM/A213). Tarp atvejų motinos svoris buvo stipriai neigiamas; ši asociacija kontrolėje buvo silpnesnė. Tais atvejais buvo nedidelis, bet reikšmingas teigiamas ryšys su gestaciniu amžiumi (pvz., B25 pav., B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/GIM/A213), kai regresuoti z rezultatai buvo įvertinti 11 ir 19 nėštumo savaitę atitinkamai 7, 2 ir 9, 9. Kitos asociacijos buvo nedidelės ir paprastai nebuvo reikšmingos.

Nepriklausomos laboratorijos atliekamas bandymų atlikimas

UCLA laboratorija atliko klasterių generavimą, DNR sekos nustatymą ir aiškinimą 605 pradinių mėginių alikvotų, kurie iš pradžių buvo apdoroti ir išbandyti SCMM, pogrupiui. Šį pogrupį atsitiktinai atrinko Koordinavimo centras iš visų 92 pacientų mėginių (plokštelių) grupių. 3 paveiksle pavaizduotas 21-osios chromosomos z balų rezultatas, pateiktas 578 mėginiams, sėkmingai ištirtiems abiejose vietose (96%). Koreliacija buvo aukšta tarp 77 Dauno sindromo ir 501 euploidinio nėštumo (atitinkamai R = 0, 80 ir 0, 83). Dvidešimt septyni pradiniai mėginio gedimai vienoje ar abiejose vietose nerodomi. Šiame 578 pogrupyje SCMM aptikimo, klaidingai teigiamų ir pradinių gedimų procentas buvo atitinkamai 98, 7%, 0, 0% ir 4, 4%. Atitinkami UCLA rodikliai buvo 98, 7%, 0, 2% ir 3, 9% („eTable B1“, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/GIM/A213).

Image

MPSS 21 chromosomos tyrimo rezultatai iš dviejų laboratorijų iš 605 mėginių. Kompiuteriu interpretuojami MPSS rezultatai išreiškiami z balais, o x ašyje - Sequenom molekulinės medicinos centro (SCMM) vertės, o y ašyje - UCLA laboratorijos vertės. Paveikslėlyje parodytas 77 Dauno sindromas ir 501 euploidinis nėštumas, kurie buvo sėkmingai išbandyti abiejose vietose. Į 27 mėginius, kurie nepavyko atlikti pradinio bandymo vienoje ar abiejose vietose, neįtraukiami. Vertikalios ir horizontalios punktyrinės linijos rodo z-rezultato ribą 3. Tarp šių pavyzdžių kilo tik vienas nesutarimas. Euploido mėginys buvo neteisingai klasifikuotas pagal UCLA ( z- rezultatas = 3, 46), bet teisingai klasifikuotas pagal SCMM ( z- rezultatas = 2, 02). Abi grupės suklasifikavo vieną Dauno sindromo mėginį.

Visas dydis

Kitame 56 tiriamųjų pogrupyje kiekvienoje laboratorijoje buvo tiriami kartotiniai 4 ml plazmos mėginiai. Vienas euploido mėginys nepavyko abejose vietose (maža vaisiaus frakcija). Dviejų papildomų euploidinių mėginių sekos nustatymas UCLA nepavyko; jų protokolas neleido pakartotinai tirti. Gedimų procentas SCMM ir UCLA buvo atitinkamai 1, 8% ir 5, 3%. Tarp likusių 53 pavyzdžių dvi svetainės sutarė dėl visų kokybės parametrų ir aiškinamųjų rezultatų (pavyzdys B39, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/GIM/A213). Abiejose laboratorijose aptikimo ir klaidingai teigiamų rodiklių procentas buvo atitinkamai 100% ir 0%.

Post hoc analizė

Didelis imties dydis suteikė galimybę ištirti alternatyvius MPSS rezultatų aiškinimo metodus. Po atsijungimo, bet prieš laboratorinį aklinavimą, SCMM laboratorija pakoregavo 21 proc. Chromosomos rezultatus, kad nustatytų GC kiekį - tai procesas, kuris pagerina MPSS našumą, 12, 13, taip pat filtruojamas pagal „Repeat Mask“ (www.repeatmasker.org). /PreMaskedGenomes.html) ir rezultatus, perduotus koordinavimo centrui, kad būtų galima nustatyti, ar alternatyvūs aiškinimo algoritmai gali veikti geriau, ar jie yra tvirtesni, ar abu. Analizė parodė, kad kontrolės rezultatai varijuoja pagal srauto elementą arba pagal plokštelę (trys srautiniai elementai, kurie apdorojami partijomis) (ANOVA, F = 13, 5, P <0, 001), tačiau SD buvo pastovus (ANOVA, F = 1, 2, P = 0, 23), leidžiame konvertuoti pagal GC pakoreguotus rezultatus į plokštelės vidurkio kartotinius. Dauno sindromo ir euploidinių nėštumų plokštelių mediana buvo dauginama atskirai, išskyrus vieną nuolatinį klaidingai neigiamą rezultatą (e. B41 pav., B priedėlis, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/GIM/A213). . Koreguojant srautinių elementų z- taškus, taip pat pagerėjo našumas, nes liko du klaidingai neigiami ir vienas klaidingai teigiamas rezultatas (pvz., „B42“ paveikslas, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/GIM/A213). Klinikinio aiškinimo metu nė viena iš šių post hoc analizių nebuvo prieinama.

