Elektroniniai polimerai lipidų membranose | mokslinės ataskaitos

Elektroniniai polimerai lipidų membranose | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biologinė fizika
  • Konjuguoti polimerai
  • Organinės molekulės medžiagų moksle

Anotacija

Biologinių elementų ir žmogaus sukurtų elektrinių prietaisų elektrinės sąsajos egzistuoja įvairiomis formomis, tačiau vis dar yra iššūkis įveikti skirtingas elektroninių laidininkų (metalų, puslaidininkių) ir biosistemų mechanines ir chemines aplinkas. Čia demonstruojame minkštas elektrines sąsajas, integruodami metalinį polimerą PEDOT-S į lipidų membranas. Paruošdami kompleksus tarp alkil-amonio druskų ir PEDOT-S, mes sugebėjome integruoti PEDOT-S tiek į liposomas, tiek į lipidų sluoksnius ant kieto paviršiaus. Tai žingsnis link efektyvaus elektroninio laidumo lipidų membranose. Taip pat pademonstruojame, kad šiame darbe sukurtos hibridinės PEDOT - amonio: lipidų struktūros veikia jonų kanalus ksenopuso oocitų membranoje, o tai rodo galimybę pasiekti ir valdyti ląstelių membranų struktūras laidžiais polielektrolitais.

Įvadas

Lipidai turi nepaprastą sugebėjimą formuoti biomembranas ir todėl formuoti skyrius gyvose sistemose. Ši lipidų savybė taip pat gali būti naudojama in vitro kuriant įvairiausias modelines membranos sistemas (MMS), tokias kaip liposomos, nanovamzdeliai, monosluoksniai, dvisluoksniai ir daugiasluoksniai sluoksniai. MMS yra plačiai naudojamos medžiagų moksle, tiriant katalizę, elektrochemiją ir baltymų sąveiką 1 . Elektroniniai polimerai gali būti puslaidininkiniai ir liuminescenciniai, taip pat ir metaliniai po dopingo - ir elektroninių polimerų naudojimas fotoniniam biomembranos modelių nustatymui yra gerai žinomas 2, bet ne elektriniai zondai. Tokių zondų plėtra, kad būtų galima naudotis neardomaisiais biomembranų elektroniniais ir joniniais procesais, gali sudaryti sąlygas naujiems režimams stebėti ir kontroliuoti biologinius procesus. Klasikiniai elektrodų metodai 3, pradedant metaliniais laidais 4, 5 ir baigiant kontaktų spaustukais 6, gali rimtai sutrikdyti biomembranos geometriją ir stabilumą 7 .

Elektros srovės gyvosiose sistemose, išskyrus keletą išimčių, 8, 9, 10 perduodamos joninėmis srovėmis. Priešingai, žmogaus sukurtų didelio tikslumo įtaisų srovės paprastai yra perduodamos elektronų. Tarp šių sąsajų reikalingos elektroaktyvios medžiagos, kur signalizacijos metu gali išsiskirti jonai ir elektronai. Galėtų būti pageidautina įvesti šį elektroninį kontaktą ir kelią į biomembraną, tokiu būdu panaudojant būdingą elektrinę izoliaciją, jau esančią dėl nepolinio biomembranos vidaus. Naujas ir intriguojantis būdas pasiekti tokias minkštas elektrines sąsajas būtų į lipidų membraną įvesti elektrai laidžias medžiagas. Tokiu atveju laidininko matmenys turėtų būti rasti biomembranų storio intervale, ribojant laidininkų pasirinkimą nanoregime. Nanolidų formavimas iš metalų lydyme priklauso nuo geometrinio nestabilumo, nes gali būti, kad kolonėlė Rayleigh-Plateau destabilizuojasi į lašelius; buvo pranešta apie panašius reiškinius, susijusius su nanovielių augimu elektrocheminiu redukcija 11 . Anglies pagrindu pagaminti laidininkai suteikia dar vieną galimybę formuoti nanodailus, taip pat nanoskopus. Grafeno ir anglies nanovamzdeliai (CNT) yra reikiamo storio, o ypač - CNT vamzdžiai turi būti reikalingi ilgio jungčiai biomembranoje. Tačiau CNT standumas mažai atitinka biomembranų lankstumą, ir žinoma, kad jie trikdo lipidų membranas, prasiskverbdami 12 . Taip pat žinoma, kad fullenai destabilizuoja lipidų membranas 13 .

