Dvigubas bakso ir bako išmušimas iš proksimalinių inkstų kanalėlių sumažina vienašališką šlaplės obstrukciją, susijusią su apoptoze ir inkstų intersticine fibroze | mokslinės ataskaitos

Dvigubas bakso ir bako išmušimas iš proksimalinių inkstų kanalėlių sumažina vienašališką šlaplės obstrukciją, susijusią su apoptoze ir inkstų intersticine fibroze | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Inkstų ligos
  • Obstrukcinė nefropatija

Anotacija

Intersticinė fibrozė, dažnas lėtinių inkstų ligų patologinis požymis, dažnai siejama su inkstų audinių apoptozė. Norėdami nustatyti susijusį apoptozinį kelią ir jo vaidmenį inkstų intersticinėje fibrozėje, mes sukūrėme pelės modelį, kuriame Bax ir Bak, du kritiniai genai, esantys vidiniame apoptozės kelyje, buvo pašalinti iš inkstų proksimalinių kanalėlių ir naudojo šį modelį inkstų apoptozės tyrimui. ir intersticinė fibrozė po vienašalio šlaplės obstrukcijos (UUO). Parodyta, kad dvigubas Bax ir Bak išmušimas iš proksimalinių kanalėlių susilpnino inkstų kanalėlių ląstelių apoptozę ir slopino inkstų intersticinę fibrozę UUO. Rezultatai rodo, kad vidinis apoptozės kelias smarkiai prisideda prie kanalėlių apoptozės ir inkstų intersticinės fibrozės inkstų ligose.

Įvadas

Inkstų intersticinė fibrozė yra dažnas patologinis požymis inkstų ligai progresuojant iki inkstų nepakankamumo stadijos 1, 2 . Nors inkstų intersticinė fibrozė pasižymi intersticinio miofibroblastų aktyvavimu ir plėtimu bei masiniu tarpląstelinio baltymo kaupimuisi baltyme 3, inkstų ląstelių fibrozė dažnai būna inkstų ląstelių sužalojimas ir mirtis bei uždegimas. Iš tikrųjų buvo teigiama, kad inkstų ląstelių žūtis ir uždegimas gali prisidėti prie inkstų intersticinės fibrozės išsivystymo. Tačiau nėra visiškai suprantama, ar inkstų kanalėlių apoptozė yra pagrindinis intersticinės fibrozės veiksnys, ir, jei ji yra, koks apoptozės kelias yra atsakingas.

Yra du pagrindiniai apoptozės keliai 4 . Išorinį kelią inicijuoja mirties receptoriai, pvz., Fas ir TNFα receptoriai, surišantys mirties ligadais, sukeliančiais kaspazės-8 ir paskesnių mirties bausmės vykdytojų kaspazių aktyvaciją. Atvirkščiai, vidinis kelias sutelktas į mitochondrijas ir todėl dažnai vadinamas mitochondrijų apoptozės keliu. Vidinis kelias apibūdinamas kaip mitochondrijų išorinės membranos prasiskverbimas, sukeliantis apoptogeninių veiksnių, ypač citochromo c, išsiskyrimą, kurie skatina kaspazės-9 ir pasrovės kaspazių 5, 6 aktyvaciją. Baxas ir Bakas yra pagrindiniai proapoptotiniai Bcl-2 šeimos baltymai, kurie yra aktyvinami vidiniame kelyje, permeabilizuojant mitochondrijų išorinę membraną, kad būtų apoptozė 7 . Ankstesniame mūsų darbe buvo nustatytas kritinis Bax ir Bak vaidmuo inkstų ląstelių apoptozėje eksperimentiniuose ūminio inkstų pažeidimo, kurį sukelia išemija / reperfuzija ir cisplatinos nefrotoksiškumas, modeliuose 5 .