Klinikiniai padariniai

Ištirti du tūkstančiai šimtas šešiolika pradinių pacientų mėginių (1696 čia ir 420 kitų pacientų pavyzdžių), naudojant 235 pacientų per savaitę pralaidumą, naudojant dvi „HiSeq 2000“ platformas. Apyvartos laikas (mėginio atšildymas norint atsijungti) pagerėjo per 9 bandymo savaites ir buvo pasiektas 10 dienų tikslas 18 iš paskutinių 20 srauto elementų (pvz., B35 brėžinys, B priedėlis, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww). com / GIM / A213). Į tai neįeina 5% mėginių, kuriems reikėjo antrojo alikvotinio kiekio, nors jų paruošimo laikas dvigubai neaugs, nes gedimai dažnai nustatomi bandymo proceso pradžioje.

Norėdami įvertinti naudingumą, paprastas modelis (pvz., B39 brėžinys, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys, //links.lww.com/GIM/A213) palygina dabartinius Dauno sindromo diagnostikos protokolus su tokiais, kurie įterpia MPSS tarp padidintos rizikos nustatymo. nėštumas ir invazinė diagnozė. Tarkime, kad 100 000 moterų, turinčių didelę Dauno sindromo riziką, turi vieną paveiktą nėštumą kiekvienam 32 įprastam nėštumui, diagnostinių tyrimų išlaidos yra 1 000 USD vienam pacientui (el. Pavyzdys B39, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys, //links.lww.com/GIM/). A213), o vaisiaus nuostolių procentas - 1 iš 200. 3, 4, 14 Visiškai imantis invazinių bandymų, kuriuos atliktų didelės rizikos moterys, būtų galima nustatyti 3000 atvejų, kurių kaina 100 mln. USD, ir 500 su procedūra susijusių nuostolių. Visiškos rizikos grupių moterų MPSS testavimo atlikimas ir invazinis testavimas toms, kurių MPSS rezultatai buvo teigiami (kartu su tomis, kurioms testas nepavyko), aptiktų 2 958 atvejus (42 praleisti), kainuojantys 3, 9 mln. USD ir 20 nuostolių. Dviejų protokolų finansinių išlaidų skirtumas galėtų padėti kompensuoti MPSS testavimo išlaidas. Neįmanoma priskirti dolerio vertės 480 galimai išvengiamiems su procedūra susijusiems nuostoliams, tačiau jie yra ne mažiau svarbūs dalykai. Jei su procedūra susijusių nuostolių procentas būtų mažesnis nei 1 iš 200, absoliutus nuostolių skaičius sumažėtų, tačiau proporcingas sumažėjimas išliktų toks pats.

DISKUSIJA

Šis tyrimas pratęsia anksčiau paskelbtų ataskaitų išvadas. 8–10 Kartu su mūsų ataskaita buvo pranešta apie 350 Dauno sindromą ir 2061 kontrolinį nėštumą. Dokumentas rodo 99, 0% jautrumą ir specifiškumą (95% PI, 98, 2–99, 8%, I 2 = 0%; „eTable B3“, B priedas, papildomas tekstas). 1 skaitmeninis turinys, //links.lww.com/GIM/A213), pateikiantis galutinius duomenis apie Downo sindromo tyrimo, pagrįsto MPSS, klinikinį pagrįstumą. Teigiamas tyrimo rezultatas padidino Dauno sindromo riziką 490 kartų (98, 6% aptikimo / 0, 2% klaidingai teigiamo rodiklio); neigiamas rezultatas sumažino riziką 72 kartus (99, 8% / 1, 4%). Testai buvo sėkmingi 992 iš 1000 moterų. Nors 5, 3% pradinių bandymų kokybės patikrinimai nepavyko, 82% jų buvo pašalinti po antrojo alikvotų tyrimo. Dauguma likusių bandymo nesėkmių buvo susijusios su maža vaisiaus frakcija, kurią galima išspręsti pakartojant mėginių ėmimą po savaitės ar dviejų nėštumo metu. MPSS veikimą patvirtino nepriklausoma laboratorija (3 pav.; „ETable B3“, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys, //links.lww.com/GIM/A213), naudojant originalius plazmos pavyzdžius ir plazmos DNR preparatus.

