Dominuojantis dmxl2 variantas yra susijęs su nesindrominiu klausos praradimu | genetika medicinoje

Dominuojantis dmxl2 variantas yra susijęs su nesindrominiu klausos praradimu | genetika medicinoje

Anonim

Dalykai

  • Ligos genetika
  • Genetinė variacija
  • Vidinė ausis
  • Neurologiniai sutrikimai

Anotacija

Tikslas:

Ištirti genetinę kurtumo etiologiją dominuojančioje šeimoje, turinčioje vėlyvą, progresuojančią, nesindrominę klausą.

Metodai:

Buvo atlikta genomo jungčių analizė 21 šeimos nariui. Kandidato patogeniški variantai buvo identifikuoti atrinktų šeimos narių seka visą egzomą ir patvirtinti visų šeimos narių Sangerio seka. Kochlearinė Dmxl2 ekspresija buvo tiriama atliekant atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją (RT-PGR) ir imuniniu būdu padengiant Corti organą iš pelių.

Rezultatai:

Priežastinis genas buvo suskirstytas į 9, 68 Mb kandidatės sritį 15q21.2 chromosomoje (maksimalus koeficiento logaritmas = 4, 03), kurioje nebuvo anksčiau aprašytų kurtumo genų. Viso egzomo sekos nustatymas nustatė, kad DMXL2 heterozigotinis c.7250G> A (p.Arg2417His) yra vienintelis patogeniškas kandidatas, atskiriantis klausą. Pelių košėje DMXL2 ekspresija buvo apribota plaukų ląstelėmis ir spiraliniais gangliniais neuronais.

Išvada:

Mūsų duomenys parodė, kad p.Arg2417His variantas DMXL2 yra susijęs su dominuojančiu, nesintetiniu klausos praradimu ir rodo svarbų DMXL2 vaidmenį vidinės ausies funkcijoje.

„Genet Med“ išankstinis internetinis leidinys 2016 m. Rugsėjo 22 d

Įvadas

Genetinės klausos praradimo priežastys priskiriamos patogeniniams variantams daugiau kaip 100 genų, turinčių įvairias funkcijas klausos sistemoje. Be to, priežastis liko neišspręsta daugiau nei 50 lokusų, genetiškai pažymėtų nesindrominės kurtumo atvejais (paveldimas klausos praradimas, //hereditaryhearingloss.org). Daugelio kurtumo genų, įskaitant WFS1 (MIM 606201), KARS (MIM 601421) ir TBC1D24 (MIM 613577), įvairių tipų patogeniniai variantai gali sukelti skirtingus fenotipus, pradedant nuo nesindrominio kurtumo iki sindrominio kurtumo ar su kurtumu nesusijusių sindromų.

DMXL2 koduoja rabconnectin-3α, rabconnectin baltymų komplekso α subvienetą, kuris sinapsėje koncentruojasi ant sinapsinių pūslelių ir vaidina svarbų vaidmenį neurosekrecijoje. 1, 2, 3 pagumburyje jis yra išreikštas tanicitų ir hipotalaminių neurosekrecinių neuronų eksocitozės pūslelėse. Sąlyginis vieno Dmxl2 alelio ištrynimas pelių neuronuose lėmė brendimą ir labai mažą vaisingumą. 4 Paveiktiems vientisos šeimos nariams homozigotinis 15 nukleotidų ištrynimas DMXL2 sukėlė progresuojančius endokrininės ir neurodevelopmental sutrikimus, įskaitant nepilną brendimą, centrinę hipotiroidizmą, periferinę polineuropatiją, protinį atsilikimą ir nenormalų gliukozės reguliavimą. 4 Vidinėse zebrafish ausyse rabconnectin-3α yra ekspresuojamas bazinėse plaukų ląstelių vietose, kur sinapsinės pūslelės yra praturtintos. Recesyvūs nesąmoningi patogeniniai zebrafish rabconnectin-3α geno rbc3a variantai sukėlė nenormalias klausos ir vestibuliarines disfunkcijas dėl netinkamo sinapsinių pūslelių parūgštinimo. 5

Iki šiol nė viena ataskaita nesiejo DMXL2 su sindrominiu ar nesindrominiu žmonių kurtumu. Šiame tyrime mes nustatėme heterozigotinį DMXL2 missense variantą, kuris buvo susijęs su dominuojančiu, nesindrominiu klausos praradimu didelėje kinų Han šeimoje.

