Dpp6 dendritinės morfogenezės reguliavimas daro įtaką hipokampo sinapsinei raidai gamtos komunikacijos

Dpp6 dendritinės morfogenezės reguliavimas daro įtaką hipokampo sinapsinei raidai gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Morfogenezė
  • Sinapsinis vystymasis

Anotacija

Dipeptidil-peptidazė 6 yra pagalbinis Kv4 sąlygojamų A tipo K + kanalų subvienetas, kuris, be to, kad pagerina kanalo paviršiaus išraišką, galimai pagreitina jų kinetiką. Dipeptidil-peptidazės 6 genas buvo susijęs su daugeliu žmogaus centrinės nervų sistemos sutrikimų, įskaitant autizmo spektro sutrikimus ir šizofreniją. Čia mes panaudojame dipeptidil-peptidazės 6 numušimą ir genetinį ištrynimą, kad atskleistume jo svarbą dendritinės filopodijos formavimuisi ir stabilumui ankstyvojo neuronų vystymosi metu. Mes nustatėme, kad hipokampo neuronai, kuriuose nėra dipeptidil-peptidazės 6, turi retesnį dendritinį išsišakojimo modelį ir mažiau stuburų per visą vystymąsi ir suaugus. Atlikdami elektrofiziologinius ir vaizdinius eksperimentus, parodėme, kad šie trūkumai sukelia mažiau funkcinių sinapsių ir atsiranda nepriklausomai nuo kalio kanalo Kv4.2 subvienetų. Mes pranešame, kad dipeptidil-peptidazė 6 sąveikauja su tarpląsteliniu miozinu, taip pat su fibronektinu tarpląstelinėje matricoje. Taigi dipeptidil-peptidazė 6 vaidina netikėtą, bet svarbų vaidmenį ląstelių adhezijoje ir judrume, darydama įtaką hipokampo sinapsių raidai ir funkcijai.

Įvadas

A tipo įtampos K + srovės hipokampo CA1 piramidiniuose neuronuose slopina veikimo potencialo pradžią ir dažnį. Dėl didelės ekspresijos ir hiperpoliarinės įtampos aktyvavimui dendrituose, jie kontroliuoja veikimo potencialo atgalinį išsiskyrimą į dendritus, prisidedant prie sinapsių integracijos ir plastiškumo 1 . Somatodendritiniai A tipo K + kanalai CA1 hipokampo piramidiniuose neuronuose visų pirma yra sudaryti iš poras sudarančių Kv4.2 subvienetų 2, 3, kuriuose vyksta veikla, priklausanti nuo hipokampo neuronų 4 . Natūralioms A srovės savybėms atkurti heterologinėse sistemose, atrodo, reikalinga Kv4.2 išraiška kartu su dviem pagalbiniais subvienetais: Kv kanalą sąveikaujančiais baltymais ir dipeptidilminopeptidazę primenančiais baltymais 5, 6 . Imunohistocheminio dažymo tyrimai rodo, kad CA1 piramidiniai neuronai pirmiausia ekspresuoja KChIP2, KChIP4 ir dipeptidil-peptidazės 6 (DPP6) baltymus 7, 8 .

Neseniai atlikti viso pasaulio asociacijų tyrimai nustatė DPP6 autizmo spektro sutrikimuose ir kitose neuropsichiatrinėse patologijose 9, 10 . DPP6 sąveikauja su Kv4 kanalais, kad smarkiai padidintų Kv4 paviršiaus išraišką ir paspartintų daugelį A tipo kanalų savybių, įskaitant jų aktyvavimą, inaktyvavimą ir atsigavimą po inaktyvacijos 11, 12 . Neseniai mes nustatėme, kad DPP6 yra ypač svarbus Kv4 kanalų lokalizavimui distaliniuose CA1 dendrituose 13 . Struktūriškai DPP6 baltymas turi vieną transmembraninį domeną su trumpu tarpląsteliniu amino galu. Tačiau didžiąją dalį baltymų sudaro didelis tarpląstelinis karboksi-galo domenas 14, 15 . Susijusios šeimos nario tarpląstelinis domenas DPPIV (taip pat vadinamas CD26) jungiasi su tarpląstelinės matricos (ECM) komponentais, tokiais kaip kolagenas, fibronektinas ir β1 integrinas (nuorodos 16, 17) ir tarpininkauja ląstelių adhezijoje, judėjime tarp ląstelių ir T-ląstelių aktyvacija 18, 19, 20 . DPP6 yra maždaug 50% panašumas į CD26 (nuoroda 21), taip pat turi cisteino turtingą domeną, kuris gali jungtis su ECM komponentais. DPP6 tarpląstelinio domeno funkcija nežinoma, tačiau remiantis jo matomumu ir panašumu į DPPIV, atrodė, kad DPP6 gali turėti reikšmės ląstelių adhezijai, pošeiminiam atpažinimui ir (arba) trans-sinapsiniam signalizavimui.

Čia parodome, kad dendritinės filopodijos pradžia ir stabilumas smarkiai sumažėja DPP6 nokauto (DPP6-KO) pelių hipokampo neuronuose. Be to, dendritinis medžio dydis, stuburo tankis ir funkcinių sinapsių skaičius sumažėja šių pelių vystymosi metu ir suaugus. Šie trūkumai buvo išgelbėti išreiškiant DPP6. Daugybė naujausių tyrimų labai padidino mūsų supratimą apie molekules, susijusias su stuburų formavimu, priežiūra ir rekonstravimu, tačiau apie molekulinius ir ląstelinius mechanizmus, kuriais formuojasi ir palaikoma dendritinė filopodija, yra žinoma gana mažai. Mūsų išvados rodo, kad DPP6, be savo kaip Kv4 partnerio, reguliuojančio dendritinį jaudrumą hipokampinio CA1 piramidiniuose neuronuose, vaidmens, turi svarbų vystymosi vaidmenį skatindamas dendritinės filopodijos formavimąsi ir stabilumą, vėliau paveikdamas sinapsių vystymąsi ir funkcijas.

Rezultatai

DPP6 yra svarbus filopodijos formavimuisi ir stabilumui

Mes nustatėme, kad pažymėtas DPP6 lokalizuojasi į dendritinę filopodiją ir stuburus (papildomas S1 pav.), Rodantis galimą vaidmenį sinapsių vystymesi. Norėdami ištirti šią galimybę, pirmiausia išmatuojome dendritinės filopodijos susidarymą hipokampo neuronuose, išaugintuose iš laukinio P0 (WT) ir DPP6-KO pelių. Nesubrendusių dendritinių filopodijų tankis DIV3 išaugintuose hipokampo neuronuose, gautuose iš DPP6-KO pelių, buvo žymiai sumažėjęs - iki maždaug 45% tiriamojo WT (1a pav., B; P <0, 05, neporinis studento t- testas). Antrame eksperimente P0 DPP6-KO pelių hipokampo neuronuose mes išreiškėme žaliai fluorescencinį baltymą (GFP) arba GFP pažymėtą DPP6 (DPP6-GFP) ir suskaičiavome nesubrendusių dendritinių filopodijų skaičių DIV3. DPP6-GFP ekspresuojantys neuronai parodė žymiai padidėjusį nesubrendusių dendritinių filopodijų tankį, palyginti su GFP kontrole, parodydami specifinį DPP6 vaidmenį reguliuojant filopodijos skaičių (1c pav., D; P <0, 05, neporinis studento t- testas). Mes taip pat išmatuojome filopodijos tankį identifikuotuose aksonuose (Tau-1 teigiamas) kultūriniuose neuronuose DIV3. Skirtingai nuo mūsų nesubrendusios dendritinės filopodijos rezultatų, reikšmingo aksoninės filopodijos skaičiaus skirtumo tarp DPP6-KO ir WT neuronų neradome (WT = 1, 81 ± 0, 16 filopodijos 20 μm aksonų ilgiui, n = 64; DPP6-KO = 1, 40 ± 0, 13). filopodijos 20 μm aksonų ilgiui, n = 85, P > 0, 05, nesuporuotas Studento t- testas). Nors filopodijos tankis nustatytuose DPP6-KO kultivuojamų neuronų dendrituose yra ženkliai sumažėjęs, palyginti su WT, mes neradome reikšmingo skirtumo tarp DIV3 WT dendritinių šakų tankio ir DPP6-KO kultivuojamų neuronų tankio (WT = 0, 08 ± 0, 02 atšakos per 20 μm, n = 44; DPP6-KO = 0, 07 ± 0, 01 atšakos per 20 μm, n = 77, P > 0, 05, neporinis Studento t- testas).

