Skiepijimų nuo šeimininko dendritinių ląstelių veiksmingumas su mažu histokompatibilumo antigeno kiekiu ar be jo, kartu su donoro limfocitų infuzija pacientams, sergantiems daugybine mieloma | kaulų čiulpų transplantacija

Skiepijimų nuo šeimininko dendritinių ląstelių veiksmingumas su mažu histokompatibilumo antigeno kiekiu ar be jo, kartu su donoro limfocitų infuzija pacientams, sergantiems daugybine mieloma | kaulų čiulpų transplantacija

Anonim

Dalykai

  • II fazės bandymai
  • Naviko imunologija

Anotacija

Donoro limfocitų infuzija (DLI) gali sukelti ilgalaikę remisiją pacientams, sergantiems išsėtine mieloma (MM), tačiau tai įvyksta gana retai. Kadangi DLI poveikis transplantato, palyginti su naviku (GvT), priklauso nuo šeimininko dendritinių ląstelių (DC) buvimo, I / II fazės tyrime mes išbandėme, ar DLI efektyvumą galima pagerinti tuo pat metu skiepijant DC-šeimininku. . Mes taip pat išanalizavome galimybę dar labiau pagerinti GvT efektą įkeliant DC su nesutampančių hematopoetinių ląstelių specifinių mažų histokompatibilumo antigenų (mHags) peptidais. Buvo įtraukti penkiolika MM pacientų, kuriems nereagavo į pirmąjį DLI. Vienuolika pacientų galėjo būti gydomi antrąja ekvivalentiška DLI doze kartu su DC vakcinomis, gautomis iš šeimininko monocitų (moDC). Keturiems pacientams DC produktai neatitiko kokybės kriterijų. Keturiems iš gydytų pacientų DC buvo įkrauti mHag peptidai šeimininkui. Toksiškumas buvo ribotas, o ūminio GvHD neatsirado. Daugumai pacientų išsivystė objektyvios anti-šeimininkų T-ląstelių reakcijos, o vienam pacientui būdingas aiškus mHag specifinis T-ląstelių atsakas, lydimas laikino klinikinio atsako. Šie radiniai patvirtina, kad DLI kartu su vakcinacija nuo šeimininko DC, nepakrauta arba neapkrauta mHag peptidais, yra įmanoma, saugi ir gali sukelti specifinius šeimininko T ląstelių atsakus. Ribotą klinikinį poveikį galima pagerinti sukuriant daugiau imunogeniškų DC produktų arba derinant šią terapiją su imunitetą stiprinančiais būdais, tokiais kaip kontrolinio taško inhibitoriai.

Įvadas

Išsėtinė mieloma (MM), piktybinė monokloninių plazmos ląstelių liga, vis dar laikoma nepagydoma, nors pastaraisiais metais pacientai patyrė esminį pagerėjimą be ligos progresavimo ir bendro išgyvenamumo, nes atsirado naujų vaistų. 1 Allogeninė kamieninių ląstelių transplantacija (alo-SCT), atskirai arba kartu su donoro limfocitų infuzijomis (DLI), gali sukelti ilgalaikę remisiją MM pacientams per donoro T-ląstelių medijuojamo transplantato ir auglio (GvT) poveikį. 2, 3, 4 Kai HLA tapati transplantacijai, šis GvT poveikis pasireiškia daugiausia atpažįstant nedidelius histokompatibilumo antigenus (mHags). mHag yra peptidai, gauti iš ląstelių baltymų polimorfinių sričių ir pateikiami ląstelės paviršiuje HLA molekulėmis. 5 Klinikiniai ir ikiklinikiniai tyrimai nuosekliai sieja mHag specifines T-ląstelių reakcijas su GvT efektu. 6, 7, 8 Kai mHags yra išreikštas visur, aloimuninis atsakas, nukreiptas į nesuderintus mHags, vis dėlto taip pat gali sukelti žalingą GvHD. Todėl tik specifinis mHags rinkinys, turintis ribotą kraujodaros ląstelių (hematopoetic-mHags) ekspresijos modelį, laikomas tinkamais imunoterapijos taikiniais antigenais nustatant recidyvuojančią ar likutinę ligą po allo-SCT. 9, 10 Palyginus su kitais hematologiniais piktybiniais navikais, ilgalaikė remisija MM po alo-SCT ir DLI yra retesnė ir dažniausiai pasireiškia kartu su GvHD. 11, 12, 13 Todėl allo-SCT šiais laikais nebelaikomas standartinės išankstinės MM terapijos dalimi, nes sergamumas ir mirštamumas nuo recidyvų padidėja vyraujant dėl ​​recidyvo sumažėjimo dėl GvT. 14, 15 grupėse, kuriose yra rizikinga rizika, ir klinikiniuose tyrimuose allo-SCT vis dar taikomas, taip pat tiriamos strategijos, kaip pakeisti pusiausvyrą tarp GvT ir GvHD bei sumažinti toksiškumą.

