Dvigubas e1a onkolitinis adenovirusas: nukreiptas į naviko heterogeniškumą dviem nepriklausomais vėžiui specifiniais promotoriaus elementais - df3 / muc1 ir htert | vėžio genų terapija

Dvigubas e1a onkolitinis adenovirusas: nukreiptas į naviko heterogeniškumą dviem nepriklausomais vėžiui specifiniais promotoriaus elementais - df3 / muc1 ir htert | vėžio genų terapija

Anonim

Dalykai

  • Adenovirusas
  • Biologinė terapija
  • Vėžys
  • Genetinė inžinerija
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2011 m. Vasario 14 d

Anotacija

Onkolitinių adenovirusų, kontroliuojamų vieno, specifiniam navikui būdingo reguliavimo elemento, terapinį naudingumą gali apriboti daugelio vėžio formų heterogeniškumas vidiniame ir tarp auglių. Norėdami išspręsti šią problemą, mes sukūrėme onkolitinį adenovirusą, kuris naudoja du skirtingus navikui specifinius promotorius (DF3 / Muc1 ir hTERT) atskiroms E1A ekspresijos kasetėms vairuoti kartu su viruso E1B srities trynimu, o tai suteikia papildomą naviko selektyvumą ir padidina onkolitinį veikla. Gautas virusas Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A sukėlė aukštesnį E1A onkoproteino kiekį, sustiprino onkolizę ir ankstesnį bei aukštesnį apoptozinį indeksą užkrėstose naviko ląstelėse, nei po infekcijos Adeno-hTERT-E1A, turinčio vieną hTERT promotorių. - „E1A“ kasetė. Izoliuotose U251 žmogaus gliosarkomos ląstelių holoklonuose (tariamose vėžio kamieninėse ląstelėse), kur DF3 / Muc1 ekspresija yra žymiai praturtinta ir hTERT ekspresija sumažėja, palyginti su tėvų U251 ląstelių populiacija, E1A gamyba ir onkolizė smarkiai sumažėjo po infekcijos Adeno-hTERT-E1A., bet ne „Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A“. Stiprus Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A onkolitinis aktyvumas tapo stipresniu priešnavikiniu aktyvumu nei Adeno-hTERT-E1A in vivo U251 kieto naviko ksenografijos modelyje, kur hTERT lygis buvo slopinamas> 90%, o DF3 / Muc1 lyginant su kultivuotomis U251 ląstelėmis, hTERT ekspresijos santykis buvo žymiai padidintas. Padidėjęs dvigubai taikomo Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A priešnavikinis aktyvumas buvo pasiektas nepaisant priešlaikinės viruso šeimininko ląstelių mirties ir sumažėjusio funkcinio viruso palikuonių, kurie ribojo navikinių ląstelių virusinę infekciją, gamybą. Šie radiniai pabrėžia terapinę onkolitinių virusų taikymo heterogeninių naviko ląstelių populiacijai naudą.

Įvadas

Adenovirusai, sukurti replikacijai sąlygojant specifinius vėžius, parodė perspektyvų savarankišką priešnavikinį aktyvumą, taip pat terapinio genų pristatymo galimybę. 1, 2 Buvo naudojamos įvairios strategijos, siekiant pagerinti navikui būdingą adenovirusinį aktyvumą, tuo pačiu sumažinant toksiškumą vėžinių šeimininko audiniams. Pvz., Vėžiui specifiniai promotoriaus elementai gali būti naudojami norint kontroliuoti E1A onkoproteino ekspresiją, o tai yra būtina adenovirusų transkripcijos aktyvacijai ir replikacijai. Tačiau net ir atlikus šiuos patobulinimus, tokie į navikus nukreipti adenovirusai klinikoje sulaukė nedidelės sėkmės. 2, 3, 4

HTERT promotorius pasižymi dideliu aktyvumu daugumos žmonių vėžiu, bet ne daugumoje šeimininko audinių, 5, 6 ir yra laikomas idealiu navikui specifiniu reguliatoriumi onkolitiniams adenovirusams. 7, 8 Anksčiau apibūdinome hTERT promotoriaus fragmentą, kuris replikacijos sąlyginio adenoviruso Adeno-hTERT-E1A kontekste pakartojo aukštą telomerazės promotoriaus pagrindu pagrįstą E1A raišką ir viruso aktyvumą vėžio ląstelėse, bet ne pirminiuose žmogaus hepatocituose. Manoma, kad onkolitinių adenovirusų, tokių kaip Adeno-hTERT-E1A, priešnavikinis aktyvumas gali būti padidintas įvedus antrą E1A kasetę, kontroliuojamą nepriklausomo, vėžiui specifinio promotoriaus elemento. Vienas iš tokių elementų yra gautas iš MUC1 geno, kuris koduoja DF3 antigeną. DF3 / Muc1 yra į mucinus panašus glikoproteinas, kuris yra ekspresuojamas ∼ 75% visų solidinių žmogaus navikų, įskaitant daugelį vėlyvos stadijos kasos, prostatos, krūties, kiaušidžių ir plaučių vėžio. 9, 10, 11, 12, 13 DF3 / Muc1 veikia kaip onkogenas, 14 yra atsparumo Herceptinui lemiantis veiksnys, 15 reguliuoja tarpląstelinių oksidantų kiekį ir apoptozę, reaguodamas į oksidacinį stresą, 16 ir turi reikšmės ląstelių adhezijai, invazijai ir metastazės. 10 DF3 / Muc1 taip pat siejamas su naviką formuojančiomis kamieninėmis / progenitorinėmis ląstelėmis panašiomis šoninėmis populiacijomis MCF-7 krūties vėžio ląstelėse 17 ir žmogaus pluripotencinių kamieninių ląstelių augimo reguliavimu. 18