Image

( a, b ) DIV3 WT arba DPP6-KO hipokampo neuronai, vizualizuoti aktino siūlams su TRITC-faloidinu (1: 1000, Sigma) ir aksonams su žymekliu Tau-1 (1: 1000, Millipore). Nesubrendusių dendritinių filopodijų (strėlių galvutės) tankis DPP6-KO neuronuose ( n = 77) sumažėja, palyginti su WT ( n = 44). ( c, d ) DIV3 DPP6-KO hipokampo neuronai, išreiškiantys arba GFP kontrolę, arba DPP6-GFP, kultivuojami 3 dienas ir vizualizuojami su aktino siūlais, naudojant TRITC-halogenidą. Filopodijos tankis padidėja DPP6-KO neuronuose, kurie išreiškė DPP6-GFP ( n = 62), palyginti su GFP kontrolėmis ( n = 56). Svarstyklės, 10 μm. Klaidų juostos žymi vidurkį ± sem * P <0, 05, nesuporuotą Studentų t- testo.

Visas dydis

Šie rezultatai, parodantys DPP6 vaidmenį reguliuojant filopodijos skaičių, gali parodyti arba poveikį filopodijos formavimuisi, arba susidariusios filopodijos stabilumą, arba abu. Norėdami tai nustatyti, mes atlikome gyvų vaizdų gavimo eksperimentus, kad stebėtume WT ir DPP6-KO pelių DIV3 hipokampo neuronų filopodiją (2 pav.). Pirmiausia išmatuotas vidutinis esamų filopodijų gyvavimo laikas per 1 h 30 sekundžių intervalais. 2a, b pav. Parodyta, kad WT neuronų filopodija yra labai stabili: ~ 75% iš 78 filopodijų trunka visas 60 minučių, įrašytų į laiko tarpą. Tačiau DPP6-KO neuronuose tik ~ 57% iš 80 filopodijų truko visą valandą. Toliau išmatuotas GFP arba DPP6-GFP transfekavimo į DPP6-KO P0 hipokampo neuronus poveikis. Rezultatai parodė, kad DPP6-GFP ekspresuojančių neuronų filopodija buvo stabilesnė (~ 70% išgyvenamumas 1 val.), Palyginti su GFP kontrole (~ 59% išgyvenamumas, 2c pav., D). Šis DPP6-KO neuronų filopodijos stabilumo iki WT lygio išgelbėjimas, pasireiškiant DPP6-GFP ekspresijai, rodo esminį DPP6 baltymo vaidmenį palaikant filopodiją kuriant hipokampo neuronus.

Image

Atskirų filopodijų gyvavimo laikas 1 valandą buvo tiriamas perfiksuotų neuronų fazinio kontrasto ir laiko intervalų sekomis ( n = 10 kiekvienos būklės neuronų). ( a, b ) WT ir DPP6-KO neuronų vaizdai, rodantys filopodiją (rodyklių galvutės). Diagrama rodo stabilios (ne mažiau kaip 60 min.) Filopodijos procentinę dalį WT ir DPP6-KO neuronams. ( c, d ) DIV3 DPP6-KO neuronų, išreiškiančių arba GFP, arba DPP6-GFP, vaizdai. Rodyklių galvutės nurodo filopodiją. Diagrama rodo stabilios (mažiausiai 60 minučių trukmės) filopodijos procentinę dalį kiekvienoje būklėje. ( e, f ) DPP6-KO pelėms per 1 valandos registraciją buvo rodoma mažiau naujos filopodijos (rodyklė), palyginti su WT. ( g, h ) DPP6 ekspresija DPP6-KO pelėse padidino inicijuotų filopodijų skaičių. Svarstyklės, 10 μm. Klaidų juostos žymi vidurkį ± sem * P <0, 05, nesuporuotą Studentų t- testo.

Visas dydis

Šiuose gyvo vaizdo tyrimuose mes taip pat suskaičiavome naujų filopodijų, inicijuotų per 1 valandą, skaičių (2e, f pav.). Mes nustatėme, kad DPP6-KO neuronai sukuria apie 60% mažiau filopodijos nei WT ( P <0, 05, neporinis Studentų t- testas). DPP6-GFP išreiškiančiuose hipokampo neuronuose DPP6-GFP aptikome, kad, palyginti su GFP kontrole, filopodijos pradžia padidėjo maždaug trigubai, beveik atstatant filopodijos susidarymo greitį iki WT lygio (2g pav., H; P < 0, 05, neporinis Studento t- testas). Apibendrinant, gyvų vaizdų matavimai rodo, kad sumažėjęs filopodijos tankis DPP6-KO hipokampo neuronuose yra dėl sumažėjusio stabilumo ir dėl to, kad DPP6 sukelia filopodiją.

Kuriant DPP6-KO neuronus, sumažėja stuburo tankis

Kadangi filopodija gali virsti stuburais 22, vėlesniame vystymosi etape ieškojome atitinkamo poveikio stuburo skaičiui. Norėdami aptikti ir suskaičiuoti dendritų spyglius, kultūrose buvo imuniniu būdu užfiksuotas mitogenu suaktyvintas baltymas 2, kad paryškintumėte dendritinę pavėsinę, ir PSD-95, kad vizualizuotumėte stuburus postsinapsinėse vietose (žr. Metodus). 3a paveiksle pavaizduoti kultivuoti WT ir DPP6-KO hipokampo neuronai DIV14. Stuburų tankis (skaičius per 20 μm ilgio) DPP6-KO neuronuose sumažėjo ~ 30%, palyginti su WT pelių tyrimais (3b pav.; P <0, 05, neporinis Studentų t- testas). Kaip nustatyta dendritinei filopodijai (1 ir 2 pav.), DPP6-GFP ekspresija DPP6-KO pelės P0 hipokampo neuronuose padidino stuburo tankį, palyginti su GFP kontrole, kai matuojama DIV 14 (3c pav., D; P <0, 05, be poros). t- testas). Norėdami nustatyti DPP6-KO neuronų stuburo tankio sumažėjimo funkcinį poveikį, išmatuojome miniatiūrines sužadinimo sinapsines sroves DIV14 kultivuojamuose WT ir DPP6-KO neuronuose. Nors mEPSC amplitudės skirtumų tarp dviejų grupių nenustatyta, DPP6-KO neuronuose reikšmingai sumažėjo mEPSC dažnis (3e pav., G, P <0, 05, neporinis Studentų t- testas). Taigi, ne tik reguliuojantis filopodijos skaičių ankstyvame vystymosi etape, DPP6 vėliau daro įtaką stuburo formavimui ir sinapsių skaičiui hipokampo neuronuose.

