Dvigubi hemidesmosominių baltymų vaidmenys kasos epitelyje: nusprendžia fosfoinositido 3-kinazė | onkogenas

Dvigubi hemidesmosominių baltymų vaidmenys kasos epitelyje: nusprendžia fosfoinositido 3-kinazė | onkogenas

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių invazija
  • Ląstelių signalizavimas
  • Onkogenezė
  • Kasos vėžys

Anotacija

Atsižvelgiant į tai, kad chemoterapija ir bioterapija nepavyksta kovoti su išplitusiu kasos vėžiu, vienas didžiausių iššūkių yra nustatyti kritinius įvykius, kurie sukelia invaziją. Vienas pradinis epitelio kancerogenezės etapas yra epitelio ląstelių tvirtinimo prie pagrindinės membranos, kurią gali užtikrinti hemidesmosomos (HD), sutrikimas. Tačiau HD egzistavimas kasos latakų epitelyje ir jų vaidmuo kancerogenezėje nėra ištirtas. HD buvo tiriami normaliose ir vėžinėse kasos ląstelėse bei pacientų mėginiai. Tada, siekiant ištirti dinaminio HD vaidmenį ir molekulinius mechanizmus kasos kancerogenezės metu, buvo naudojami unikalūs vėžio ląstelių modeliai, kuriuose HD surinkimą galima farmakologiškai manipuliuoti somatostatino / sst2 signalų perdavimu. Netikėtai pranešame, kad žmogaus kasos latakų epitelyje yra subrendusių 1 tipo HD, turinčių α6β4 integrino ir bullous pemfigoido antigeno BP180. Svarbu tai, kad HD yra išardoma kasos kancerogenezės metu. Skaidymui dėl HD reikia nuo fosfoinositido 3-kinazės (PI3K) priklausomos indukcijos iš matricos metaloproteazės MMP-9, kuri skaido BP180. Taigi integrinas α6β4 išsidėsto į ląsteles vedančius kraštus, kur paradoksaliai skatina ląstelių migraciją ir invaziją per S100A4 aktyvaciją. Kadangi S100A4 savo ruožtu skatina MMP-9 ekspresiją, užburtas ciklas palaiko BP180 skilimą. Šios PI3K-MMP-9-S100A4 signalizacijos kilpos inaktyvacija atvirkščiai blokuoja BP180 skilimą, sukelia HD pakartotinį surinkimą ir slopina ląstelių invaziją. Darome išvadą, kad subrendę 1 tipo HD yra kritinės kasos latakų epitelio tvirtinimo struktūros, kurių suirimas, aktyvavus PI3K kancerogenezės metu, išprovokuoja kasos vėžio ląstelių migraciją ir invaziją.

Įvadas

Kasos latakų adenokarcinoma (PDAC) yra ypač sudėtingas piktybinis navikas, atsižvelgiant į paprastai išplėstinę invazinę stadiją diagnozuojant ir gana ribotas gydymo galimybes. 1 Aišku, kad reikia geriau suprasti molekulinius kelius, susijusius su ankstyva PDAC invazija.

Invazijos proceso pradinis etapas yra epitelio ląstelių atsiskyrimas nuo pagrindinės membranos (BM). 2 Hemidesmosomos (HD) yra kelių baltymų kompleksai, užtikrinantys stabilų epitelio ląstelių sukibimą su pagrindine KM. Subrendę 1 tipo HD yra sudaryti iš α6β4 integrino, plektino, bulious pemfigoido (BP) antigenų BP180 (dar vadinamų BPAG2 arba XVII tipo kolageno) ir BP230 (BPAG1). Transmembraninis α6β4 ir BP180 jungiasi prie laminino-332 BM, o tarpląstelinis HD stabilizavimas vyksta dėl jų sujungimo su keratino tarpiniais siūlais per du plaksus - plektiną ir BP230, taip sukuriant stabilų tvirtinimo kompleksą. 3 Šios subrendusios 1 tipo HD struktūros buvo aprašytos (pseudo) stratifikuotoje ir tam tikroje sudėtinėje epitelyje, tačiau tik paprastame pieno kilmės epitelyje. Iš tiesų, paprastai aprašomas paprastas epitelio sukibimas su pamatiniu BM, nes tai susiję su nesubrendusiais 2 tipo HD, kuriuose yra tik α6β4 integrino ir plektino. 5

HD yra labai dinamiškos struktūros, kurias galima greitai išardyti tokiomis sąlygomis, kai reikalingas (dalinis) atsiskyrimas nuo KM, įskaitant normalų epitelio ląstelių dalijimąsi, diferenciaciją ar migraciją. HD sutrikimas palengvina ne tik ląstelių atsiskyrimą nuo BM, bet ir α6β4 integrino, kuris yra pagrobtas iš pagrindinės „ląstelių tvirtinimo“ funkcijos HD, funkciją, siekiant skatinti ląstelių migraciją. Integrino α6β4 delokalizaciją bent iš dalies sukelia augimo faktoriaus stimuliuojamas β4 subvienetų fosforilinimas ir tai priklauso nuo jo, tokiu būdu palengvinant jo atsiribojimą nuo hemidesmosominių partnerių. 5, 7, 8 Esant šiai fosforilintai formai, α6β4-integrinas yra susikaupęs ties ląstelių priekiniais kraštais, kur jis skatina judrumą, pertvarkydamas citoskeletinį aktiną, taip pat proliferaciją ir išgyvenimą. 6

Įdomu tai, kad α6β4 integrinas yra per daug ekspresuojamas ir perkeliamas į naviko invazinius frontus invazinėse ir metastazavusiose karcinomose, įskaitant krūties, storosios žarnos, plokščiųjų ląstelių karcinomą ir PDAC. 9, 10, 11, 12. Nustatyta, kad pakitusi α6β4 integrino ekspresija ir lokalizacija yra suragėjusių ląstelių karcinoma, susijusi su HD skaidymu, kuris yra kritinis žingsnis link vėžinių ląstelių invazijos. Be to, plektinas yra pirmasis PDAC biomarkeris, leidžiantis aptikti pirminius ir metastazavusius PDAC pažeidimus, 13, 14, tačiau jo per didelis ekspresijos kasos vėžio ląstelėse mechanizmas ir reikšmė yra mįslingi. Neseniai paskelbtoje ataskaitoje aprašoma plektino ir β4 integrino sąveika kasos vėžio ląstelėse, kuri nutrūksta aktyvavus RON receptorius, palengvinant ląstelių migraciją. 15 Ši literatūra rodo kritinį hemidesmosomalinių baltymų vaidmenį PDAC. Tačiau jų vaidmuo normaliame kasos latakų epitelyje ir kancerogenezės metu liko nežinomas.