Organiniai elektroniniai polimerai, priešingai, geriau suderina chemines ir mechanines savybes, ir gali būti biologiškai suderinami 14, 15, 16 . Į lipidų membranas įterpto polipirolio elgesys buvo ištirtas elektrochemiškai 17 . Anksčiau modeliavimas parodė, kad molekulinės vielos, vedančios iš poli (alkiltiofeno), gali prasiskverbti pro palaikomas lipidų membranas 18, tai rodo, kad yra galimybė naudoti tiofeno pagrindu pagamintus polimerus srovėms pernešti per biomembranas. Naujausiame darbe pranešta apie pastangas integruoti puslaidininkinius polielektrolitus į biomembranas ir ląsteles 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 . Rezultatai rodo, kad laidūs polielektrolitai gali spontaniškai integruotis į ląstelių membranas ir padėti juos laidoti biomembranose. Tačiau kol kas nepranešama apie didelio nuotolio lipidų sluoksnių laidumą.

Poli (3, 4-etilendioksitiofeno) sulfonatas (PEDOT-S) yra tiofeno pagrindu pagamintas polimeras (1a pav.), Kurio metalinis laidumas 30 S / cm yra 26, 27 . PEDOT-S poliariniai ir bipolaroniniai krūviai yra atsakingi už laidumą 26, 28, 29, 30 . Tai yra teigiamos skylės, susidarančios dopingo metu, kai aplinkiniame tirpale esantys protonai jungiasi su konjuguotu stuburu. Tai leidžia suderinti dopingo laipsnį su pH. Viena iš PEDOT-S pranašumų yra tai, kad jame yra neigiamai įkrautos sulfonatų grupės, turinčios mažą pKa, kovalentiškai pritvirtintą prie stuburo, kuris stabilizuoja poliaronus ir bipolaronus polioelektrolito leistinoje būsenoje ir daro jį pagal apibrėžimą savaiminį. Anksčiau mes panaudojome PEDOT-S, kad paruoštume laidžias kompozicines medžiagas su DNR 31 ir baltymais 32 . Jo įtraukimas į struktūras, kurių pagrindą sudaro fosfolipidai, taip pat sudarytų kelią laidžių lipidų nanovamzdelių ir membranų kūrimui.

Image

( a ) i) PEDOT-S monomeras, ii) dioktilo-amonio chloridas, alkil-amonio molekulė, naudojama vėlesniuose eksperimentuose, iii) DOPC, molekulė, naudojama sukurti P-: DOPC struktūras, iv) numanoma PEDOT - amonio kompleksas. ( b ) PEDOT-S tirpsta vandenyje (viršuje), bet nusėda 2, 5 mM dioktilo amonio (viduryje), o nuosėdos tirpsta chloroforme (apačioje). c ) PEDOT - amonio kompleksų, ištirpintų chloroforme: metanolyje (2: 1), ištirpinto iš vandens tirpalų, kai pH 4 (kietas) arba pH, ištirpinti amonio kompleksuose (100 μg / ml, remiantis PEDOT-S), spektrai. 9 (punktyrinis brūkšnys), atitinkantis atitinkamai su leduotu ir nuimtu PEDOT-S. Naudotos alkil-amonio druskos buvo tetrabutilo-amonio (žalia), heksadecil-trimetil-amonio (raudona), dioktilo-amonio (mėlyna) ir nonilo-amonio (juoda). PEDOT - amonio ( d ) ir PEDOT - trimetil-amonio ( e ) kompleksai, ištirpinti (100 μg / ml, remiantis PEDOT-S) chloroforme: metanolyje (2: 1), buvo apibūdinti po to, kai nusodinti iš vandens tirpalų, kurių pH buvo diapazone 9–4. Rodyklės rodo padidėjusį dopingo kiekį, kai sumažėja pH.