Medžiagos ir metodai

Tiriamieji ir klinikinis vertinimas

Mes įdarbinome didelę kinų Hanų šeimą (šeima KH) iš Džedziango provincijos, Kinijos, turintys klausą, kurioje vyrauja autosominiai vyraujantys nesindrominiai klausos sutrikimai. Ši šeima apėmė septynias kartas ir turėjo bent 16 narių, kuriems iki 20 metų buvo sutrikusi klausa. Šiame tyrime dalyvavo vienuolika paveiktų ir 11 nepaveiktų narių ( 1a pav. ). Iš visų dalyvių buvo gautas informuotas sutikimas. Šiam tyrimui pritarė Šanchajaus Jiaotongo universiteto medicinos mokyklos Xinhua ligoninės etikos komitetas.

Image

KH šeimos kilmės, audiogramų ir sąsajų analizės rezultatai. a ) KH šeimos kilmė. Asmenys, atrinkti jungčių analizei ir viso egzomo sekos nustatymui, yra pažymėti atitinkamai žvaigždutėmis ir trikampiais. Proband II-1 žymimas rodykle. Trijų kandidato variantų (G: c.2155A> G, genotipai AP4E1 , NM_001252127; C: c.940T> C CYP19A1 , NM_000103; A: c.7250G> A, DMXL2 , NM_001174116) rodomi visiems šeimos nariams. „+“ Nurodo etaloninį alelį. Asmuo II-2, kuris patyrė pagrindinį rekombinacijos įvykį, yra pabrauktas. b ) paveiktų asmenų KH šeimoje audiogramos. c ) 15 chromosomos viso genomo jungčių analizės šansų (LOD) balų logaritmas. Didžiausias LOD balas buvo perskaičiuotas iki 4, 33, įtraukus trijų kandidatų variantų genotipus į II-2.

Visas dydis

Visų dalyvaujančių narių klausos lygis buvo matuojamas gryno tono audiometrija. Pažeistiems nariams buvo atlikta išsami ligos istorija ir fizinė apžiūra, siekiant atmesti aplinkos priežasčių ar sindromo silpnėjimo galimybę. Papildomi klausos vertinimai apėmė otoskopinį tyrimą, otoakustinę emisiją ir laikinojo kaulų didelės skyros kompiuterinės tomografijos skenavimą.

Viso genomo jungčių analizė

Daugiamačio genomo jungčių analizė atlikta 21 šeimos nariui (pažymėti žvaigždutėmis 1a paveiksle ) naudojant „HumanOmniZhongHua-8 BeadChip“ (Illumina, San Diegas, Kalifornija), turinčius 900 015 SNP žymenų. Švaraus koeficiento (LOD) balų logaritmui apskaičiuoti buvo pasirinkti 6301 etiketės SNP (pasiskirsčiusių kiekviename 0, 5 cM genomo srities) genotipai, naudojant Merlin v. 1.1.23 parametrinių sąsajų analizės paketą. Buvo manoma, kad paveldėjimo modelis dominuoja visapusiškai. Buvo manoma, kad ligos alelių dažnis yra 0, 0001.