Šiuo metu mes ištyrėme dviejų atskirų navikui būdingų promotoriaus elementų panaudojimą adenovirusinio E1A susidarymo, taigi ir viruso replikacijos, reguliavimui specifiniu vėžiu. Šios strategijos tikslas buvo padidinti viruso šeimininko diapazoną, kad apimtų platų spektrą žmogaus navikų, įskaitant navikus, kurių ląstelių subpopuliacija turi didelius DF3 / Muc1 ir hTERT aktyvumo skirtumus. Nustatyta, kad naviko ląstelės, užkrėstos dvigubu E1A kasetės virusu, aprašytu čia, Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A, išreiškia didesnį E1A onkoproteino kiekį ir yra padidintos lizės su ankstesniu ir aukštesniu apoptoziniu indeksu nei naviko ląstelės, užkrėstos atitinkamu pavieniu E1A kasečių virusas, Adeno-hTERT-E1A. Tačiau dėl padidėjusios Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A sukeliamos apoptozės, palyginti su Adeno-hTERT-E1A, sumažėja viruso išsiskyrimas, viruso plitimas ir kaip pagalbinio viruso aktyvumas. Nepaisant to, padidėjęs Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A onkolitinis aktyvumas paverčia didesnį priešnavikinį aktyvumą žmogaus gliosarkomos naviko ksenografo modelyje, kur tariamos vėžio kamieninės ląstelės (holoklonai - kloniškai išskirtos ląstelės, turinčios vėžines kamienines ląsteles panašias savybes ir auga holoklono morfologija) 19 rodo padidėjusią DF3 / Muc1 ekspresiją, palyginti su hTERT. Taigi dvigubos E1A kasetės adenoviruso terapinis potencialas yra savarankiškas priešvėžinis agentas prieš heterogenines naviko ląstelių populiacijas, nors ir sumažėjęs gebėjimas daugintis ir plisti adenovirusinę infekciją.

Rezultatai

DF3 promotoriaus naviko ląstelių transkripcinis aktyvumas

DF3 / Muc1 šerdies promotorius (nukleotidai nuo –699 iki +27) turi E-dėžutę, keletą GC turinčių sričių ir Sp1 vietas bei TATA dėžutę. 23, 24, 25 Norėdami išsiaiškinti, ar šis promotoriaus fragmentas gali suteikti stiprią ekspresiją naviko ląstelėse, šio promotoriaus sukelta luciferazės reporterio plazmidė buvo perkeista į žmogaus naviko ląstelių liniją (1a pav.). DF3 / Muc1 promotoriaus reguliuojamas luciferazės aktyvumas turėjo ląstelių linijos ekspresijos profilį, panašų į endogeninės DF3 / Muc1 RNR (1b pav.), Daugumoje tirtų ląstelių linijų, kas rodo, kad pagrindinis promotoriaus aktyvumas yra svarbus ląstelės DF3 / Muc1 veiksnys. RNR lygiai. Tačiau BT-549 ir ​​A549 ląstelių atveju buvo pastebėtas aukštas luciferazės promotoriaus aktyvumas, tačiau mažai endogeninės RNR. Tai rodo, kad neigiamos reguliavimo sekos, esančios už pagrindinio DF3 promotoriaus konstrukto ribų, gali būti svarbios DF3 ekspresijai šiose dviejose ląstelių linijose. DF3 / Muc1 RNR varijavo tarp ląstelių linijų, bet buvo labiausiai ekspresuojama krūties vėžio ląstelių linijose (1b paveikslas; pirmosios šešios ląstelių linijos). DF3 / Muc1 RNR buvo sunkiai aptinkama žmogaus hepatocituose, kur adenovirusai pasižymi stipriu natūraliu tropizmu, palaikydami DF3 / Muc1 šerdies promotoriaus naudojimą, kad būtų palengvintas vėžiui būdingas adenovirusinis reiškinys.

Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A onkolitinis profilis

Mes sukūrėme „Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A“ (1c pav.), Kurioje yra „DF3 / Muc1“ promotoriaus varoma E1A kasetė, be „Adeno-hTERT-E1A“ esančios hTERT promotoriaus varomos E1A kasetės. 7 Šios dvigubos E1A kasetės viruso onkolitinis profilis buvo palygintas su vienos PAV kasetės Adeno-hTERT-E1A profiliu (2 paveikslas). U251 žmogaus gliosarkomos ląstelėse reikėjo šiek tiek aukštesnio Adeno-hTERT-E1A MOI, kad būtų pasiektas panašus onkolizės lygis, kaip matyti po 3 ir 6 dienų (2a paveikslas). Nors U251 ląstelės turi aukštą endogeninį hTERT 7 aktyvumą ir jose trūksta DF3 / Muc1 RNR (1b pav.), Šerdies DF3 / Muc1 promotoriaus, įtraukto į mūsų adenovirusą, aktyvumas (1a pav.), Nors ir mažas, akivaizdžiai pakanka, kad padidėtų Adeno-DF3. Nuo -E1A / hTERT-E1A priklausoma onkolizė, palyginti su Adeno-hTERT-E1A infekuotomis ląstelėmis. Didesnis onkolitinio aktyvumo padidėjimas naudojant dvigubą E1A kasetės virusą buvo pastebėtas A549 plaučių vėžio ląstelėse ir MCF-7 / 4HC krūties vėžio ląstelėse (2b ir c paveikslai), kur DF3 / Muc1 promotoriaus aktyvumas yra didelis (1a pav.). MDA-MB-231 ląstelėse, kurios rodo žemą DF3 / Muc1 promotoriaus aktyvumą (1a pav.) Ir mažą vidinį adenoviruso užkrečiamumą, onkolizė buvo silpnesnė. 7

Image

Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A ir Adeno-hTERT-E1A onkolitinis aktyvumas - keturios žmogaus naviko ląstelių linijos: U251 ( a ), A549 ( b ), MCF-7 / 4HC ( c ) ir MDA-MB-231 ( d ) buvo užkrėsti Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A arba Adeno-hTERT-E11A nurodytais MOI. Likusias ląsteles kiekiui įvertinti, ląstelės buvo nudažytos krištolo violetine spalva 3 (kairėje) arba 6 dienas vėliau (dešinėje). Duomenų taškas parodo vidutines ± sd vertes, remiantis n = 3 pakartojimais, kai neužkrėstų ląstelių kontrolė nustatyta = 100%.

