Afatinibo, negrįžtamo erbių šeimos blokatoriaus, veiksmingumas gydant pelių nesmulkialąstelinį plaučių vėžį intracerebrinėse metastazėse | acta pharmaologica sinica

Afatinibo, negrįžtamo erbių šeimos blokatoriaus, veiksmingumas gydant pelių nesmulkialąstelinį plaučių vėžį intracerebrinėse metastazėse | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Šiuo metu yra nedaug veiksmingų terapinių variantų nesmulkialąsteliniam plaučių vėžiui (NSCLC) gydyti su metastazėmis smegenyse (BM). Naujausi įrodymai rodo, kad NSCLC sergantys pacientai, sergantys KM, gerai reaguoja į afatinibą, tačiau mažai žinoma apie pagrindinius mechanizmus. Šiame tyrime mes įvertinome afatinibo efektyvumą gydant pelių kaulų raumenis ir ištyrėme, ar afatinibas gali aktyviai prasiskverbti iš smegenų ir kraujo barjero bei prisijungti prie savo tikslo. NSCLC BM modelis buvo nustatytas nuogoms pelėms intracerebriniu būdu injekuojant PC-9.luc ląsteles. Navikai buvo matuojami kas savaitę, naudojant in vivo kiekybinę bioluminescenciją. Pelėms 14 dienų buvo skiriama afatinibo (15, 30 mg · kg –1 · d – 1, ig). Priešnavikinis afatinibo veiksmingumas buvo nustatytas pagal naviko augimo slopinimą (TGI), kuris buvo apskaičiuotas kaip [1− (naviko tūrio pokytis gydymo grupėje / kontrolinėje grupėje) × 100]. Farmakokinetinės savybės buvo išmatuotos pelėms, kurios vartojo vienkartinę afatinibo dozę (30 mg / kg, ig). Afatinibo farmakodinamika taip pat buvo įvertinta nustatant pEGFR (Tyr1068) ekspresiją smegenų naviko židiniuose, naudojant imunohistochemiją. Afatinibo (15, 30 mg · kg –1 · d – 1 ) skyrimas nuo dozės priklausomai nuo PC-9 auglio augimo smegenyse sušvelnino atitinkamai 90, 2% ir 105% TGI. Sušvirkštus afatinibą ( 30 mg / kg), afatinibo koncentracija plazmoje buvo 91, 4 ± 31, 2 nmol / L per 0, 5 val., Pasiekė piką (417, 1 ± 119, 9 nmol / L) per 1 val., Ir vis tiek buvo nustatyta po 24 val. Smegenų smegenų skysčio (KSF) koncentracijos buvo panašios. Afatinibo T 1/2 vertės plazmoje ir CSF buvo atitinkamai 5, 0 ir 3, 7 valandos. Plazmos ir CSF AUC (0–24 val.) Reikšmės buvo atitinkamai 2375, 5 ir 29, 1 nmol / h. Plazmos ir CSF koncentracijos buvo koreliuojamos ( r = 0, 844, P < 0, 01). Farmakodinamikos tyrimas parodė, kad po afatinibo vartojimo pEGFR raiškos lygis sumažėjo 90% 1 val. Emax buvo 86, 5%, o EC50 buvo 0, 26 nmol / l. Parodyta teigiama koreliacija tarp CSF koncentracijų ir pEGFR moduliacijos. Afatinibas prasiskverbia pro BBB NSCLC BM pelėms ir prisideda prie smegenų naviko atsako. CSF ekspozicijos lygis yra koreliuojamas su plazmos lygiu, kuris savo ruožtu yra susijęs su pEGFR moduliacija naviko audiniuose. Rezultatai patvirtina galimą afatinibo vartojimą NSCLC sergantiems pacientams, sergantiems KMT.

Įvadas

Manoma, kad kiekvienais metais JAV įvyksta apie 200 000 smegenų auglių atvejų, iš kurių didžioji dalis (160 000) yra metastazės smegenyse (BM) 1 . Šių pacientų prognozė po diagnozės yra labai prasta. 20–40% pacientų nesmulkialąstelinis plaučių vėžys (NSCLC) ligos metu turi KMT. Šiuo metu viso smegenų spindulinė terapija (WBRT) yra vienintelis patvirtintas priežiūros standartas gydant KM, turinčius centrinės nervų sistemos (CNS) simptomus 3 . Nebuvo patvirtinta jokia tikslinė molekulinė terapija, gydant NSCLC BM.