Viso egzomo patogeniškų variantų seka ir tikrinimas

Viso egzomo sekos buvo atliktos trimis paveiktais (II-1, IV-1 ir IV-4) nariais ir vienu nepaveiktu (IV-6) nariu ( 1a paveiksle pažymėtais trikampiais), kaip aprašyta anksčiau. 20 794 genų (33, 2 Mb, 97, 2% konsensusą koduojančių egzonų), egzotinių mikroRNR ir kitų nekoduojančių RNR 6 egzonai ir juosiančios introninės sritys buvo užfiksuoti „Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit“ ir sekos surinktos naudojant „HiSeq 2000“ instrumentą (Illumina). Vaizdo analizė, klaidų įvertinimas ir bazinės iškvietos buvo atliekamos naudojant „Illumina Pipeline“ (1.3.4 versija). Skaitymai buvo suderinti su NCBI37 / hg19 rinkiniu, naudojant „BWA Multi-Vision“ programinės įrangos paketą. SNP ir indeliai buvo identifikuoti naudojant atitinkamai SOAPsnp programinę įrangą ir GATK Indel Genotyper. Kandidato patogeniniai variantai buvo apibrėžti kaip nesąmonė, nesąmonė, suskaidymo ir indelio variantai, kurių alelių dažnis yra ne didesnis kaip 0, 001, viešose variantų duomenų bazėse dbSNP ir 1000 genomai ir ankstesniuose sekos sekos duomenyse apie 1000 kinų hano suaugusiųjų kontrolę su normalia klausa (įmonėje). viso egzomo sekos duomenys naudojant tą pačią platformą).

Kandidato patogeniniai variantai buvo geografiškai nustatyti visiems 22 šeimos nariams, naudojant Sangerio seką. Galimas patogeniškas nustatyto varianto poveikis buvo įvertintas skaičiavimo priemonėmis, įskaitant „Mutation Taster“ (//www.mutationtaster.org), „PROVEAN“ ir SIFT (kurių ribos atitinkamai buvo −1, 3 ir 0, 05; //sift.jcvi.org). ).

Atvirkštinės transkriptazės PGR ir Dmxl2 imuninis dažymas pelių kochlejoje

Atliekant visos RNR, ekstrahuoto iš P1 ir P60 pelių košelių, panaudotą atvirkštinės transkriptazės PGR (RT-PGR), naudojant SuperScript vieno žingsnio RT-PGR sistemą („ThermoFisher Scientific“, Waltham, MA). Dxml2 41 ir 43 egzonuose bei 42 ir 44 egzonuose buvo suprojektuotos pirmyn ir atvirkštinės pradmenų poros, gaunančios atitinkamai 151 bp ir 279 bp PGR produktą. DMXL2 dažymas imunofluorescenciniu būdu buvo atliktas pelių Corti organo skerspjūvyje, kaip aprašyta anksčiau. 7 Trumpai tariant, pelių šermukšniai pirmą kartą buvo nuvalyti 0, 12 M EDTA pavidalu 1-2 dienas. Čiulptukas dehidratacijai buvo įterptas į 30% sacharozę, o po to - į UŠT per naktį, po to kriosekcionavimas į 8 μm storio griežinėlius. Audiniai ir stikleliai buvo inkubuojami pirminiame antikūnu, praskiestu PBS, turinčiame 0, 5% tritono, 5% asilo serumo ir 1% BSA, kambario temperatūroje per naktį ir aptikti naudojant rūšims būdingus Alexafluor konjuguotus antrinius antikūnus (ThermoFisher), praskiestus santykiu 1: 500. Visi vaizdai buvo tikrinami naudojant „Leica SP5“ konfokalinį mikroskopą. Antikūnai, naudojami šiame tyrime, buvo triušio anti-DMXL2 (ab122552, Abcam, Cambridge, MA), nustatantys tris pagrindines DMXL2 izoformas, triušio anti-MYOSIN VIIA (25–6790, Proteus, Ramona, CA) ir ožkos anti-SOX2 (sc. -17320, Santa Krusas, Dalasas, Teksasas). RT-PGR ir imuninio dažymo eksperimentai buvo atlikti trimis tiražais su C57BL / 6 pelėmis. Nebuvo naudojamas atsitiktinumas ir nebuvo naudojamas apakinimas.