Anksčiau įrodėme, kad 90% žmogaus PDAC praranda su G baltymu sujungto sst2 receptoriaus ekspresiją. Pakartotinai ekspresuodamasis kasos vėžio ląstelėse, sst2 pristato onkosupresinį poveikį, slopindamas naviko augimą, angiogenezę ir metastazę. 16, 17, 18 Naudojant kelis sst2 ekspresuojančius vėžinių ląstelių modelius, įskaitant kasą, mes pranešame, kad sst2 slopina ląstelių migraciją ir invaziją, priversdamas surinkti HD HD. Svarbu tai, kad pirmąjį paprasto kasos latako epitelio aprašą pateikiame subrendusiems 1 tipo HD, kurie sutrinka kasos kancerogenezės metu, bet atstatomi po sst2 pakartotinės ekspresijos. Tai yra pirmasis aprašytas farmakologinio peptido / receptoriaus signalas, sukeliantis šių tvirtinimo struktūrų surinkimą iš naujo. Naudojant sst2 ekspresuojančius ląstelių modelius, nustatomi molekuliniai HD apykaitos mechanizmai kasos vėžio ląstelėse. Jie apima pagrindinio onkogeninio fosfoinositido 3-kinazės (PI3K) kelio reguliavimą.

Rezultatai

Subrendę 1 tipo HD, kurių sudėtyje yra BP180, yra žmogaus kasos latakuose, tačiau jie išardomi PDAC kartu su BP180 skilimu.

Nors α6β4 integrino β4 subvienetas yra per daug ekspresuojamas ir delokalizuotas žmogaus PDAC, jo funkcija normalioje kasoje 10 nežinoma. Todėl HD yra buvęs ištirtas žmogaus PDAC ir normalių gretimų audinių mėginiuose, taip pat žmogaus kasos latakų epitelio (HPDE 19 ) normaliose ir vėžinėse (BxPC-3, CFPAC-1) ląstelėse (1 paveikslas). Atliekant įprastų kasos latakų imunohistocheminę analizę, tiek β4, tiek BP180 baltymai susitelkia ties latakų epitelio baziniu sluoksniu, susilietę su KM (1a paveikslas, N, rodyklės galvutės). Tačiau PDAC mėginiuose abu baltymai išsidėstę iš šių ląstelių ir substrato kontaktinių vietų: 60 žmogaus PDAC atvejų analizė (1 lentelė) rodo, kad β4 ir BP180 integrinas yra labai išreikštas 65 ir 80% PDAC, kur jie dažnai yra delokalizuojami. atitinkamai 95 ir 83% (delokalizacija> 25% ląstelių), esant vėžinių ląstelių, esančių „latakų liaukose“ (1a pav., T, rodyklės), ląstelių tarpusavio šoniniams kontaktams (1a pav., T rodyklės), o integrino β4 - izoliuotų invazinių vėžio ląstelių membranomis migruojančios struktūros (1a pav., T, intarpas). Įdomu tai, kad BP180 delokalizacija yra koreliuojama su naviko laipsniu ( r 2 = 0, 68), o 17% PDAC 1 laipsnio lokalizacijos vis dar yra bazinė BP180 lokalizacijos reikšmė, palyginti su 5% integrinu β4, o tai rodo, kad β4 integrinas delokalizuojasi ankstyvoje kasos vėžinės vėžio genezės metu. pranešė. Nepaisant to, kai BP180 yra delokalizuotas, β4 integrinas taip pat delokalizuojamas ( r 2 = 0, 66). Celiuliozėje subrendusių 1 tipo HD diskų buvimą patvirtina α6, β4 ir BP180 integruotos struktūros, išreikštos panašiomis į pleistrą struktūromis (būdingos HD), vaizduojamos normalių HPDE ląstelių baziniame sluoksnyje atliekant konokalinę mikroskopiją, ir ten, kur α6 ir BP180 kolokalizuojasi (1b paveikslas, HPDE, rodyklių galvutės nukreiptos į HD). Priešingai, tiek β4, tiek BP180 integrinas yra perkeltas į vėžinių BxPC-3 ir CFPAC-1 ląstelių priekinius kraštus (β4) ir į ląstelių kontaktus (β4 ir BP180) (1b paveikslas, rodyklės). BxPC-3 ląstelėse α6 ir β4 integrinai, bet ne BP180, kolokalizuojasi lamellipodijoje (papildomas S1A paveikslas, rodyklės). Β4 integrinas imponuoja kartu su kitais subrendusio 1 tipo HD hemidesmosominiais komponentais, tai yra, BP180, BP230, plektinu ir α6 integrinu normalioje HPDE, bet ne vėžinėse BxPC-3 ląstelėse, kuriose yra tik α6 ir β4 integrinai. kompleksas (1c paveikslas). Perdavimo elektroninė mikroskopija patvirtina, kad subrendę 1 tipo HD yra tarpląstelinės matricos (ECM) kontaktuose latakų ląstelėse (1d paveikslas, rodyklės, normali žmogaus kasa). Atrodo, kad viso ilgio hemidesmosominis BP180 baltymas yra ekspresuojamas normaliame žmogaus kasos audinio ir HPDE ląstelių mėginiuose (atitinkamai 1e paveikslas, N 1, 2, 3 ir HPDE). Keista, bet BP180 suskaidoma į 120 kDa formą (BP120) PDAC ir BxPC-3 vėžio ląstelėse, kur vyrauja ši BP120 forma (atitinkamai 1e pav., T 1–5 ir BxPC-3). Šie rezultatai pirmą kartą apibūdina subrendusių 1 tipo HD, turinčių BP180, buvimą paprastame kasos latakų epitelyje. Šios tvirtinimo struktūros sunaikinamos kasos vėžio mėginyje, galbūt per BP180 skilimą, ir tai rodo vaidmenį PDAC ląstelių invazijoje.

Image

Subrendusios 1 tipo HD tipo struktūros, turinčios BP180, yra žmogaus kasos latakuose, tačiau jos išardomos PDAC kartu su BP180 skilimu. a ) Imunohistochemija, naudojant anti-β4 arba anti-BP180 antikūnus normalioje (N) arba tumoralinėje (T) parafino įterptose kasos atkarpose (atitinkamai 12 arba 60 skirtingų normalių kasos ar PDAC mėginių). ( b ) α6, β4 arba BP180 integrinų imunofluorescencinės mikroskopinės analizės normalios kasos HPDE ir vėžio BxPC-3 bei CFPAC-1 ląstelėse. Parodyta α6-integrino ir BP180 kolokacija (susijungimas). Rodyklių galvutės nurodo į hemidesmosomas, rodyklės - į migracijos struktūras prie ląstelių priekinių kraštų (vienas laukas reprezentuoja n = 5 nepriklausomas analizes). Įdėklai rodo didesnį padidintą hemidesmosomų vaizdą. c ) serijinis imuninis tirpinimas, naudojant anti-BP180, -BP230, -plektiną, -integrino α6, o po to β4 integrino (pakrovimo kontroliniai) antikūnus, naudojant HPDE arba BxPC-3 ląstelių ekstraktus, po β4 integrino imunoprecipitacijos arba naudojant visus baltymų ekstraktus ( nėra imunoprecipitacijos (ip): indėlis = 10% ekstraktų, naudojamų ip) (reprezentatyvus n = 3 nepriklausomi eksperimentai). d ) normalaus žmogaus kasos TEM (vienas laukas reprezentuoja n = 3 nepriklausomas analizes). e ) imunoblotai, naudojant anti-BP180 ir anti-pan-citokeratino (CK) arba anti-β-tubulino (įkrovimo kontrolinius) baltymų antikūnus iš kasos normalios HPDE ir vėžio BxPC-3 ląstelių bei iš normalių (N 1, 2, 3 ) ir navikiniai (T 1, 2, 3, 4, 5 ) kasos mėginiai.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Sstostatino sst2 receptoriaus aktyvinimas: farmakologinis būdas surinkti HD