Image

( a, b ) P0 WT arba DPP6-KO neuronai buvo auginami iki DIV14, po to imuniniai dažomi MAP2 (žalia, 1: 1000, Chemicon), kad būtų paryškinta dendritinė pavėsinė, ir PSD-95 (raudona, 1: 200, NeuroMab) kaip stuburo žymeklis. Įrašas dešinėje skydelyje yra padidintos dėžutės sritis. Rodyklių galvutės nurodo nugaros pavyzdžius. Diagrama, rodanti, kad stuburo tankis DPP6-KO pelių hipokampo neuronuose ( n = 45) yra sumažėjęs, palyginti su WT ( n = 49). Svarstyklės, 10 μm. ( c, d ) DIV14 DPP6-KO hipokampo neuronai, išreiškiantys arba GFP, arba DPP6-GFP. Įrašas dešinėje skydelyje yra padidintos dėžutės sritis. Rodyklių galvutės nurodo nugaros pavyzdžius. Diagrama rodo, kad DPP6-GFP ( n = 38) padidino stuburo tankį, palyginti su GFP kontrolėmis ( n = 45). Svarstyklės, 10 μm. mEPSC dažnis, bet ne amplitudė, sumažėja DPP6-KO hipokampo neuronuose. ( e, f ) MEPSC pėdsakų iš WT ir DPP6-KO kultivuotų hipokampo neuronų, užfiksuotų DIV14 ir 15 vietose, mastelio juostos: 10 pA, 250 ms ( e ) ir 4 pA, 20 ms ( f ). ( g ) Vidutinis mini dažnis sumažėja DPP6-KO ( n = 23), palyginti su WT ( n = 16) kultivuotais hipokampo neuronais, tuo tarpu amplitudė neturi įtakos. Klaidų juostos žymi vidurkį ± sem * P <0, 05, nesuporuotą Studentų t- testo.

Visas dydis

DPP6 numušimo poveikis vystymuisi

Norėdami pamatyti, ar DPP6 vaidmuo reguliuojant dendritinį stuburo formavimąsi paveikė sinapsiogenezę, mes panaudojome RNR trukdžius prieš DPP6 hipokampo neuronų kultūrose per greitą sinapsių formavimąsi ir dendritinio filopodijos tankio sumažėjimą. E18 žiurkės hipokampo neuronai buvo transfekuoti RNR interferencija, nukreipta prieš DPP6 ('siDPP6') 23, arba kontroliuojamaisiais RNR interferencija (siCtrl) plazminant. Kaip kontrolę mes išmatuojome siDPP6 ekspresijos poveikį filopodijos skaičiui neuronuose, išaugintuose iš DPP6-KO pelių. Nei siDPP6, nei siCtrl nepaveikė filopodijų skaičiaus DPP6-KO neuronuose (DPP6-KO + siCtrl = 1, 49 ± 0, 24 filopodijos 20 μm, n = 12; DPP6-KO + siDPP6 = 1, 35 ± 0, 26 filopodijos 20 μm, n = 14)., P > 0, 05, nesuporuotas Studentų t- testas).

DIV7 metu 14 ir 21 kultivuoti neuronai buvo fiksuoti ir imunizuoti su mitogenu aktyvuotu baltymu 2, kad būtų paryškinta dendritinė pavėsinė, ir su faloloidinu, kad būtų paryškinti aktino pagrindu išsikišimai. Norėdami išmatuoti sinapsių tankį, mes kartu su presinapsiniu žymeniu sinaptofizinu ir po sinapsės žymėtoju PSD-95 žymime neuronus. Puncta, kur sinapsitofizino ir PSD-95 ženklinimas sutapdavo, buvo skaičiuojami kaip sinapsės. Norėdami nustatyti DPP6 numušimo įtaką filopodijos, stuburo ir sinapogenezės formavimuisi, aptikome ir suskaičiavome filopodijos, stuburo ir sinapsių tankį subrendus WT hipokampo neuronams ir transfekuotiems neuronams siCtrl-GFP arba siDPP6-GFP. WT hipokampo neuronų kultūrose buvo laipsniškai mažinamas filopodijos tankis tarp DIV7 ir DIV21 ir atitinkamai padidėjo stuburo ir sinapsių tankis brendimo metu (papildomas S2 pav.). SiDPP6 ekspresuojančiuose neuronuose mes nustatėme, kad filopodijos tankis DIV7 reikšmingai sumažėjo ~ 42%, o DIV14 - ~ 30%, palyginti su siCtrl (4a pav., B, e; P <0, 05, neporinis Studento t- testas). Abiejose grupėse pagal DIV21 filopodijų skaičius buvo nereikšmingas (4c pav., E). Mes taip pat nustatėme, kad siDPP6 sukelia atitinkamą stuburo tankio sumažėjimą ~ 40% DIV14 ir ~ 50% DIV21, palyginti su siCtrl (4b pav., C, f; P <0, 05, neporinis Studento t- testas), o Sinapsių tankis sumažėjo ~ 20% DIV14 ir 40% DIV21 neuronuose, išreiškiančiuose siDPP6, palyginti su siCtrl (4c pav., g; P <0, 05, neporinis Studento t- testas). Atitinkamai, mEPSC dažnis buvo sumažintas siDPP6 ekspresuojančiuose neuronuose, palyginti su kontroliniais (siCtrl = 105, 7 ± 28, 1 įvykiai min −1, n = 20; siDPP6 = 43, 3 ± 9, 0 įvykiai min −1, n = 17, P <0, 05, be suplanuoto Studento t. -testas). Tačiau mEPSC amplitudės skirtumo nenustatyta (siCtrl = 15, 4 ± 1, 3 pA, n = 20; siDPP6 = 13, 8 ± 1, 5 pA, n = 17, P > 0, 05, nesuporuotas Studento t- testas). Be to, DPP6-GFP ekspresija subrendusiuose DPP6-KO neuronuose padidino stuburo skaičių, palyginti su kontroliniais DPP6-KO neuronais, išreiškiančiais tik GFP kontrolę (DPP6-KO + GFP = 5, 26 ± 0, 23 stuburo per 20 μm, n = 45; DPP6 - KO + DPP6-GFP = 7, 11 ± 0, 31 smaigalys per 20 μm, n = 38, P > 0, 05, nesuporuotas Studento t- testas). Šie rezultatai rodo, kad DPP6 yra svarbus reguliuojant sinapsių vystymąsi hipokampo neuronuose.