Afatinibas yra geriamasis, negrįžtamas ErbB šeimos blokatorius, patvirtintas Europos Sąjungoje, JAV ir keliose Azijos bei Lotynų Amerikos šalyse tirozino kinazės inhibitorių (TKI) nevartojusius pacientus, sergančius epidermio augimo faktoriaus receptoriais (EGFR), mutavusį NSCLC. Skirtingai nuo grįžtamojo EGFR-TKI gefitinibo ir erlotinibo, afatinibas kovalentiškai jungiasi prie ErbB receptorių in vitro , tokiu būdu negrįžtamai blokuodamas signalizaciją ir sukeldamas ilgalaikį anti-mitogeninį aktyvumą 4 . Neseniai atlikta analizė pranešė, kad 35 pacientams, sergantiems BMS iš LUX-Lung3 tyrimo, kurie buvo gydomi pirmosios eilės afatinibu arba cisplatina / pemetreksedu, vidutinis išgyvenamumas be progresijos (PFS), gydant afatinibą, buvo 11, 1 mėnesio, palyginti su PFS. 5, 4 mėnesiai, gydomi chemoterapija (pavojaus santykis [HR], 0, 54; P = 0, 138) 5 . Kitame tyrime, kuriame buvo iš anksto apdoroti NSCLC pacientai, sergantys CNS metastazėmis ir gavę afatinibą Afatinib labdaros vartojimo konsorciume (ACUC), pranešta, kad trisdešimt penki procentai (11 iš 31) įvertintų pacientų turėjo smegenų atsaką, šešiolika procentų (5 iš 31) reagavo tik smegenyse, o šešiasdešimt šeši procentai (21 iš 32) po gydymo afatinibu 6 kontroliavo smegenų ligas. Atrodo, kad afatinibas prasiskverbia į CNS, kai jo koncentracija yra pakankamai didelė, kad būtų klinikinis poveikis CNS metastazėms. Ikiklinikiškai ribotas skaičius tyrimų parodė afatinibo ekspozicijos ir veiksmingumo ryšį pacientams, sergantiems KS.

Šiame tyrime mes panaudojome pelių BM modelį, kuris buvo sukurtas naudojant stereotaksinį injekcijos metodą. Mes skyrėme afatinibą normalioms pelėms ir pelėms, kurių kaulų apykaitos rodikliai buvo įvertinti, ir įvertinome afatinibo efektyvumą, gydant intracerebrinį NSCLC su aktyvinančiomis EGFR mutacijomis, taip pat koreliaciją tarp cerebrospinalinio skysčio (CSF) ir fosforilintų EGFR (pEGFR) moduliacijų navikams esant skirtingos dozės. Mes taip pat bandėme išsiaiškinti, ar afatinibas gali aktyviai įsiskverbti į smegenų ir kraujo barjerą (BBB) ​​bei prisijungti prie savo tikslo.

medžiagos ir metodai

Ląstelės ir chemikalai

PC-9 ląstelės buvo gautos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC) ir buvo reguliariai auginamos RPMI-1640 terpėje, papildytoje 10% ( v / v ) veršelinio vaisiaus serumo (Gibco, Carlsbad, CA, JAV). Visos ląstelės buvo palaikomos 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2 drėkinimo sąlygomis. Afatinibas (Kaimanas, San Diegas, Kalifornija, JAV) buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO).

Vaistų administravimas

Afatinibas buvo paruoštas 1% ( v / v ) metilceliuliozės / Tween-80 tirpale dejonizuotame vandenyje. Navikų augimo tyrimui pelėms buvo duodama 15 ir 30 mg / kg afatinibo arba nešiklio kontrolė vieną kartą per parą per burną, ištisą 14 dienų. Farmakokinetikos (PK) ir farmakodinamikos (PD) tyrimams pelėms buvo duodama vienkartinė kontrolinės medžiagos nešiklio dozė arba 30 mg / kg afatinibo dozė.

Virusų perdavimas

PC-9 ląstelės buvo transfekuotos ŽIV1 pagrindu pagamintu lentivirusiniu vektoriaus plazmidės pHRSIN-CSGW-DINotI, kuri ekspresuoja žvirblinių luciferazę (luc), kontroliuodama blužnį sufokusuojančio viruso promotorių. Lentivirusiniai vektoriai buvo sugeneruoti transfekuojant 293T ląsteles plazmidėmis, koduojančiomis vezikulinio stomatito viruso G apvalkalą, gag-pol ir luc. Kondicionuota terpė, turinti virusinius vektorius, buvo surinkta 48 valandas po transfekcijos. PC-9 ląstelės buvo transfekuotos naudojant virusinius supernatantus. Stabilus klonas buvo parinktas ribojant praskiedimą ir kultivuojamas pridedant 1 μg / ml puromicino. Luc ekspresija buvo patvirtinta išmatuojant luciferozės aktyvumą naudojant „Bright-Glo Luciferase Assay System“ (Promega). Išsamios procedūros aprašytos ankstesniuose leidiniuose 7, 8 . Transfekuota ląstelių linija vadinama PC-9.luc. Vidutinis luciferazės aktyvumo lygis 5x104 ląstelėse buvo maždaug 1500 santykinai lengvų vienetų.