Anksčiau įrodėme, kad somatostatino receptoriaus sst2 ekspresija BxPC-3 vėžio ląstelėse sumažina jų tumorigeninį poveikį. Dėl to konfokalinės mikroskopijos metu HD (HD) būklė buvo palyginta su modeliais (BxPC-3 / sst2), palyginti su sst2 (BxPC-3 / sst2). Tėvų BxPC-3 / maketinėse ląstelėse integrino subvienetai β4 ir α6 (papildomas paveikslas S1A) kolokalizuojasi ties ląstelių priekiniais kraštais (rodyklėmis) (papildomas paveikslas S1A), artimai kontaktuodami su židinio kompleksu susijusiu baltymu paxilinu (2a paveikslas). ), o plektinas pasiskirsto citoplazmoje (papildomas paveikslas S1B). Priešingai, BXPC-3 / sst2 bazinių ląstelių ir substrato kontaktuose stebimos HD struktūrai būdingos pleistrų struktūros, apimančios α6 ir β4 kolokalizuotus integruotus subvienetus su BP180 ir plektinu (2a paveikslas, papildomi S1C ir S1D paveikslai, rodyklių galvutės). ląstelių, nurodant, kad sst2 signalo atkūrimas gelbsti subrendusių 1 tipo HD formavimąsi, panašų į tuos, kurie stebimi ne transformuotose HPDE ląstelėse (1b pav.). Atitinkamai, imunodepresitacijos eksperimentai, naudojant anti-integriną β4, patvirtina BP180 ir α6 integrino buvimą komplekse su β4 BxPC-3 / sst2, tuo tarpu tik α6 integrinas, bet ne BP180 yra imunodepresuotas kartu su β4. „BxPC-3 / maketo ląstelės“ (2b paveikslas). Mes anksčiau įrodėme, kad sst2 receptoriaus aktyvinimas priklauso nuo autokrininės kilpos, kai sst2 transfekcija BxPC-3 ląstelėse, kurios endogeniškai šio receptoriaus neišreiškia, skatina sst2 ligando somatostatino, kuris savo ruožtu nuolat suaktyvėja, ekspresiją ir sekreciją. jo receptorių. 17 Įdomu tai, kad somatostatino ekspresijos numušimas naudojant specifinę mažą trukdančią RNR (siRNR) (siSom), kuri užtemdo šią autokrininę kilpą, 18 panaikina HD montažą BxPC-3 / sst2 ląstelėse ir skatina integrino β4 delokalizaciją į ląstelės priekinius kraštus ( Papildomas paveikslas S1B). Priešingai, iššūkis BxPC-3 / sst2 ląstelėms (anksčiau perkeltoms su siSom) su specifiniu sst2 agonistu BIM23197 išgelbėja HD, tai rodo, kad HD surinkimas priklauso nuo somatostatino (papildomas paveikslas S1E). Norint tiesiogiai vizualizuoti HD in vivo , buvo atlikta perdavimo elektronų mikroskopija navikams, atsirandantiems po poodinėmis BxPC-3 / mock ar BxPC-3 / sst2 ląstelėmis plikomis pelėmis. 17 Vaizdai rodo, kad subrendę 1 tipo HD yra lėtai augančiuose sst2 ekspresuojančiuose navikų ksenografuose (2c paveikslas, rodyklės galvutės), bet ne sparčiai augančiuose maketo BxPC-3 navikuose (papildomas paveikslas S1F).

Image

sst2 sukelia 1 tipo HD surinkimą kasos vėžio ląstelėse. a ) Bendras dažymas naudojant anti-β4 ir anti-paxillin antikūnus BxPC-3 / modelio ląstelėse arba anti-BP180 ir anti-α6 antikūnus BxPC-3 / sst2 ląstelėse, analizuojamas konfokaliniu vaizdavimu (vienas laukas reprezentuoja n = 5 nepriklausomos analizės). Rodyklių galvutės ir strėlės yra tokios, kaip parodyta 1b paveiksle. Įterpti į sujungtą vaizdą rodo didesnį padidintą hemidesmosomų vaizdą. ( b ) Serijinis imuninis tirpinimas naudojant anti-BP180, -integrino α6, o paskui -integrino β4 (pakrovimo kontrolinius) antikūnus, naudojant BxPC-3 / mock arba BxPC-3 / sst2 ląstelių ekstraktus, arba BxPC-3 / mock ląsteles, apdorotas 24 h. atlikus LY294002, atlikus β4 integruotojo imunoprecipitaciją, arba naudojant visus baltymų ekstraktus (be imunoprecipitacijos (ip): įvestis = 10% ip naudojamų ekstraktų) (reprezentuojanti n = 3 nepriklausomus eksperimentus). c ) TEM navikų, gautų iš poodinių BxPC-3 / sst2 ląstelių ksenografų, atvaizdai, rodantys tipiškus trišalius 1 tipo elektronus HD, esančius ląstelės ir substrato sąlyčio vietose. D yra desmosomos (vienas laukas reprezentuoja n = 3 nepriklausomas analizes).

Visas dydis

Tada mes ištyrėme, ar subrendusio 1 tipo HD kaupimas po aktyvavimo sst2 gali būti apibendrintas kitoms sst2 ekspresuojančioms ląstelėms. Yra žinoma, kad HaCaT keratinocitai turi HD ir išreiškia sst2 (papildomas paveikslas S2A). Žinoma, kad gydymas epidermio augimo faktoriumi (EGF) išardė HD keratinocituose. Tai atvaizduojama tiek β4 integrino nukreipime į ląstelių priekinius kraštus (migruojančias struktūras), tiek BP180 perkėlimą į kontaktus tarp ląstelių (papildomas paveikslas S2B, strėlės). Ląstelių gydymas kartu su BIM23197 (sst2 agonistu) panaikina šias EGF sukeltas delokalizacijas, priversdamas surinkti HD, o tai rodo vizualinis integrino β4 ir BP180 buvimas pleistrų pavidalo struktūrose (papildomas S2B paveikslas, rodyklės galvutės). Panašiai, vartojant BIM23197, burnos ir ryklės plokščiųjų ląstelių karcinomos HSC-3 ląstelėse, kurios ekspresuoja sst2 receptorius (papildomas S2A pav.) Ir kur β4 integrinas yra ląstelių priekiniuose kraštuose (papildomas S2C paveikslas, rodyklės), gydymas BIM23197. (Papildomas S2C paveikslas, rodyklių galvutės). Šie rezultatai rodo, kad sst2 kontroliuoja HD surinkimą skirtingos kilmės epitelio ląstelėse.