Dabartiniame tyrime buvo paimta daugybė mėginių (surinkimas, apdorojimas, užšaldymas ir gabenimas) iš 27 registracijos vietų; imituoja numatomą klinikinę praktiką. Mūsų išvados patvirtina MPSS efektyvumą plačiame gestacijos amžiuje, įvairiose rasinėse / etninėse grupėse, atsižvelgiant į bet kokį motinos amžių ir pagal visas diagnostinių tyrimų indikacijas (pvz., B23 brėžinys, B priedas, 1 papildomas skaitmeninis turinys 1, //links.lww.com/). GIM / A213). Kraujavimui iš makšties ar mėginio hemolizės veikimui įtakos neturi, todėl mėginio apdorojimo laikas yra iki 6 valandų. Dėl gerai aprašyto padidėjusio kraujo tūrio atskiedimo efekto 15 bandymų nesėkmių dažniau patiria sunkesnės moterys. Gali būti tikslinga atsižvelgti į vaisiaus frakciją. Apskritai, dauguma moterų, kurių atrankos rezultatai klaidingai teigiami, vengs invazinių testų, tuo tarpu beveik visi paveikti nėštumai bus užtikrintai diagnozuojami įprastomis invazinėmis priemonėmis. Šis tyrimas remia MPSS siūlymą moterims, kurioms nustatyta aukšta Dauno sindromo rizika, atsižvelgiant į testo sudėtingumą ir reikalingus išteklius. Jei tyrimai būtų atliekami mažiausiai du kartus per savaitę, 95% pacientų rezultatų apsisukimo laikas būtų palyginamas su šiuo metu prieinamu amniono skysčio ląstelių citogenetinei analizei ir chorioninio villus mėginių ėmimui. MPSS prieinamumas taip pat galėtų pateisinti mažesnį serumo / ultragarsinio patikrinimo ribų sumažėjimą, dėl ko būtų galima geriau nustatyti Dauno sindromą. Šiame tyrime pirmą kartą aprašomas būdingas kintamumas tarp srautinių elementų į srautinių elementų. Šių pokyčių apskaita pagerina klinikinius rezultatus. Kaip geriausiai atlikti tokius pakeitimus, reikia daugiau studijų.

Post hoc analizės rezultatas buvo mažesnis klaidingai neigiamas ir klaidingai teigiamas rezultatas, daugiausia dėl GC kiekio koregavimo. Tai yra tvirtas įrodymas, kad MPSS efektyvumas bus geresnis, kai bandymai bus pritaikyti praktikoje. Šis tyrimas taip pat pateikia įrodymų, kad MPSS gali būti paversta iš tyrimų į klinikinę aplinką esant pagrįstiems pokyčiams ir pralaidumui. Reikia atkreipti dėmesį į kai kuriuos įgyvendinimo klausimus. Naudingas būtų surinkimo vamzdelis, kurį būtų galima laikyti ir gabenti aplinkos temperatūroje nepažeidžiant DNR 16 be ląstelių lygio. Šiuo metu mėginiai turi būti apdorojami, užšaldomi ir gabenami ant sauso ledo, panašiai kaip ir mūsų tyrimo metu. Kadangi tai buvo stebėjimo tyrimas, pagrįstas demonstracinis projektas, įrodantis veiksmingumą klinikinėje aplinkoje. Reikia sukurti ir patvirtinti mokomąją medžiagą tiek pacientams, tiek paslaugų teikėjams, kad būtų lengviau priimti pagrįstus sprendimus. Papildomos problemos yra išlaidų kompensavimas ir atitinkamų profesinių gairių parengimas. Kai kurie teigė, kad vaisiaus DNR tyrimas sukelia naujų etinių klausimų. 17–19 Rekomenduojant nustatyti MPSS tikrinimą padidintos rizikos moterims, daugelis iš šių klausimų nėra svarbūs.

Pagrindinis prenatalinio patikrinimo tikslas buvo sumažinti invazinių procedūrų poreikį. 20 MPSS bandymų dar negali būti laikomi diagnostiniais. Tačiau, pasiūlius MPSS tyrimus moterims, kurioms jau yra didelė Downo sindromo rizika, galima sumažinti su procedūra susijusius nuostolius iki 96%, išlaikant aukštą nustatymą. Vis dar reikia patvirtinti invaziniais testais. Šis tyrimas, kartu su ankstesnėmis ataskaitomis, patvirtina aukštą našumą, tačiau mes papildome įrodymus atlikdami bandymus CLIA sertifikuotoje laboratorijoje, turėdami antrus alikvotus dėl pradinių gedimų, stebėdami apyvartos laiką, vertindami operatoriaus ir operatoriaus bei mašinos ir mašinos kintamumą, mėginio rezultatų pogrupio patvirtinimas nepriklausomoje akademinėje klinikinėje laboratorijoje ir medicinos genetiko / laboratorijos direktoriaus integravimas į ataskaitų teikimo procesą. Šioje ataskaitoje nenagrinėjami kiti chromosomų anomalijos 13 ar įvykiai, tokie kaip dvynių nėštumas. Tobulėjant technologijoms, tokie patobulinimai taps prieinami. Nors vis dar reikia išspręsti kai kuriuos įgyvendinimo klausimus, įrodymų pagrindu šį testą kliniškai reikia pradėti taikyti moterims, kurioms yra didelė Dauno sindromo rizika, prieš pradedant invazinius diagnostinius tyrimus.