Rezultatai

Fenotipo apibūdinimas

11 paveiktų KH šeimos narių audiogramos parodytos 1b paveiksle . Dvišalis, lengvas ar vidutinio sunkumo klausos praradimas prasidėjo antruoju gyvenimo dešimtmečiu ir per šeštąjį dešimtmetį laipsniškai vystėsi iki sunkaus iki gilaus. Paspaudimų sukeltos otoakustinės emisijos nebuvo visiems paveiktiems nariams. Laikino kaulo didelės skiriamosios gebos kompiuterinės tomografijos skenavimu vidinių ausų apsigimimų nenustatyta. Pažeisti nariai nepranešė apie jokius su vestibuliniu disfunkcija susijusius simptomus. Buvo nustatyta, kad klausa nėra nesindrominė, nes paveiktų asmenų organizme nepastebėta jokių papildomų anomalijų.

Šeimos padėties žemėlapis

Daugelio taškų viso genomo jungčių analizė, kurioje dalyvavo 10 paveiktų (paveiktas individas II-2 vėliau buvo įdarbintas ir nebuvo įtrauktas į jungties analizę) ir 11 nepaveiktų šeimos narių (pažymėti žvaigždutėmis 1a paveiksle ), sudarė 9, 68 Mb vietos kandidato intervalą chromosomoje. 15q21.2 tarp žymeklių rs16962243 ir rs8037652 ( 1c paveikslas ir papildoma S1 lentelė internete). Markerio rs11071224 atveju buvo gautas didžiausias LOD balas - 4, 03. Nė vienas iš pozicijos kandidato genų per šį intervalą nebuvo susijęs su sindrominiu ar nesindrominiu kurtumu, o tai reiškia, kad klausos praradimą greičiausiai sukėlė naujas kurtumo genas.

Su klausos praradimu susijusio varianto identifikavimas

Viso egzomo sekos nustatymui buvo pasirinkti trys paveikti nariai ir vienas nepaveiktas narys (pažymėti trikampiais 1a paveiksle ). Visų keturių asmenų vidutinis gylis buvo didesnis nei 100 ×, o tikslinių regionų, kuriems taikoma 10 ar daugiau kartų, procentinė dalis buvo didesnė nei 89, 0%. Laikantis 15q21.2 chromosomos kandidato intervalo, 92, 3% tikslinio regiono buvo uždengti 10 ar daugiau skaitymų, o likę 7, 7% blogai uždengto regiono buvo tikrinami naudojant Sangerio seką. Trims paveiktiems asmenims buvo nustatyti trys patogeniškų variantų kandidatai, visi esantys 15q21.2 chromosomos pozicijos intervale, bet ne paveiktiems asmenims ( papildoma S1 lentelė internete). Sanger sekos nustatymas kitiems šeimos nariams, ypač atskiram II-2 (pabrauktas 1a paveiksle ), kuris vėliau buvo įdarbintas ir nebuvo įtrauktas į sąsajų analizę, parodė, kad vienintelis variantas, išsiskiriantis su klausos praradimu, buvo c.7250G> A (p.Arg2417His) DMXL2 29 egzone (NM_001174116, perskaičiuotas maksimalus LOD balas = 4, 33; 1a pav. ). Prognozuojama, kad šis p.Arg2417H variantas pakeis labai konservuotą Arg2417 liekaną tarp Rav1p_C domeno ir DMXL2 C-terminalo WD domenų ( 2 paveikslas ), o Mutacijos degustatorius numatė, kad jis bus žalingas (numatymo balas = 0, 999), PROVEAN ( numatymo balas = -2, 86) ir SIFT (numatymo balas = 0, 027) skaičiavimo įrankiai. Exome agregacijos konsorciumo (ExAC) duomenų bazėje jo mažas alelių dažnis yra 0, 00003 (4 iš 121 174 alelių) ir jo nebuvo 1000 1000 etniškai suderintų suaugusiųjų kontrolėje su normalia klausa (vidutinis ir mažiausias NGS gylis buvo 52, 4 × ir 42, 5 ×, atitinkamai varianto vietoje).

