Arbidolio veiksmingumas mirtinų hantaan viruso infekcijų atvejais žindomoms pelėms ir in vitro | acta pharmaologica sinica

Arbidolio veiksmingumas mirtinų hantaan viruso infekcijų atvejais žindomoms pelėms ir in vitro | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Arbidolis yra imunomoduliatorius, pirmą kartą sukurtas Rusijoje. Šiame tyrime mes pranešame apie antivirusinį arbidolio poveikį Hantaan virusui (HTNV) in vitro ir in vivo .

Metodai:

Arbidolio antivirusinis aktyvumas in vitro buvo nustatytas apnašų formavimo tyrimu, kuris svyravo nuo 0, 5 iki 8 μg / ml. Norint ištirti, ar arbidolis turi antivirusinį poveikį in vivo , žindomos BALB / c pelės, užkrėstos HTNV, buvo gydomos arbidoliu 24 val. Prieš užkrėtimą 5, 10 arba 20 mg · kg −1 · d – 1 kartą per dieną. 10 dienų. 12 ir 28 dieną po infekcijos (pi) buvo nustatyti histopatologiniai pokyčiai ir virusinis antigenas. 4, 8, 12 ir 16 dienomis pi buvo nustatytas tikslinių organų virusinis krūvis ir arbidoliu gydytų gyvūnų kraujo serume TNF-α.

Rezultatai:

Arbidolis, stiprindamas in vitro prieš virusinę infekciją ar po jos, stipriai slopina HTNV, o 50% slopinamosios koncentracijos (IC50) yra atitinkamai 0, 9 ir 1, 2 μg / ml. 50% mirtina arbidolio dozė (LD 50 ) pelėms žindenėms buvo 78, 42 mg · kg –1 · d –1 . Išgėrus arbidolio, padidėjo išgyvenamumas ir vidutinis laikas iki mirties (MTD). Gydymas arbidoliu sumažino histopatologinius pokyčius, sumažino viruso kiekį ir viruso antigeno kiekį bei pakoregavo serumo TNF-α lygį.

Išvada:

Arbidolis turi savybę sukelti apsauginį antivirusinį poveikį prieš HTNV in vivo ir in vitro .

Įvadas

Hantavirusai yra Hantavirus genties, Bunyaviridae šeimos, apgaubti virusai, kurių genomą sudaro trys neigiamos prasmės RNR segmentai. Dideli (L), maži (S) ir vidutiniai (M) segmentai koduoja nuo RNR priklausomą RNR polimerazę, nukleokapsido (N) baltymą ir atitinkamai du apvalkalo glikoproteinus (G1 ir G2) 1 . Hantavirusai žmonėms perduodami įkvėpus užkrėstų graužikų aerozolinius ekskrementus. Infekcija gali sukelti hantavirusinį plaučių sindromą (HPS) ir hemoraginį karščiavimą su inkstų sindromu (HFRS) 1, 2 . Kasmet visame pasaulyje pranešama daugiau kaip 10 000 HFRS atvejų, daugiausia Azijoje ir Europoje 3, 4 . Mirtingumas svyruoja nuo 1% nuo Puumala viruso (PUUV) ir Seulo viruso infekcijų iki maždaug 15% nuo Hantaan (HTNV) viruso infekcijų 5, 6, 7, 8 .

Vakcinacija yra tinkamiausias būdas HFRS kontroliuoti ir sumažinti sergamumo poveikį. Buvo panaudotos kelios inaktyvuotos HTNV ir Seulo viruso vakcinos, skirtos HFRS 8, tačiau jos dar nėra visiškai veiksmingos ir neapsaugo nuo visų padermių. Be to, ne visi žmonės, kuriems gresia pavojus, gali būti skiepijami, ypač tie, kurie gyvena regionuose, kuriuose yra tik retkarčiais.

Per pastaruosius keletą metų buvo dedama daug pastangų ieškant veiksmingų anti-HTNV agentų. Kai kuriems nukleozidų analogams buvo nustatyta, kad jie labai slopina gyvūnų modelius 9, tačiau ribavirinas yra vienintelis antivirusinis agentas, žinomas kaip sėkmingas nuo HTNV infekcijos klinikiniuose takuose10. Tačiau ribavirino vartojimą riboja jo mielosupresija ir toksiškumas 11, 12, 13 . Maisto ir vaistų administracija (FDA) nepatvirtino jokio antivirusinio vaisto HFRS 5 gydyti. Todėl labai svarbu stengtis ieškoti alternatyvių agentų.