HD skaidymas skatina kasos vėžio ląstelių migraciją ir invaziją

Tada mes hipoteze, kad HD suskaidymas kasos kancerogenezės metu yra labai svarbus norint įgyti ląstelių migracines ir invazines savybes. Norėdami ištirti šią hipotezę, pasinaudojome savo HD sukelta sistema „sst2“. Nuskaityta elektroninė mikroskopija atskleidžia drastiškus fenotipinius pokyčius, kuriuos sukelia sst2 ekspresija BxPC-3 ir HaCaT ląstelėse (atitinkamai S3A ir S4A paveikslai). Membranos išsikišimai, dar vadinami nugaros raukšlėmis, banguojančiais BxPC-3 / maketo ir EGF apdorotų HaCaT ląstelių membranos paviršiais ir sukeliantys filopodiją bei lamellipodiją, rodo migracijos aktyvumą. Tai taip pat patvirtina F-aktino, rodančio žievės struktūrą, pasiskirstymas lamellipodia skleidžiant BxPC-3 / maketo ląsteles (papildomas paveikslas S3B, rodyklė). Membranos išsikišimų nėra sst2 ekspresuojančiose BxPC-3 / sst2 ląstelėse (papildomas S3B paveikslas), kuriose F-aktinas susistemėja į daugiakampį aktino tinklą, būdingą nemotorinėms ląstelėms. Panašiai EGF + BIM23197 apdorotos HaCaT ląstelės išlyginamos ant lėkštelės, parodant didelius ląstelių ir ląstelių kontaktus, tiksliai taip, kaip HaCaT ląstelės liko neapdorotos (papildomas S4A paveikslas). Kiekybiškai BxPC-3 / sst2 ląstelių migracinės savybės smarkiai sumažėja, palyginti su BxPC-3 / maketinėmis ląstelėmis (3a paveikslas), o BIM23197 žymiai sumažina EGF migracijos poveikį HaCaT ląstelėse (papildomas S4B paveikslas, apatinė panelė). .

Image

HD skaidymas skatina kasos vėžio ląstelių migraciją ir invaziją. ( a, c ) BxPC-3 / modelio, palyginti su BxPC-3 / sst2, ir siCTR, palyginti su siBP180 perkeltų BxPC-3 / sst2, migracijos ( a ) arba invazijos ( c ) kiekybinis įvertinimas. Rezultatai yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis (± sem), normalizuotas pagal vertes, gautas atitinkamai BxPC-3 / mock ląstelėms arba siCTR perkeltoms BxPC-3 / sst2 ląstelėms. (*** P <0, 005; ** P <0, 01; * P <0, 05). b ) Imunoblotai, naudojant baltymų ekstraktų iš siCTR arba siBP180 perkeltų BxPC-3 / sst2 ląstelių (viršutinės plokštės) baltymų ekstraktų anti-BP180 arba anti-CK18 (įkrovimo kontrolės) antikūnus (reprezentatyvus n = 3 nepriklausomiems eksperimentams). Imunofluorescencinis β4 subvienetų vaizdavimas siCTR arba siBP180 perkeltose BxPC-3 / sst2 ląstelėse (apatinės plokštės) (vienas reprezentatyvus laukas, kai n = 5 nepriklausomos analizės). Rodyklių galvutės ir strėlės yra tokios, kaip parodyta 1b paveiksle. ( d, e ) hematoksilino eozinu (HE) dažantys užšaldyti naviko skyriai, gauti po ksenografijos į BxPC-3 / modelio arba BxPC-3 / sst2 ląstelių CAM ( d ) arba siCTR arba si-BP180 perkeltų BxPC- 3 / sst2 ląstelės ( e ) (vienas reprezentatyvus laukas n = 3 nepriklausomi eksperimentai, 10 kiaušinių kiekvienoje sąlygoje). Mėginiai, nurodyti e punkte, taip pat buvo paženklinti Ki67 antikūnais. f ) Imuninis tirpinimas naudojant kondicionuotų terpių (CM) anti-laminin-332 arba MMP-2 (įkrovimo kontrolinis) antikūnus iš siCTR arba si-BP180 transfekuotų BxPC-3 / sst2 ląstelių (reprezentuojančių n = 3 nepriklausomus eksperimentus). .

Visas dydis

Norėdami ištirti, ar ląstelių migracijos sumažėjimas, kurį sukelia sst2, priklauso nuo HD pakartotinio surinkimo, mes privertėme HD išmontavimą, pervesdami siRNR, nukreiptą į BP180 (siBP180), BxPC-3 / sst2 arba HaCaT ląstelėse. BP180 nutildymas BxPC-3 / sst2 ląstelėse sukelia HD suskaidymą, kurį patvirtina β4 dažytų pleistrų pavidalo struktūrų išnykimas (3b paveikslas) ir migracija, taip pat invazija yra sustiprinta iki lygių, panašių į tuos, kurie stebimi BxPC-3 / juokingos ląstelės (3a ir c paveikslai). Priešingai, BP180 ekspresijos panaikinimas BxPC-3 / maketinėse ląstelėse neturi įtakos ląstelių migracijai ar invazijai (nerodyta). Po BP180 nutildymo „HaCaT“ ląstelėse (papildomas S4B paveikslas, viršutinis skydelis), BIM23197 nebeleidžia užkirsti kelio HD išmontavimui, kurį išprovokuoja EGF (papildomas paveikslas S4C), ir todėl nebeleidžia užkirsti kelio EGF stimuliuotai migracijai (papildomas S4B paveikslas, apatinis skydas).