Image

( a - c ) Fiksuoti hipokampo neuronai buvo imunizuoti, kad būtų nustatytas F-aktinas (raudonas), kad būtų galima pamatyti filopodijas ir stuburus, ir MAP2 (žalia), kad būtų paryškinta dendritinė pavėsinė ir GFP (mėlyna). a ) rodyklių galvutės nurodo filopodijos pavyzdžius; ( b, c ) rodyklės galiukai rodo stuburų pavyzdžius. ( d ) Fiksuoti hipokampo neuronai buvo imunizuoti ant PSD-95 (raudonos), kad būtų vizualizuotos postsinapsinės vietos, ir sinapsofizinas (žalia), kad būtų paryškinti presinapsiniai požymiai ir GFP (mėlyna). Sinapsėmis buvo laikoma sutampanti PSD-95 ir sinaftofizino punkcija. Čia pateikiami pavyzdžiai yra DIV21. Rodyklių galvutės nurodo sinapsių pavyzdžius. Svarstyklės, 10 μm. e ) Diagrama, kurioje palygintas filopodijų skaičius 100 μm dendrito ilgio, jei siCtrl ( n = 24, 13, 20) ir siDPP6 ( n = 27, 17, 19) išreiškia hipokampo neuronus atitinkamai DIV7, 14 ir 21. ( f ) grafikas, kuriame palyginamas stuburo skaičius per 20 μm dendrito ilgio siCtrl ( n = 17, 13, 20) ir siDPP6 ( n = 20, 17, 19), išreiškiančių hipokampo neuronus atitinkamai DIV7, 14 ir 21. g ) Diagrama, kurioje palyginamas sinapsių skaičius 20 μm dendrito ilgyje, jei siCtrl ( n = 23, 23, 26) ir siDPP6 ( n = 28, 14, 24) išreiškia hipokampo neuronus atitinkamai DIV7, 14 ir 21. Klaidų juostos žymi vidurkį ± sem * P <0, 05, nesuporuotą Studentų t- testo.

Visas dydis

DPP6 efektai nepriklauso nuo Kv4.2

DPP6 yra svarbus reguliuojant Kv4.2 dendritinę išraišką ir funkciją 13 . Norėdami sužinoti, ar DPP6 praradimo poveikis sinapsiniam vystymuisi susijęs su jo, kaip Kv4.2, pagalbinio subvieneto, vaidmeniu, pakartojome aukščiau pateiktus eksperimentus, naudodami DIV3 Kv4.2-KO kultivuojamus neuronus. Tačiau, skirtingai nuo DPP6-KO neuronų, rezultatai parodė, kad aksonų ir nesubrendusių dendritų filopodijos tankis Kv4.2-KO ir WT neuronuose reikšmingai nesiskiria (5 pav.; Dendritinei filopodijai WT = 2, 33 ± 0, 24 filopodija). per 20 μm, n = 44; Kv4.2-KO = 2, 11 ± 0, 19 filopodijos per 20 μm, n = 45, P > 0, 05; aksonų filopodijai WT = 1, 81 ± 0, 16 filopodijos 20 μm, n = 64; Kv4.2-KO = 1, 87 ± 0, 32 filopodijos per 20 μm, n = 58, P > 0, 05, neporiniai Studentų t- testai). Taip pat nepastebėjome nesubrendusių dendritinių šakų skaičiaus skirtumų (WT = 0, 08 ± 0, 02 atšakos per 20 μm, n = 44; Kv4.2-KO = 0, 09 ± 0, 01 atšakų per 20 μm, n = 45, P > 0, 05, be porų). Studento t- testas). DIV14 metu mes nustatėme, kad Kv4.2-KO neuronuose stuburo skaičius nesikeičia, palyginti su WT (WT = 7, 66 ± 0, 29 stuburo per 20 μm, n = 49; Kv4.2-KO = 6, 88 ± 0, 27 spyglių per 20 μm)., n = 47, P > 0, 05, nesuporuotas Studento t- testas) ir nei mEPSC dažnis (WT = 58, 2 ± 11, 8 įvykiai min −1, n = 25; Kv4, 2-KO = 43, 3 ± 8, 9 įvykiai min −1, n = 25, P > 0, 05, nesuporuotas Studento t- testas) arba amplitudė (WT = 16, 4 ± 0, 9 pA, n = 25; Kv4, 2-KO = 15, 7 ± 1, 2 pA, n = 25, P > 0, 05, nesuporuotas Studento t- testas ) skyrėsi. Todėl darome išvadą, kad DPP6 poveikis filopodijos formavimuisi ir stabilumui pasireiškia nepriklausomai nuo jo, kaip pagalbinio Kv4.2 subvieneto, vaidmens.

Image

( a, b ) DIV3 WT arba Kv4.2-KO hipokampo neuronai, vizualizuoti aktino siūlams su TRITC-phalloidin (1: 1000, Sigma) ir aksonams su žymekliu Tau-1 (1: 1000, Millipore). Filopodijos (rodyklių galvučių) tankis Kv4.2-KO neuronuose reikšmingai nesiskiria nuo WT ( P > 0, 05). ( c, d ) DIV14 WT arba Kv4.2-KO neuronai buvo kultivuojami ir imuniniai dažomi naudojant MAP2 (žalias, 1: 1000, Chemicon), kad būtų paryškinta dendritinė pavėsinė, ir PSD-95 (raudonas, 1: 200, NeuroMab) kaip stuburo žymeklis. Įrašas dešinėje skydelyje yra padidintos dėžutės sritis. Rodyklių galvutės nurodo nugaros pavyzdžius. Grafikas, rodantis, kad stuburo tankis Kv4.2-KO pelių hipokampo neuronuose nepakinta, palyginti su WT. Svarstyklės, 10 μm. Klaidų juostos reiškia vidurkį ± sem

Visas dydis

DPP6 trūkumo pasekmės suaugusiųjų neuronuose

Norėdami nustatyti, ar aukščiau aprašytas poveikis vystymuisi yra reikšmingas suaugus, mes panaudojome dažymą biocitinais, norėdami išskirti pavienius CA1 piramidinius neuronus iš 6–8 savaičių amžiaus WT ir DPP6-KO pelių. Palyginti su WT kontrole, suaugusiųjų DPP6-KO pelių piramidinės ląstelės žymiai sumažino stuburo tankį tiek viršūninėje, tiek bazinėje dendrito vietose (6a, b pav.). Kai duomenys buvo suskirstyti į atskiras viršūninio dendrito dalis, paaiškėjo, kad DPP6-KO pelių stuburo tankis dramatiškai sumažėjo (~ 52%) distaliniuose dendrituose (~ 240 μm), palyginti su WT ( n = 10 DPP6-KO, n = 10, kai WT, P <0, 05, nesuporuotas Studentų t- testas), o proksimaliniuose dendrituose pastebėtas tik nedidelis stuburo skaičiaus sumažėjimas (~ 15%) (~ 40 μm, n = 10 DPP6-KO, n = 10 WT).

Image

a ) Tipiški dendritiniai stuburo (rodyklių galvutės) vaizdai iš CA1 neuronų iš WT ir DPP6-KO pelių tam tikrais atstumais. Svarstyklės, 5 μm. ( b ) stuburo skaičiaus kiekybinis įvertinimas ( n = 10 DPP6-KO, n = 10 WT). c ) Tipiški mEPSC įrašai iš WT ir DPP6-KO CA1 hipokampinių piramidinių neuronų iš P14 (kairieji pėdsakai) ir 6–8 savaičių amžiaus pelės (dešiniai pėdsakai). Valymo juostos juosta, 10 pA, 20 ms. Vidutinė mEPSC skalės juosta, 1 pA, 10 ms. ( d ) mEPSC dažnis (P14 pelių WT n = 8, DPP6-KO n = 7; suaugusių pelių n = 10 kiekvienoje WT ir DPP6-KO), bet nekeičiama didžiausia P14 ir suaugusių pelių amplitudė ( P > 0, 1). DPP6-KO neuronai. Klaidų juostos žymi vidurkį ± sem ( e ). DPP6-KO pelių neuronuose stebimas paprastesnis dendrito išsišakojimo modelis. Vaizdai, kuriuose pavaizduoti biocitinais užpildyti neuronai, pažymėti Alexa-488 konjuguotu streptavidinu, 6–8 savaičių WT ir DPP6-KO pelėms. Mastelio juosta, 50 μm. ( f ) Atsekti konfokalinio kamino vaizdai iš WT ir DPP6-KO pelių CA1 hipokampo neuronų. g ) Nubraižytų WT ir DPP6-KO neuronų dendritinių sankirtų skaičius, palyginti su viršūnių ir bazinių dendritų atstumu ( n = 10 WT, n = 10, kai DPP6-KO, P <0, 05, nesuporuotas Studento t- testas). Klaidų juostos žymi vidurkį ± sem * P <0, 05, nesuporuotą Studentų t- testo.