Arbidolis (ARB; 1H -indol-3-karboksirūgšties, 6-brom-4 - [(dimetilamino) metil] -5-hidroksi-1-metil-2 - [(feniltio) metil] -, etilo esterio, monohidrochlorido) yra imunomoduliatorius, kuris buvo sukurtas Rusijoje14. Įrodyta, kad jis pasižymi plačiu antivirusiniu poveikiu tokiems virusams, kaip gripo virusas, coxsackievirus, respiracinis sincitinis virusas 15 ir hepatito C virusas (HCV) 16 . Antivirusiniai arbidolio mechanizmai gali atsirasti dėl padidėjusio interferono susidarymo arba slopinant apvalkalo viruso sintezę endosomose 17 . Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti arbidolio anti-HTNV aktyvumą in vivo ir in vitro .

medžiagos ir metodai

Virusas

76–118 Hantaan viruso padermės buvo gautos iš Kinijos Profilaktinės medicinos akademijos Virologijos instituto, Pekinas, Kinija. Virusas buvo penkis kartus platinamas „Vero E6“ ląstelėse (ATCC CRL 1586), kad titras būtų 1 × 106 TCID50 / 0, 1 ml. Inokuliacijai su gyvūnais virusų atsargos buvo praskiedžiamos būtiniausiomis terpėmis (MEM) (turinčiose 2% FCS, 100 V / ml penicilino ir 0, 1 mg / ml streptomicino) ir laikomos daugybėje vienkartinių alikvotų -80 ° C temperatūroje.

Reagentai ir junginiai

Arbidolis (gautas iš „Qianjiang Pharmaceutical Co, LTD“, Hubei, Kinija) iš pradžių buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO), o po to toliau atskiedžiamas MEM, turinčiu 2% FCS (2% MEM), kad būtų galima atlikti bandymus in vitro . Galutinė didžiausia DMSO koncentracija buvo 0, 05%, o ekvivalentinis DMSO kiekis buvo pridėtas prie visų nekontroliuojamų mėginių. Arbidolis buvo suspenduotas 0, 5% sterilizuotoje metilceliuliozėje bandymui in vivo . Monokloninis antikūnas, nukreiptas į nukleokapsidų baltymą (A 35, pateiktas Virologijos instituto, Kinijos Profilaktinės medicinos akademijos, Pekinas, Kinija), buvo naudojamas kaip pirminis netiesioginės imunofluorescencijos antikūnas esant 5 μg / ml koncentracijai. Antrasis antikūnas buvo fluoresceino izotiocianatas (FITC) konjuguotas ožkos anti-pelės IgG antikūnas (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Arbidolio įvertinimas in vitro

Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Norint nustatyti citotoksinę arbidolio koncentraciją, susiliejusių „Vero E6“ ląstelių monosluoksniai buvo veikiami įvairiomis arbidolio koncentracijomis 2% MEM, o kaip kontrolė buvo naudojama praskiedimo terpė su 0, 05% DMSO. Po 10 dienų inkubacijos ląstelių gyvybingumas buvo ištirtas MTT kolorimetriniu tyrimu 18 . Vidutinė citotoksinė koncentracija (CC 50 ) buvo ta koncentracija (μg / ml), kurios reikia norint sumažinti ląstelių gyvybingumą 50%.

Virusinio derliaus mažinimo tyrimas

Confluent Vero E6 ląstelės buvo užkrėstos 100 TCID50 / 0, 1 ml HTNV. Po 2 valandų adsorbcijos 35 ° C temperatūroje, ląstelės buvo padengtos 2% MEM, turinčiomis įvairią arbidolio koncentraciją. Po 10 dienų pi buvo auginamos dviem šaldymo ir atšildymo ciklais, po to centrifuguojamos mažu greičiu (1000 x g ), o supernatantai buvo titruojami plokštelių tyrimu 19, 20 . Trumpai tariant, nuosekliųjų 10 kartų praskiedimų supernatantai buvo inokuliuoti į Vero E6 ląstelių monosluoksnius 24 šulinėlių plokštelėse ir po to uždengti agarozės perdengimo terpe. Po 5 dienų inkubavimo 35 ° C temperatūroje, ant šulinio buvo pridėtas antrasis agarozės sluoksnis, į kurį įdėta neutrali raudona spalva (0, 167 mg / ml), ir inkubuojamas dar 2 dienas 35 ° C temperatūroje 5% CO 2 atmosferoje. Po inkubacijos buvo suskaičiuotas plokštelių skaičius. Antivirusinis aktyvumas buvo apibrėžtas kaip 50% slopinamoji koncentracija (IC50), ty koncentracija, reikalinga viruso derliui sumažinti 50%, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis kultūromis. Taigi arbidolio selektyvusis indeksas (SI) buvo nustatytas iš CC50 / IC50 .

Pirminio apdorojimo tyrimas

Norint įvertinti arbidolio poveikį ląstelių infekcijos profilaktikai, serijiniai dvejopi arbidolio praskiedimai buvo ištirpinti 2% MEM ir inkubuojami su ląstelėmis 24 valandas 35 ° C, 5% CO 2 atmosferoje. Pašalinus junginį, ląstelės du kartus plaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) ir ląstelių monosluoksniai buvo užkrėsti 100 TCID50 / 0, 1 ml HTNV. Ląstelių monosluoksniai buvo auginami 2% MEM (įskaitant 0, 05% DMSO), o mėginiai, išauginti 0, 05% DMSO be arbidolio, buvo naudojami kaip kontrolė. Dešimt dienų po inokuliacijos kultūros buvo užšaldomos ir virusų išeiga buvo nustatyta apnašų tyrimu. IC50 buvo nustatyti taip, kaip aprašyta aukščiau.