Intracerebrinis nesmulkialąstelinis plaučių vėžio modelis

Patogenų neturinčios atletiškos (nu / nu) pelės, nuo 6 iki 8 savaičių, buvo gautos iš Charles River (Pekinas, Kinija). Visus tyrimus su gyvūnais patvirtino Zhejiang medicinos mokslų akademijos (Hangdžou, Kinija) institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas, o eksperimentai buvo atlikti pagal Nacionalinės tyrimų tarybos nustatytas gaires. Pelės buvo aklimatizuojamos 1-2 savaites prieš pradedant eksperimentus. Norint implantuoti naviko ląsteles, pelės buvo anestezuojamos ketamino / ksilazino mišiniu. Per parieto-pakaušio kaulą padarytas 1 cm įpjovimas ir nustatyta bregma. Kaukolė buvo pradurta 2 mm dešine šonine bregmos puse ir 1 mm priekyje vainikinės siūlės. Iš viso buvo įšvirkšta 1, 0 × 106 PC-9.luc ląstelių, kurių tankis yra 1 × 105 ląstelės / μL. Po auglio ląstelių inokuliacijos visos pelės buvo stebimos naudojant IVIS Lumina vaizdo gavimo stotį (Caliper Life Sciences). Prieš skiriant afatinibą arba kontrolinį tirpiklį, augliams buvo leista augti (spinduliavimo intensyvumas siekė maždaug 4 × 106 fotonų per sekundę steradianui kvadratiniame cm [fotonai / s / sr / cm 2 ). Be to, siekiant nustatyti, ar navikas sėkmingai įsitvirtino smegenyse, smegenų audinys buvo surinktas praėjus 14 dienų po naviko ląstelių injekcijos, suskaidytas į patologinius skyrius ir nudažytas hematoksilinu ir eozinu (H&E). BBB vientisumas taip pat buvo nustatytas po auglio ląstelių injekcijos, atliekant intracerebrines nuogų pelių injekcijas. BM pelėms ir normalioms pelėms ( n = 3 kiekvienos grupės laiko taške) buvo skiriama 30 mg / kg afatinibo per burną. Po dozavimo 0, 5, 1, 2, 8 ir 24 valandomis gyvūnai buvo humaniškai paaukojami, o mėginiai buvo paimti. CSF buvo surinktas įkišant 1 ml švirkštą į ilgį per atlanto-pakaušio membraną 30 ° kampu ir laikomas -80 ° C temperatūroje iki PK analizės.

Naviko augimo tyrimas

Pelės buvo atsitiktine tvarka suskirstytos į tris grupes, iš kurių kiekviena gavo kontrolinį tirpiklį ( n = 5), 15 mg / kg afatinibo ( n = 5) arba 30 mg / kg afatinibo ( n = 5). Navikai kas savaitę buvo matuojami in vivo kiekybine bioliuminescencija. Vaizdo gavimas buvo atliktas naudojant IVIS Lumina vaizdo gavimo stotį (Caliper Life Sciences). Rengiantis vaizdavimui, pelės tuo pačiu metu buvo anestezuojamos ketaminu / ksilazinu ir įšvirkščiamos į pilvaplėvės ertmę luciferino (D-Luciferin kalio druskos, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences); pelės buvo vaizduojamos 10 minučių po injekcijos. Dominančios sritys (IG), apimančios intrakranijinę signalo sritį, buvo apibrėžtos naudojant „Living Image“ programinę įrangą, o visi duomenys buvo nurodyti kaip spinduliavimas (fotonai / s / sr / cm 2 ). Kiekvienos grupės intensyvumas buvo užfiksuotas, kad būtų galima nustatyti naviko augimo slopinimo procentą ir priešnavikinį efektyvumą. Naviko augimo slopinimas [(TGI, %) = (1 - naviko tūrio pokytis gydymo grupėje / naviko tūrio pokytis kontrolinėje grupėje) × 100] buvo naudojamas nustatant naviko augimo slopinimo procentą ir priešnavikinį efektyvumą.