Tada buvo tiriamas HD dalyvavimas kasos vėžio ląstelių invazijoje, ksenografuojant BxPC-3 ląsteles in vivo ant viščiuko chorioallantoinės membranos (CAM). Kaip parodyta anksčiau, 18 sst2 išraiška žymiai sumažina naviko augimą (6, 6 ± 1, 9 mm 3, kai BxPC-3 / sst2, palyginti su 30, 1 ± 8, 3 mm 3, kai BxPC-3 / maketinės ląstelės) (papildomas S3C paveikslas). Įdomu tai, kad BxPC-3 / maketo navikai rodo invazinius migruojančių ląstelių priekinius frontus į CAM, tuo tarpu BxPC-3 / sst2 navikai išlieka maži ir lokalizuoti (3d pav.). Svarbu tai, kad siBP180 transfekuotos BxPC-3 / sst2 ląstelės efektyviau įsiveržia į CAM nei siCTR transfekuotos ląstelės, tai patvirtina gilesnis įsiskverbimas į CAM (3e pav.). Nutildžius BP180 BxPC-3 / sst2 ląstelėse, taip pat išsiplėtę CAM navikai (28, 9 ± 9, 1, palyginti su 2, 8 ± 1, 9 mm 3, esant siCTR transfekuotiems navikams) (papildomas S3C paveikslas), nors tai nedaro įtakos BxPC-3 / sst2 ląstelių proliferacijai CAM in vivo tyrimas (3d paveikslas, Ki67 ženklinimas), taip pat ląstelių išgyvenimas ar proliferacija in vitro (papildomas S3D paveikslas). Įdomu tai, kad BP180 nutildžius BxPC-3 / sst2 ląstelėse, atitinkamuose CAM navikuose pastebimas padidėjęs ECM nusėdimas (žvaigždutės, 3e pav.), Paaiškinantis, kodėl šie navikai yra padidėję, palyginti su kontrolinėmis (siCTR perkeltomis). Tai atitinka padidėjusį laminino-332 sekreciją siBP180-, palyginti su siCTR- transfekuotomis BxPC-3 / sst2 ląstelėmis (3f pav.). Šie rezultatai rodo, kad somatostatino / sst2 signalizacija sukelia HD surinkimą skirtingose ​​epitelio ląstelėse, įskaitant kasos vėžio ląsteles ir keratinocitus; Taigi HD surinkimas slopina ląstelių migracijos ir (arba) invazines savybes.

Molekuliniai mechanizmai, pagrindžiantys HD suskaidymą kasos vėžio ląstelėse

Vėliau buvo ištirtas BP180 skaidymo (į BP120, 1e pav.) Įsiskverbimas į HD. Buvo aprašyta, kad BP180 skilimas į BP120 vyksta tarpląsteliniu būdu, atpalaiduodamas BP120 fragmentą ECM. HD, kurį vėl surinko sst2 ekspresija BxPC-3 ląstelėse, koreliuoja su BP180 kaupimu ląstelių ekstraktuose (4a pav., Ląstelės) ir su BP120 ekspresijos sumažėjimu ląstelių kondicionuojamoje terpėje (4a pav., CM), o BP180 mRNR ekspresija. neturi įtakos sst2 (papildomas paveikslas S5A). Anksčiau mes parodėme, kad sst2 slopina PI3K BxPC-3 ląstelėse. 17 slopindamas PI3K (LY294002) BxPC-3 / maketinėse ląstelėse, BP180 suskaido į BP120 (4b paveikslas) ir imituoja sst2 efektą, atkurdamas HD jungtį: β4 ir BP180 integrinai yra perkeliami į tipiškas pataisas primenančias HD 1 tipo struktūras, kur BP180 ir α6 integrinas kolocalizuojasi (4c ir d paveikslai, rodyklės galvutės), ir BP180 kartu imponuoja implantą α6β4 (2b paveikslas). Kitoje žmogaus kasos vėžio CFPAC-1 ląstelių linijoje patvirtinta, kad HD montažas atsistato slopinant PI3K (4e pav.). Priešingai nei sst2wt, mutanto sst2 baltymo (sst2 Y71F ), kuris neveiksmingas slopinant PI3K, ekspresija BxPC-3 ląstelėse 17 neveikia nei BP180 / BP120 santykio (papildomas paveikslas S5B), nei atkuria HD sąveiką (papildomas paveikslas S5C). HD surinkimas BxPC-3 / sst2 ląstelėse taip pat susijęs su nuo PI3K nepriklausančio kito hemidesmosomalinio komponento BP230 mRNR ir baltymų (papildomas S5A paveikslas ir papildoma S5B pavidalas) kaupimu iš HD sujungtų citokeratinų 5 ir 14 (papildomas paveikslas S5D ir E) ir su pažymėtu citokeratino tinklo tankinimu (papildomas S5D paveikslas, perdavimo elektronų mikroskopija).

Image

Nuo PI3K priklausomo BP180 skilimo vaidmuo suskaidant HD. ( a, b ) Imunoblotai, naudojant anti-BP180, CK18 (įkrovos kontrolė), BP120, MMP-9 arba MMP-2 (pakrovimo kontrolė) ląstelių ekstraktų (ląstelių) arba kondicionuotų terpių (CM) iš BxPC-3 / maketo antikūnus ir BxPC-3 / sst2 ląstelės ( a ), arba iš BxPC-3 / maketinės ląstelės, apdorotos 24 valandas DMSO arba 25 μM LY294002 ( b ) (reprezentuojančios n = 3 nepriklausomus eksperimentus). ( c – e ) imunofluorescencinis konfokalinis vaizdas ant BxPC-3 / modelio ( c, d ) arba CPAC-1 ( e ) ląstelių, apdorotų DMSO arba LY294002, kaip aprašyta b punkte, naudojant anti-β4 ir anti-BP180 antikūnus ( c, e ) arba dažytos kartu su anti-BP180 ir anti-α6 antikūnais ( d ) (vienas reprezentatyvus laukas n = 5 nepriklausomos analizės). Rodyklių galvutės ir strėlės yra tokios, kaip parodyta 1b paveiksle. Įdėklai rodo didesnį padidintą hemidesmosomų vaizdą.

Visas dydis

Kaip mes parodome, kad sst2 sumažina matricos metaloproteazės MMP-9 (4a paveikslas, CM), kuri yra gerai ekspresuojama ir teigiamai reguliuojama PI3K keliu BxPC-3 / maketinėse ląstelėse, ekspresiją (gydymas LY294002 mažina jos raišką: pav. 4b, CM), mes iškėlėme hipotezę, kad MMP-9 skaido tarpląstelinį BP180 domeną, taip sukeldamas HD išardymą. MMP-9 nėra ekspresuojamas normaliose žmogaus kasos latakų ląstelėse, tačiau jo ekspresija stebima 100% 60-ies žmonių PDAC atvejų grupėje (5a paveikslas). Apskaičiuotas MMP-9 ekspresijos (tiek vėžio, tiek stromos ląstelėse) balas yra teigiamai koreliuojamas su BP180 delokalizacija iš ląstelių ir substrato kontaktinių vietų ( r 2 = 0, 84). BxPC-3 / maketų ląstelių apdorojimas rekombinantiniu, aktyviu MMP-9 (rMMP-9) yra pakankamas, kad būtų sukeltas HD suskaidymas, kurio pakartotinį surinkimą paskatino PI3K inhibitorius LY294002 (5b paveikslas, rodyklės rodo migracijos struktūras). Panašiai BxPC-3 / sst2 ląstelių apdorojimas rMMP-9 yra pakankamas HD skilimui skatinti (5c paveikslas). siRNR sąlygotas MMP-9 nutildymas BxPC-3 / maketinėse ląstelėse neleidžia BP180 suskaidyti į BP120 (5d pav., CM ir ląstelės), o BxPC-3 / sst2 ląstelių apdorojimas rMMP-9 skatina BP180 skilimą į BP120 (pav. 5e, CM ir ląstelės). Tačiau MMP-9 sunaikinimas BxPC-3 / maketinėse ląstelėse (siRNR) nėra pakankamas, kad būtų galima pradėti HD surinkimą (papildomas S6A paveikslas). Čia MMP-9 vaidmuo skaidydamas BP180 taip pat patvirtinamas HBS-3 plokščių karcinomos ląstelėse (papildomas S6B paveikslas), kurios taip pat išreiškia suskaidytą BP120 formą. Šie rezultatai yra pirmasis įrodymas, kad PI3K slopinimas (naudojant specifinį jo inhibitorių LY294002 arba per somatostatino / sst2 signalus) yra būtinas ir pakankamas, kad būtų galima pakartotinai surinkti HD kasos vėžio ląstelėse. Atvirkščiai, išreikšdamas aktyviąją PI3K efektoriaus MMP-9 formą, jis sužlugdomas, net jei jo slopinimas yra būtinas (norint slopinti BP180 skilimą), bet nepakankamas norint atkurti HD.