Tiesioginis virucidinis tyrimas

Virusinės suspensijos, turinčios 100 TCID50 / 0, 1 ml viruso atsargų, 2 valandas 35 ° C temperatūroje buvo inkubuotos vienodame terpės kiekyje su arba be serijinių dvigubų arbidolio skiedimų. Susikaupusių Vero E6 ląstelių pasikartojančios kultūros buvo užkrėstos 200 μL sumaišyta suspensija. Sėjamoji buvo pašalinta per 2 valandas po užkrėtimo ir 10 dienų palaikyta terpe, kurioje yra 2% FCS, 35 ° C temperatūroje. Surinktų frakcijų virusinis derlius buvo nustatytas plokštelių tyrimu.

Antivirusinis aktyvumas in vivo

Gyvūnai

Specifiniai patogenai be nėščių BALB / c pelių buvo gautos iš Uhano universiteto gyvūnų tyrimų centro. Gyvūnai buvo paskirstyti į atskirus narvus ir jiems buvo duotas maistas bei vanduo. Jie buvo stebimi kasdien, o gimimai buvo skaičiuojami pagal artimiausią dieną. Remiantis 50% mirtina HTNV intrakranijinės (ic) inokuliacijos žindomoms pelėms doze (LD50), 1–2 dienų amžiaus pelėms intrakranijiškai buvo pasėjama 100 LD 50 viruso atsargų, kad būtų galima nustatyti priimtiną infekcijos dozę. Visas darbas su šiais gyvūnais buvo atliktas 3-iojo lygio gyvūnų biologinės saugos (ABSL-3) laboratorijoje, esančioje Uhano universiteto gyvūnų tyrimų centre, ir buvo patvirtintas Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto.

Toksiškumo in vivo nustatymas

Arbidolio dozė buvo laikoma mirtinai toksiška 1 dienos amžiaus pelėms. Ištirtos dozės buvo 160, 80, 40, 20 ir 10 mg · kg –1 · d – 1 . Įprasta kontrolė vietoj arbidolio gaudavo 0, 5% metilceliuliozės tirpalą. Pelės (n≥9) buvo gydomos per burną vieną kartą per dieną 10 dienų. Gyvūnų svoris buvo nustatomas kiekvieną dieną. Jie buvo stebimi mirties dieną iš viso 20 dienų.

Tyrimų su gyvūnais eksperimentinis dizainas

Pelėms, žindančioms apie 2 dienas, buvo pasėjama 100 LD 50 viruso atsargų. Pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į penkias grupes (35 pelės kiekvienoje grupėje) ir arbidolis buvo tiriamas pagal šias dozavimo schemas: 5, 10 arba 20 mg · kg –1 · d – 1 kartą per dieną 10 dienų. Gydymas buvo pradėtas to paties tyrėjo likus 24 valandoms iki užsikrėtimo ir dozė buvo pakoreguota atsižvelgiant į svorio pokyčius. Placebo kontrolinės grupės (inokuliuotos 100 LD50 HTNV) ir normalios kontrolinės (inokuliuotos 2% MEM) vietoje arbidolio buvo gautos 0, 5% metilceliuliozės tirpalo. Gyvūnai buvo stebimi du kartus per dieną ir sveriami vieną kartą per dieną. Pelių mirtingumas buvo stebimas kiekvieną dieną 28 dienas po užsikrėtimo. Mirtis, įvykusi praėjus 24 valandoms po viruso užkrėtimo, buvo traumuota, o tokie gyvūnai buvo laikomi pasitraukusiais. Arbidolio poveikis buvo įvertintas naudojant sumažėjusį mirštamumą ir prailginant vidutinį laiką iki mirties (MTD). Kiekvienai eksperimento vietai buvo paaukotos keturios pelės (4, 8, 12 ir 16 pi dienos), o išgyvenusios gyvūnai buvo sunaikinti 28 pi dieną. Serumai buvo sujungti visiems tyrimams. Smegenys, plaučiai ir inkstai buvo aseptiškai išpjaustyti iš gyvūnų ir padalyti į tris dalis: trečdalis buvo užšaldyta, kad būtų galima nustatyti antigeną netiesioginės imunofluorescencijos būdu (IFA), trečdalis buvo įdėta į formaliną histologiniam tyrimui, o likusi dalis buvo laikoma Virusologiniams parametrams nustatyti -80 ° C.

Histologinis tyrimas

Keturi gyvūnai buvo paaukoti 12 pi dieną, o likę gyvūnai buvo sunaikinti 28 pi dieną. Smegenų, plaučių ir inkstų skiltelės buvo fiksuotos 10% formalino, dehidratuotos etanolyje ir įterptos į parafiną. 5 μm storio dalys buvo dažytos hematoksilinu ir eozinu (H&E).

JEIGU

12 dieną pi buvo paaukoti keturi gyvūnai, o 28 dieną pigesni gyvūnai buvo sunaikinti. Užšaldyti smegenų, plaučių ir inkstų skyriai buvo paruošti kriostatu. IFA buvo atliktas, kaip buvo pranešta anksčiau 20, naudojant N-specifinį monokloninį antikūną A 35 . Specifinės reakcijos tarp A 35 ir N baltymų buvo aptiktos naudojant FITC konjuguotą ožkos anti-pelės IgG ir stebėtos fluorescencine mikroskopija (Olympus CX-41, Japonija).