Visas dydis

Norėdami nustatyti, ar šis stuburo praradimas nesukelia funkcijų sutrikimų, atlikome elektrofiziologinius įrašus iš WT ir DPP6-KO suaugusiųjų ūminių hipokampo pjūvių. Genetinis DPP6 praradimas sąlygojo reikšmingą mEPSC dažnio sumažėjimą tiek P14 jaunoms pelėms (6c pav., D; WT n = 8; DPP6-KO n = 7; P <0, 05, neporinis Studentų t- testas), tiek suaugusioms pelėms. su WT (6c pav., d; WT n = 6; DPP6-KO n = 7; P <0, 05, nesuporuotas Studento t- testas). mEPSC amplitudė neturėjo reikšmingos įtakos DPP6 praradimui nė viename vystymosi etape (6c pav., d; P14 amplitudė, kai WT n = 8, DPP6-KO n = 7; suaugusiųjų amplitudė, kai WT n = 6, DPP6-KO n = 7; P > 0, 1). Nebuvo rasta skirtumų tarp genotipų porinių impulsų palengvinimo eksperimentuose (papildomas S3 pav.), Rodantis postsinapsinį DPP6 praradimo poveikį.

Apibendrinant, mEPSC dažnio sumažėjimas, bet ne amplitudė, taip pat nesant suporuotų impulsų palengvinimo pokyčių, rodo, kad DPP6-KO pelėms yra mažiau funkcinių sužadinimo sinapsių CA1 neuronų dendrituose. Todėl mes ištyrėme biocitinu dažytų hipokampo CA1 piramidinių neuronų dendritinę morfologiją tiek WT, tiek DPP6-KO pelėse (6e pav., G). Sholl analizė parodė, kad DPP6-KO pelių neuronuose yra paprastesnis dendritinis išsišakojimo modelis, palyginti su WT kontrolėmis (6f pav., G). DPP6-KO pelėse radome mažiau dendritinių sankirtų vietose, esančiose daugiau kaip 40 μm atstumu nuo somos visame dendritiniame medyje, palyginti su WT (6 pav.; N = 10 - DPP6, n = 10 - WT, P <0, 05, be poros). t- testas). DPP6-KO neuronuose viršūninio dendrito kamieno ilgis nesiskyrė nuo WT (WT = 232, 1 ± 17, 0 μm, DPP6-KO = 225, 1 ± 19, 3 μm, n = 10, P > 0, 05), tačiau bendras DPP6 apikalinio dendrito ilgis - KO reikšmingai sumažėja (WT = 781, 6 ± 46, 4 μm, DPP6 = 488, 6 ± 51, 0 μm, n = 10, P <0, 05, neporinis Studento t- testas). Funkcinių sužadinamųjų sinapsių sumažėjimą DPP6-KO CA1 neuronuose, palyginti su WT, gali paaiškinti jų negausioji dendritinė pavėsinė, taip pat sumažėjęs stuburo tankis likusių viršūninių dendritų ilgio vienete. Šis radinys skiriasi nuo aukščiau aprašytų DIV3 DPP6-KO neuronų atveju, kai neradome skirtumo nuo WT skirtumo dendritinių šakų skaičiumi šioje jauname etape, tai rodo DPP6 raidos poveikį šakų sudėtingumui. Kaip aprašyta aukščiau (5 pav.), Mes nustatėme, kad DPP6 veikia nepriklausomai nuo jo, kaip pagalbinio Kv4.2 subvieneto, vaidmens kuriant neuronus, nes Kv4.2-KO neuronuose filopodijos susidarymas ir stabilumas nebuvo paveikti. Taigi, suaugusioms pelėms, mes taip pat neradome jokio Kv4.2-KO poveikio dendritiniam išsišakojimui, palyginti su WT (papildomas S4 pav.).

DPP6 poveikio filopodijai mechanizmas

Mūsų rezultatai rodo, kad DPP6 vaidmuo reguliuojant sinapsių vystymąsi ir funkcijas, įskaitant filopodijos formavimąsi ir stabilumą. Filopodijos išsikišimas susijęs su aktino citoskeleto pertvarkymu. Norėdami suprasti molekulinius mechanizmus, pagrindžiančius DPP6 poveikį sinapsės vystymuisi, mes imunoprecipiduoti DPP6 iš hipokampo neuronų lizatų, kad nustatytume DPP6 sąveikaujančius baltymus (7a pav.). Masės spektrometrija juostoms, kurios buvo nusodintos iš WT, bet nebuvo DPP6-KO neuronų, leido atpažinti mioziną-X kaip DPP6 sąveikaujantį baltymą. Miozinas-X yra netradicinis miozinas, žinomas kaip svarbus formuojant ir pailginant filopodiją 24 . Manoma, kad miozinas-X taip pat gabena krovinių molekules filopodijoje ir sukuria variklio-bazės jungtį tarp integrinų ir citoskeleto 25 .

Image

( a ) WT ir DPP6-KO DIV14 neuronų lizatai buvo nugriauti DPP6 antikūnu ir atskirti 4–12% SDS – PAGE. Gelis dažomas Coomassie mėlyna spalva. Raudonas langelis parodo, kad DPP6-KO pelėse išsitraukė „Myosin-X“. Mastelio juosta, 50 μm. ( b ) Natūralus pelių smegenų bendras IP rodo, kad endogeninis DPP6 sąveikauja su Myosin-X. IgG kaip nespecifinė kontrolė. ( c ) DPP6 jungiasi su Myosin-X COS7 ląstelėse, kartu transfekuotose su DPP6 ir Myosin-X atliekant bendro IP tyrimą. Ištraukimui buvo naudojamas DPP6 antikūnas, o lizatai tiriami anti-miozino-X antikūnu (1: 4000, Sigma) arba anti-DPP6 antikūnu (1: 2000, Abcam), po to vizualizuojami anti-triušio Alexa Fluor 680. ir anti-triušio Alexa Fluor 800 antrinis antikūnas. Mastelio juosta, 50 μm. d ) „Myosin-X-GFP“ (žalia) ir „DPP6-Cherry“ (raudona), išreikšti COS7 ląstelėse, vaizdai, rodantys jų lokalizaciją filopodijos gale (geltoni, rodyklių galvutės, signalai sutampa). Svarstyklės, 10 μm.

Visas dydis

Norėdami gauti daugiau patvirtinimo, DPP6 – miozino – X sąveika, mes nustatėme, kad endogeninis DPP6 ir miozinas – X kartu imunodepresituoja pelių smegenų lizatuose (7b pav.). DPP6 ir miozinas-X taip pat kartu nusodinami, kai pernešami į COS7 ląsteles (7c pav.). Kadangi vienas intriguojančių „Myosin-X“ bruožų yra jo lokalizavimas 26–27 filopodijos galiukuose, mes taip pat išbandėme, ar šioje vietoje nėra DPP6. Kaip parodyta 8d pav., Tiek DPP6, tiek miozinas-X yra filopodijos galiukuose (7d pav.). HEK ląstelės, kartu išreiškiančios membranos baltymo žymeklį, membranos-mCherry, kartu su DPP6-GFP, parodė aiškią kolokalizaciją, kuri rodo DPP6-GFP membraninę išraišką (papildomas S5 pav.).