Remiantis kelių gyvūnų modelių išvadomis, dendritinių ląstelių (šeimininko-DC) buvimas mišrių chimerinių recipientų organizme laikomas esminiu, norint sukurti tinkamą GvT atsaką. Būtent, DC-šeimininkai turi didesnį pajėgumą, kad pradėtų donoro T ląsteles nuo šeimininko antigenų, taip pat ekspresuojamų piktybinėse ląstelėse. 16, 17, 18, 19, 20, 21, tačiau, gavę neemioabliatyvų alo-SCT, MM pacientai greitai virsta visišku donoro chimerizmu DC skyriuje, dažnai prieš nustatant veiksmingą GvT atsaką. 22, 23, 24 Todėl DLI GvT efekto gerinimas tuo pat metu priimant DC-infuzijas atrodo patraukli strategija. Iki šiol buvo atlikta keletas klinikinių MM MM vakcinacijos atvejų, kai transplantacija nebuvo atlikta, naudojant autologinius DC, turinčius MM specifinį imunoglobino idiotipą (Id). 25, 26, 27, 28, 29, 30 Perspektyvios galimybės autologinėje aplinkoje taip pat pasirodė skiepijamos pacientai, turintys naviko lizato užpildytą DC arba DC, sujungtą su autologinėmis mielomos ląstelėmis. 31, 32 punkte, tačiau, nustatant alo-SCT, pagrindinės DC gali būti užpūstos, kad sukeltų GvT efektą, nes jos jau išreiškia nesuderintus mHag. Kaip alternatyva, priimančiosios DC gali būti papildomai apkraunamos šeimininko hematopoetiniais mHagais, kad būtų nukreiptas imuninis atsakas į piktybines ląsteles. 9, 33

Norėdami patikrinti šias hipotezes, atlikome I / II klinikinės fazės tyrimą, į kurį buvo įtraukti MM pacientai, sergantys nuolatine išmatuojama liga po alo-SCT ir pirmojo DLI. Vienuolika iš 15 įtrauktų pacientų buvo gydomi antrąja ekvivalentiška DLI doze kartu su pakartotine šeimininko DC vakcinos paskyrimu. Pirmieji septyni pacientai buvo gydomi neiškrautais šeimininko DC, o paskutiniai keturi pacientai buvo skiepyti mHag užpildyta šeimininko DC vakcina. Dalis vakcinos (1/6) buvo įpilta į kontrolinį antigeną su rakto skylutės limocito hemocianinu (KLH).

Naujų GvHD neatsirado, o toksiškumas buvo lengvas. Visiems vertinamiems pacientams išsivystė objektyvios T ląstelių reakcijos į KLH; 6/10 vertinamų pacientų parodė anti-šeimininkų T ląstelių atsaką, o 1/4 pacientų mHag peptidais įkrauti DC sukėlė objektyvų T ląstelių atsaką prieš atitinkamą mHag peptidą. Be to, 5/11 pacientų pastebėta klinikinė nauda nuo stabilios ligos iki CR.

medžiagos ir metodai

Pacientų

Tyrimą patvirtino institucinis etikos komitetas (IRB 05-263, NTR625 / 1872). Visi pacientai pateikė rašytinį informuotą sutikimą. Iš pradžių pacientai, kuriems buvo taikytas HLA atitikimas broliui ar seseriai arba MUD allo-SCT dėl MM, buvo įtraukti remiantis šiais tinkamumo kriterijais: a) nuolatinė išmatuojama liga po pirmojo DLI, skiriama arba prieš, arba dėl progresuojančios ligos; b) ūmaus GvHD (aGvHD)> A laipsnio ir išplitusios lėtinės GvHD (cGvHD) nebuvimo; c) ECOG 0–2 būklės ir d) nėra sunkios širdies, kepenų, inkstų ar metabolinės ligos. Įtraukus pirmuosius devynis pacientus, tinkamumo kriterijai buvo išplėsti reikalaujant, kad bent viename iš mHags HA-1, HA- neatitiktų transplantato, palyginti su šeimininku (mHag nėra donore, yra recipiente) neatitikimas. 2, UTA2-1, ACC-1, ACC-2 arba LRH-1 kartu su HLA tipu, pateikiančiu mHag. MHag neatitikimas buvo nustatytas nustatant paciento ir donoro molekulinius tipus, kaip aprašyta kitur. 34