RT-PGR

4, 8, 12 ir 16 pi dienomis, remiantis gamintojo instrukcijomis, visa HTNV užkrėstų pelių plaučiai, smegenys ir inkstai buvo išskirti iš RNR, naudojant TRIzol® reagentą (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNR (1, 0 μg) buvo atvirkščiai perrašyta, kai reakcijos tūris buvo 20 μL. CDNR sintezė buvo vykdoma 42 ° C temperatūroje 60 min., Po to denatūravimo etapas 95 ° C temperatūroje 5 min. Atvirkštinės transkripcijos produktai buvo naudojami kaip PGR šablonai. PGR protokolą sudarė 30 denatūravimo ciklų (94 ° C 1 min.), Atkaitinimo (55 ° C 2 min.) Ir pratęsimo (72 ° C 3 min.), Naudojant šiluminį ciklą (Eppendorf, vokiečių kalba). Aptikimui buvo pasirinktas viruso genomo S segmentas ir naudojamos pradinės sekos buvo 5′-TGA GAA ATG TGT ATG ACA tGA-3 ′ (prasmė) ir 5′-ACT AGA CAC TGT TTC AAA TGA-3 ′ (antisense). . Lygiagreti β-aktino mRNR išraiška buvo patikrinta tomis pačiomis PGR sąlygomis, kaip ir vidinis standartas, naudojant pradmenis 5′-TCA TCA CTA TTG GCA ACG AGC-3 ′ (sens) ir 5′-AAC AGT CCG CCT AGA AGC AC -3 ′ (antisense). Kiekybiniam įvertinimui buvo sukurtos standartinės kreivės, parodančios, kad PGR aptikimas buvo tiesiniame diapazone. PGR juostos ant gelio buvo nuskaitytos naudojant kompiuterinę analizės sistemą (Bandscan 5.0, Glyko), o viruso mRNR signalas buvo normalizuotas, palyginti su atitinkamu β-aktino mRNR signalu iš to paties mėginio. Duomenys pateikiami kaip mRNR / β-aktino santykis.

Plaučių, inkstų ir smegenų virusų titrų nustatymas

4, 8, 12 ir 16 pi dienomis keturių pelių iš kiekvienos grupės organai buvo homogenizuoti iki 10% (masės / tūrio) suspensijos bandymo terpėje. Homogenatams buvo atlikti du užšaldymo ir atšildymo ciklai, po to centrifuguota mažu greičiu (1000 x g ). Infekcinių viruso dalelių titrai buvo nustatyti standartiniu apnašų susidarymo tyrimu.

TNF-α nustatymas serume, naudojant fermentinį imunosorbentų tyrimą (ELISA)

Kraujas buvo gautas 4, 8, 12 ir 16 pi dienomis, o serumas buvo laikomas –80 ° C. Pagal gamintojo instrukcijas TNF-α serume buvo aptiktas atliekant kiekybinį „sandwich“ fermento imunologinį tyrimą (EIA) (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Statistinė analizė

Duomenys buvo analizuojami naudojant SPSS 16.0 programinę įrangą. Norint nustatyti statistinius MTD, serumo TNF-α lygio ir mRNR / β-aktino santykio skirtumus, buvo naudojamas vienpusis ANOVA. Įvairių grupių grupių išgyvenamumo pasiskirstymui įvertinti buvo naudojamas log rank testas. Laikoma, kad bet kuri mažesnė nei 0, 05 P vertė rodo statistinį reikšmingumą.

Rezultatai

HTNV slopinimas in vitro

Vero E6 ląstelės buvo gydomos arbidolio koncentracijomis nuo 1 iki 20 μg / ml, ląstelių gyvybingumas buvo tiriamas MTT metodu. Arbidolis nedaro reikšmingos įtakos ląstelių gyvybingumui, kai koncentracija yra mažesnė nei 8 μg / ml, o arbidolio CC50 buvo 15, 64 μg / ml. Todėl mes ištyrėme arbidolio anti-HTNV aktyvumą esant 8 μg / ml ar mažesnei koncentracijai. Rezultatai apibendrinti 1 lentelėje. Apskritai arbidolis buvo efektyvus prieš HTNV, kai jis buvo pridėtas prieš ar po virusinės infekcijos, o vidutinės IC50 vertės buvo nustatomos naudojant plokštelių formavimo testą. Atliekant šį eksperimentą mažesnės nei 8 μg / ml koncentracijos arbidolio tiesiogiai virucidinio poveikio nenustatyta.

Pilno dydžio lentelė

Arbidolio veiksmingumas atliekant mirtinas HTNV infekcijas žindomoms pelėms

Arbidolio LD50

10 dienų gydymas burnos ertmės arbidoliu parodė, kad arbidolio LD50 buvo 78, 42 mg · kg −1 · d −1 . Reikėtų pažymėti, kad mažesnėms nei 40 mg · kg −1 · d – 1 dozėms svorio beveik nepastebėta. Šiame diapazono nustatymo tyrime nebuvo bandoma nustatyti pelių mirties priežasties.