Visas dydis

Ligos laidžius polimerus / oligomerus turėtų būti įmanoma integruoti į lipidų membranas. Įrodyta, kad fluorescencinis polielektrolitas, primenantis PEDOT-S, sąveikauja su liposomomis, paruoštomis iš 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocholino (DOPC, 1a pav.) 33, kuris yra vienas iš labiausiai paplitusių gyvūnų ir augalų fosfolipidų. ląstelės. PEDOT-S stuburas yra hidrofobinis ir todėl natūraliai asocijuojasi su hidrofobine lipidų membranos dalimi; tačiau PEDOT-S yra pakeistos hidrofilinėmis sulfonatų grupėmis, todėl integracija į membraną yra sudėtinga. Tuo pat metu šios hidrofilinės sulfonatų grupės daro polimerą savaiminį, kuris, naudodamas biologinę membraną, gali suteikti medžiagai unikalias savybes. Todėl mes ieškojome būdų, kaip paruošti supramolekulinius kompleksus tarp katijonų ir anijoninio PEDOT-S. Tokie kompleksai gali turėti lipofilinių savybių, tuo pačiu išlaikydami savarankiško dopingo galimybę. Polimerų ir paviršiaus aktyviųjų medžiagų mišiniai turi turtingą viršmolekulinę chemiją 34, o ankstesni pranešimai parodė, kad alkil-amonio druskos gali būti naudojamos siekiant padidinti DNR 35, 36, celiuliozės nanokristalų 37 ir kitų polielektrolitų 38, 39, 40, 41 hidrofobiškumą . Įkvėptas šio ir vieno tyrimo, kaip padidinti PEDOT paviršiaus aktyvumą: polistireno sulfonatas 42, mes ištyrėme įvairias alkil-amonio druskas, kad sudarytume hidrofobinį PEDOT-S, esant supermolekulinėms sąveikoms. Susidarę PEDOT - amonio kompleksai gali būti ištirpinti organiniuose tirpikliuose. Šiuos kompleksus apibūdinome spektroskopiškai ir elektriškai bei panaudojome PEDOT kompleksą kartu su DOPC, kad sukurtume PEDOT-: DOPC lipidų hibridines struktūras (šiame darbe žymimas P-: DOPC). Mes ištyrėme struktūras, tirdami jų adsorbcijos elgseną lipidinėse membranose, turinčiose kvarco kristalų mikrobalanso išsisklaidymą (QCM-D), ir patikrinome jų elektrines savybes matuojant jų laidumą nanoelektroduose, taip pat laidžios atominės jėgos mikroskopu (C-AFM). Mes taip pat parodėme, kad P-: DOPC struktūros susisiekia su jonų kanalais biologinėse ląstelėse, padarydamos jas atviresnes esant neigiamoms membranos galimybėms.