Image

P.Arg2417His variantas DMXL2 . a ) Variantų ir pamatinių sekų chromatogramos. b ) DMXL2 Arg2417 liekanų išsaugojimas Homo sapiens , Mus musculus , Bos taurus , Canis lupus , Gallus gallus ir Danio rerio . c ) DMXL2 baltymo domeno struktūra nurodant rodyklę p.Arg2417H varianto vietą. Žaliosios dėžutės: WD domenai; purpurinė dėžutė: „Rav1p_C“ domenas.

Visas dydis

Kochlearinė pelės Dmxl2 išraiška

Norėdami išsamiau išaiškinti DMXL2 vaidmenį klausoje, mes ištyrėme Dmxl2 raišką pelių kochlejoje . RT-PGR parodė Dmxl2 raišką bendroje RNR, ekstrahuotoje iš P1 ir P60 pelių kochlejų ( 3a pav. Ir papildomas S1 paveikslas internete). Atliekant Corti organo P1, P6 ir P60 kriosekcijas , vidiniame ir išoriniame plaukų ląstelėse bei spiraliniuose gangliniuose neuronuose buvo galima aptikti ribotą imunofluorescencinį Dmxl2 dažymą ( 3b, c paveikslai ir duomenys nepateikti). . Įdomu tai, kad plaukų ląstelėse stebimas imuninis dažymas buvo pastebimai praturtintas ties plaukų ląstelių bazine sritimi ir spiralinių ganglinių neuronų, esančių į plaukų ląsteles, neurofilamento galūne, kas rodo, kad DMXL2 gali veikti presinapsinėje ir postsinapsinėje plaukų ląstelių inervacijos pusėse.

Image

Dmxl2 išraiška pelių kochleoje . ( a ) RT-PCR, parodantis Dmxl2 (151 bp ir 279 bp PCR produktų) ekspresiją bendroje RNR, ekstrahuotoje iš P1 pelių kochlejos. Pelės uodegos genomo DNR buvo naudojama neigiamoms kontrolėms. ( b ) C600 C6 organo imuninis dažymas iš pelių, rodančių DMXL2 (žalią) ekspresiją spiraliniuose gangliniuose neuronuose. c ) DMXL2 ekspresija išorinėse plaukų ląstelėse (OHC) ir vidinėse plaukų ląstelėse (IHC), taip pat spiralinių ganglinių neuronų skaidulose. Raudona: SOX2 dažymas žymi atramines ląsteles. Mėlyna: ląstelių branduolių dažymas DAPI. Strypai, 25 μm.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes pateikėme genetinius įrodymus, patvirtinančius, kad p.Arg2417His variantas DMXL2 yra susijęs su dominuojančiu, nesintetiniu klausos praradimu, įskaitant: (i) sąsajų analizę, nustatant 9, 68 MB pozicijos kandidato intervalą 15q21, 2 chromosomoje (maksimalus LOD). balas = 4, 33), kuriame yra DMXL2 ; (ii) viso egzomo sekos nustatymas nustatė, kad heterozigotinis p.Arg2417H yra DMXL2 kaip vienintelis patogeninis variantas kandidatas, išsiskiriantis su klausos praradimu KH šeimoje; (iii) p.Arg2417H variantas pakeitė labai konservuotą DMXL2 aminorūgštį, pasižymi ypač mažu alelių dažniu (0, 00003 ExAC duomenų bazėje, jo nėra 1000 etniškai suderintų normalios klausos kontrolės priemonių) ir, kaip prognozavo Mutation Taster, padarė žalingą., PROVEAN ir SIFT skaičiavimo įrankiai; ir (iv) Dmxl2 mRNR ir baltymų ekspresija pelėse atitinka jo vaidmenį klausoje. Tačiau dabartiniame tyrime naudojamas viso egzomo sekos nustatymo metodas turi keletą apribojimų: (i) nebuvo apimti nekoduojantys regionai; ii) maždaug 10% tikslinių kodavimo regionų yra žemiau 10 x skaitymo gylio; ir iii) kopijų skaičių variantų negalima patikimai aptikti. Todėl išlieka galimybė, kad priežastinio varianto nepavyko nustatyti atliekant viso egzomo seką ir kad DM.L2 p.Arg2417H variantas gali būti pusiausvyros sąsajoje tik su tikruoju priežastiniu variantu.