Visas dydis

Padidėjusi E1A ekspresija ir padidėjusi naviko ląstelių apoptozė dėl dvigubo E1A kasetės viruso

Naviko ląstelėse, užkrėstose Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A ir Adeno-hTERT-E1A, buvo stebima E1A baltymo gamyba, būtina sąlyga adenoviruso replikacijai ir adenoviruso potencialas lizuoti infekuotas ląsteles. Remiantis 2 paveiksle parodytais onkolitinio aktyvumo profiliais, ląstelėse, užkrėstose dvigubos kasetės virusu, E1A baltymų kiekis buvo didesnis (3 paveikslas). Taigi pridėjus antrąją, DF3 promotoriaus kontroliuojamą E1A kasetę, padidėjo E1A ekspresija kiekvienoje ląstelių linijoje.

Image

E1A baltymų lygis ir apoptozės indukcija, nustatyta PARP skilimo ir kaspazės-3/7 aktyvumo būdu adenovirusu užkrėstose ląstelėse - ( a ) ir ( b ) E1A baltymo vakariniai blotai U251 ir A549 ląstelių ląstelių lizatuose (50 μg / juosta). užkrėstos 24 valandas arba MDA-MB-231 ir MCF-7/4-HC ląstelės, 48 ​​valandas užkrėstos Adeno-hTERT-E1A arba Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A nurodytais MOI. A549 ir ​​MCF-7 / 4HC taškai buvo pakartoti PARP skilimo produktui p85. Western blot buvo veikiami lygiagrečiai visoms ląstelių linijoms; taigi antikūnų signalo intensyvumas yra tiesiogiai palyginamas. Aukštesni MOI ir vėlesni laiko taškai buvo naudojami MCF-7 ir MDA-MB-231 ląstelėms dėl mažesnio jų vidinio adenovirusinio užkrečiamumo. 7 ( c ), norint ištirti viruso sukeltą apoptozę, kiekviena naviko ląstelių linija buvo užkrėsta nurodytais virusais ir MOI ir po 30 val. Buvo patikrinta, ar kaspazės aktyvumas 3/7, po Caspase-Glo analizės rinkinio. Statistinė dviejų pusių nesuporuotų studentų t- testų analizė su 95% pasikliovimo intervalais nustatė reikšmingą apoptozės padidėjimą ( * P <0, 05; ** P <0, 001). „Caspase-Glo“ foninio aktyvumo vertės (atimtos iš kiekvieno mėginio) buvo: U251, 11 200; MDA-MB-231, 3 400; MCF-7 / 4HC, 830; ir A549, 1820 m.

Visas dydis

Nors adenovirusinė infekcija paprastai sukelia ląstelių mirtį neapoptoziniu mechanizmu, 26 čia aprašytiems onkolitiniams virusams trūksta E1B srities genų, koduojančių antiapoptozinius veiksnius, E1B-19 kDa ir E1B-55 kDa. Šių genų ištrynimas gali padidinti selektyvumą vėžio ląstelių atžvilgiu, kai mutavus arba slopinant apoptozės kelius. Padidėjusi E1A ekspresija naviko ląstelėse, užkrėstose Adeno-hTERT-E1A, kartu su E1B geno delecija lemia naviko ląstelių žudymą E1A sukeltu apoptoziniu mechanizmu. 7 Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A užkrėstos navikinės ląstelės buvo ištirtos ir palygintos su ląstelėmis, užkrėstomis Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A, PARP skilimui - ankstyvam apoptoziniam įvykiui. PARP skilimas, gaunant PARP-p85, įvyko esant mažesniems Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A MOI, palyginti su Adeno-hTERT-E1A MCF-7 / 4HC ir A549 ląstelėse (3a ir b paveikslai). U251 ląstelėse PARP-p85 lygiai (duomenys nepateikti) ir kaspazės 3/7 aktyvumas (3c paveikslas), atspindintis pasroviui būdingus apoptozinius įvykius, buvo labai panašūs po užsikrėtimo bet kuriuo virusu, atitiko panašų ir beveik visišką onkolitinį aktyvumą. kiekvieno viruso, pavaizduoto 2a paveiksle. Pridėjus antrąją E1A kasetę, žymiai padidėjo kaspazės-3/7 aktyvumas MDA-MB-231, MCF-7 / 4HC ir A549 ląstelėse (3c paveikslas), kas atitinka reikšmingesnį PARP skilimo ir onkolizės padidėjimą šiose ląstelėse.

Aktyvumas U251 naviko ksenografu modelyje

Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A priešnavikinis aktyvumas buvo lyginamas su Adeno-hTERT-E1A aktyvumu pelėms, turinčioms poodinius žmogaus U251 naviko ksenografus (4a pav.). Reikšmingas naviko augimo slopinimas buvo pasiektas vartojant Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A (23, 4 ± 7, 6% slopinimas po 1 gydymo laikotarpio (0–14 dienų) ( P <0, 05, palyginti su kontrole; dispersijos analizės vienpusis tyrimas su Bonferroni kartotiniu palyginimu) ) ir 36, 9 ± 11, 2% slopinimo ( P <0, 01 prieš kontrolę) 2-ojo gydymo laikotarpio pabaigoje (14–37 dienos)), bet ne su Adeno-hTERT-E1A. Agresyvus U251 navikinių ląstelių augimas lėmė tik trumpą augimo sustojimo periodą, kuris buvo akivaizdus po antrosios Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A injekcijų serijos. Navikų augimo tendencijos reikšmingai skyrėsi kiekvienam virusui ( P <0, 05), tačiau tik Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A gydymo grupė reikšmingai skyrėsi nuo kontrolės be viruso ( P <0, 01). Nebuvo pastebėta jokio reikšmingo toksiškumo šeimininkams nė vienam virusui, kaip nustatyta stebint kūno svorį (duomenys nepateikti).