Vakcinos šeimininkui gamyba

DC-ląstelių vakcina šeimininkei buvo pagaminta geros gamybos praktikos sąlygomis institucinėje ląstelių terapijos įstaigoje. DC-šeimininkai buvo generuojami iš monocitų, išskirtų iš autologinių leukaferezės produktų, surinktų ir konservuotų prieš allo-SCT, arba be jokio kamieninių ląstelių mobilizuojančio agento (PB), arba po G-CSF mobilizacijos iš kraujodaros progenitorinių ląstelių (HPC), atsižvelgiant į tai, kas buvo prieinama. kiekvienam pacientui, naudojant 5 dienų protokolą. Trumpai tariant, monocitai buvo išskirti adheziniu plastiku ir diferencijuojami į DC, kultivuojant su IL-4 (500 V / ml) ir GM-CSF (800 V / ml) X-vivo 15 terpėje, papildytoje 2% sujungto žmogaus serumo, 72 valandas. . Susidarę DC buvo brandinami auginant dar 48 valandas, pridėjus šviežio IL-4 ir GM-CSF bei PGE2 (10 μg / ml, Pfizer), IL-1β (5 ng / ml), IL-6 (15). ng / ml), TNF-α (600 TV / ml) (visi iš „Cellgenix“, Freiburg im Breisgau, Vokietija). Brandinimo metu 20% DC buvo inkubuojami su KLH (50 μg / ml; Biosyn, Arzneimittel GMBH). 5 dieną subrendę DC buvo surinkti ir užkonservuoti naudojant 10% DMSO ir 10% žmogaus serumo albumino. Nuo 10 paciento PGE2 koncentracija brendimo metu buvo sumažinta iki 1 μg / ml, kad pagerėtų atsistatymas po šaldymo. Be to, subrendę ir ne KLH impulsiniai DC buvo įpilti į pasirinktą mHag peptidą, inkubuojant ląsteles su 10 μg / ml peptido 3 valandas prieš pradedant konservuoti.

Vakcinos šeimininko fenotipiniai ir funkciniai testai

Kiekvieno DC produkto alikvotė prieš infuziją buvo kontroliuojama įvairiai, įskaitant sterilumą, gyvybingumą, grynumą, subrendusio DC kiekį ir alostimuliuojančią gebą. Sterilumas buvo nustatytas įprastinėmis mikrobiologinėmis analizėmis. Grynumas buvo nustatytas atliekant srauto citometrinę analizę paviršinių žymeklių CD11c (DC), CD3 (T ląstelės), CD16 / 56 (NK ląstelės), CD14 (monocitai), CD19 / 20 (B ląstelės) ir CD66acde (granulocitai), atliekama naudojant FACS Calibur ir FACS Canto srauto citometrus (BD, Franklin Lakes, NJ, JAV). DC branda buvo įvertinta analizuojant HLA-DR, CD80, CD86 ir CD83 raišką CD11c + ląstelėse, naudojant srauto citometriją. Aliuminio antigeno, turinčio DC, pajėgumas buvo nustatytas mišrių limfocitų DC reakcijose, kai dviejų atskirų donorų HLA nesuderinamas PBMC buvo stimuliuojamas nuosekliais DC produktų skiedimais. HLA neatitinkančių T ląstelių proliferacinis atsakas prieš DC buvo nustatytas atliekant 3H-timidino inkorporaciją į DNR, kaip aprašyta anksčiau. 8

Gydymas

Pacientai vartojo maksimalią 90 × 10 6 DC dozę, kuri buvo skiriama per vieną – tris maksimaliai 30 × 106 DC dozę per infuziją, kas 2 savaites. Pirmoji injekcija buvo derinama su DLI, švirkščiama tokia pačia doze kaip ir ankstesnio DLI. Kiekviename kurse 2/3 DC buvo sušvirkščiama į veną (iv) ir 1/3 DC buvo intradermiškai (ID) ant viršutinių kojų, šalia kirkšnies limfmazgio srities. Pusė ID. sušvirkštus DC, maksimaliai 5x106 DC per infuziją, impulsai buvo gauti naudojant kontrolinį peptidą KLH. Progresuojančios ar nuolat išmatuojamos ligos atveju po tyrimo gydymas pacientais galėtų būti vėl gydomas nauja serija, vėl maksimaliai 90 × 10 6 DC, kartu su dozę didinančia DLI.

Imuninis stebėjimas

T ląstelių proliferacija ir IFN-γ gamyba po 5 dienų stimuliavimo KLH, mHag peptidais, DC-šeimininkais, šeimininko PBMC ir donoro PBMC buvo vertinami naudojant kriofizinius konservus PBMC, kurie buvo išskirti iš pacientų periferinio kraujo, surinktų anksčiau ir reguliariai. po 20 savaičių po pirmosios DC vakcinacijos. Proliferacinis atsakas buvo nustatytas standartiniais 5 dienų 3H-timidino pagrįstais T ląstelių proliferacijos tyrimais. Šių tyrimų supernatantai be ląstelių buvo naudojami IFN-γ produkcijai matuoti standartiniais sumuštinių ELISA tyrimais. 8 Pacientams, kurie buvo gydomi mHag užpildytais DC (UPN nuo 10 iki 13), ląstelės taip pat buvo paženklintos mHag peptido-MHC tetramerais ir išanalizuotos srauto citometrijos metodu, norint išmatuoti mHag specifinius atsakus.

Pavėluoto tipo padidėjusio jautrumo odos tyrimai

Po dviejų savaičių po trečiosios vakcinacijos in vivo imunizacija nuo šeimininko DC, šeimininko PBMC ir prieš KLH buvo įvertinta švirkščiant priimančiojo ir donoro PBMC (1 × 106 ląstelių), šeimininko DC ir KLH (50 μg / ml). ) 0, 5 ml 0, 9% NaCl. Teigiamos uždelsto tipo padidėjusio jautrumo reakcijos buvo apibrėžtos kaip mažiausiai 2 cm skersmens indukcija po 72 valandų injekcijos.