Apsauginis arbidolio veiksmingumas žindančioms pelėms

Pelės, žindančios, buvo užkrėstos HTNV, kaip aprašyta aukščiau, ir buvo gydomos šiais dozavimo režimais: 5, 10 arba 20 mg · kg −1 · d –1 kartą per dieną 10 dienų. Gyvūnai buvo stebimi ir sveriami kiekvieną dieną. Šiems gyvūnams įvertinti klinikiniai simptomai buvo laikina hiperaktyvumo būsena, svorio kritimas ir supuvę jų paltų išvaizda, lydima ištiesta laikysena ir laipsniškai mažėjantis judumas. Abiejų užpakalinių galūnių paralyžius atsirado prieš mirtį. Palyginti su placebu gydytais gyvūnais, arbidoliu gydyti gyvūnai mirė vėliau, o klinikinių požymių sumažėjo priklausomai nuo dozės. Išgyvenusių žmonių svoris atsigavo ir simptomai išnyko iki 28 dienos (1 paveikslas). Visos placebu gydytos pelės mirė, jų MTD buvo 17, 17 dienų, o gydymas arbidoliu padidino išgyvenamumą ir MTD (1 paveikslas). Arbidolis, vartojęs 10 mg · kg –1 · d – 1, išgyvenamumą padidino iki 33, 3%, o MTD - iki 21, 5 dienos ( P <0, 05), o vartojant 20 mg · kg −1 · d – 1 - išgyvenamumą padidino iki 60%, o MTD iki 23, 8 dienos ( P <0, 05).

Image

Išgerto arbidolio poveikis mirtinajam HTNV iššūkio modeliui. Arbidolis po 5, 10 ir 20 mg · kg −1 · d – 1 buvo išgertas 24 valandas prieš užkrėtimą 100 LD50 HTNV (76–118 kamienas). Pelės buvo sveriamos kiekvieną dieną atskirai. HTNV užkrėstų pelių išgyvenimo procentai buvo skaičiuojami kiekvieną dieną, o eksperimentas buvo nutrauktas 28 dieną. Statistinė analizė, naudojant log rank testą, nustatė, kad išgyvenimo procentas padidėjo gydant arbidoliu ( P <0, 05). MTD statistiniams skirtumams nustatyti buvo naudojama vienpusė ANOVA. b P <0, 05, palyginti su placebu.

Visas dydis

Arbidolio poveikis histopatologiniams pokyčiams

Keturi gyvūnai iš kiekvienos grupės buvo paaukoti 12 pi dieną, o likę gyvūnai buvo paaukoti 28 pi dieną. Patologiniam tyrimui buvo paimti plaučiai, smegenys ir inkstai. Normalių kontrolinių organų struktūra nebuvo pakitusi (žr. 2D paveikslą). Tačiau 12-tą dieną visiems užkrėstiems gyvūnams atsirado įvairaus sunkumo histopatologiniai pokyčiai. Pažeidimai buvo šie (2A pav.): Smegenys (išsklaidyti kraujavimai, grūstys, edema ir židininė nekrozė), plaučiai (sutirštėjusios alveolių sienos, intersticinių limfocitų ir makrofagų infiltracija bei kraujavimas) ir inkstai (židininis inksto intersticinis kraujavimas, užgulimas). . 12 dieną pi arbidoliu gydytų gyvūnų (10 ir 20 mg · kg –1 · d – 1 ) plaučiuose pastebimai sumažėjo histopatologiniai pokyčiai, o smegenyse ir inkstuose sumažėjo edema ir židininė hemoragija, palyginti su placebu. 2B pav.). 28 dieną pi nebuvo išgyvenusių žmonių plaučių, inkstų ir smegenų histologinių pokyčių (2C paveikslas).

Image

Arbidolio poveikis organų histopatologijai žindančioms pelėms, užkrėstoms HTNV (× 400). 12 dieną pi ir 28 pi dienas buvo paaukotos keturios pelės, kad paruoštų pjūvius H&E dėmėms. (a1 – a3) Histologinis pjūvis iš placebo kontroliuoja gyvūną (rodyklė viršutiniame skydelyje). a1) Plaučiai (sutirštėjusios alveolių sienos, intersticinių limfocitų ir makrofagų infiltracija ir kraujavimas). a2) Inkstai (židininis inksto intersticinis kraujavimas, perkrova). (a3). Smegenys (židinio nekrozė ir kraujavimas). (b1 – b3) Histologinis pjūvis, gautas iš vienos pelės, gydytos arbidoliu po 20 mg · kg –1 · d – 1, 12 dieną pi. (c1 – c3) Histologinis pjūvis iš vienos pelės, gydytos arbidoliu po 20 mg · kg –1 · d – 1 28 dieną, pi. (d1 – d3) histologinis pjūvis iš įprastos kontrolės. Masto juosta = 25 μm.

Visas dydis

Arbidolas slopina organuose ekspresuojamą virusinį antigeną

Naudodami IFA, mes aptikome viruso antigeną gyvūnų plaučiuose, smegenyse ir inkstuose, kaip aprašyta aukščiau. Normalių kontrolinių organų imunofluorescencija nebuvo rodoma (3D paveikslas). Palyginimui, placebo kontrolinės medžiagos plaučiuose, smegenyse ir inkstuose buvo pastebėta specifinė fluorescencija (3A pav.). 12 dieną pi arbidoliu gydytų gyvūnų (10 ir 20 mg · kg –1 · d – 1 ) plaučiai parodė reikšmingą imunofluorescencijos sumažėjimą, o virusų antigeno sumažėjimas buvo išreikštas smegenyse ir inkstuose, palyginti su placebu. apdorotos kontrolinės medžiagos (3B paveikslas). 28 dieną pi viruso viruso antigenas nebuvo aptiktas išgyvenusių žmonių smegenyse (3C paveikslas). Plaučiuose ir inkstuose imunofluorescencija buvo daug mažesnė (3C pav.).