Image

Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A ir Adeno-hTERT-E1A priešnavikinis aktyvumas: DF3 / Muc1 ir hTERT raiškos pokyčių įtaka kietiems navikams ir išaugintoms navikinėms ląstelėms. Pelės, turinčios U251 naviko ksenografus, buvo gydomos fosfatais. buferinis druskos tirpalas (transporto priemonės kontrolė) arba 5 × 10 8 apnašas formuojančių vienetų per naviką per dieną, naudojant Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A ('Ad-DF3 / hTERT') arba Adeno-hTERT-E1A ('Ad-hTERT'). ) kiekvieną dieną iš eilės (rodyklės), o virusas buvo pakartotas po 14 dienų. a ) Santykinis naviko tūris, normalizuotas pagal naviko tūrį pirmąją viruso injekcijos dieną (0 dieną) ( n = 5 pelių ir n = 10 navikų kiekvienoje grupėje vidurkis ± se). Duomenų apie naviko tūrį dispersijos analizės vienpusio analizės rezultatai, naudojant Bonferroni kartotinio tyrimo pataisą, yra tokie, kaip parodyta ( * P <0, 05; ** P <0, 001). ( b - d ) DF3 / Muc1 (kairėje) ir hTERT (dešinėje) RNR buvo tiriamos qPCR kietų navikų ksenografuose, išaugintuose pelių iš U251, A549 ir ​​MDA-MB-231 ląstelėse (keturi skirtingi naviko RNR mėginiai) ir keturiose. atskirti RNR preparatus nuo atitinkamų kultūroje išaugintų ląstelių linijų. RNR lygis buvo nustatytas atsižvelgiant į keturių ląstelių kultūros (DF3) arba keturių naviko (hTERT) mėginių vidutinį RNR lygį. Pateikti duomenys yra n = 3 pakartojimų vidurkis ± sd. Statistinė analizė atlikus dvipusį nesuporuotą Studento t- testą su 95% pasikliautiniais intervalais, lyginant sugrupuotų navikų RNR lygius su sugrupuotos ląstelių kultūros RNR lygiais: P <0, 001 ( ** ); P <0, 0001 ( *** ); ir P <0, 05 ( * ).

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme, kodėl dvigubas E1A kasetės virusas U251 navikuose buvo aktyvesnis už vienintelį hTERT-E1A kasetės virusą, atsižvelgiant į aukštą hTERT promotoriaus aktyvumą 7 ir žemą DF3 / Muc1 promotoriaus aktyvumą, matomą U251 ląstelėse (1a pav.). Kai kultivuojamos U251 ląstelės mažai ekspresuoja DF3 / Muc1 RNR, U251 naviko ksenografuose stebėjome ∼ 43 kartus didesnį DF3 / Muc1 RNR kiekį (4b paveikslas). Priešingai, hTERT RNR buvo was 10 kartų mažesnė U251 navikuose nei auginamose U251 ląstelėse (4b paveikslas). Šis nuo naviko priklausomas DF3 / Muc1 padidėjimas ir hTERT ekspresijos sumažėjimas paaiškina padidėjusį Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A priešnavikinį aktyvumą in vivo , palyginti su Adeno-hTERT-E1A. Palyginti su ląstelėmis, A549 navikuose pastebėtas labai panašus padidėjusios DF3 / Muc1 ekspresijos (∼ 21 karto) ir sumažėjusios hTERT ekspresijos (∼ 15 kartų) modelis. MDA-MB-231 navikuose DF3 / Muc1 ekspresija taip pat padidėjo ∼ 10 kartų, tačiau hTERT raiška nepakito, palyginti su kultivuojamomis naviko ląstelėmis (4d paveikslas).

Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A aktyvumas prieš U251 holoklonus

Kultūrinės naviko ląstelės, augančios holoklono morfologija, yra praturtintos vėžines kamienines ląsteles turinčiomis ląstelėmis. Buvo išskirti 19 U251 holoklonų, apibūdinami DF3 / Muc1 ir hTERT ekspresijos atžvilgiu. 5a paveiksle parodytas 10 kartų padidėjęs DF3 / Muc1 RNR ir 5 kartus sumažėjęs hTERT RNR trims nepriklausomiems U251 holoklonams, palyginti su tėvų U251 ląstelių linija arba mišriu U251 meroklono / paraklono subpopuliacija, kuri sudaro 90%. tėvų ląstelių populiacijos. DF3 / Muc1 yra susijęs su į naviko kamienines ląsteles krūties vėžiu. ALDH1A1, nustatyto į naviko kamieną panašių ląstelių žymeklio, 27 ekspozicija taip pat buvo praturtinta ∼ 10 kartų visuose trijuose holoklonuose, tuo tarpu labai aukšta tėvų ląstelių raiška - interleukinas-8, susijęs su naviko progresavimu ir metastazėmis - 28. panaikinta (duomenys nepateikti), atsižvelgiant į šių holoklonų vėžines kamienines ląsteles. Sutikus su pastebėtais hTERT ir DF3 / Muc1 ekspresijos pokyčiais, U251 holoklonai parodė sumažėjusį atsaką į Adeno-hTERT-E1A, tai rodo žymiai mažesnis E1A baltymo lygis U251 holoklonuose, užkrėstuose Adeno-hTERT-E1A, palyginti su Adeno- DF3-E1A / hTERT-E1A (5b paveikslas). Adeno-hTERT-E1A taip pat parodė iš esmės sumažintą holoklonų onkolizę, palyginti su pirminėmis U251 ląstelėmis (5c paveikslas), tuo tarpu Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A onkolitinis aktyvumas šiek tiek sumažėjo (5d paveikslas), ką galima paaiškinti. dėl sumažėjusio adenovirusinio holoklonų užkrečiamumo, nustatomo pagal Adeno-βgal užkrečiamumą (duomenys nepateikti). Atsižvelgiant į numanomą holoklonų naviko kamieninių ląstelių potencialą, šie radiniai sukelia galimybę, kad didesnis Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A (4 paveikslas) pastebėtas didesnis priešnavikinis aktyvumas iš dalies kyla dėl to, kad jis nukreiptas į šią ląstelių populiaciją.