Image

Nuo MMP-9 priklausomo BP180 skilimo vaidmuo suskaidant HD. Imunohistochemija naudojant anti-MMP-9 antikūnus normalioje (N) arba navikinėje (T) parafino įterptose kasos atkarpose (atitinkamai 12 arba 60 skirtingų normalių kasos ar PDAC mėginių). ( b, c ) β4 imunofluorescencinis konfokalinis vaizdavimas ant BxPC-3 / modelio ( b ) arba BxPC-3 / sst2 ( c ) ląstelių, apdorotų DMSO, LY294002 arba su 25 μM LY294002 ir 100 ng / ml rekombinantinio junginio deriniu. MMP-9 (rMMP-9) ( b ) arba su rMMP-9 ( c ) (vienas reprezentatyvus laukas n = 5 nepriklausomos analizės). Rodyklių galvutės ir strėlės yra tokios, kaip parodyta 1b paveiksle. ( d, e ) Imunoblotai, naudojant anti-BP180, CK18 (įkrovos kontrolė), BP120, MMP-9 arba MMP-2 (pakrovimo kontrolė) antikūnus iš siCTR arba siMMP-9 transfekuotų BxPC-3 / maketinių ląstelių ekstraktų ir kondicionuotą terpės ( d ) arba rMMP-9 apdorotų BxPC-3 / sst2 ląstelių ekstraktų ir kondicionuotų terpių ( e ) (reprezentuojančių n = 3 nepriklausomus eksperimentus). Atminkite, kad anti-MMP-9 antikūnas atpažįsta endogeninę (e) MMP-9 formą BxPC-3 / maketinėse ląstelėse, tuo tarpu atpažįsta rekombinantinę (r) formą, greitesnę mobilumą SDS – PAGE, nei endogeninė, BxPC– 3 / sst2 ląstelės (kurios neišreiškia endogeninės formos).

Visas dydis

Įjungus HD montažą, išvengiama kasos vėžio ląstelių invaziškumo, nes tai daro įtaką α6β4 integrino proinvaziniam signalizacijos keliui.

Kai jis perkeliamas į invazinius frontus, α6β4 β4 subvienetas fosforilinamas tirozino liekanose, tokiu būdu inicijuodamas išgyvenimą ir invazinius signalizacijos kelius. 20 Čia parodyta, kad α6β4 integrino sugrįžimas į HD BxPC-3-sst2 ląstelėse yra atvirkščiai, kai tiriamasinas defosforiluoja β4 subvienetą (6a paveikslas, viršutinės plokštės). Panašiai gydymas somatostatino analogu apsaugo nuo EGF sukeltos β4 fosforilinimo HaCaT ląstelėse (papildomas S2D paveikslas). sst2 sukeltas β4 fosforilinimas yra susijęs su tvirta S100A4 baltymo (6a paveikslas, apatinės plokštės) ir mRNR (6b paveikslas) ekspresija, kuri priklauso nuo PI3K slopinimo, nes sst2 Y71F mutantas neturi jokio poveikio (papildomas S5B paveikslas, apatinės plokštės) ). Nuosekliai slopindamas PI3K (LY294002) BxPC-3 ląstelėse, taip pat panaikina S100A4 raišką (6c paveikslas). Įrodyta, kad S100A4 raišką (ir iš to išplaukiančią proinvazinę funkciją) transkripcijos būdu reguliuoja α6β4 integrinas tik tada, kai fosforilinamas β4 subvienetas. BP180 nutildymas BxPC-3 / sst2 ląstelėse arba gydymas BxPC-3 / sst2 ląstelėmis rekombinantiniu MMP-9 sukelia panašų HD suskaidymą (nes, atitinkamai, nėra BP180 ekspresijos ar BP180 skilimo), ir integrino α6β4 delokalizaciją. į invazinius frontus (atitinkamai 3b ir 5c paveikslai). Šiomis sąlygomis padidėja β4 integrino fosforilinimas ir S100A4 ekspresija (6d ir e pav.). Šie rezultatai rodo, kad sst2 sukeltas HD pakartotinis surinkimas kasos vėžio ląstelėse yra susijęs su β4 integrino persikėlimu į HD, kur jis defosforilinamas ir negali sukelti S100A4 ekspresijos. S100A4 ekspresijos išgelbėjimas BxPC-3 / sst2 ląstelėse (6f paveikslas, viršutinė plokštė) panaikina sst2 slopinantį poveikį tiek MMP-9 ekspresijai (6f paveikslas, apatinė panelė), tiek in vitro ląstelių invazijai (6g paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad pats S100A4 stimuliuoja MMP-9 raišką, kaip pastebėta ir siBP180 transfekuotose ląstelėse, kur padidėja tiek S100A4, tiek MMP-9 raiška (6d paveikslas, apatinės plokštės). Slopindamas PI3K, sst2 panaikina MMP-9 / S100A4 / MMP-9 užburtą ciklą, kuris kasos vėžio ląstelėse skatina BP180 skilimą, HD suskaidymą ir galiausiai ląstelių migraciją bei invaziją (7 paveikslas).