Image

Slopinamasis arbidolio poveikis virusiniam antigenui, išreikštam HTNV užkrėstų pelių žindančių organų organuose (× 400). 12 ir 28 dienomis pi buvo paaukotos keturios pelės iš kiekvienos grupės ir paruošti skyriai IFA. (a1 – a3) 12 dieną placebu gydyto gyvūno organuose (rodyklė) buvo aptiktas virusinis antigenas. (a1) plaučiai; (a2) inkstai; (a3) smegenys; (b1 – b3) 12 dieną pi buvo aptinkamas virusinis antigenas gyvūnuose, gydytuose 20 mg · kg –1 · d – 1 arbidoliu. (c1 – c3) Virusinis antigenas, išreikštas išgyvenusiam gyvūnui, esant 28 dpi. (d1 – d4) Užkrėstas gyvūnas. Masto juosta = 25 μm.

Visas dydis

Arbidolio sukeliamas HTNV mRNR slopinimas

Pusiau kiekybinė RT-PGR analizė buvo atlikta visoms RNR, ekstrahuotoms iš užkrėstų gyvūnų audinių, kaip aprašyta aukščiau skyrelyje „Medžiagos ir metodai“. 4 dieną pi nebuvo nustatyta virusinės mRNR HTNV užkrėstų pelių plaučiuose, inkstuose ir smegenyse. (4A pav.). MRNR / β-aktino santykis plaučiuose sumažėjo priklausomai nuo dozės ir laiko. 16 dieną pi nebuvo nustatyta virusinės mRNR gyvūnų, gydytų arbidoliu po 10 ar 20 mg · kg −1 · d – 1, plaučiuose, o santykis smegenyse sumažėjo priklausomai nuo dozės. Gyvūnams, gydytiems arbidoliu po 20 mg · kg –1 · d – 1, mRNR / β-aktino santykis inkstuose buvo 0, 24 ( P <0, 05), tuo tarpu placebo kontrolinis santykis buvo 0, 88 (4 pav. 4B). Norint toliau ištirti arbidolio poveikį HTNV genų ekspresijai, buvo išmatuota viruso mRNR išgyvenusiųjų audiniuose (28 diena pi). Po gydymo arbidoliu po 10 ar 20 mg · kg –1 · d – 1 nebuvo viruso mRNR plaučiuose ar smegenyse, tačiau virusinė mRNR nustatyta inkstuose.

Image

Slopinamasis arbidolio poveikis virusų kiekiui HTNV užkrėstų pelių žindančių organų organuose ( n = 4). 4, 8, 12 ir 16 dienomis pi virusų kiekis plaučiuose, inkstuose ir smegenyse buvo nustatytas pusiau kiekybiniu RT-PGR ir plokštelių tyrimu, kaip aprašyta skyrelyje „Medžiagos ir metodai“. Kiekvienas duomenų taškas reiškia trijų reikšmių vidurkį. savarankiški eksperimentai. a) RT-PGR vaizdai. Aptikimui pasirinktas viruso genomo S segmentas (242 bp). M: DNR žymeklis; NC: normalus valdymas; HD: 20 mg · kg –1 · d – 1 ; MD: 10 mg · kg –1 · d – 1 ; LD: 5 mg · kg –1 · d – 1 ; VC: Placebo kontrolė; (b) Santykinė viruso S geno mRNR išraiška prieš β-aktiną HTNV užkrėstose pelėse. (b1) plaučiai; (b2) inkstai; (b3) smegenys; b P <0, 05, palyginti su placebu. e P <0, 05 palyginti su HD. c) Infekcinių viruso dalelių titrai organuose buvo nustatyti standartiniu plokštelių tyrimu. (c1) plaučiai; (c2) inkstai; (c3) Smegenys.

Visas dydis

Arbidolio sumažintas HTNV titras

Infekcinių viruso dalelių titrai buvo nustatyti aukščiau aprašytu standartiniu apnašų susidarymo tyrimu. Gyvūnų, užkrėstų HTNV, audiniuose 4 dieną nebuvo nustatyta infekcinių viruso dalelių. Kaip parodyta 4C paveiksle, virusų titrai gyvūnų, gydomų arbidoliu, plaučiuose sumažėjo priklausomai nuo dozės ir laiko, palyginti su placebu gydytais kontroliniais vienetais. Po gydymo 20 mg · kg –1 · d – 1 arbidoliu, virusų titrai inkstuose pastebimai sumažėjo 16 dieną pi. Vidutinis smegenų virusinis produktyvumas sumažėjo priklausomai nuo dozės 16 dieną - pi. Ligonių išgyvenusių žmonių plaučiuose, inkstuose ir smegenyse neužkrėstos infekcinės viruso dalelės (28 diena pi).