Image

Genų ekspresija ir adenovirusinis aktyvumas U251 holoklonuose - ( a ) DF3 / Muc1 (kairėje) ir hTERT (dešinėje) RNR qPCR analizė iš U251 gautų holoklonų (žymimų A1, B3 ir B6), tėvų U251 ląstelių populiacijos ir meroklono / paraklono (M / P) mišrių ląstelių populiacija. RNR lygis buvo nustatytas atsižvelgiant į U251 tėvų ląsteles ir yra n = 3 replikacijų vidutinės ± sd vertės. Statistinė RNR lygio analizė holoklonuose, palyginti su U251 ir meroklono / paraklono populiacijomis: ** P <0, 01; *** P <0, 001. b ) E1A (viršuje) ir PARP p85 baltymų (apačioje) Western blot analizė iš visų ląstelių lizatų (50 μg per juostą), paruoštų iš U251 holoklonų ir tėvų ląstelių, 24 valandas užkrėstų Adeno-hTERT-E1A ('hT'). arba Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A ('D / hT'), kaip nurodyta. ( c ir d ) U251 holoklonai ir tėvų ląstelės buvo pasėti 24 valandas prieš užkrėtimą Adeno-hTERT-E1A ( c ) arba Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A ( d ) nurodytais MOI. Ląstelės buvo nudažytos kristalų violetinėmis medžiagomis po 3 dienų, kad būtų galima įvertinti likusias ląsteles. Pateikti duomenys yra vidutinės ± sd vertės, pagrįstos n = 3 pakartojimais, kai neužkrėstų ląstelių kontrolė nustatyta = 100%. Vienpusis „Bonferroni“ kartotinio tyrimo koregavimo dispersijos tyrimas neparodė reikšmingų skirtumų Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A sukeliamo citotoksiškumo profiliuose holoklonams ir tėvų U251 ląstelėms ( d ), tuo tarpu citotoksiškumo profiliai reikšmingai skyrėsi Adeno-hTERT. -E1A infekuoti holoklonai B3 ir B6 (bet ne holoklonas A1), palyginti su tėvų U251 ląstelėmis ( P <0, 05) ( c ). Adeno-hTERT-E1A sukelto citotoksiškumo profiliai žymiai skyrėsi holoklono A1 atžvilgiu, palyginti su U251 tėvo ląstelėmis, kai buvo tiriami atskiri MOI, svyruojant nuo 5 iki 20 MOI ( P <0, 05).

Visas dydis

Patobulinta naviko ląstelių apoptozė slopina viruso išsiskyrimą ir dvigubo kasetinio viruso pagalbinio viruso aktyvumą

Toliau mes ištyrėme, ar ankstesnė ir platesnė Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A sukelta apoptozė sutrikdo jo gebėjimą gaminti aktyvias, funkcines viruso daleles ir tokiu būdu plisti virusinę infekciją navikinių ląstelių populiacijoje. Superdenatantai iš naviko ląstelių, užkrėstų Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A arba Adeno-hTERT-E1A, buvo surinkti ir titruojami, kad būtų nustatytas funkcinis virusas. Adeno-hTERT-E1A buvo efektyvesnis nei Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A, kalbant apie funkcinio viruso išsiskyrimą, kaip matyti įvairiais laiko momentais po užsikrėtimo, tiek U251, tiek A549 ląstelėse (6a pav.). Šie duomenys rodo, kad antroji Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A E1A kasetė sukelia priešlaikinę šeimininko ląstelių mirtį, sumažindama bendrą funkcinių virusinių palikuonių derlių.

Image

Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A rodo sumažėjusį viruso plitimą ir sumažėjusį pagalbinio viruso aktyvumą Adeno-2B11 tarpininkaujamo CPA provaisto aktyvacijai - ( a ) U251 ląstelės (kairėje) ir A549 ląstelės (dešinėje) buvo užkrėstos Adeno-hTERT- E1A (hTERT) arba Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A (DF3 / hTERT) prie MOI 5. Ląstelių kultūros supernatantas buvo pašalintas po 1–7 dienų, kaip nurodyta, ir užteptas 293 ląstelėms titruoti adenoviruso daleles, išleistas į supernatantas. Pateikti duomenys yra vidutinės ± sd vertės, pagrįstos trijų pakartotinių viruso supernatantų dešimtkartinių praskiedimų (10 0, 10 −1 ir 10 − 2 ) dubliavimosi titrais. Skaičiai kiekvienoje juostoje rodo adenovirusų titro santykį tarp Adeno-hTERT-E1A ir Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A. Statistinė analizė naudojant dvipusį nesuporuotą Studento t testą su 95% pasikliovimo intervalais Adeno-hTERT-E1A ir Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A atžvilgiu: * P <0, 05; ** P <0, 001. b ) nuo dozės priklausomas U251 ląstelių, užkrėstų ląstelių kultūros supernatantais, užmušimas iš U251 ląstelių, anksčiau užkrėstų Adeno-2B11 (MOI 8) kartu su Adeno-hTERT-E1A (kairėje), ONYX-015 (viduryje) arba Adeno-, nužudymu. DF3-E1A / hTERT-E1A (dešinėje) esant 0, 1, 5 ir 5 MOI. Ląstelės, apdorotos virusu, nesant CPA, buvo nustatytos kaip 100%. ( c ir d ) Aktyvusis CPA metabolitas, 4-OH-CPA, buvo tiriamas atliekant efektyvią skysčių chromatografiją U251 ir MCF-7 / 4HC ląstelėse, užkrėstose Adeno-2B11 + Adeno-hTERT-E1A (baltos juostos) arba su Adeno-2B11 + ONYX-015 (juodomis juostomis) 2 dienas, po to 4 valandas inkubuojant su 250 μM CPA + semikarbazidu (5 m M). B ir c punktuose nurodyti duomenys yra vidutinės + sd vertės, pagrįstos n = 2 pakartojimais. Visi eksperimentai buvo atlikti bent dviem egzemplioriais.