Toksiškumo įvertinimas

Toksiškumui įvertinti buvo naudojama naujausia nepageidaujamų reiškinių bendrojo toksiškumo kriterijų versija (3.0 versija 1–8 pacientams ir 4.0 versija 10–13 pacientams). GvHD įvertinimas buvo atliktas remiantis IBMTR kriterijais, pagal kuriuos GvHD klasifikuojamas pagal dalyvaujančio odos paviršiaus procentą, serumo bilirubino kiekį ir viduriavimo kiekį mililitre per dieną keturiose klasėse. 35

Klinikinio atsako įvertinimas

Atsakymo kriterijai buvo pagrįsti Tarptautinės mielomos darbo grupės vienodais kriterijais. 36, 37 Be to, atrinktiems pacientams plazmos ląstelių chimerizmas buvo nustatytas šviežiai FACS išgrynintose kaulų čiulpų plazmos ląstelėse, naudojant anksčiau aprašytą metodą, ir buvo naudojamas kaip papildomas ligos aktyvumo žymeklis. 38 Laikantis Tarptautinės mielomos darbo grupės vienodų atsakymo kriterijų, laikas iki ligos progresavimo buvo apibrėžtas kaip laikas nuo pirmosios vakcinacijos nuo DC pradžios iki progresavimo ar atkryčio.

Rezultatai

Monocitų, gautų iš DC, skiepijimo iš šeimininko DC sukūrimo ir paskyrimo galimybė kartu su DLI

Norėdami sukurti vakcinas nuo šeimininko DC, mes išskyrėme monocitus iš užšaldytų aferezės produktų, surinktų su hematopoetinių pirmtakų ląstelių mobilizavimu su G-CSF arba be jo. Naudodami 5 dienų auginimo protokolą, 11 iš 15 pacientų sugebėjome subrendusias DC iš kultūrinių šaldytų aferezės produktų išauginti (1 lentelė). Fenotipinės analizės, naudojant srauto citometriją, buvo naudojamos siekiant nustatyti ne DC teršalų kiekį, o taip pat įvertinti DC brandą (1a ir b paveikslai, 1 papildomas paveikslas). Neapdoroti aferezės produktai (periferinis kraujas, PB) turėjo palyginti daugiau B ląstelių nei G-CSF mobilizuotos ląstelės (HPC), kurias kai kuriais atvejais buvo sunku pašalinti plastikiniu sukibimu, todėl sumažėjo DC produktų grynumas. 4 ir 9 pacientų DC produktai buvo laikomi nepavykusiais, nes jau tada nedidelis išaugintų DC skaičius užkrėtė didžiulį B ląstelių kiekį ir po kriokonservacijos prastai atsigavo. 11 ir 14 pacientų turimose autologinėse ląstelėse nebuvo pakankamo skaičiaus monocitų ir iš tikrųjų bandymai iš etaloninių mėginių buvo nesėkmingi. Todėl šie pacientai nebuvo įtraukti į tolesnę analizę (1 lentelė). Kitus 11 pacientų užkrėtimas ne DC buvo minimalus, o DC buvo subrendęs fenotipas (HLA-DR hi, CD83 +, CD80 / 86). Jų aloostimuliacinis gebėjimas buvo laikomas tvirtu, kai T-ląstelių stimuliacinis pajėgumas buvo daug didesnis nei 10 kartų, palyginti su foniniu lygiu, esant PBMC: DC santykiui 10: 1, kuris iš esmės buvo palaikomas santykiu 20: 1 ir net 40: 1. (1c pav.).

Pilno dydžio lentelė

Image

Fenotipas ir allostimuliacinis DC pajėgumas. ( a ) Norint įvertinti DC vakcinų grynumą, buvo nustatyti CD11c, CD3, CD14, CD19, CD56 ir CD66acde raiškos lygiai. Neapdoroti aferezės (PB) produktai pavaizduoti raudonai, o G-CSF mobilizuotos kraujodaros progenitorinės ląstelės (HPC) - juodai. ( b ) Norint įvertinti DC brandą, buvo nustatytas HLA-DR hi, CD80 / CD86 ir CD83 teigiamų ląstelių procentas DC populiacijoje ( aukštos CD11c ir FSC / SSC aukštos ląstelės). c ) Aliso stimuliuojantis DC pajėgumas buvo nustatytas standartine 5 dienų mišrių limfocitų ir DC reakcija. Pavaizduotos visų 11 vartojamų DC produktų proliferacijos tyrimų vidutinės vertės, kiekvienam produktui tiriant du PBMC donorus. Norint normalizuoti skirtingų asmenų rezultatus, proliferacinis pajėgumas esant PBMC: DC santykiui 10: 1 buvo nustatytas 100%, o kitos sąlygos apskaičiuojamos atsižvelgiant į šią normalizuotą vertę.