Šiame tyrime mes sukūrėme specifinį Bax / Bak dvigubo išmušimo pelių modelį, kuriame yra inkstų kanalėliai, ir išbandėme „Bax / Bak“ dvigubo išmušimo poveikį kanalėlių apoptozei ir inkstų intersticinei fibrozei vienpusio šlaplės obstrukcijos (UUO) modelyje.

Rezultatai

Ankstesniame darbe mes parodėme, kad išeminis ūminis inksto pažeidimas palengvėjo proksimalinių inkstų kanalėlių „Bax“ išmušimo pelėms [PT-Bax (- / -)] pelėms ir visuotinėms Bak nokauto [Bak (- / -)] pelėms, palaikant kritinį vaidmenį iš Bax / Bak tarpininkaujamo mitochondrijų apoptozės kelio 5 . Tačiau Baxo ir Bako vaidmuo lėtinėje inkstų patologijoje, pavyzdžiui, UUO, nebuvo visiškai aiškus. Norėdami tai išspręsti, pirmiausia sukūrėme „Bax“ („flox“ / „flox“) Bak (WT / WT) X CRE X peles, veisdami „Bax“ (flox / flox) Bak (WT / WT) XY ir „Bax“ (WT / WT) Bak (WT / WT). ) X CRE X CRE (PEPCK-CRE) pelės. Tada mes atgal sukryžiavome Bax (flox / flox) Bak (WT / WT) X CRE X peles su Bax (WT / WT) Bak (flox / flox) XY pelėmis 2 kartoms, kad gautume proksimaliniam kanalėliui būdingą Bax / Bak dvigubą nokautą. (PT-Bax / Bak-DK) pelės (1A pav.). Be genotipo rezultatų (neparodyta), Bax ir Bak išeikvojimas proksimalinėse kanalėlių ląstelėse PT-Bax / Bak-DK pelėse buvo patvirtintas ir Western blot analize (1 pav. B). Pažymėtina, kad PT-Bax / Bak-DK pelių inkstų žievės audiniuose buvo likusių Bax ir Bak signalų, nes proksimaliniuose kanalėliuose buvo ribojamas nokautas ir Bax ir Bak ekspresija kituose ląstelių tipuose nebuvo paveikta.

Image

( A ) Schema, rodanti veisimo protokolą, kaip generuoti PT-Bax / Bak-DK peles sukryžminant Bax (flox / flox) Bak (WT / WT) X CRE X peles su Bax (WT / WT) Bak (flox / flox) XY pelės. ( B ) Inkstų žievės audinių imunoblotų analizė, siekiant patvirtinti Bax ir Bak ekspresijos sumažėjimą PT-Bax / Bak-DK pelėse.

Visas dydis

Dvigubas kanalėlių Bax ir Bak išmušimas slopina UUO sukeltą inkstų apoptozę

UUO yra dažniausiai naudojamas inkstų fibrozės tyrimų modelis. Patologiniai UUO pokyčiai apima kanalėlių pažeidimus ir mirtį, fenotipinius inkstų ląstelių pakitimus ir intersticinį uždegimą 8 . Tirpalu TUNEL aptikę mažiau apoptozinių ląstelių PT-Bax / Bak-DK inkstų audiniuose nei WT inkstų audiniuose po UUO 4, 7 ir 14 dienų (2A ir B pav.), Rodo vamzdinių Bax ir Bak vaidmenį apoptozėje UUO.

Image

PT-Bax / Bak-DK ir vadinamosioms WT pelėms (10–12 savaičių amžiaus) buvo atlikta UUO arba fiktyvi chirurgija, o paskui paaukojo, kad surinktų inkstus atitinkamai per 4, 7 ir 14 dienų. ( A ) TUNEL dažymo tipiniai vaizdai. ( B ) TUNEL teigiamų ląstelių kiekybinis įvertinimas inkstų audiniuose. Duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± SD. * P <0, 05, reikšmingas skirtumas tarp WT ir PT-Bax / Bak-DK grupių.