Iki šiol buvo pranešta apie homozigotinį 15 bp kadrų ištrynimą rėmelyje (c.5824_5838del / p.1942_1946del) DMXL2 grupėje , kuri sukėlė naujai klasifikuotą sindromą, įskaitant gonadotropinės ašies trūkumą, centrinę hipotiroidizmą, periferinį demielinizuojantį sensorimotorį. polineuropatija, intelekto negalia ir gili hipoglikemija, progresuojanti iki nonautoimuninio nuo insulino priklausomo cukrinio diabeto. 4 Vis dėlto nukentėjusiems asmenims šioje šeimoje nebuvo klausos praradimo. Kraujo limfocitų kiekybinis RT-PGR parodė, kad dėl homozigotinės p.1942_1946del mutacijos 75% sumažėjo DMXL2 mRNR lygis. KH šeimoje sergantys asmenys neturėjo jokių gonadotropinių ir neurodegramentinių anomalijų, išskyrus vėlyvą, progresuojantį klausos praradimą. Skirtingi fenotipai leidžia manyti, kad heterozigotinis p.Arg2417H variantas greičiausiai susijęs su nesindrominiu klausos praradimu dėl funkcijos padidėjimo ar dominuojančio-neigiamo mechanizmo, konkrečiai veikiančio vidinės ausies funkciją.

Mūsų žiniomis, mūsų žiniomis, pirmasis atskleidė DMXL2 kaip su kurtumu susijusį geną žmonėms. Nuosekliai buvo įrodyta, kad rbc3α, zebrafish DMXL2 ortologas, buvo lokalizuotas baziniame zebrafish plaukų ląstelių regione ir kad mutantiniai rbc3α aleliai, išskirti iš didelio masto ekrano, turėjo klausos ir vestibuliarinius defektus zebrafish. 5 Mutantinės zebrafish plaukų ląstelėse sinapsinių pūslelių pH buvo padidėjęs, o V-ATPazės citozolinis V1A subvienetas nebebuvo praturtintas sinapsinėmis sritimis, tai rodo, kad Rbc3α moduliuoja sinapsinį pernešimą plaukų ląstelėse skatindamas V-ATPazės aktyvumą ir rūgštėjimą. sinapsinių pūslelių. Mūsų tyrime DMXL2 imuninis dažymas Corti organe iš pelių taip pat parodė plačią ekspoziciją plaukų ląstelių bazinėje srityje, kur yra sinapsinės pūslelės ( 3c paveikslas ). Įdomu tai, kad stipri Dmxl2 ekspresija taip pat buvo nustatyta spiralinių ganglinių neuronų, išsikišusių į plaukų ląsteles, neurofilamentinėse galūnėse ( 3b pav., C ), kas rodo, kad DMXL2 gali veikti ir postsinapsinėse plaukų ląstelių inervacijos pusėse. Mūsų rezultatai atitiko anksčiau pateiktus pelės vidinės ausies genų ekspresijos duomenis, kurie parodė, kad Dxml2 buvo praturtintas plaukų ląstelėse 3, 86 karto (klaidingo atradimo dažnis <0, 05) ir buvo išreikštas spiralinėse ir vestibulinėse ganglijose. 8, 9

Apibendrinant galima pasakyti , kad mūsų tyrimas nustatė, kad DMXL2 yra naujas genas kandidatas į žmogaus kurtumą, o tai gali suteikti naujų žinių apie klausos ir klausos sutrikimų molekulinį mechanizmą. Norint išsamiau ištirti jo vaidmenį plaukų ląstelių sinapsinėse mechanizmuose ir postsinapsinius nervų kelius, reikalingi DMXL2 funkciniai tyrimai.

Atskleidimas

Autoriai teigia, kad interesų konflikto nėra.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

  2. 2.

    Papildoma S1 lentelė