Visas dydis

Pacientai buvo gydomi iš viso 18–90 × 10 6 DC, sušvirkščiamais po vieną – tris dozes. Kiekvieną dozę sudarė daugiausia 20 × 106 DC, švirkščiamų į veną, ir du kartus 5 × 106 DC, švirkščiamų ID. kiekvienoje viršutinėje kojos dalyje. Jei kiekvienoje dozėje buvo mažiau nei 30 × 10 6 DC, proporcija liko nepakitusi, kai buvo sušvirkšti du trečdaliai ląstelių iv ir 1/3 id. Vienam pacientui (UPN 10) 12 ir 14 savaičių po to buvo paskirtos dvi papildomos DC vakcinos. gydymo pradžia, nes pirmieji trys vakcinacijos kursai nei sukėlė nei klinikinį atsaką, nei GvHD. Po 4 mėnesių nuo pirmojo gydymo pacientas (UPN 13) buvo gydomas antruoju DLI ir DC skiepijimo etapu. Siekdama laikytis vakcinacijos schemos, ji pirmiausia gavo DLI padidintą dozę be DC vakcinacijos, o vėliau panašią DLI dozę su likusia DC vakcinos dalimi, suleista per pirmąjį skiepijimo etapą.

DC-host vakcinos nesukelia GvHD

Nei vienam pacientui, pradėjusiam tyrimą, neatsirado jokių naujų ūminio ar lėtinio GvHD ar gyvybei pavojingo toksinio poveikio požymių (2 lentelė). Vienam pacientui (UPN 2), pradėjusiam tyrimą su lengvu lėtiniu odos GvHD, šiek tiek padidėjo burnos gleivinės (A laipsnio) GvHD ir kartu padidėjo cholestaziniai kepenų fermentai, o tai lengvai pašalino vietiniai ir trumpalaikis sisteminis gydymas steroidais.

Pilno dydžio lentelė

Buvo pranešta apie du sunkius nepageidaujamus reiškinius: vieną didelio karščiavimo epizodą praėjus kelioms valandoms po antrosios DC vakcinacijos (UPN 15), kuris savaime išnyko kitą dieną, be jokių infekcijos požymių; ir kitas pacientas pateko į ligoninę dėl plaučių uždegimo 11 savaitę (UPN 13). Karščiavimo epizodas buvo laikomas galimu imunologiniu šalutiniu gydymo poveikiu, ir šis pacientas prieš skirdamas kitą vakciną vartojo profilaktinius steroidus. Kiti nepageidaujami reiškiniai buvo nugaros, kojų skausmai, savaiminis viduriavimo epizodas ir atskiras šarminės fosfatazės padidėjimas - visi bendrieji II ir III laipsnio toksiškumo kriterijai (2 lentelė). Be to, visiems pacientams injekcija į poodį patyrė lengvą ir laikiną vietinį indukciją.

Vakcinacijos nuo priimančiosios DC gali sukelti atitinkamą T ląstelių reakciją

Imunologinė išilgai surinktų PBMC mėginių analizė atskleidė laipsnišką ir greitą reikšmingų IFN-γ atsakų prieš KLH ir šeimininko-DC vystymąsi arba proliferacinį T-ląstelių atsaką prieš KLH ir šeimininko-PBMC, 6/6 vertinamų atvejų, skiepytų nepakrautais DC. Pacientams UPN 5 ir 7 nepavyko nustatyti IFN-γ atsakymo, tačiau jie parodė aiškų proliferacinį atsaką atitinkamai prieš KLH ir šeimininko DC. Pacientams, kurie buvo gydomi DC skiepijant mHag, reikšmingas IFN-γ atsakas prieš KLH buvo stebimas 4/4 atvejo, o prieš priimančiojo DC - 2/4 atvejų (2a ir b paveikslai). Visi šie atsakai pasireiškė neatsižvelgiant į bendrą suleistų DC kiekį. Jei įmanoma, PBMC mėginiai taip pat buvo stimuliuojami donoro PBMC. Atsakymai prieš priimančiosios DC (IFN-γ sekrecija) ir šeimininko PBMC (proliferaciją) visais atvejais buvo, išskyrus 12-osios savaitės UPN 15 mėginį, didesnį nei atsakas prieš donoro PBMC, patvirtinantis indukuotų T ląstelių atsakymų šeimininkui specifiškumą ( 2a ir b pav. Kelių T ląstelių pogrupių, įskaitant CD4 +, CD8 +, reguliuojančias, naivias, centrinės ir efektorinės atminties T ląsteles, fenotipinė analizė nenustatė pastovių pokyčių po vakcinacijos (duomenys nepateikti). DTH odos tyrimai, atlikti šešiems pacientams (nuo 2 iki 7 UPN) praėjus 6 savaitėms po DLI ir pirmosios vakcinacijos DC, parodė teigiamą indukciją prieš šeimininko DC - šeši, prieš šeimininko PBMC viename ir KLH prieš keturis pacientus. Šie rezultatai vėl parodė, kad šiems pacientams po vakcinacijos atsirado KLH ir šeimininko specifinis imuninis atsakas.