Arbidolio poveikis HTNV infekuotų pelių TNF-α lygiui serume

TNF-α serumo koncentracijos buvo tiriamos ELISA metodu, siekiant nustatyti arbidolio imunologinį poveikį pelėms, užkrėstoms HTNV. 4 dieną pi, normalių gyvūnų TNF-α lygis serume buvo 79, 56 pg / ml. Palyginimui, TNF-α koncentracija serume placebo kontrolėje buvo 183, 58 pg / ml ( P <0, 05). Palyginti su placebo kontrole, gydymas arbidoliu sumažino TNF-α sekreciją priklausomai nuo dozės ( P <0, 05). 8, 12 ir 16 pi dienomis TNF-α koncentracija serume gyvūnams, gydytiems 10 ir 20 mg arbidolio dozėmis, buvo nuo 30 iki 80 pg / ml, o placebo kontrolinė dalis buvo mažesnė. aptikimo riba (15, 63 pg / ml). Rezultatai pateikti 2 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

Arbidolio antivirusinis aktyvumas prieš HTNV in vitro

Šiame tyrime arbidolis slopino HTNV replikaciją, kai jis buvo pridėtas prieš arba po infekcijos, kai IC50 buvo atitinkamai 0, 9 ir 1, 2 μg / ml, o SI buvo 17, 4 ir 13, o tai rodo, kad arbidolis yra labai aktyvus prieš HTNV. Nežinoma, kodėl šiame eksperimente nepastebėtas virucidinis arbidolio poveikis, tuo tarpu kai kurių kitų virusų virucidinis poveikis pasireiškė 15 . Gali būti, kad įvertinta arbidolio koncentracija yra mažesnė už IC50. Vero ląstelėms būdingas chromosomų defektas, galintis blokuoti I tipo interferono (IFN) ekspresiją 21 . Mūsų duomenys rodo, kad arbidolis gali sukelti patvarų antivirusinį poveikį Vero ląstelėse, ne tik blokuodamas viruso dalelių adsorbciją ant ląstelių, bet ir slopindamas vėlyvą viruso replikacijos ciklo etapą. Todėl antivirusinis arbidolio aktyvumas gali būti visiškai ne dėl IFN susidarymo, o labiau susijęs su arbidolio poveikiu keičiant ląstelių mikro aplinką, kad būtų apribota HTNV amplifikacija. Ankstesni pranešimai 16 parodė, kad arbidolio afinitetas membranoms gali slopinti kelis HCV gyvenimo ciklo aspektus, todėl siūlome, kad panašus veikimo mechanizmas gali egzistuoti ir slopinant HTNV infekciją.

Arbidolio sauga žindant BALB / c peles

Ankstesnis tyrimas parodė, kad pelių BALB / c pelėms, gydomoms per burną, LD50 dozė buvo maždaug 314 mg · kg −1 · d 1 . Įrodėme, kad BALB / c pelėms, žindančioms arbidolį 10 dienų, žindyti skirta LD50 dozė buvo 78, 42 mg · kg –1 · d –1 . Be to, mes nustatėme, kad žindomos pelės, užkrėstos HTNV ir gydomos arbidoliu po 40 mg · kg −1 · d − 1, parodė ryškų toksiškumą, kurį patvirtina svorio kritimas, o mirtis įvyko 7 ar 8 dpi (duomenys nepateikti). Todėl mūsų pasirinktos išbandomos dozės buvo 5, 10 ir 20 mg · kg –1 · d – 1 .

Naujagimio BALB / c pelės modelio, skirto HTNV infekcijai, sukūrimas

Yra daugybė gyvūnų modelių, skirtų HFRS tyrimui, 22, 23, tačiau mirtina liga gali būti sukelta tik naujagimiams ir imunodeficito turintiems gyvūnams 24, 25, 26 . Taigi, mes sukūrėme užkrėtimo modelį, kai inokuliuojamos žindančios pelės HTNV prieš tai vartojant prieš 20 . Užkrėstiems gyvūnams buvo būdinga ligos raida ir infekcijos sukeltų pažeidimų progresavimas, taip pat tiksliniuose organuose nustatyti virusologiniai parametrai. Be to, neigiami apkrėstų gyvūnų histopatologinių tyrimų rezultatai (2 paveikslas) atmetė galimybę, kad užkrėtimo būdas galėjo tiesiogiai ar netiesiogiai lemti mirtiną ligą. Visi šie atradimai kartu leidžia manyti, kad BALB / c pelės, kurios buvo užkrėstos HTNV, gali būti naudojamos kaip tinkamas antivirusinių agentų vertinimo modelis.