PK / PD tyrimas

Pelės buvo atsitiktine tvarka suskirstytos į dvi grupes ir gavo po vieną kontrolinio nešiklio dozę ( n = 3 per laiko tašką) arba 30 mg / kg afatinibo ( n = per laiko tašką). Po dozavimo 0, 5, 1, 2, 8 ir 24 val. Gyvūnai buvo humaniškai paaukoti, o mėginiai buvo paimti. Visas kraujas buvo paimtas atliekant intrakardinę punkciją, o plazmos sluoksnis buvo gautas 15 min. Centrifuguojant 1500 x g greičiu. CSF buvo surinktas įterpiant 1 ml švirkštą į gaubtą per atlanto-pakaušio membraną 30 ° kampu. Plazma ir CSF buvo laikomi -80 ° C temperatūroje iki PK analizės. Afatinibas buvo analizuotas didelio efektyvumo skysčių chromatografija kartu su tandemine masės spektrometrija (HPLC-MS / MS) 9 . Prieš ekstrakto įšvirkštimą į HPLC-MS / MS instrumentą plazmos mėginiai buvo ekstrahuojami kietos fazės tirpalu. CSF mėginiai buvo švirkščiami tiesiogiai be išankstinio ekstrahavimo etapo. Chromatografinės ir masių spektrometrinės sąlygos buvo vienodos abiem matricoms. Mėginiai buvo chromatografuoti atvirkštinės fazės analitinėje HPLC kolonėlėje, gradientuojant. Afatinibas ir vidinis standartas buvo aptikti MS / MS, naudojant teigiamąjį purškimą elektroniniu purškimu. Kalibravimo diapazonas buvo tiesinis: nuo 0, 500 iki 250 ng / ml plazmoje ir nuo 0, 100 iki 20, 0 ng / ml CSF. Smegenų navikai buvo surinkti kiekvienu laiko momentu ir 24 valandas fiksuojami 10% buferiniame formaline ir po to įterpiami į parafiną imunohistocheminiam (IHC) dažymui. PK / PD parametrams apskaičiuoti buvo naudojami standartiniai neskaidomieji metodai ir E max modelis; Šiems skaičiavimams buvo naudojama „PKSolver“ programinė įranga.

Imunohistochemijos analizė

Antigenas buvo paimtas iš formalinu fiksuotų, į parafiną įterptų audinių (FFPE) skyrių 5 min., Naudojant atsitraukimo buferį (DAKO, Glostrup, Danija), ir mėginiai po to 5 minutes buvo plaunami tekančiu vandeniu. Tada audinių mėginiai buvo plaunami Tris buferiniu druskos tirpalu, kuriame yra 1% Tween (TBST), ir buvo inkubuojami su endogeniniu peroksidazės blokatoriumi ant „LabVision“ automatinio konteinerio 10 min. Objektyvai buvo du kartus plaunami TBST ir inkubuojami su pirminiais antikūnais (pEGFR, Abcam) 60 minučių kambario temperatūroje, po to du kartus plaunami TBST. DAKO EnVision + sistema-HRP buvo naudojama kaip antrinis antikūnas gyvybingumui, o dažymas buvo aptiktas naudojant diaminobenzidiną (DAKO). Tada, praėjus 15 minučių po apdorojimo streptavidino peroksidaze ir plovimo TBST, stikleliai buvo išlyginti 4 ', 6-diamidino-2-fenilindoliu ir DAPI ir vizualizuoti chemiliuminescencija, kaip aprašyta aukščiau 10 . Norint išanalizuoti pradinę išraišką ar moduliaciją, atliktas IHC PEGFR įvertinimas pagal šią formulę: balų skaičius = 0 × [% ląstelių be dažymo (0)] + 1 × [% ląstelių su silpnu ar vos matomu dažymu (1+) ] + 2 × [% ląstelių su silpnu ar vidutinio sunkumo dažymu (2 +)] + 3 × [% ląstelių su stipriu dažymu (3+)]. Šis metodas sujungė teigiamą intensyvumą ir naviko ląstelių dažymo procentą, o rezultatai buvo įvertinti nepriklausomai dviejų patologų, naudojant mikroskopiją.

Statistinė analizė

Siekiant palyginti afatinibo koncentracijas tarp pelių su BM ir normalių pelių skirtingu laiko momentu, buvo taikoma dvipusė dispersijos analizė (ANOVA). Studentų t testai buvo naudojami norint nustatyti reikšmingus skirtumus tarp pelių išgyvenimo įvairiose eksperimentinėse ir kontrolinėse grupėse. Afatinibo koncentracijos plazmoje ir CSF koreliacijai palyginti buvo naudojamos dalinės koreliacijos, kontroliuojančios skirtingus laiko taškus. P reikšmė, mažesnė kaip 0, 05, buvo laikoma reikšminga.