Image
Image

Imunologinis pacientų, gydytų bent viena DC vakcina, reakcija. a ) T ląstelių reaktyvumas paciento PBMC, surinktas prieš pat ir periodiškai po DLI, kartu su šeimininko DC vakcinacijomis, buvo tiriamas IFN-γ sekrecijos ELISA metodu prieš nurodytas ląsteles ir peptidus. Priimančiosios DC buvo naudojamos PBMC: DC santykiu 10: 1; PBMC buvo naudojami santykiu 1: 1. Tyrime buvo pridėta peptidų, kurių koncentracija buvo 5 ug / ml. ( b ) Paciento PBMC proliferacija buvo nustatyta naudojant 3H-timidiną po 5 dienų inkubacijos su šeimininko ir donoro išvestu PBMC. Priimančiojo ir donoro PBMC buvo naudojami santykiu 1: 1. Atkreipkite dėmesį, kad visais atvejais proliferacija buvo žymiai didesnė po inkubacijos su šeimininko PBMC, lyginant su donoro PBMC, tačiau laikas bėgant skirtingas kiekvienam pacientui.

Visas dydis

Vakcinacijos, priimančios DC, kai kuriems pacientams sukelia klinikinį atsaką

Vienuolikos pacientų, kurie buvo skiepyti bent viena DC vakcina, klinikinis atsakas ir laikas iki ligos progresavimo buvo stebimi (2 lentelė ir 3 paveikslas). Iš viso 2 pacientams nustatyta objektyvi klinikinė nauda. 7 pacientas dalyvavo tyrime su minimaliai aptinkama liga po pirmojo prevencinio DLI (aptinkamo M baltymo, tačiau jo kiekybiškai neįmanoma nustatyti) metu, kai 98% donoro plazmos ląstelių chimerizmas buvo išmatuotas atliekant PGR analizę. Šis pacientas po DC vakcinacijos patyrė ilgalaikį molekulinį CR, pagerėjus 100% donoro plazmos ląstelių chimerizmui, tokia padėtis išlieka daugiau nei 6 metus. 15 pacientas pradėjo didėti laisvosios grandinės (FLC) vertės po to, kai prieš tai buvo nutrauktas gydymas ciklofosfamidu. Po tyrimo gydymo šiam pacientui pasireiškė dalinis atsakas, kuris tęsėsi 19 savaičių nuo gydymo pradžios. Dalinio atsako metu šiam pacientui stebimas mHag ACC-1 specifinių T ląstelių padidėjimas tirpinant tetrameru, kuris sumažėjo atkryčio metu. Trims kitiems pacientams buvo pastebėtas galimas klinikinis pranašumas, atsižvelgiant į ilgalaikę PFS, palyginti su ankstesniu gydymu. 6 paciento liga stabilizavosi 30 savaičių po DC vakcinacijos, klinikinio atsako nepastebėta jokiu kitu ankstesniu šio paciento farmakologiniu ar imunologiniu gydymu. 10 pacientui pasireiškė stabilios ligos laikotarpis, trunkantis 16 savaičių po DLI ir DC skiepijimų, o tai buvo geresnis atsakas, palyginti su ligos progresavimu, stebėtu prieš tyrimą ir po ankstesnio DLI. 13 pacientei buvo skiepytos dvi DC skiepų serijos, pirmą kartą ji sirgo stabilia liga 17 savaičių, o antrą kartą - 28 savaites. Priešingai, ji patyrė tiesioginį ligos progresavimą po antrojo DLI, netaikant DC. Antroji DC vakcinacijų serija iš to paties kultūros laikotarpio buvo atlikta praėjus 12 mėnesių po pirmosios, nes tuo metu progresuoja liga, po pakartotinio indukcijos su keturiais 21/28 dienų ciklais lenalidomidu, ciklofosfamidu ir prednizonu (REP). Kitiems šešiems pacientams (vienas gydytas mHag užpildytomis, o penkiems - nekraunamomis DC vakcinomis) vakcinacija ir vėlesni objektyvūs imunologiniai atsakai, nustatyti periferiniame kraujyje ir odoje, neparodė klinikinio GvT efekto, tai patvirtina progresuojantis liga per 3–8 savaites nuo vakcinacijos pradžios.

Image

Klinika pacientams, kurių atsakas stabilus. Ligos aktyvumo eiga prieš gydymą ir po jo parodyta visiems pacientams, kuriems buvo nustatytas tam tikras klinikinis atsakas ( a : UPN 6, b : UPN 7, c : UPN 10, d : UPN 13, e : UPN 15). ). Kiekvienam pacientui tinkamiausias ligos aktyvumo žymuo pavaizduotas kairėje y ašyje. UPN 7 taip pat parodytas plazmos ląstelių chimerizmas kaip alternatyvus žymeklis dešinėje y ašyje. 10, 13 ir 15 pacientams, be to, dešinėje y ašyje nurodytos mHag specifinės T ląstelės, apibrėžtos kaip ląstelių, parodančių dvigubai teigiamus APC ir PE peptido-MHC tetraimerų procentus CD3 + CD8 + populiacijoje, procentas. 15 pacientui parodomi tetramero FACS brėžiniai 0 ir 10 savaitę, tetramero PE ir APC dvigubi teigiami rezultatai buvo laikomi tikromis mHag specifinėmis T ląstelėmis. Raudonos rodyklės rodo DLI skyrimą, o mėlynos rodyklės - kas savaitę kas savaitę. Chemoterapinis gydymas vaizduojamu laikotarpiu parodomas pilka linija. REP = lenalidomido, ciklofosfamido ir prednizono derinys.