Visas dydis

Dvigubas kanalėlių Bax ir Bak išmušimas palengvina su UUO susijusią inkstų fibrozę

Norėdami išaiškinti Bax ir Bak genų išmetimo poveikį inkstų intersticinei fibrozei, mes aptikome kolageno nusėdimą pagal Masson trichromo dažymą ir fibrozinių požymių baltymų ekspresiją 9, 10 . Kaip parodyta 3 pav., UUO metu padidėjo mėlynojo Masson trichromo dažymas. Svarbu tai, kad laukinio tipo audiniuose aiškiai matomas didesnis Masson trichromo dažymas nei PT-Bax / Bak-DK inkstų audiniuose inkstų intersticiniame srityje 7 ir 14 UUO dienų, tačiau nepastebimas skirtumas per 4 UUO dienas (3A ir B pav.) . Nuosekliai, po 7 dienų ir 14 dienų UUO, PT-Bax / Bak-DK inkstų audiniuose buvo fibronektino, fibrozinio ir ECM žymens, žymiai mažesnis nei laukinio tipo audiniuose (4 pav.). Kito ECM baltymo kolageno IV ekspresija taip pat buvo mažesnė PT-Bax / Bak-DK inkstų audiniuose po 14 dienų UUO, nors skirtumo tarp audinių nebuvo nustatyta per 7 dienas. Panašiai, α-SMA, būdingo miofibroblastų 11 baltymo žymeklio, raiška taip pat buvo slopinama 14 dienų UUO vartojant PT-Bax / Bak-DK pelėms (4 pav.). Šie rezultatai rodo, kad tiek Bax, tiek Bak abliacija palengvina ECM ir fibrotinių baltymų nusėdimą, inkstų intersticinės fibrozės požymius.

Image

PT-Bax / Bak-DK ir vadinamosioms WT pelėms (10–12 savaičių amžiaus) buvo atlikta UUO arba fiktyvi chirurgija, o paskui jie paaukojo, kad per inkstus būtų surinktos per 4, 7 ir 14 dienų parafino įdėjimui ir Masson trichromo dažymui. ( A ) Tipiški Masson trichromo dažymo vaizdai. ( B ) Masson trichromo teigiamų sričių kiekybinis įvertinimas visame inkstų audinio lauke. Duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± SD. * P <0, 05, reikšmingas skirtumas tarp WT ir PT-Bax / Bak-DK grupių.

Visas dydis

Image

PT-Bax / Bak-DK ir vadinamosioms WT pelėms (10–12 savaičių amžiaus) buvo atlikta UUO arba fiktyvi chirurgija, o paskui jie paaukojami, kad surinktų inkstus po 4, 7 ir 14 dienų. ( A ) Fibronektino, α-SMA, IV kolageno ir ciklofilino B inkstų audinių imunoblotų analizė (įkrovos kontrolė). ( B ) Fibronektino, α-SMA ir kolageno IV imunoblotinių signalų densitometrinės analizės santykis su ciklofilinu B. Duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± SD. * P <0, 05, reikšmingas skirtumas tarp WT ir PT-Bax / Bak-DK grupių.