Rezultatai

BM modelio sudarymas

Tarp PC-9.luc ląstelių ir PC-9 ląstelių jokių akivaizdžių morfologinių pokyčių nepastebėta. Mes taip pat pastebėjome, kad PC-9.luc ląstelės, palyginti su PC-9 ląstelėmis, turėjo panašų ląstelių ciklo pasiskirstymą, augimo kinetiką ir ląstelių dvigubinimo laiką (32, 6 ± 3, 2 vs 31, 9 ± 3, 3 h) (papildomas paveikslas S1). Šis BM modelis buvo nustatytas nuogoms pelėms, švirkščiant PC-9.luc ląsteles į smegenis. Po operacijos akivaizdžių kūno svorio pokyčių nepastebėta. 1A paveiksle parodytas bioliuminescencinis vaizdas (BLI) praėjus 14 dienų po to, kai buvo sušvirkštos naviko ląstelės. BLI signalas pasiekė 4, 36 × 10 6 p / s / sr / cm2, padidėdamas 18 kartų, palyginti su pradine linija, 2, 40 × 105 p / s / sr / cm 2 (papildomas S2 paveikslas). H&E dažymas taip pat buvo atliekamas smegenų audinyje, siekiant įvertinti patologinę būklę (1B pav.). Buvo pastebėtas lokalus naviko židinys, o skirtumas tarp židinio ir normalaus audinio buvo gana aiškus. Didžiausia afatinibo koncentracija BM pelių ir normalių pelių CŠSF buvo atitinkamai 17, 48 ± 1, 50 nmol / L ir 14, 01 ± 3, 03 nmol / L, praėjus 1 valandai po pirmojo vartojimo (1C pav.). Afatinibo koncentracija KM ir normalių pelių CŠSF sumažėjo per 2 h (3, 40 ± 0, 90 nmol / L ir 2, 87 ± 1, 54 nmol / L), 8 h (0, 27 ± 0, 09 nmol / L ir 0, 31 ± 0, 06 nmol / L). ir 24 valandos (0, 10 ± 0, 18 nmol / L ir 0, 04 ± 0, 07 nmol / L). Dviejų grupių C CSF reikšmės reikšmingo skirtumo neparodė ( F = 1, 91, P = 0, 181) (1C paveikslas). Nors stereotaksinis injekcijos BM modelis gali sukelti BBB žalą, mūsų rezultatai parodė, kad BBB vis dar nepažeistas. Be to, po intrakranijinės 10 μL skysčio injekcijos jokių reikšmingų elgesio sutrikimų nepastebėta. Todėl nusprendėme, kad atlikti šį tyrimą naudojant šį BM modelį yra įmanoma.

Image

Nustatyto BM modelio patvirtinimas. (A) Reprezentatyvus bioliuminescencinis vaizdas 14 dienų po 1, 0 x 106 PC-9 ląstelių įšvirkštimo. (B) H&E dažymas smegenų audiniuose. (C) CSF koncentracijos palyginimas sušvirkštus 30 mg / kg afatinibo BM ir normalioms pelėms ( n = 3 / laiko taškas / grupė). Vidurkis ± SEM.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Afatinibas slopino intrakranijinių navikų augimą

Patikrinus BM modelio pagrįstumą, įvertinome afatinibo efektyvumą pelėms, turinčioms KM. Dviejų afatinibo dozių (30 ir 15 mg / kg) ir vienos tirpiklio kontrolės poveikis buvo įvertintas siekiant įvertinti dozės ir atsako santykį. Kuriant BM, naviko augimas buvo stebimas naudojant bioliuminescencinį vaizdą (2A pav.). Vėžiu gydomų gyvūnų naviko našta padidėjo beveik 4 kartus, palyginti su d 7 (16, 71 × 10 6 p / s / sr / cm 2 ), ir toliau didėjo beveik 20 kartų, vartojant d 14 (85, 22 × 10 6 p / s / sr / cm 2 ), palyginti su naviko našta d 0 (4, 15 × 10 6 p / s / sr / cm 2 ) (2B paveikslas). Gydant afatinibu, 15 mg / kg afatinibo vartojimas slopino PC-9 gautų navikų augimą smegenyse, nes TGI dažnis buvo 7, 8 (7, 11 × 10 6 p / s / 7, 8) ir 90, 2% (7, 11 × 10 6 p / s). sr / cm 2 ) ir d 14 (12, 54 × 10 6 p / s / sr / cm 2 ). Kai afatinibo dozė buvo padidinta iki 30 mg / kg, naviko augimo slopinimas buvo dar labiau sustiprintas, o TGI rodiklis d7 buvo 124, 7%, tai rodo naviko regresiją d 14 (2C pav.). BLI signalas buvo atitinkamai 1, 23 × 10 6 p / s / sr / cm2 ir 2, 7 × 105 p / s / sr / cm 2, esant d7 ir d14 (2A pav.).