Visas dydis

Diskusija

Šiame klinikiniame perspektyviame tyrime mes pademonstruojame vakcinacijos nuo šeimininko DC ir kartu su DLI, kartu su mHag peptidais ar be jo, galimybes ir saugumą. Pastebėjus reagavimą į šeimininko T ląstelių reakcijas, gautas atlikus kombinuotą DLI ir DC-vakcinaciją, galima pagrįsti mūsų hipotezę, kad MM pacientų greitą priimančiųjų APC pakeitimą donoro APC, paprastai sukeliantį nereagavimą į DLI, galima saugiai grąžinti. ex vivo infuzija sukūrė subrendusius šeimininko DC. Be to, išsivysčius mHag peptidams specifinėms T-ląstelių reakcijoms, kurios lydėjo laikiną klinikinį atsaką bent vienam pacientui, galima teigti, kad egzistuojančios priimančiosios DC DC nesuderintos mHag peptidai gali pakreipti donoro T limfocitus norima GvT kryptimi. Galiausiai stebimi galimi klinikiniai atsakai (nuolatinė molekulinė remisija vienam pacientui, PR vienam pacientui ir galimas ligos stabilizavimas trims pacientams) rodo, kad DC vakcinacija prisideda prie kliniškai reikšmingo GvT poveikio.

DC vakcinacijos galimybė šiame tyrime pirmiausia priklausė nuo DC gamybos iš šaldytų aferezės produktų atkuriamumo ir veiksmingumo. Mūsų pradinis tyrimas atskleidė, kad 5 dienų ex vivo DC kultūros protokolas, priešingai nei dažniausiai naudojami 7–9 dienų DC kultūros protokolai 39, 40, 41, buvo tinkamesnis DC, gauto iš šaldytų aferezės produktų, gyvybingumui. Su šia adaptacija mes sugebėjome žymiai pagerinti DC derlingumą, susidarantį iš užšaldytos aferezės medžiagos monocitų, nepakenkdami jų subrendusiam fenotipui ir antigeno funkcijoms. Nepaisant to, tarp atskirų atšildytų monocitų gebėjimo prilipti prie plastiko skirtumai ir skirtingi atsigavimo procentai subrendę DC po kriokonservacijos lėmė (tikėtiną) trijų DC produktų gedimą dėl nepakankamo DC išeigos. Vienam pacientui (UPN 4) produktas nebuvo skiriamas dėl per daug gaminyje esančių teršalų B ląstelių. Nerasta ryšio tarp gydymo skaičiaus ar tipo prieš aferezę ar G-CSF panaudojimo mobilizacijai ir DC kultūrų rezultatų. Nuo 10 paciento pusės mes sumažinome PGE2 koncentraciją brandinimo kokteiliuose, o tai žymiai pagerino jautrumą kriokonservacijai, nepaveikdami DC brendimo. Nepaisant intensyvių ikiklinikinių kultūrų bandymų, tokių kaip monocitų izoliacija MACS pagrindu, o ne plastikinis sukibimas, mes negalėjome toliau pagerinti DC susidarymo iš šaldytų aferezės produktų. Užterštumas ne DC, ypač B ląstelėmis, išlieka nuolatinės DC susidarymo iš užšaldytų aferezės produktų trūkumas.

Ankstesni MM DC vakcinacijos tyrimai parodė, kad skiepai nuo DC priimančiosios gali ir saugūs autologinėje aplinkoje. Daugeliu atvejų kai kurie pacientai buvo naudojami Id impulsų DC, sukeliantys specifinius imuninius atsakus, tačiau klinikinių reakcijų retai būdavo, greičiausiai dėl mažo Id antigeno imunogeniškumo. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 42 Ankstesniuose tyrimuose paprastai buvo skiriami nesubrendę DC, dėl kurių suboptimalus antigeno pateikimo gebėjimas galėjo pabloginti rezultatus. Duomenys apie DC vakcinacijos įgyvendinamumą ir veiksmingumą nustatant alo-SCT yra riboti. Turimi tyrimai daugiausia naudojami (antigenų įnešti) donoro DC, 43, 44, 45, 46, nes iš šeimininko išvestų DC naudojimas teoriškai galėtų padidinti GvHD riziką, nes jie turi visur esančių ir hematopoetiniu požiūriu ribotų mHags. Nepaisant to, mes manėme, kad būtina įvertinti neapkrautų ir į mHag užpildytų šeimininko DC skiepijimų efektyvumą, nes padidėjęs aloreaktyvumas, nukreiptas į kitus, plačiai išreikštus mHags, taip pat gali veikti kaip priešvėžinių reakcijų varomoji jėga ir sustiprinti GvT efektą. 47 Be to, ankstesnio tyrimo metu pacientams, sergantiems MM, iškrovimo iš šeimininko išvestos DC skyrimas pacientams, sergantiems MM, nesukėlė nei GvHD, nei kitokio reikšmingo toksiškumo, kartu sukeldamas mielomos reakciją į T ląstelių reakciją 1/6 pacientams. 40, 41 Taigi, teoriniai vakcinacijos nuo šeimininko DC trūkumai gali būti pervertinti. Atitinkamai, nė vienam iš pacientų šiame tyrime neatsirado aGvHD. Tik vienas pacientas patyrė lengvai kontroliuojamą anksčiau buvusio lengvo lėtinio gleivinės GvHD paūmėjimą, patvirtinantį vakcinacijos nuo šeimininko DC saugumą kartu su DLI.