Arbidolis yra veiksmingas prieš HTNV in vivo

Junginių vartojimo būdas yra svarbus in vivo , o arbidolis yra gana netirpus vandeninėje terpėje. Todėl tyrime arbidolis buvo skiriamas per burną. Remiantis kitų autorių ataskaitomis 15 ir mūsų in vitro rezultatais , gyvūnai buvo pradėti gydyti 24 valandas prieš užkrėtimą. Mes įrodėme, kad išgertas arbidolis po 10 ar 20 mg · kg –1 · d – 1 reikšmingai sumažino klinikinių HTNV požymių atsiradimą ir padidino išgyvenamumą bei MTD (1 paveikslas). Iki 28 dienos visi išgyvenę pacientai buvo besimptomiai, padidėjo svoris ir jų organuose nebuvo jokių histopatologinių pokyčių. Virusinio antigeno ekspresija reikšmingai sumažėjo plaučiuose ir inkstuose, o išgyvenusių žmonių smegenyse HTNV antigenas nebuvo aptiktas. Visi šie duomenys leidžia manyti, kad arbidolis turi savybę sukelti apsauginį antivirusinį poveikį prieš HTNV in vivo , o šio eksperimento metu nustatyta mažiausia efektyvi 10 mg · kg −1 · d – 1 koncentracija. Pusiau kiekybiniai RT-PGR duomenys parodė, kad aukščiausias viruso replikacijos lygis plaučiuose, inkstuose ir smegenyse placebo kontrolėje pasirodė 16pi dieną, tai yra panašus į kitų rezultatus 25, 27, o arbidoliu gydomų gyvūnų - mažesnis. didžiausias lygis ir (arba) vėlavimas pasiekti aukščiausią lygį (4B paveikslas). Virusų titrai plaučiuose pirmiausia sumažėjo priklausomai nuo dozės ir laiko, po to sumažėjo smegenys ir vėliau inkstai (4C paveikslas), kaip nustatyta apnašų tyrimu, rodantis, kad gydymas arbidoliu sumažina infekcinį virusą ir bendro viruso RNR organuose. Po gydymo arbidoliu išgyvenusių žmonių plaučiuose ir smegenyse virusinė mRNR ar užkrečiamos viruso dalelės nebuvo aptiktos. Nors visų arbidoliu gydytų pelių, išgyvenusių HTNV infekciją, inkstuose buvo nustatyta virusinė RNR, nė vienoje pelėje nebuvo pastebėta infekcinių viruso dalelių, tai rodo, kad pagrindiniai HTNV audiniai žindomose pelėse yra inkstai, tačiau HTNV nepavyko pakartoti esant arbidoliui. Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad arbidolis gali slopinti HTNV replikaciją in vivo , nes skirtinguose organuose efektyvumas skiriasi dėl arbidolio pasiskirstymo audiniuose ir organizmo HTNV tropizmo. Įrodėme, kad 4 dieną pi nebuvo nustatyta virusinė mRNR ar užkrečiamų viruso dalelių gyvūnų, užkrėstų HTNV, audiniuose, kas rodo labai mažą viruso replikacijos lygį organuose. Tai atitinka Kim et al rezultatus 25 .

Buvo pranešta, kad padidėjusia TNF-α koncentracija kraujo plazmoje buvo nustatyta HFRS pacientų kraujyje ūminės 28 fazės metu. Niikura ir kt. 29 rezultatai patvirtino, kad endotelio ląstelių HTNV infekcija gali prisidėti prie padidėjusio kraujagyslių nutekėjimo dėl ilgo atsako į TNF-α. Mūsų tyrimuose 4-ą dieną pi buvo padidėjęs TNF-α kiekis serume, parodydamas, kad gydymas arbidoliu gali sumažinti TNF-α lygį 4-ą dieną pi priklausomai nuo dozės (2 lentelė). Įrodyta, kad arbidolis daro įtaką 14 makrofagų aktyvinimui . Tai rodo, kad arbidolis gali moduliuoti TNF-α lygį dėl suaktyvinančių makrofagų. Serumo TNF-α lygis sumažėjo 8, 12 ir 16 pi dienomis, kurį gali lemti išsiskyręs TNF-α prisijungimas prie TNF-α receptorių (TNFR), išreikštas ląstelės membranoje arba išsiskiriantis iš 30, 31 serumo . 32 ; tokiu būdu mažiau išskiriama išskiriamo TNF-α. Arbidoliu gydytiems gyvūnams buvo nustatytas didesnis TNF-α lygis nei placebo kontrolėms, o tai rodo, kad arbidolio veikimo mechanizmas gali būti susijęs ne tik su TNF-α lygio serume moduliavimu, bet ir su TNFR ekspresija audiniuose 32, 33, 34 . Todėl įmanoma, kad be anti-HTNV aktyvumo, arbidolis taip pat galėjo modifikuoti TNF atsakus ir apsaugoti peles nuo mirtino užkrėtimo.

Apibendrinant, arbidolis turi savybę sukelti apsauginį antivirusinį poveikį prieš HTNV in vivo ir in vitro . Nustatyta, kad arbidolis stipriai slopina HTNV, kai jis pridedamas prieš ar po virusinės infekcijos in vitro . Išgertas arbidolis gali sumažinti histopatologinius pokyčius, sumažinti viruso antigeno ekspresiją ir viruso kiekį ir modifikuoti TNF atsaką. Arbidolio veikimo mechanizmui ištirti reikalingi papildomi eksperimentai. Arbidolis gali būti perspektyvus kandidatas ankstyvam Hantaviruso infekcijos gydymui.

Autoriaus indėlis

Hai-ying DENG atliko tyrimus, išanalizavo duomenis ir parašė darbą; Fan LUO atliko tyrimus ir išanalizavo duomenis; Li-qiao SHI išanalizavo duomenis; Qiong ZHONG ir Ying-juan LIU atliko tyrimus; Zhan-qiu YANG sukūrė tyrimą, išanalizavo duomenis ir parašė rankraštį.