Image

Skirtingų afatinibo dozių poveikis pelių raumenų kraujyje. (A) Pelių, turinčių smegenų metastazes d 0, 7, 14, biologinės liuminescencijos vaizdas po gydymo skirtingomis afatinibo dozėmis ir nešiklio kontrole. (B) Pelių, turinčių metastazes smegenyse, vidutinis spinduliavimas, palyginti su laiku. Gydymas buvo pradėtas d 0 ( n = 5 / laiko taškas / grupė). (C) Auglių augimą slopinanti mažų ir didelių afatinibo dozių dozė skirtingu laiko momentu. Vidurkis ± SEM.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Afatinibo PK / PD parametrai PC-9 smegenų metastazių modelyje

Mūsų duomenys parodė, kad BM pelėms auglys regresija pasireiškė po gydymo 30 mg / kg afatinibo. Tada skirtingu momentu nustatėme afatinibo koncentracijas CSF ir plazmoje, kad išanalizuotume šio vaisto farmakokinetines savybes. Afatinibo koncentracija plazmoje buvo 91, 4 ± 31, 2 nmol / L 0, 5 valandos po injekcijos ir pasiekė piką (417, 1 ± 119, 9 nmol / L) 1 valandą po injekcijos. Tada laikui bėgant koncentracija plazmoje pradėjo mažėti. 24 val. Afatinibas buvo aptiktas žemai. Afatinibo koncentracija KSF buvo panašus, esant 0, 74 ± 0, 43 nmol / L, matuojant 0, 5 valandos po injekcijos; koncentracija pasiekė piką (17, 5 ± 1, 50 nmol / l) 1 valandą po injekcijos (3A paveikslas). T 1/2 vertės plazmoje ir CSF buvo atitinkamai 5, 0 ir 3, 7 valandos. AUC (0–24 h) vertės plazmoje ir CSF buvo atitinkamai 2375, 5 nmol / h ir 29, 1 nmol / h, tuo tarpu AUC CSF / AUC plazmos santykis buvo 1, 23%. Pearsono koreliacijos koeficientas tarp afatinibo koncentracijos plazmoje ir CSF buvo 0, 844, taigi rodo stiprią teigiamą koreliaciją ( P <0, 01, 3A pav.). CŠSF ir C plazmos santykis buvo 0, 8% (0, 5 val. Po injekcijos) ir 4, 2% (1 val. Po injekcijos), o vėliau laikui bėgant jis sumažėjo (3B pav.).

Image

Farmakokinetinė afatinibo analizė naudojant PC-9 smegenų metastazių modelį. A) afatinibo koncentracija kraujyje ir smegenų stuburo skystyje (CSF); mėginiai buvo imami praėjus 0, 5, 2, 8 ir 24 valandoms po 30 mg / kg afatinibo vartojimo ( n = 3 / laiko taškas). (B) Afatinibo ekspozicijos CSF ir plazmoje santykis 0, 5, 2, 8 ir 24 valandas po 30 mg / kg afatinibo vartojimo. Vidurkis ± SEM.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norėdami ištirti afatinibo farmakodinamiką, nustatėme pEGFR (Tyr1068) raišką smegenų naviko židiniuose imunohistochemijos būdu. 4A paveiksle parodytas pEGFR IHC rezultatas. Praėjus valandai po 30 mg / kg afatinibo vartojimo, PEGFR signalas sumažėjo 90%. Pastovus pEGFR slopinimas buvo stebimas po 8 val. Ir palaipsniui atsigavo po 24 val. Pastebėta teigiama koreliacija tarp afatinibo koncentracijos CSF ir pEGFR moduliacijos (4B paveikslas). Emax modelis buvo naudojamas afatinibo koncentracijos CSF ir pEGFR ryšiui nustatyti (5 pav.). Emax buvo 86, 5%, o EC50 buvo 0, 26 nmol / l.

Image

Afatinibo farmakokinetinė ir farmakodinaminė koreliacija PC-9 smegenų metastazių modelyje. (A) IHC parodė pEGFR moduliaciją naviko audinyje 0, 5, 1, 2, 8 ir 24 valandas po 30 mg / kg afatinibo vartojimo. (B) Buvo nustatyta tendencija, rodanti teigiamą CSF koncentracijos ir pEGFR moduliacijos koreliaciją ( n = 3 / laiko taškas). Vidurkis ± SEM.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę
Image