Nepriklausomai nuo kintančio DC kiekio, kuris buvo skiriamas vakcinuotiems pacientams, mes stebėjome objektyvius atitinkamus imunologinius atsakus. Nors klinikinis vakcinacijos, susijusios su DC-šeimininku, veiksmingumas šiame tyrime buvo ribotas, pažymėtina, kad pacientai, įtraukti į abi tyrimo dalis, buvo stipriai iš anksto gydyti, turėdami agresyvios, greitai progresuojančios ligos požymių. Vis dėlto mes stebėjome vieną nuolatinį CR, vieną PR ir galimą ligos stabilizavimąsi trims pacientams. Šie atsakai negalėjo būti koreliuojami su paskirta DC doze, palyginti su pacientais, kuriems klinikinis atsakas nebuvo. Tačiau ne visais atvejais šios reakcijos nebuvo pasiektos vartojant ankstesnę panašią DLI dozę, nes šiems pacientams progresas pasireiškė iškart po ankstesnių DLI. Pažymėtina, kad antrosios DC vakcinacijos naktį UPN 15 patyrė kitaip nepaaiškinamą aukštos karščiavimo epizodą. Šiuo tiksliu laikotarpiu mHag specifinių T ląstelių procentas pradėjo didėti, o FLC lygis pradėjo mažėti, kas rodo imunologinį atsaką tuo metu (3e pav.). MHag specifinių T ląstelių procentas buvo nustatytas dažant tetrameru, nes dėl mažo absoliutų ląstelių skaičiaus patvirtinti jų specifiškumą funkciniais eksperimentais nebuvo įmanoma.

Nors negalime atmesti teorinės galimybės, kad šio tyrimo pacientai būtų gavę panašų klinikinį atsaką su antrąja DLI doze be DC vakcinacijos, paprastai manoma, kad pastaroji nebus veiksminga. Todėl vėliau nepakeista DLI paprastai skiriama didesnė dozė. Taigi pagunda spėlioti, ar mūsų tyrimo grupėje atlikta vakcinacija prisidėjo prie teigiamų klinikinių rezultatų. Nepaisant to, kadangi bendras šio tyrimo klinikinis veiksmingumas buvo santykinai mažas, palyginti su stebėtu imunologiniu poveikiu, atrodo, kad norint pagerinti priešnavikinį vakcinacijos nuo šeimininko DC poveikį, reikia alternatyvių skiepijimo strategijų ar papildomų strategijų. Pavyzdžiui, pastaraisiais metais moDC buvo dažniausiai naudojami ląstelių tipai skiepijimo tyrimuose, kaip tai buvo taikoma ir šiame tyrime. Taip yra daugiausia dėl to, kad juos palyginti lengva generuoti ex vivo ir jie pasižymi dideliu kostimuliacinių molekulių kiekiu. Nepaisant to, kaupiant duomenis pabrėžiama ribota moDC galimybė sukelti atitinkamą klinikinį atsaką, todėl būsimų tyrimų metu dėmesys bus nukreiptas į natūraliai atsirandančius mieloidinių ir plasmacitoidinių DC pogrupius. 48, 49 Gali būti, kad sėkmingiau bus skiepijama DC-host iš kitų DC šaltinių. Kita vertus, anksčiau buvo aprašyta, kad tiek pacientams, sergantiems MM, tiek cirkuliuojančiai, tiek ex vivo sugeneruotai DC yra fenotipiškai ir funkciškai sutrikę, palyginti su sveikų donorų DC. Šį susilpnėjimą iš esmės galima panaikinti pridedant p38 inhibitoriaus, IL-6 neutralizuojančio antikūno ir JAK2 / STAT3 inhibitoriaus. 50, 51, 52 Taip pat vakcinacija DC su kitais vaistais, tokiais kaip ciklofosfamidas ar kontrolinių punktų blokatoriai, gali padidinti atsako greitį. 42, 53, 54 Be to, norint ateityje plačiai taikyti su mHag užpildytą DC vakcinaciją, reikia nustatyti labiau apribotus hematopoetinius mHagus, nes šio tyrimo įtraukimo procentai vis dar buvo maži. Currently, around 35% of patients in our cohort of MM patients treated with allo-SCT have a known relevant mHag-mismatch, precluding the other 65% from this type of therapy. 55 This current trial must therefore be considered as a proof of principle, in expectation of further improvements on various fronts for definitive implementation in everyday practice.

In conclusion, we demonstrate that host-DC vaccination in combination with DLI after allo-SCT in patients with MM is feasible, safe and induces objective host-specific immune responses. Pulsing the DCs with mismatched mHag peptides can give rise to the generation of mHag-specific T-cell responses. These data warrant further host-DC vaccination studies to improve overall clinical efficacy.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento kaulų čiulpų transplantacijos svetainėje (//www.nature.com/bmt)