Image

Transfekuotos COS7 ląstelės buvo pasodintos ant 96 šulinėlių indų, padengtų poli-L-lizinu ( a, b ) arba padengtos ECM baltymais (atitinkamai kolageno IV, fibronektinu, lamininu arba kolagenu I) ( c, d ) 1 val. Nelipnios ląstelės buvo nuplaunamos ir lipnios ląstelės buvo tiriamos krištolo violetiniu dažymu. DPP6 ekspresija žymiai padidino COS7 ląstelių sukibimą su poli-L-lizino substratu, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis ( P <0, 001, neporinis Studento t- testas) ( a, b ). Grafikai rodo vidutinį OD ir standartinę paklaidą ( n = 4 eksperimentai). COS7 ląstelės, ekspresuojančios DPP6, parodė žymiai pagerintą ląstelių prisirišimą prie fibronektino, bet ne prie kolageno IV, laminino ar kolageno I, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis ( P <0, 001, neporinis studento t- testas) ( c, d ). Grafikai rodo vidutinį OD ir standartinę paklaidą ( n = 3 eksperimentai). ( e, f ) Dendritinę filopodiją sustiprina RGD peptidai DIV3 DPP6-GFP ekspresuojančiuose hipokampo neuronuose. e ) DPP6-KO hipokampo neuronai išreiškė GFP (kairėje) arba DPP6-GFP (dešinėje). DIV3 neuronai buvo gydomi kontroliniais RAD arba RGD peptidais (250 μM, 60 min.), Fiksuoti ir vizualizuoti aktino gijas su TRITC-faloidinu (1: 1000, Sigma). Rodyklių galvutės nurodo filopodiją. ( f ) Filopodijos tankis GFP ekspresuojančiuose neuronuose, gydant RDG, DPP6-KO pelėse buvo šiek tiek padidintas, palyginti su kontroliniu RAD gydymu ( n = 28 RAD, n = 32 RGD gydymui, P > 0, 05, be suplanuoto Studento t - testas), tačiau DPP6-KO neuronuose, ekspresuojančiuose DPP6-GFP, gydant RGD, filopodijos tankis žymiai padidėja (lyginant su kontrole) ( n = 37 RAD, n = 38 RGD gydymui, P <0, 05, nesuporuotas Studento t - testas). Svarstyklės, 10 μm. Klaidų juostos reiškia vidurkį ± sem

Visas dydis

DPP6 sukelia filopodijos susidarymą dėl ląstelių adhezijos

Kaip ir kitų DPP, tarpląstelinį DPP6 domeną sudaro β-sraigtas ir α / β-hidrolazės domenas 15 . β raketai sukuria puikias baltymų ir baltymų sąveikos platformas, o DPPIV (taip pat vadinama CD26) tarpląstelinis domenas jungiasi su tokiais ECM komponentais kaip kolagenas, fibronektinas ir β1 integrinas. 16, 17, 28 . DPP6 yra maždaug 50% panašumas į CD26 21, taip pat turi cisteino turtingą domeną, kuris gali jungtis su ECM funkcijos komponentais ląstelių adhezijoje. Mes ištyrėme DPP6 transfekcijos poveikį COS7 ląstelių adhezijai prie kultūros substrato poli-L-lizino. Mes nustatėme, kad COS7 kartu su DPP6 padidintu ląstelių sukibimu yra maždaug dvigubai didesnis, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, perkeltomis tik su vektoriais (8a pav., B; P <0, 05, neporuotas Studento t- testas), nurodant, kad DPP6 skatina ląstelių sukibimą su substratas.

Integrinai sudaro didelę šeimą heterodimerinių (α / β-subvienetų) membranos, apimančios ECM receptorius 29, 30, kurios jungiasi su arginino-glicino-aspartato (RGD) motyvu, aptinkamu daugelyje ECM baltymų. Kadangi ši trumpa peptidų seka pati gali sąveikauti su integrino receptoriais ląstelės paviršiuje, RGD motyvas dažnai buvo įnešamas į įvairias polimerines medžiagas, siekiant sustiprinti jų ląstelių sukibimo gebėjimą naudoti audinių inžinerijoje. Norėdami nustatyti, ar DPP6 turi įtakos ląstelių sukibimui, prisijungdamas prie RGD motyvų, esančių ECM baltymuose, imitavome ECM poveikį integrino signalizacijai kultivuojamuose hipokampo neuronuose, pritaikydami RGD turinčią peptidą, tada ištyrėme jo poveikį filopodijos formavimuisi. Kultūriniai P0 DPP6-KO hipokampo neuronai, išreiškiantys arba GFP, arba DPP6-GFP, buvo gydomi DIV3 kontroliniais RAD arba RGD turinčiais peptidais (250 μM, 60 min.). Tada neuronai buvo pritvirtinti, o jų aktino siūlai vizualizuoti TRITC-halogeninu. Suskaičiavome filopodijų skaičių per dendrito ilgį ir nustatėme, kad gydant RGD, DPP6-KO neuronuose filopodijos tankis šiek tiek padidėja, bet nežymiai padidėja, palyginti su kontroliniais RAD peptidais (8e pav., F P > 0, 1). Tačiau tuo pačiu gydymu RGD DPP6-GFP ekspresuojančiuose DPP6-KO neuronuose filopodija reikšmingai padidėjo ~ 40%, palyginti su kontroliniu RAD ( P <0, 05, neporinis Studentų t- testas).

Šie rezultatai yra suderinami su Shi ir Ethell 31 rezultatais, kurie parodė, kad gydymas RGD paskatino esamų dendritinių stuburo pailgėjimą ir paskatino naujų filopodijų susidarymą, ir tai rodo, kad RGD peptidas veikia kaip substratas stabilumui sustiprinti. Taigi ECM – DPP6 sąveika tikriausiai palaiko filopodijos formavimąsi ir stabilumą, prisijungiant prie ECM RGD motyvo, kad padidintų ląstelių adheziją. Mes atlikome ECM surišimo testą, norėdami rasti galimus ECM baltymų partnerius DPP6. Rezultatai, pateikti 8c, d pav., Rodo tokią DPP6 sąveiką, konkrečiai su fibronektinu. Tačiau neradome įrodymų apie DPP6 sąveiką su 1, 4 tipo kolagenu ar lamininu.

Diskusija

Šiame tyrime mes nustatėme naują DPP6 vaidmenį reguliuojant dendritinių filopodijų susidarymą ir stabilumą. Dėl DPP6 numušimo ar genetinio ištrynimo atsirado mažiau filopodijų, pastebėtų ankstyvoje vystymosi stadijoje. Be to, gyvų vaizdų darymo eksperimentai parodė, kad DPP6 turinčių neuronų filopodija buvo nestabili, palyginti su tyrimais iš WT neuronų. Šiuos trūkumus buvo galima išgelbėti iš išorinės DPP6 ekspresijos ir jie nebuvo pakartoti Kv4.2-KO neuronuose, kurie parodo specifinį DPP6 vaidmenį neuronų vystymesi, nepriklausomai nuo jo, kaip pagalbinio Kv4.2 subvieneto, hipokampo neuronuose. Suaugusiesiems DPP6-KO neuronai rodė mažiau funkcinių sinapsių ir retesnę dendritinę pavėsinę. Atrodo, kad DPP6 veikia postsinaptiškai, nes buvo pastebėtas sumažėjęs sinapsių perdavimas nepažeidžiant presinapsinių savybių. Be to, mes pateikiame įrodymų, rodančių DPP6 ir Myosin-X, molekulinio variklio, veikiančio formuojant filopodiją, sąveiką 32 . Galiausiai mes parodėme, kad DPP6 sąveikauja su ECM baltymo fibronektinu, kad padidintų ląstelių sukibimą su substratu. Iš viso šie duomenys rodo struktūrinį DPP6 vaidmenį, darantį įtaką dendritų morfologijai ir sinapsių skaičiui, prasidedančiam ankstyvoje vystymosi stadijoje ir besitęsiančiam iki pilnametystės. Didelis DPP6 vystymosi vaidmuo rodo galimą patofiziologinį ryšį su jo genetiniu ryšiu su imlumu autizmui 9, pabrėždamas tolesnio DPP6 vaidmens svarbą normalios grandinės formavimosi ir sinapsės vystymosi metu.