Visas dydis

Diskusija

Apoptozė, kaip užprogramuota ląstelių žūties forma, įvyksta vystymosi ir patogenezės po vystymosi metu. Ypač tada, kai audiniai ar organai yra patologinėse situacijose, tokiose kaip išemija, hipoksija, toksiškumas ir metabolinis stresas, ląstelės gali patirti 5, 12, 13 apoptozę. Nemažai įrodymų parodė du pagrindinius apoptozės kelius: išorinį ir vidinį. Bax ir Bak yra du proapoptotiniai Bcl-2 šeimos baltymai, turintys keturis BH (Bcl-2 homologija) domenus 14, 15, 16 . Paprastai Baksas gyvena ląstelių citozolyje, tuo tarpu Bakas yra konstituciškai ekspresuojamas mitochondrijose. Kai ląstelės patiria stresą, Bax yra suaktyvinamas, kad persikeltų į mitochondrijas, ir bendradarbiauja su Bak, kad sukeltų mitochondrijų išorinės membranos permeabilizaciją, kad išsiskirtų apoptogeniniai veiksniai, įskaitant citochromą c, kad suaktyvintų vidinį apoptozės kelią. Nesant Baxo ir Bako, su stresu susijusi apoptozė sumažėja, o tai palaiko kritinį Baxo ir Bako vaidmenį išoriniame apoptozės kelyje 17, 18 . Inkstuose mūsų ankstesnis darbas parodė Bax aktyvaciją sergant cisplatinos sukeltu ūminiu inksto sužalojimu ir parodė, kad Bax pašalinimas iš lytinių ląstelių gali sumažinti cisplatinos sukeltą inkstų apoptozę pelėms 19 . Be to, mes pademonstravome kritinį Bax ir Bak vaidmenį išeminėje AKI, naudojant globalų ir proksimalų kanalėlėms būdingą išmuštos pelės modelį 5 . Tame tyrime pastebėjome, kad visuotinis Bax nokautas neapsaugojo išeminės AKI dėl padidėjusio neutrofilų infiltracijos, tačiau proksimaliniam kanalėliui būdingas Bax išmušimas galėtų pagerinti išeminę AKI. Atvirkščiai, visuotinis Bak nokauto pelių modelis parodė apsauginį išeminės AKI poveikį išsaugodamas mitochondrijų dinamiką ir vientisumą 5 . Pažymėtina, kad Bax ir Bak nokauto pelės susilpnino išeminės AKI apoptozę nepaveikdamos kanalėlių nekrozės 5, ir tai rodo specifinį Bax ir Bak vaidmenį reguliuojant inkstų apoptozę. Nepaisant šių tyrimų, Baxo, Bako vaidmuo ir vidinis apoptozės kelias lėtinėmis inkstų ligų sąlygomis išlieka mažiau aiškūs. Šiame tyrime mes sukūrėme pelės dvigubo Bax ir Bak išmušimo iš proksimalinių inkstų kanalėlių modelį ir panaudojome šį modelį, kad parodytų vidinio apoptozės kelio vaidmenį UUO susijusioje apoptozėje ir intersticinėje fibrozėje.

Kokį vaidmenį kanalėlių apoptozė vaidina fibrozėje ir inkstų patologijose, sergant CKD ar lėtinėmis inkstų ligomis? Johnsonas ir Dipietro parodė, kad apoptozė turėjo įtakos organų fibrozės inicijavimui ir plitimui tiesiogiai ar netiesiogiai 20 . Netiesiogiai apoptozė gali sukelti uždegimą, kad stimuliuotų fibrozę. Šiuo atžvilgiu po aktyvavimo makrofagai gali išskirti profibrotinius citokinus ir augimo faktorius, tokius kaip naviko nekrozės faktorius α (TNFα), interleukinas (IL) -6, IL-10 ir transformuojantis augimo faktorius β1 (TGF-β1) 21, 22 . Kita vertus, apoptozinės ląstelės gali tiesiogiai paveikti fibroblastines ląsteles ir miofibroblastus, kad padidintų jų proliferaciją ir aktyvaciją į 3, 23, 24, profibrotinius fenotipus. Mūsų tyrime apoptotines ląsteles aptikome laukinio tipo inkstų audiniuose, dažniausiai išorinėje medulės juostoje, pradedant nuo UUO 4 dienos ir palaipsniui didėjant po UUO 7 dienų ir 14 dienų. Palyginti su laukinio tipo, PT-Bax / Bak-DK audiniuose kiekviename laiko taške po UUO atsirado mažiau apoptozinių ląstelių. Kartu su apoptozė, laukinio tipo audiniuose nuolat didėjo inkstų fibrozė, kuri taip pat buvo slopinama pelėms PT-Bax / Bak-DK, rodančioms kanalėlių ląstelių apoptozės ir intersticinės fibrozės koreliaciją (3A ir B pav.). Šie rezultatai kartu su neseniai atliktu tyrimu 25 patvirtina kanalėlių ląstelių apoptozės vaidmenį fibrogenezėje tarpskiltyje. Pažymėtina, kad mūsų tyrime UUO metu buvo likusi apoptozė PT-Bax / Bak-DK pelėse (2 pav.). Viena galimybė yra tai, kad be Bax / Bak tarpininkaujamo mitochondrijų kelio, kiti kanalų apoptozės keliai, pvz., Mirties sąlygojamas išorės kelias, taip pat gali prisidėti prie kanalėlių ląstelių apoptozės UUO. Taip pat buvo tikimasi, kad PT-Bax / Bak-DK modelyje Bax ir Bak abliacija įvyks 70–80% proksimalinių kanalėlių ląstelių dėl PEPCK-Cre ekspresijos 26 efektyvumo, o likę 20–30% ląstelių vis dar buvo Baksas ir Bakas už apoptozę. Galiausiai, kai kuri likusi apoptozė gali atsirasti kitų tipų ląstelėse, tokiose kaip distaliniai kanalėliai.