CSF koncentracijos ir pEGFR santykio E max modelis.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Šiuo metu yra nedaug veiksmingų gydymo būdų 11, 12 KM . Lėtą KM terapijos vystymąsi gali lemti tinkamų tyrimų modelių trūkumas. Šiame tyrime mes sukūrėme pelių BM modelį, kuris suteikia galimybę ištirti BM. BM modeliams sukurti buvo sukurti įvairūs metodai, tarp kurių du labiausiai paplitę metodai yra vidinė miego arterijos injekcija (ICA) ir stereotaktinės injekcijos metodai 13 . Mūsų tyrime buvo naudojamas stereotaksinis injekcijos metodas afatinibo veiksmingumui ištirti plaučių vėžio KMT. BM buvo sėkmingai nustatytas 30 iš 30 pelių, tai rodo, kad mūsų modelis yra patikimas. Remiantis patologiniu vertinimu, naviko mazgeliai buvo nustatyti 100% pelių. Vidinis miego arterijos injekcijos metodas atspindi hematogeninę metastazę, imituojančią natūralų BM procesą. Šis metodas yra techniškai sunkiausias, nes norint atlikti mikrochirurginį skaidymą ir lėtai įpurkšti ląstelių suspensiją, reikia atlikti didelę praktiką 14 . Do et al pakartojo šį metodą 29 pelėms; keturios neatskleidė bioliuminescencijos, nes mažesnė 2, 5 x 105 sušvirkštų ląstelių koncentracija, trys mirė operacijos metu dėl kraujavimo, trys mirė per 7 dienas po procedūros ir tik 19 pelių augliai išsivystė per 42 dienas po injekcijos 15 . Be to, iš ICA gautas BM modelis buvo atkurtas tik su keliomis žmogaus ląstelių linijomis. Atvirkščiai, stereotaksinius injekcijų modelius lengviau atlikti ir gyvūnai juos geriau toleruoja. Be abejo, stereotaksinis įpurškimo modelis gali pakenkti BBB vientisumui. Nustačius afatinibą CŠSD sušvirkštus tą pačią dozę, reikšmingo skirtumo ( F = 2, 44, P = 0, 216) tarp normalių pelių ir BM pelių neradome, taigi galima daryti išvadą, kad stereotaksinė injekcija nepažeidė BBB.

Tada mes ištyrėme afatinibo efektyvumą BMS iš NSCLC. Afatinibo vartojimas padidino auglių slopinimą ir netgi padidino auglio dozę. PEGFR moduliacijos lygiai buvo koreliuojami su afatinibo koncentracija CSF ( P <0, 01), tai rodo, kad afatinibo naviko slopinamasis poveikis yra nukreiptas į EGFR kelią. Mūsų duomenys parodė, kad 30 mg / kg afatinibo vartojimas beveik pašalino naviko ląsteles iki d 14. Būdamas antros kartos EGFR-TKI, afatinibas yra negrįžtamas EGFR-TKI ir pasižymi stipriu afiniškumu ErbB receptoriams. 1 lentelėje apibendrintos šiuo metu turimų EGFR-TKI inhibitorinės koncentracijos įvairių mutacijų tipams in vitro 6, 16 . Mažesnė IC50 vertė rodo, kad afatinibas yra stipresnis nei pirmosios kartos TKI. Afatinibas pirmiausia jungiasi su albuminu plazmoje, jo santykis su pelėmis yra daugiau kaip 92%, o žmonių - maždaug 95%. 17, 18, 19 . Mažos albumino koncentracijos KSF sukelia nesusietą afatinibą kaip pagrindinę formą. Taigi PD analizė parodė, kad afatinibo EC50 yra 0, 26 nmol / L - reikšmė, panaši į PC-9 ląstelių IC 50 (0, 28 nmol / L) in vitro , nurodytą mūsų ankstesniame darbe 20 .