„Miozinas-X“ yra pliusinis, didelio darbo santykio miozinas 32, 33, kuris naudoja savo motorinę veiklą, kad gabentų save ir savo krovinius į filopodijos galiukus. Naujausi biocheminiai duomenys rodo, kad miozinas-X gali būti paverstas iš neaktyvaus monomero į aktyvųjį dimerą 34, o tai rodo, kad ląstelėse reguliuojamas jo gebėjimas gabenti krovinius į filopodiją. Kartu su kristalų struktūros duomenimis, rodančiais akivaizdžiai didelį tarpląstelinį DPP6 15 domeną ir anksčiau praneštą ECM, susijusį su giminingu šeimos nariu, DPP4 / CD26 19, 20, mūsų rezultatai rodo modelį, kai „Myosin-X“ pateikia DPP6 prie filopodijos patarimų, kur jo tarpląstelinis domenas sąveikauja su fibronektinu ECM, kad užtikrintų mechaninį stabilumą ir palengvintų filopodialinį pailgėjimą, galbūt užkertant kelią miozino-10 ir (arba) aktino srautui atgal.

Išvada, kad DPP6 sąveikauja su baltymais ECM, taip pat reikšminga, nes ji suteikia funkciją dideliam tarpląsteliniam domenui. Šis DPP6 domenas (kaip ir DPP10 ir kitų transmembraninių DPP domenai) sudaro didžiąją baltymų dalį. Vis dėlto eksperimentai su chimeriniais baltymais, neturinčiais tarpląstelinio DPP6 domeno (kurį pakeitė Myc žymių serija), parodė, kad šie mutantai sukelia Kv4 kanalų ekspresijos ir biofizikinių savybių pokyčius, panašius į tuos, kuriuos gamina visas baltymas 8 . Čia mes nustatėme, kad hipokampo neuronai, išauginti iš Kv4.2-KO pelių, nepasižymi panašiu poveikiu filopodijos formavimuisi ir stabilumui, kaip čia pranešta apie DPP6-KO (5 pav.). Todėl atrodo, kad DPP6, nepriklausomai nuo jo, kaip Kv4 pagalbinio subvieneto, vaidmens kūrimo metu turi funkcijas. Šie rezultatai patvirtina rezultatus, rodančius, kad DPP6 nereikia kompleksiškai formuoti su Kv4 kanalais, kad būtų galima pernešti tarpląstelinę ląstelę, ekspresuoti membranas ir perdirbti 35, 36 .

DPP6 praradimas ne tik turėjo įtakos filopodijos stabilumui, bet ir turėjo įtakos stuburo skaičiui ir dendritinių išsišakojimų modeliams CA1 neuronuose suaugusiems neuronams. Kadangi DIV3 filialų skaičiaus skirtumų nerasta, tikėtina, kad retesnis dendritinių šakojimosi būdas suaugusiame amžiuje gali būti vystomasis. Tikimasi, kad dėl nedažno medžio sumažės bendras stuburo skaičius, tačiau taip pat nustatėme, kad likę suaugusiųjų DPP6-KO neuronų dendritai sumažino stuburo tankį, palyginti su WT. Tai taip pat gali būti netaisyklingo vystymosi pasekmė, jei nėra DPP6, arba, galbūt, rodo, kad DPP6 veikia sinapsių stabilumą per visą vystymąsi ir suaugus. Įdomu tai, kad stuburo tankio sumažėjimas DPP6-KO dendrituose buvo ryškiausias distaliniuose dendrituose, o tai atitinka DPP6 poveikį A-tipo K + srovės amplitudėms; nuostoliai taip pat buvo ryškiausi distaliniuose CA1 dendrituose. Būsimi tyrimai bus reikalingi norint išsiaiškinti, ar tai rodo DPP6 tarpląstelinio atpažinimo ir (arba) trans-sinapsinius signalinius vaidmenis ir, jei taip, ar tokiu būdu veikiantys DPP6 baltymai taip pat veikia nepriklausomai nuo Kv4 kanalų.

Metodai

Konstruoja

DPP6-GFP arba DPP6-mCherry konstrukcijos buvo paruoštos PGR metodu ant žiurkės pcDNA3-DPP6 (nuoroda 21) ir subklonuotos į pEGFP-N1 arba pmCherry-N1 vektorių (Clontech, Mountain View, CA). Myosin-X-GFP constructs are previously described and characterized (Berg and Cheney 27 ). Additional details, including construction specifics and primer sequences, are given in the Supplementary Methods.

Rat and mouse hippocampal neuron culture and transfection

For details on the preparation of the primary hippocampal neuron cultures from E18-19 WT, DPP6-KO and Kv4.2-KO mice or Sprague–Dawley rats, please see Supplementary Methods. These methods were approved by NICHD's Animal Care and Use Committee.

Imunocitochemija

The cultured hippocampal neurons were fixed with freshly prepared 4% paraformaldehyde plus 4% sucrose in phosphate-buffered saline (PBS). Neurons were blocked with 10% normal goat serum in PBS and permeabilized with 0.2% Triton X-100 PBS for 10 min, immunostained with rabbit anti-MAP2 (1:1000, Chemicon), mouse anti-PSD-95 (1:200, NeuroMab), mouse anti-Synaptophysin (1:500, Millipore), mouse anti-Tau-1 (1:1000, Millipore) for 1 h at 37 °C, washed with PBS and incubated with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti-rabbit (1:500, Invitrogen), Alexa Fluor 555 conjugated goat anti-mouse or Alexa Fluor 633 goat anti-rabbit for 1 h at 37 °C. Some neurons were counterstained with TRITC-phalloidin (1:500, Invitrogen) to visualize actin filaments. Cells were imaged with a Zeiss Axioplan 2 microscope or a Zeiss LSM510 confocal microscope (Carl Zeiss, Germany) using a 63 × objective with a 1.4 numerical aperture. Imaging and measurements are described in full in Supplementary Information.

Time-lapse light microscopy

To make time-lapse sequences, the WT or DPP6-KO P0 mouse 13 hippocampal neurons, in some cases expressing DPP6-GFP or GFP as a control, were cultured for 3–4 days on 25 mm round coverslips. Time series were acquired in differential interference contrast mode using 0.5% transmission of the 561 nm laser on the transmission path of a Zeiss Live Duo scan microscope. The neurons were maintained at 37 °C with 5% CO 2 in a humidified environment. The cells were exposed to light only during image acquisition (5–7 s per image). We used a × 63 per 1.40 Oil differential interference contrast M27 Plan-Apochromat objective. Time-lapse recordings of dendrites were carried out for 60 min during which time images were collected at a rate of one image every 30 s. Filopodia detected during the recording period and which remained for the duration were counted as new filopodia. All images were analysed using MetaMorph software.