Visas dydis

Siekiant nustatyti, kaip adenoviruso išsiskyrimo sumažėjimas veikia kartu vartojamo replikacijos trūkumo adenoviruso ekspresiją, buvo atlikti tyrimai su Adeno-2B11, 20, koduojančiu provaistus aktyvinantį citochromą P450 fermentą 2B11 (CYP2B11), efektyvų katalizatorių. CPA aktyvinimas. 29 U251 ląstelės buvo užkrėstos Adeno-2B11 derinyje su Adeno-hTERT-E1A, Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A ar kitu onkolitiniu virusu, ONYX-015, 30, esant įvairiems MOI. Maždaug po 3 dienų kultūros supernatantai buvo uždedami ant šviežių U251 ląstelių, esant CPA, CYP2B11 aktyvuotam provaistui. Adeno-hTERT-E1A buvo veiksmingiausias palengvinant Adeno-2B11 replikaciją, dėl kurio CPA sukeltas ląstelių žūtis, o ONYX-015 parodė vidutinį aktyvumą (6b paveikslas). Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A buvo beveik neaktyvus (6b paveikslas), tai atitiko ankstyvą onkolizę ir sumažintą viruso išsiskyrimą (6a paveikslas), apimantį Adeno-2B11 pagalbininko viruso aktyvumą. Kultūros supernatantų, išskiriančių aktyvų CPA metabolitą 4-OH-CPA, analizė patvirtino aukštesnį Adeno-hTERT-E1A gebėjimą tarnauti kaip viruso pagalbininką U251 ląstelėse, tai įrodo mažesni MOI, reikalingi norint gaminti aukštą 4-OH-CPA lygiai (6c paveikslas). Esant aukštesniems MOI, Adeno-hTERT-E1A sukėlė didelę ląstelių mirtį (duomenys nepateikti), taigi sumažėja ląstelių, galinčių konvertuoti CPA į 4-OH-CPA, skaičius. Adeno-hTERT-E1A ir ONYX-015 parodė panašų helpero viruso aktyvumą MCF-7 / 4HC ląstelėse (6d pav.), Tuo tarpu MDA-MB-231 ląstelėse, kurias iš esmės sunku užkrėsti, Adeno-hTERT-E1A parodė mažai pagalbininkų. viruso aktyvumas, tuo tarpu ONYX-015 buvo neaktyvus (duomenys nepateikti).

Diskusija

Vėžiui specifiniai stimuliatoriai gali būti naudojami kontroliuojant virusus reguliuojančius genus, tokius kaip adenovirusas E1A, siekiant apriboti onkolitinių adenovirusų replikaciją piktybinėse ląstelėse ir audiniuose. Taip pat aprašyti dvejopo specifiškumo adenovirusiniai promotoriai, kurie reguliuoja E1A ekspresiją reaguodami į įvairius dirgiklius, pavyzdžiui, estrogenus ir hipoksiją. 31 Vėžiui specifiniai promotoriai DF3 / Muc1 ir hTERT gali suteikti specifinį navikui replikaciją, taip pat buvo aprašyta keletas naviko ląstelių replikaciją sukeliančių, DF3 / Muc1 ir hTERT varomų adenovirusų. 8, 32 Tačiau nė vienas iš šių virusų neapjungia abiejų promotoriaus elementų į vieną virusą, kad sureguliuotų E1A raišką ir viruso replikaciją. Kadangi hTERT yra išreikštas> 90% vėžio atvejų, 5, 6 ir DF3 / Muc1 padidėja aktyvumas 75% kietų navikų ir su vėžinėmis kamieninėmis ląstelėmis susijusiose subpopuliacijose, 17, 18 yra onkolitinis virusas, apimantis abi šias savybes. potencialas sukelti onkolitinį aktyvumą įvairiuose žmogaus navikuose ir navikinių ląstelių populiacijose. DF3 ir hTERT ekspresijos heterogeniškumas viename auglyje, aptariamas žemiau, galėtų dar labiau padidinti tokio viruso naudingumą. Šiuo metu mes aprašome naują adenovirusą Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A, kur DF3 / Muc1 ir hTERT genų reguliavimo sekos yra sujungtos į vieną virusą, kad būtų sukurtas terapinis požiūris į heterogeninių naviko ląstelių populiacijas, įskaitant vėžio kamieną. kaip ląstelės, tam tikro paciento navike.

Adeno-hTERT-E1A yra vienas hTERT-E1A kasetės adenovirusas, kuris naudoja hTERT šerdies promotorių, kad sukeltų adenovirusinę E1A ekspresiją panašiai kaip endogeninis viso ilgio hTERT promotorius. 7 Be to, Adeno-hTERT-E1A derina E1A hTERT reguliavimą su E1B srities genų E1B-19 kDa ir E1B-55 kDa ištrynimu, kad dar labiau padidintų naviko ląstelių specifiškumą. 7 Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A yra tos pačios hTERT-E1A ekspresijos kasetės ir E1B genų delecijos, kaip ir Adeno-hTERT-E1A, tačiau, be to, antrojoje E1A ekspresijos kasetėje yra kontroliuojamas pagrindinis DF3 / Muc1 promotoriaus elementas. Šis promotoriaus elementas buvo pasirinktas remiantis ankstesniais promotoriaus delecijos tyrimais 23, 24, 25 ir parodytas čia, kad sureguliuotų ekspresiją priklausomai nuo ląstelių linijos, panašiai kaip endogeninės DF3 / Muc1 RNR. Antrosios E1A geno kasetės įtraukimas nesukėlė dvigubo DF3 / hTERT adenoviruso genomo rekombinacijos ar nestabilumo po viruso amplifikacijos. Funkcionaliai antroji E1A kasetė suteikė Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A galimybę indukuoti aukštesnę E1A raišką, platesnę apoptozę ir didesnę onkolizę, palyginti su Adeno-hTERT-E1A. Visi čia pateikti tyrimai buvo atlikti lygiagrečiai, naudojant kruopščiai titruotas vieno hTERT ir dvigubo DF3 / hTERT adenovirusų partijas, todėl labai tikėtina, kad papildomas Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A aktyvumas atsiranda dėl antrojo, DF3 promotoriaus valdoma E1A kasetė. Pastangos paruošti vieną DF3 virusą šiam įsitikinti buvo nesėkmingos.

Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A onkolitinis aktyvumas buvo padidintas, palyginti su Adeno-hTERT-E1A, keliose auginamose naviko ląstelėse. Padidėjęs aktyvumas taip pat pastebimas in vivo U251 gliosarkomos kieto naviko ksenografijos modelyje (4a pav.). Atsižvelgiant į aukštą U251 ląstelių adenovirusinį užkrečiamumą ir aukštą hTERT promotoriaus aktyvumą, buvo tikimasi, kad abu Adeno-hTERT-E1A ir Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A sukels stiprų priešnavikinį atsaką. Tačiau Adeno-hTERT-E1A, sukėlęs didelę U251 ląstelių mirtį kultūroje, U251 naviko ksenografuose nepasižymėjo reikšmingu priešnavikiniu aktyvumu, priešingai nei Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A. Adeno-hTERT-E1A, bet ne Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A, neveiksmingumas U251 navikams in vivo gali būti paaiškintas 10 kartų sumažėjusia hTERT išraiška kartu su 43 kartus padidėjusiu DF3 / Muc1. ekspresija, kurią stebėjome U251 kietuose navikuose, palyginti su kultivuotomis U251 ląstelėmis (4b paveikslas). Taigi, DF3 / Muc1 promotoriaus, kuris anksčiau buvo įrodytas, padidėjęs aktyvumas sergant daugeliu vėžio rūšių, įskaitant krūties, prostatos, kiaušidžių, kasos, storosios žarnos ir plaučių, atvejais, kai DF3 / Muc1 yra per daug išreikštas, 9, 10, 11, 12, 13 taip pat gali būti naudingas gydant gliosarkomas, tai rodo mūsų atradimas, kad DF3 / Muc1 ekspresija yra maža kultivuojamų U251 ląstelių, bet stipriai padidėja, kai U251 ląstelės auginamos kaip kieti navikai in vivo . Didelis DF3 / Muc1 ekspresijos padidėjimas ir didelis hTERT ekspresijos sumažėjimas taip pat buvo pastebėti A549 navikuose, palyginti su kultivuotomis A549 ląstelėmis (4c paveikslas). Tačiau hTERT nebuvo sureguliuotas esant MDA-MB-231 navikams (4d pav., Dešinėje), ir tai gali paaiškinti, kodėl vienos kasetės Adeno-hTERT-E1A rodo stiprų priešnavikinį poveikį MDA-MB-231 ksenografams. Pagrindiniai veiksniai, lemiantys šiuos pagrindinius DF3 / Muc1 ir hTERT raiškos pokyčius kietojo naviko ksenografuose, nėra žinomi, tačiau DF3 / Muc1 atveju tai gali būti susiję su jo vaidmeniu naviko angiogenezėje ir tarpląstelinės matricos rekonstravime. ląstelių kultūros. Kartu šie atradimai pabrėžia galimą dvigubo promotoriaus reguliuojamo adenoviruso, tokio kaip Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A, naudojimo pranašumą, kuris, kaip tikimasi, turės priešnavikinį poveikį, nepriklausomai nuo to, ar tikslinės naviko ląstelės per daug išreiškia DF3 / Muc1, ar hTERT. Neseniai I fazės klinikiniame tyrime buvo vertinamas hTERT promotoriaus reguliuojamas adenovirusas Telomelizinas, kurio klinikinis aktyvumas buvo ribotas, o kai kuriuose tiriamų pacientų pogrupyje buvo viruso replikacijos įrodymų. Nors pacientų reakcijų heterogeniškumas gali būti susijęs su hTERT heterogeniškumu, apie kurį pranešta pacientų populiacijai, 33 ta galimybė šiame tyrime nebuvo svarstoma. Atsižvelgiant į šiuos atradimus, susijusius su vienu promotoriaus reguliuojamu adenovirusu, ir atsižvelgiant į naviko hTERT raiškos, kuri būdinga atskiriems pacientams, o taip pat galbūt ir individualias tam tikro paciento naviko ląsteles, nevienalytiškumą, būsimi tyrimai, naudojant dvigubą promotoriaus reguliuojamą adenovirusą, pvz. Galima tikėtis, kad E1A / hTERT-E1A gali būti naudingi ir dėl to gali pagerėti klinikinis atsakas.