Image

S100A4 vaidmuo integrino α6β4 proinvazinėje signalizacijoje. a ) Serijinis imuninis tirpinimas, naudojant anti-fosfotirozino (YP), o po to β4 (pakrovimo kontrolinius) antikūnus, atlikus BxPC-3 / modelio arba BxPC-3 / sst2 ląstelių ekstraktų (viršutinės plokštės) imuninį nusodinimą β4 arba imunoblotus naudojant anti-S100A4. arba β-tubulino (pakrovimo kontrolinis) ląstelių ekstraktų iš BxPC-3 / modelio ir BxPC-3 / sst2 ląstelių (apatinės plokštės) antikūnas (reprezentuojantis n = 3 nepriklausomus eksperimentus). ( b ) S100A4 mRNR RT-qPCR kiekybinis įvertinimas BxPC-3 / maketų ir BxPC-3 / sst2 ląstelėse, normalizuotas iki vertės, gautos BxPC-3 / makiažo ląstelėms. Rezultatai yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis (± sem). ( ** P <0, 01). c ) Ląstelių ekstraktų, gautų iš BxPC-3 ląstelių, 30 minučių apdorotų DMSO arba 25 μM LY294002 (reprezentatyvus n = 3 nepriklausomi eksperimentai), ląstelių ekstraktų, gautų iš BxPC-3 ląstelių, imunologinis žymėjimas naudojant anti-S100A4 arba anti-β-tubulino (įkrovimo kontrolinį) antikūną. . ( d, e ) Imunoblotai, naudojant anti-BP180, S100A4 ar β-tubulino (įkrovimo kontrolinį) antikūną, arba anti-YP, o po to anti-β4 (pakrovimo kontrolinis) antikūnus, atlikus siCTR ar siBP180 transfekuoto β4 imuninį nusodinimą ( d ) arba apdoroti arba neapdoroti rMMP-9 ( e ), BxPC-3 / sst2 ląstelių ekstraktais. Immunoblotting using MMP-9 or MMP-2 (loading control) antibody is performed in the same conditions as above but on cell-conditioned media (representative of n =3 independent experiments). ( f ) Immunoblotting using an anti-S100A4 or β-tubulin (loading control) antibody of S100A4-transfected BxPC-3/sst2 cell extracts, or using an anti-MMP-9 or MMP-2 (loading control) antibody of S100A4-transfected BxPC-3/sst2 cell-conditioned media (representative of n =3 independent experiments). ( g ) Quantification of in vitro invasion assays of BxPC-3/mock, BxPC-3/sst2 and mock- or S100A4-transfected BxPC-3/sst2 cells. Data are normalized to the value obtained for the respective mock cells, and are the average (±sem) of three independent experiments (*** P <0.001).

Visas dydis

Image

Scheme depicting molecular mechanisms underlying HD breakdown during PDAC carcinogenesis and HD restoration induced by sst2. (1) Mature type-1 hemidesmosomal structures comprising the integrin α6β4, plectin, BP230 and BP180, and providing cell anchorage to the basal lamina (laminin-332), are surprisingly present in the normal human pancreatic ducts, but disrupted in PDAC cells. (2) Indeed, high MMP-9 expression/ activity, stimulated by growth factor-induced PI3K activity in PDAC cells, results in BP180 cleavage, thereby conducting the HD breakdown. As consequences, migration and invasion are promoted at least through integrin α6β4 delocalization to migration structures where it is phosphorylated on tyrosine and stimulates expression of the pro-invasive S100A4 protein. S100A4 maintains itself a vicious cycle on BP180 cleavage because it increases MMP-9 expression. (3) Importantly, re-expressing/activating sst2 in PDAC cells blocks PI3K activity, thereby restoring HD assembly. This is achieved at least through inhibition of PI3K-MMP-9-dependent cleavage of BP180, thereby relocalizing integrin α6β4 to HD at the cell basal layer under a tyrosine-unphosphorylated form, where it does not anymore increase S100A4 expression. Consequently, PDAC cell migration and invasion are repressed.

Visas dydis

Diskusija

Apart from stratified epithelia, mature type-1 HDs had only been observed in the normal mammary simple epithelium, however they are lost in breast cancer cells. 4 Our results describe for the first time the presence of mature type-1 HDs (containing BP180) in the simple exocrine pancreatic ductal epithelium. In pancreatic cancer cells, however, we show that type-1 HDs are absent despite the overexpression of integrin β4 and plectin. Delocalization of integrin β4 and BP180 is frequently observed in human PDAC and occurs from ductal cell-ECM contacts to lateral sides of the cell. Interestingly, we observed that HD loss during pancreatic carcinogenesis is associated with a cleavage of BP180. We, therefore, hypothesized that type-1 HDs have a critical role in anchoring the pancreatic ductal epithelium to the underlying BM; their disruption during carcinogenesis probably involving BP180 cleavage may, however, support cell migration and invasion.

Accordingly, our data demonstrate that the reassembly of type-1 HDs in pancreatic cancer cells inhibits cancer cell migration and invasion. Interestingly, this rescue can be achieved through inhibition of PI3K activity or triggered by activation of the somatostatin/sst2 receptor system that inhibits PI3K. 17 Conversely, in PI3K-inhibited cancer cells, disrupting type-1 HDs is sufficient to stimulate invasion. Our data unravel an original PI3K-dependent scenario in pancreatic cancer cells, whereby high PI3K activity induces the MMP-9-dependent cleavage of BP180, which is sufficient to induce type-1 HD breakdown and the subsequent release from HDs of integrin β4 that delocalizes to the lateral membrane sides of cancer cells. It may also explain why plectin is delocalized in pancreatic cancer cells. 14 Therefore, localized at the cell-leading edges, integrin β4 is tyrosine-phosphorylated and stimulates expression of the pro-invasive protein S100A4. Strikingly, we show that, in turn, S100A4 induces MMP-9 expression, thereby maintaining a positive feedback loop on MMP-9 activation and subsequent BP180 cleavage. By inhibiting PI3K, sst2 breaks this vicious cycle.

BP180 proteolytic cleavage into BP120 has been described to occur within the extracellular non-collagenous 16A domain, adjacent to the cell membrane. 22 It results in type-1 HD breakdown by destabilizing the interactions of BP180 with integrin α6β4 and BP230. 22 The molecular mechanisms responsible for BP180 cleavage into a BP120 form have not been documented in carcinomas. This cleavage has been attributed to a neutrophil-derived MMP-9 in the autoimmune BP skin-blistering disease 23 or to ADAMs in normal primary keratinocytes. 24 MMP-9 is a critical protease involved in pancreatic cancer cell invasiveness. 25 Interestingly, MMP-9 has recently been shown to also cleave the integrin β4 ectodomain, leading to epithelial corneal erosions in mice through HD disassembly. 26 Although we did not observe such integrin β4 cleavage in pancreatic cancer cells, we cannot exclude that it concerns a fraction of the protein. Nevertheless, this reinforces the critical role of MMP-9 in type-1 HD breakdown during pancreatic carcinogenesis, although acting through BP180 cleavage. Cleavage of other substrates than BP180 outside HDs is also probably involved in MMP-9 pro-invasive activity on pancreatic cancer cells.