Staining and imaging analysis

Six to eight-week-old male WT C57BL/6 and DPP6-KO mouse brain slices (250 μm thick) were prepared using a vibrating tissue slicer as described for the whole-cell electrophysiological recording methods listed below. Two milligrams of biocytin was added to 1 ml internal solution containing (in mM): 20 potassium chloride, 125 potassium gluconate, 10 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 4 NaCl, 0.5 EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid), 10 phosphocreatine, 4 ATP, 0.3 TrisGTP (pH 7.2 with NaOH) and was passively perfused into CA1 neurons. Somatic patches were maintained for 20 min to let biocytin diffuse throughout the neuron. Access (5~10 MΩ) was carefully monitored during all injections. After slowly withdrawing injection pipettes, slices were rapidly transferred to PBS containing 4% PFA. Tissue was fixed for 24 h before IHC staining. Biocytin-filled slices were single labelled with Alexa-488 conjugated streptavidin (1:500, Invitrogen) overnight at 4 °C after being permeabilized with 0.3% Triton X-100 in PBS. Following 4 × washes in PBS, slices were then cryoprotected using a 25% sucrose/PBS solution, and subsectioned into 70-μm thick slices using a freezing microtome, washed in PBS at 4 °C for 2–3 h and mounted on gelatin-coated slides using Mowiol mounting medium (Calbiochem, La Jolla, CA).

Confocal image stacks of stained cells were performed at the NICHD Microscopy & Imaging Core facility using a Zeiss LSM 510 Inverted Meta with × 63 oil objective lens. Branching complexity was analysed by Sholl analysis 37 . Neurons were traced with the center of the soma as a focal point. Sholl measurements were obtained by quantifying the number of dendritic intersections crossing each 20-μm radius from soma. To calculate spine density, all dendrites located at a specific distance (40, 120, 240 μm from soma) were counted, and the number of spines along the length was counted to give a measure of spine per 20 μm length.

Co-immunoprecipitation and western blotting

To confirm an interaction between DPP6 and Myosin-X, we performed co-IP experiments either in native, detergent-solubilized mouse brain extracts or COS7 cells co-transfected with various DPP6 and Myosin-X constructs for 24–48 h. Mouse brain or cells were lysed in lysis buffer: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 1% NP40, 0.5% SDS and protease inhibitor mixture (Roche, Indianapolis, IN). Anti-DPP6 (2 μg per 500 μg protein, Abcam, Cambridge, MA), IgG (Invitrogen) as nonspecific control was then added to the lysate. The mixture was then incubated and rotated at 4 °C overnight. The antibody–antigen complex was immobilized by adsorption onto 50 μl of immobilized protein A (Pierce, Rockford, IL) and incubated for 2 h at room temperature. The protein-bead mixtures were washed 6 × with lysis buffer. The beads were resuspended in reducing SDS sample buffer and analysed on 3–8% Tris-acetate SDS polyacrylamide gels. The separated proteins were immunoblotted using DPP6 (1:2000) or Myosin-X antibody (1:4000, Cat# HPA024223, Sigma) and visualized by Alexa Fluor 680 secondary antibody (1:10, 000, Invitrogen) and Alexa Fluor 800 secondary antibody (1:10, 000, Rockland, Gilbertsville, PA). Immunoreactivity was detected with the Odyssey infrared imaging system (LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska).

Cell adhesion and ECM binding assay

Adhesion of COS7 cells to a substratum was assayed as described 38, 39 . Ninety-six-well plates coated with 0.1 mg ml −1 poly-L-lysine overnight at 4 °C were used for cell adhesion assay; ECM-coated 96-well plates (BD BioCoat, Bedford, MA) were used for binding assay. Plates were blocked with DPBS containing 2% BSA for 2 h. Transfected cells were harvested with enzyme-free cell dissociation buffer (Invitrogen), and then plated in DMEM with 1% BSA at a density of 60, 000 cells per well. Cells were allowed to attach to the wells for 60 min at 37 °C, then non-adherent cells were washed away. The remaining adherent cells were fixed with 5% glutaraldehyde for 30 min and stained with 5 mg ml −1 crystal violet in 20% methanol for 30 min, washed with PBS and extracted with 0.2% Triton X-100 for 30 min. Microplates were colorimetrically evaluated at 576 nm.

RGD or RAD treatment

DIV3 mouse hippocampal neurons were treated with 250 μM RGD-containing peptide [Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro (GRGDTP)] (EMD Biosciences, San Diego, CA) or the control RAD-containing peptide [Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro (GRADSP)] (EMD Biosciences) for 1 h at 37 °C with 5% CO 2, then neurons were fixed and immunostained with TRITC-phalloidin and density of filopodia quantified.

Elektrofiziologija

Six- to eight-week-old male C57BL/6 WT, Kv4.2-KO and DPP6-KO mice were anaesthetized by isoflurane prior to decapitation according to the methods approved by NICHD's Animal Care and Use Committee. Acute brain slices (250-μm thick) were prepared using a vibrating tissue slicer as described previously 13 . The cultured hippocampal neurons were recorded on DIV 14–16. During recording, cultured neurons were bathed in extracellular solution containing (in mM) 145 NaCl, 3 KCl, 10 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 8 dextrose, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2 . Somatic whole-cell recordings were performed at 32–33 °C for slices and 20 °C for cultured neurons, and were made from visually identified CA1 pyramidal neurons using differential interference contrast optics. Recording pipettes had tip resistances of 3–5 MΩ. Series resistance varied between 6 and 15 MΩ, and was carefully monitored throughout the experiments. No compensation for series resistance was employed. Neurons showed a resting membrane potential lower than −60 mV. Recordings in which the resting potential changed by more than ±5 mV of the initial value were excluded from the analysis. All electrophysiological data were recorded using a Multiclamp 700B amplifier. Signals were digitized at 10 kHz with a Digidata 1440 A and filtered at 2 kHz for miniature excitatory synaptic currents and at 4 kHz for PPF recordings.

For recording miniature excitatory synaptic currents, recording pipettes were filled with intracellular solution containing (in mM) 100 Cs-gluconate, 5 MgCl 2, 0.6 ethylene glycol tetraacetic acid, 8 NaCl, 40 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 2 NaATP, 0.3 TrisGTP (pH 7.2 with KOH). TTX (1 μM), Bicuculline (20 μM) were included in the external solution during all mEPSC recordings. After whole-cell formation, a 5-min recovery period elapsed before data collection. Membrane potential was held at −65 mV. Each neuron was recorded continuously for 10 min. Synaptic currents were analysed with the Mini Analysis program (Synaptosoft Inc.). Only events showing a rise time and decay time less than 2 and 10 ms, respectively, and amplitude greater than 8 pA, were analysed. For PPF recordings, the patch electrode solution contained the same internal solution listed above for mEPSC recordings. Experiments were performed in 20 μM Bicuculline. A 50-ms interval elapsed between the 1st and 2nd stimulus pulse. Paired-pulse ratios are the ratio of the amplitude of the second EPSC to the first. All PPF recordings were analysed using Clampfit 10.1 and Microsoft Excel. Statistical significance was evaluated using Student's t -test (unpaired, two tails).

Papildoma informacija

How to cite this article: Lin, L. et al. DPP6 regulation of dendritic morphogenesis impacts hippocampal synaptic development. Nat. Bendruomenė. 4:2270 doi: 10.1038/ncomms3270 (2013).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary Figures S1-S5 and Supplementary Methods

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.