Naviko ląstelių heterogeniškumas yra plačiai paplitęs, kaip paaiškėjo viso genomo raiškos profiliavimo tyrimais, 34, 35, ir tai gali atsirasti dėl ląstelių diferenciacijos, naviko progresavimo ir klonų išsiplėtimo. 36 Diferencijuota navikinių ląstelių subpopuliacija ir genetinė raida skirtingose ​​mikroaplinkose prisideda prie naviko heterogeniškumo ir daro įtaką vidiniam ir įgytam atsparumui vaistams. 37, 38 Be to, dažnai pastebimas pirminių navikų ir jų metastazavusių pažeidimų nevienalytiškumas, kuris apsunkina vėžio gydymą. Naviko ląstelių heterogeniškumo, susijusio su kamieninių / progenitorinių ląstelių tipo nišomis, diferenciacijos būsenomis ir ciklinės bei neciklinės ląstelių būklės tyrimais 17, išryškėja sunkumai kuriant terapiją, kuri veiksmingai nukreiptų į visas naviko ląstelių populiacijas. Šiuo metu mes ištyrėme galimą Adeno-DF3-E1A / hTERT-E1A naudą gydant heterogeninių naviko ląstelių populiacijas. Dokumentuotas DF3 / Muc1 ir hTERT raiškos heterogeniškumas atskiruose navikuose ir tarp naviko ląstelių linijų bei DF3 / Muc1 tarp ląstelių tam tikroje naviko ląstelių linijoje. 39, 40 DF3 / Muc1 heterogeniškumas taip pat stebimas tarp vėžio diferenciacijos ir progresavimo stadijų, 9, 10, 12 ir hTERT išraiška, taip pat praturtinta metastazavusiais pažeidimais, palyginti su pirminiais navikais. Tokio heterogeniškumo įtaka viruso onkolitiniam aktyvumui buvo akivaizdi ištyrus U251 holoklonus. Holoklonai sudaro nedidelę dalį auginamų naviko ląstelių populiacijos ir rodo praturtėjimą į naviko kamienines ir progenitorines ląsteles. 19 Analysis of the U251 gliosarcoma holoclones isolated in this study revealed a substantial ( ∼ 10-fold) increase in DF3/Muc1 expression coupled with a ∼ 5-fold decrease in hTERT expression compared with the overall population of U251 cells. Correspondingly, substantial decreases in E1A production and oncolysis were observed following infection of the holoclones with Adeno-hTERT-E1A but not Adeno-DF3-E1A/hTERT-E1A. This finding highlights the ability of our dual E1A cassette adenovirus to target a tumor cell subpopulation that may be an important therapeutic target in view of its stem/progenitor cell-like potential. Thus, our work complements recent and proposed efforts to utilize adenoviral vectors to target cancer stem cell populations. 42, 43

The adenoviral E1A protein induces p53-related increases in apoptosis and has strong intrinsic cytotoxic activity. 44, 45, 46 EIA can be used as a therapeutic gene to induce anti-tumor responses, including inhibition of angiogenesis 46 and can sensitize tumor cells to chemotherapy and radiation. 47, 48, 49 In the case of Adeno-DF3-E1A/hTERT-E1A, the absence of the anti-apoptotic activities of both E1B proteins coupled with the high level of E1A expression resulted in early host-cell apoptosis and increased oncolytic activity. However, this early induction of viral host cell death suppressed viral replication and decreased by four to six-fold the subsequent release of functional progeny available for later rounds of infection and viral spread, compared with tumor cells infected with Adeno-hTERT-E1A. Although adenovirus-induced host cell death typically proceeds by an apoptosis-independent pathway, the absence of both anti-apoptotic E1B proteins and the increased cytotoxicity associated with the elevated expression of E1A by Adeno-hTERT-E1A changes the mechanism of cell death from late-stage viral replication-induced lysis to an E1A-dependent apoptosis, as we reported earlier. 7 In cells infected with Adeno-DF3-E1A/hTERT-E1A, the second E1A cassette further increases E1A expression, thereby increasing oncolysis by an apoptotic mechanism, which interrupts viral progeny maturation and decreases viral spread. Accordingly, when we investigated the potential of both viruses to facilitate the spread and expression of the replication-deficient Adeno-2B11, which encodes the CPA-activating cytochrome P450 2B11, 20, 29 Adeno-DF3-E1A/hTERT-E1A was ineffective in facilitating Adeno-2B11/CPA-dependent killing of co-infected tumor cells. We also investigated the oncolytic adenovirus ONYX-015, which has undergone extensive clinical evaluation. 30 ONYX-015 retains one of the two E1B genes, E1B-19 kDa , and in contrast to Adeno-hTERT-E1A induces little or no detectable tumor cell apoptosis. 7 Nevertheless, Adeno-hTERT-E1A exhibited greater helper virus activity toward Adeno-2B11 than ONYX-015, as evidenced by the enhanced chemosensitization of U251 cells to CPA and by the increased production of active prodrug metabolites (4-OH-CPA) seen in U251 cells. The loss of helper virus activity in the case of Adeno-DF3-E1A/hTERT-E1A demonstrates the importance of balancing E1A production with the extent and the timing of virus-induced apoptosis. Indeed, to be most effective, P450 and other prodrug enzyme-based gene therapy strategies require delayed, rather than accelerated death of tumor cells that express the prodrug-activating enzyme. 50

In conclusion, we have engineered a novel dual E1A cassette oncolytic adenovirus that displays improved oncolysis in many cancer cell lines compared with the corresponding single E1A-cassette adenovirus and has the potential to target a heterogeneous tumor cell population, including cancer stem-like cells, which display strong DF3/Muc1 promoter activity. Despite the increased activity of the dual E1A cassette virus as a stand-alone anti-cancer agent, the premature apoptosis of infected tumor cells decreased its potential to replicate and to facilitate helper virus activity. Future studies may examine adenoviral genomes that combine the dual promoter E1A gene control described here with the retention of adenoviral E1B and/or E3 region genetic elements to prevent premature host cell apoptosis and thereby facilitate more efficient production of viral progeny while maintaining activity in a wide range of cancer types and tumors with heterogeneous tumor cell populations.

Žodynas

4-OH-CPA

4-hydroxycyclophosphamide

CMV

citomegalo virusas

CPA

ciklofosfamidas

E1A

early adenoviral region 1A

FBS

vaisiaus galvijų serumas

hTERT

human telomerase

MOI

daugybė infekcijos

PARP

poli (ADP-ribozės) polimerazė

pfu

apnašas formuojantys vienetai

qPCR

quantitative PCR

RPMI

Roswell Park Memorial Institute