Pilno dydžio lentelė

EGFR-TKI yra mažų molekulių, prasiskverbiančių per BBB, klasė dviem mechanizmais: lipofilinis pasyvusis kelias ir receptoriaus tarpinamas aktyvusis transportavimo kelias 21 . Sutrikęs BBB, esant BM, sukelia padidėjusį pasyvų TKI transportą. Didžiausias afatinibo prasiskverbimo greitis šiame tyrime buvo 4, 2% (3B paveikslas). Priešingai, normos yra 0, 6–1, 3% gefitinibo ir 2, 8–4, 4% erlotinibo 10, 22, 23, 24 . Schuler ir kt. Atlikta LUX-Lung3 ir LUX-Lung6 tyrimų rezultatų analizė parodė, kad, lyginant su chemoterapija, pirmosios eilės afatinibas pagerina PFS EGFR mutacijų teigiamu NSCLC sergančių pacientų, kurių BM 5, atžvilgiu . Nors afatinibo prasiskverbimo greitis buvo panašus į erlotinibo, afatinibo IC50 buvo tik 10%. LUX-Lung8 tyrimas atskleidė reikšmingą išgyvenamumo be progresijos ir bendro išgyvenamumo pagerėjimą gydant afatinibu, palyginti su gydymu erlotinibu pacientams, sergantiems plaučių plokščialąsteline karcinoma 25 . Be to, afatinibo poveikis pacientams buvo veiksmingas po pirmosios kartos EGFR-TKI nesėkmės. Schuler ir kt. Retrospektyviai išanalizavo afatinibo veiksmingumą 571 pacientui po EGFR-TKI nesėkmės. Autoriai nustatė, kad afatinibas sukelia adenokarcinomą turinčių pacientų vidutinį 4, 0 mėnesių gydymo iki nesėkmės (TTF) laiką, palyginti su plačiai iš anksto gydytu NSCLC. Be to, pacientams, sergantiems EGFR mutavusia NSCLC, buvo pasiektas ilgesnis 4, 6 mėnesio TTF 26 . Mes nusprendėme naudoti 15–30 mg / kg dozę vieną kartą per parą 14 dienų pelėms. Atsižvelgiant į dozės koeficientą žmonėms ir pelėms, mūsų tyrime 15 mg / kg afatinibo dozės intensyvumas yra lygus 46, 2 mg per parą žmonėms, ir tai yra toleruojama.

Afatinibas turi vidutinį gebėjimą prasiskverbti į BBB, tuo tarpu didžiąją dalį vaisto neutralizuoja P-glikoproteinas, kuris yra vienas iš ištekėjimo siurblių, esančių ant endotelinių ląstelių membranos 21 . Todėl klinikoje ribotas vienkartinio afatinibo veiksmingumas KM gydymui. WBRT yra KMT priežiūros standartas, tačiau dedamos pastangos tiriant tikslinės terapijos ir WBRT derinį. Ankstesni tyrimai parodė EGFR-TKI derinio su WBRT naudą ir pagrįstumą 27, 28. WBRT ardo BBB ir lemia padidėjusį afatinibo praėjimą per BBB pasyviu keliu. Ankstesnis mūsų darbas parodė, kad afatinibas pasižymi radiosensibilizuojančiu poveikiu PC-9 ląstelėse ir PC-9 ląstelėse, atspariose gefitiniibui, kurių jautrumo padidinimo santykis (SER) yra atitinkamai 1, 22 ir 1, 50, 20 . Afatinibas labai blokavo bazinį EGFR ir ERK fosforilinimo lygį ir sukėlė vėlavimą radiacijos sukeltą AKT fosforilinimą plaučių vėžio ląstelėse. Be to, afatinibas sustiprino radiacijos sukeltą apoptozę ir lėmė DNR pažeidimo atstatymą PC-9 gefitiniibui atspariose ląstelėse dėl sumažintos DNR-pKcs ekspresijos. Šie duomenys taip pat patvirtina gydymo, įskaitant WBRT ir afatinibo derinį, galimybę pacientams, kuriems yra NSCLC BM.

Apibendrinant galima pasakyti, kad šis tyrimas parodė afatinibo veiksmingumą BM pelės modelyje, naudojant PC-9 ląsteles. Pastebėtas veiksmingumas koreliavo su suleista doze, nes didelė afatinibo dozė lėmė BM regresiją. Afatinibo koncentracija kraujo plazmoje buvo koreliuojama su KSF koncentracija, tai rodo, kad yra įmanoma skirti didelę afatinibo dozę. Be to, afatinibo koncentracija CSF buvo koreliuojama su pEGFR moduliacija naviko audiniuose. Šie radiniai įrodo, kad afatinibas gali būti naudojamas NSCLC pacientams, sergantiems KMT.

Autoriaus indėlis

Tyrimą sukūrė Sheng-lin MA, Bing XIA ir Shi-rong ZHANG; Eksperimentus atliko Lu-cheng ZHU, Ši-rong ZHANG, Yan-ping JIANG, Jing ZHANG, Ru-jun XU ir Ya-si XU; Duomenų analizę atliko Lu-cheng ZHU ir Shi-rong ZHANG; Lu-chengas ZHU ir Shi-rongas ZHANG parašė rankraštį.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

    A. Nustatytų PC-9.luc sublinio ląstelių charakteristikos, palyginti su PC-9 ląstelėmis.

  2. 2.

    Papildomas S2 paveikslas

    A. Tipinis vaizdas, rodantis spinduliuotę pirmą dieną po naviko ląstelių injekcijos; B. Tipinis vaizdas, rodantis spindesį praėjus 14 dienų po naviko ląstelių injekcijos

    Papildomą informaciją galima rasti „Acta Pharmacologica Sinica“ svetainėje.