Rezultatai

PEDOT-- amonio kompleksų paruošimas ir apibūdinimas

PEDOT-S blogai sąveikauja su DOPC membranomis, tačiau sąveiką galima skatinti formuojant supramolekulinį kompleksą tarp polioelektrolitų ir amfifilinių katijonų, sąveikaujančių su anijoninių sulfonatų grupėmis. Taigi mes ištyrėme PEDOT-S (~ 16 monomerų vienetų 43 ) ir įvairių alkil-amonio druskų sąveiką, siekdami suformuoti PEDOT - amonio kompleksus, kurie tirpsta organiniuose tirpikliuose (1b pav.). Tai būtų patrauklus būdas PEDOT-S įterpti į liposomines membranas, sumaišius hidrofobinius PEDOT-amonio kompleksus su fosfolipidais tiesiai į tirpiklį, naudojamą formuojant liposomas. Daugelis tirtų alkil-amonio druskų sudarė kompleksus su PEDOT-S, kurie nusėda vandenyje; tačiau ne visi nuosėdos buvo lengvai ištirpinti organiniame tirpiklyje. UV-vis spektroskopija gali būti naudojama norint patikrinti, ar PEDOT-S išlieka sugertoje būsenoje po to, kai suformuojamas kompleksas, nes jo difuzinis spektras atrodo skirtingai, kai jo sudėtyje yra nusidėvėjimo ir nurašymas 44, kur dedopingas rodo didelę absorbcijos smailę, esant maždaug 500– 600 nm. Keturios šiame darbe išbandytos alkil-amonio druskos (nonilo-amonio chloridas, tetrabutilo-amonio fluoridas, heksadecil-trimetil-amonio bromidas ir dioktilo-amonio chloridas) sukūrė kompleksus su PEDOT-S, turinčiais skirtingą chloroformo tirpumo laipsnį: metanolį ( 2: 1). Mes nustatėme, kad PEDOT-S dopingas kompleksuose buvo išsaugotas organiniame tirpiklyje, kas leido kontroliuoti dopingo laipsnį vandens tirpalo, iš kurio buvo nusodinami PEDOT-amonio kompleksai, pH (1c pav. ). Dioktilo-amonio chloridas ir heksadecil-trimetil-amonio bromidas buvo lengviausias darbas ir davė nuosėdas, lengvai tirpstančias organiniuose tirpikliuose. Abiejoms molekulėms buvo įmanoma sureguliuoti dopingo laipsnį koreguojant vandens tirpalo pH (1d pav., E). Gryno PEDOT-S laidumas yra apie 30 S / cm. Norėdami įsitikinti, kad PEDOT-S susimaišymas su izoliuojančiomis alkil-amonio molekulėmis šio laidumo visiškai nesumažina, mes peiliu dengėme plonas plėvelių kompleksų plėveles ant mikroskopo stiklo plokštelių. Plėvelių IV kreivės atskleidė, kad kompleksų, paruoštų esant 4 pH, laidumas vis dar yra atitinkamai maždaug 0, 4 S / cm ir 0, 8 S / cm, jei tai visiškai užpildytos PEDOT ir PEDOT - trimetil-amonio plėvelės. Visais vėlesniais eksperimentais, pateiktais žemiau, mes pasirinkome naudoti PEDOT - amonio kompleksą.