Our data indicate that in contrast to PI3K inhibition (using the PI3K inhibitor LY294002, or through the expression of sst2), which is sufficient to restore type-1 HD assembly in pancreatic cancer cells, MMP-9 silencing, although precluding BP180 cleavage, is not. It suggests that other event(s) under the control of the PI3K pathway are necessary. In PI3K-inhibited pancreatic cancer cells, our hypothesis is that dephosphorylation of the integrin β4 constitutes the second event that is, in addition to inhibition of BP180 cleavage, necessary for HD assembly. Consistently, dephosphophorylation of the integrin β4 is also observed upon expression of sst2. Integrin β4 dephosphorylation likely facilitates its interaction with plectin, a first step-forming labile type-2 HDs; then BP180 and BP230 are recruited to this pre-formed complex to form mature type-1 HDs, as described in migrating keratinocytes. 8 Accordingly, it has been recently reported that integrin β4 phosphorylation on T1736 alters its association with plectin, 8 and that RON-mediated PI3K activation in pancreatic cancer cells induces integrin β4 dissociation from plectin. 15 This hypothesis is also consistent with our results demonstrating that integrin β4 delocalizes early in grade 1 PDAC, where BP180 is not yet delocalized. Paradoxically, our results indicate that MMP-9 is already expressed (mostly score 1) in these low-grade tumors; but it has been reported that, although expressed, MMP-9 is not activated yet, 27 explaining why BP180 is not delocalized. These data are of critical importance because they unravel the critical role in pancreatic cancers cells of PI3K in regulating hemidesmosomal protein expression/phosphorylation, and subsequently type-1 HD turnover.

Unraveling that somatostatin/sst2 signaling acts at the cell/ECM interface to promote HD reassembly is original because it is the first identification of an inducible peptide/receptor system able to regulate positively the dynamics of type-1 HD assembly. As similar observations apply in epithelial cells of different origins (pancreas, oropharynx and skin), we suggest that the hormone somatostatin, through activation of sst2, is generally involved in the maintenance of epithelia integrity. This is consistent with sst2 loss of expression during pancreatic carcinogenesis, 18, 28 and with sst2 oncosuppressive properties upon re-expression in pancreatic cancer cells. 17, 18 sst2-inhibitory role on pancreatic cancer cell migration and invasion is here ascribed to its capability to rescue type-1 HD assembly.

In summary, we here unravel the existence of type-1 HDs in normal human pancreatic ducts, which are disrupted in PDAC. Furthermore, sst2-expressing cells have served as a unique tool to identify the molecular mechanisms involved in HD turnover, and to provide mechanistic insights into the early acquisition of an invasive behavior by the pancreatic cancer cells (Figure 7).

medžiagos ir metodai

Cells and reagents

Human pancreatic cancer BxPC-3 cells were maintained in DMEM (1 g/l glucose) and CFPAC-1 in Iscove's Modified Dulbecco's Medium, supplemented with 10% foetal calf serum. BxPC-3 cells have been stably transfected with the human wild-type or mutated Y 71 F sst2 cDNA, 18 and BxPC-3/sst2 with a S100A4-FLAG cDNA. Human normal pancreatic ductal HPDE cells (HPV-16E6E7-immortalized, gift from Dr Tsao, University of Toronto) were cultured in keratinocyte-SFM supplemented with 5 ng/ml EGF and 50 g/ml bovine pituitary extract (Life Technologies SAS, Saint Aubin, France).

Recombinant MMP-9 and PI3K inhibitor LY294002 were from Calbiochem (Merck Millipore, Molsheim, France), EGF from R&D Systems (R&D Systems Europe, Abingdon, UK) and rat laminin-5 (332) from Millipore (Merck Millipore).

Human normal pancreatic and PDAC protein extracts, and paraffin-embedded samples were from BioChain (CliniSciences sa, Nanterre, France), from US Biomax (Rockville, MD, USA) (tissue-microarrays PA207) and from the Pathology Department of Toulouse Hospital, Toulouse, France. This study was approved by the ethic committee of the Institution.

RNR trukdžiai

Human siRNAs for BP180, somatostatin and MMP-9, non-targeting (control) siRNA and DharmaFECT-1 transfection reagent were from Dharmacon (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). A pool of four designed siRNAs targeting each gene was first tested, and two specific siRNAs have then been used separately in functional assays for each target gene to knockdown (Supplementary Table 1). Results are presented for siRNA_1 but are also representative of siRNA_2, except for functional assays where results represent the mean of siRNA_1 and siRNA_2 effects.

Imunohistochemija

Paraffin-embedded normal and tumoral pancreas sections were incubated with primary antibodies (Supplementary Table 2), and then with peroxidase-conjugated secondary antibodies (Dako, Carpinteria, CA, USA). AEC was applied as a chromogen. Sections were finally counterstained with Mayer hemalun. Except when indicated, scales represent 10 μm.

Imunofluorescencija

Cells grown on laminin-332 (0.5 μg/ml) were fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.3% Triton X-100. Selected proteins were immunodetected using primary antibodies and then with fluorescent secondary antibodies (Supplementary Table 2). Cells were visualized using a Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope (objective: × 63/1, 4 oil). To immunodetect hemidesmosomal components, images were obtained from horizontal sections ( x – y plane) taken at cell-basement membrane contacts. Images are representative of at least five different fields in at least three independent experiments. Scales represent 10 μm.

Protein extraction and western blot

Proteins were extracted in 0.4% SDS, 10 m M NaCl, 20 m M Tris–HCl, pH 7.5, supplemented with 2 m M orthovanadate and a protease inhibitor cocktail (Roche SAS Boulogne-Billancourt, France) for 20 min, sonicated and boiled before adding Triton X-100 (final concentration 1%). Samples were then resolved by SDS–PAGE (7, 5%), immunoblotted with primary antibodies (Supplementary Table 2) then with secondary HRP-conjugated antibodies (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) and visualized by enhanced chemiluminescence (Pierce).

For assessing extracellular protein expression, cell media were concentrated using 30 kDa centricons (Millipore, UFC803024) and submitted to western blot analysis (Supplementary Table 2).

Migration and in vitro invasion assays

Migration and invasion assays were performed using transwell inserts (8.0 μm pore size, BD Falcon, Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France), coated with Matrigel for invasion. Cells were seeded on the upper chamber. Chemoattractant was added (serum for BxPC-3 and 10 n M EGF for HaCaT cells) to the lower chamber. BxPC-3 cells were allowed to migrate for 20 h (migration), 72 h (invasion) and HaCaT for 8 h (migration).

Cells that migrated to the lower side of the membrane were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with crystal violet (0.2%) in 20% methanol. Quantification of the membrane surface area covered by migrated/invaded cells was performed with Morpho Expert software, Explora Nova (La Rochelle, France).

CAM assay

Fertilized chicken eggs (Morizeau, France) were incubated at 37 °C and 80% humidified atmosphere. Cell xenografting was performed as previously described. 18 Tumor volumes were estimated by the equation: V =4/3 r 3, with r =1/2 √(d1 × d2).

Statistinė analizė

Statistical analyses were performed by comparing two by two independent conditions (with homogeneous variances) using an unpaired parametric t -test. All values are mean±sem

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

  2. 2.

    Papildoma S1 lentelė

  3. 3.

    Papildoma S2 lentelė

  4. 4.

    Papildoma S3 lentelė

    Prie šio dokumento pridedama papildoma informacija „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)