Apibendrinant, šis tyrimas nustatė proksimalinių inkstų kanalėlių Bax / Bak dvigubo išmušimo pelių modelį. Naudodamiesi šiuo modeliu, mes parodėme Bax / Bak tarpininkaujamo būdo vaidmenį inkstų apoptozėje UUO metu. Mes taip pat manome, kad inkstų kanalėlių apoptozė prisideda prie intersticinės fibrozės.

Medžiagos ir metodai

Gyvūnai

Pelių linija su nuplėštu Bax genu iš pradžių buvo gauta iš daktaro Stanley Korsmeyerio iš Dana-Farber vėžio instituto (Bostonas, MA) 27 . Pelės su floksuotu Bak genu buvo pagamintos mūsų laboratorijoje standartine transgenine procedūra. Abiejų pelių linijų fonas yra mišrus 129 ir C57BL / 6. PEPCK-CRE pelių liniją maloniai pateikė dr. Volkeris Haase'as iš Vanderbilto universiteto medicinos mokyklos (Našvilis, TN) 26 . Šios pelės buvo sukryžiuotos kelioms kartoms, kaip pavaizduota 1A pav., Kad gautų inkstų proksimalinius kanalėlių-Bax / Bak dvigubo išmušimo peles (PT-Bax / Bak-DK) ir laukinio tipo peles (WT). Pelių genotipai buvo patikrinti naudojant PGR pagrįstą genotipą. Šiame tyrime buvo naudojami 10–12 savaičių vyrai. Visi gyvūnai buvo prižiūrimi Charlie Norwood VA medicinos centre 12 valandų šviesos / 12 valandų tamsumo modeliu, laisvai pasiekiant maistą ir vandenį. Visi eksperimentai buvo atlikti pagal protokolą, patvirtintą Gyvūnų priežiūros ir naudojimo instituto komiteto Charlie Norwood VA medicinos centre, Augusta, GA.

Regentai

Pirminių antikūnų šaltiniai buvo šie: Fibronektinas, α-SMA, Kolagenas Ι ir Kolagenas IV buvo įsigyti iš „Abcam“ (Kembridžas, MA), o β-aktinas - iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO). Visi antrieji antikūnai buvo įsigyti iš „Jackson Immuno Research Laboratories Inc“ (West Grove, PA). Paraformaldehidas buvo iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO).

Gyvūnų chirurgija

PT-Bax / Bak-DK ir WT pelės buvo anestezuojamos injekcijomis į pilvaplėvės ertmę 60 mg / kg pentobarbitalio. Kankinimui palengvinti po operacijos buvo suleista 0, 05 mg / kg buprenekso. Operacijos metu pelės buvo laikomos ant kontroliuojamos temperatūros operacinio stalo, kad palaikytų kūno temperatūrą. Kairysis šlapimtaklis buvo išpjaustytas ir perrišamas 4, 0 šilko dviem taškais išilgai ilgio, tuo tarpu fiktyvioms grupėms buvo taikoma ta pati procedūra, išskyrus šlapimtakių ligavimą. Po 4, 7, 14 dienų UUO pelės buvo paaukotos, o inkstai buvo paimti patologinei ir imunoblotologinei analizei atlikti.

Imunobloto analizė

Inkstų audinio lizatai buvo ekstrahuojami 2% SDS buferiu, kaip anksčiau 28 . Baltymų kiekiai buvo nustatyti naudojant „Thermo Scientific“ BCA rinkinį ir vienodi baltymų kiekiai buvo įpilti į kiekvieną juostą SDS-poliakrilamido elektroforezei atlikti ir perkeliami į PVDF membraną. Blotas užblokuotas 5% pieno 1 valandą kambario temperatūroje ir inkubuotas su specifiniu pirminiu antikūnu. Blotuota membrana buvo plaunama TBST 4 kartus, po to inkubuojama su krienų peroksidaze konjuguotu antriniu antikūnu, o signalai buvo atskleisti naudojant chemiliuminescencijos rinkinį („Thermo Scientific“).

Masson trichrominis fibrozės dažymas

Inkstų fibrozė buvo nustatyta dažant Masson trichromu pagal standartinį protokolą, kaip aprašyta neseniai 29 . Trumpai, audinys buvo nudažytas hematoksilinu, o po to - raudonojo skystojo skysčio dažų rūgščių kompleksu, po to inkubuojamas su fosfomolibdino rūgšties tirpalu. Galiausiai audinys buvo tiesiogiai nudažytas mėlynu anilino skysčiu ir acto rūgštimi. Masson dažymo teigiamas plotas procentais buvo nustatytas 10–20 mikroskopinių laukų kiekvienam mėginiui, o ImageJ buvo naudojamas kiekybiniam įvertinimui.

TUNEL tyrimas

TUNEL tyrimas buvo atliktas naudojant „Roche“ in situ ląstelių mirties aptikimo rinkinį, kaip anksčiau 29, 30 . Parafinu įterptas audinys buvo deparafinuotas ir permeabilizuotas 0, 1 M natrio citrato, pH 6, 0, 65 ° C temperatūroje 1 valandą. Tada audinio dalis buvo inkubuota su TUNEL reakcijos buferiu 1 valandą 37 ° C temperatūroje, drėgnoje kameroje. Skaidrės buvo sumontuotos naudojant „ProLong Antifade Reagent“. Teigiamas dažymas buvo aptiktas „Axioplan2“ fluorescenciniu mikroskopu. Kiekvienoje audinio dalyje atsitiktine tvarka buvo parinkta 10–20 laukų, kad būtų galima suskaičiuoti teigiamas dažymo ląsteles.

Statistinė analizė

Visos vertės buvo išreikštos kaip vidurkis ± SD. Dviejų grupių palyginimas buvo atliktas suporuotas Studentų t-testas arba neporinis studentų t-testas. ANOVA buvo naudojami palyginti kelias grupes. Duomenys buvo analizuojami naudojant programinės įrangos paketą „Prism 6.0“ (San Diegas, CA). Svarba buvo įvertinta pagal P vertę <0, 05.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį: Mei, S. et al . Dvigubas Bax ir Bak išmušimas iš proksimalinių inkstų kanalėlių sumažina vienašališką šlaplės obstrukciją, susijusią su apoptoze ir inkstų intersticine fibroze. Mokslas. Rep. 7, 44892; „doi“: 10.1038 / srep44892 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.