P-: DOPC struktūrų sąveika su lipidų pleiskanomis

Yra daugybė liposomų paruošimo protokolų, ir mes naudojome vieną, kuris susijęs su išspaudimu, dėl kurio susidaro mažos vienaląsčios pūslelės, kurių diametras yra kontroliuojamas. Rengiant liposomas, įtraukus hidrofobinį PEDOT - amonio kompleksą, buvo galima sukurti struktūras, paremtas DOPC, įskaitant PEDOT-S. Norėdami dar labiau apibūdinti šias struktūras, mes atlikome kvarco kristalų mikrobalansą su dispersijos (QCM-D) tyrimais, susijusius su jų sąveika su lipidų dvisluoksniais sluoksniais. Pirmiausia DOPC liposomos buvo perneštos per mikrofluidinę sistemą į SiO2 jutiklio paviršių ir buvo suformuotas lipidų dvisluoksnis sluoksnis 45, 46, 47 . Kai buvo įvestas tirpalas su P-: DOPC struktūromis, buvo pastebėti dažnio pokyčiai ir išsisklaidymas, rodantys struktūrų adsorbciją ant lipidų dvisluoksnio sluoksnio (2a pav.). Po skalavimo fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) QCM-D grafikai grįžo prie gryno lipidų dvisluoksnio verčių, tai rodo, kad adsorbuotos struktūros buvo lengvai pašalintos. Antra, mes pristatėme liposomų tirpalą su P-: DOPC struktūromis tiesiai į SiO 2 jutiklio paviršių, iš pradžių nesukurdami lipidų dvisluoksnio. Šį kartą QCM-D grafikai parodė, kad buvo suformuotas lipidinis dvisluoksnis sluoksnis, tačiau dažnis ir išsisklaidymas išliko gana aukšti, o tai rodo, kad dvisluoksnyje arba ant jo yra didesnių struktūrų jau nuo pat pradžių (2b pav.). Po skalavimo PBS dažnio ir išsklaidymo poslinkiai išliko gana aukšti. Tai rodo, kad yra P-: DOPC struktūros, įterptos į lipidų dvisluoksnį sluoksnį. AFM matavimai buvo atlikti su mėginiais, paruoštais kaip ir pirmajame QCM-D eksperimente, tačiau tik 30 s skalaujant MilliQ vandeniu, kad būtų pašalintos druskos. Tai parodė adsorbuotų struktūrų ant dvisluoksnio, kurių skersmuo yra apie 100 nm (2c pav.), Skaičių, kuris gerai atitinka 100 nm angas, naudojamas liposomų ekstruzijos procese. Aukštis buvo apie 10 nm, greičiausiai dėl konstrukcijų griūties džiovinant. Taigi įrodyta, kad lipidai su susijusiais kompleksais, įskaitant PEDOT-S, gali tvirtai pritvirtinti ir galbūt integruotis į dvilypius sluoksnius ant kieto paviršiaus.

Image

( a ) 100 nm DOPC liposomos (500 μg / ml) pasiekia SiO2 QCM-D jutiklį per 6 minutes, o lipidų dvisluoksnis sluoksnis susidaro maždaug po 9 minučių ( A ). P-: Įvestos DOPC struktūros (500 μg / ml DOPC, 50 μg / ml PEDOT-S) ir pasiekė jutiklį per 19 min. ( B ), kuris sukėlė dažnio pokyčius ir išsklaidymą, rodantį struktūros adsorbciją. Po papildomų 18 minučių pradėta skalauti grynu PBS ( C ) ir kreivės vėl tapo švarios lipidų dvisluoksnės vertės. b ) P-: DOPC struktūros (500 μg / ml DOPC, 50 μg / ml PEDOT-S) buvo įvestos tiesiogiai ir pasiekė SiO2 QCM-D jutiklį per 5 minutes. Lipidinis dvisluoksnis sluoksnis buvo suformuotas maždaug per 11 minučių ( D ), o išsisklaidymo ir dažnio pokyčiai išliko dideli, o tai rodo P-: DOPC struktūrų buvimą paviršiuje. Skalavimas PBS pradėtas po papildomų 16 min. ( E ) ir tęsiamas 50 min., Tačiau kreivių poslinkiai išliko dideli. c ) P-: DOPC struktūrų, adsorbuotų ant palaikomo lipidų dvisluoksnio, paruošto SiO2 substrate, AFM vaizdas.

Visas dydis

P-: DOPC konstrukcijų elektrinis apibūdinimas

Mes matavome sroves per P-: DOPC struktūras, adsorbuotas ant lipidų dvisluoksnių sluoksnių, paruoštų ant nanoelektrodų, su 100 nm tarpais, atitinkančiais struktūrų dydį. Įtampa, sklindanti nuo 0–1 V iki 300 s, esant 0, 5 V laiko srovei, rodė kelias μ A sroves (3a pav.). Stabili srovių srovė rodo, kad laidumas yra elektroninis. Etaloniniai mėginiai, turintys tik lipidinius dvisluoksnius sluoksnius, arba lipidiniai dvisluoksniai sluoksniai, apdoroti hidrofiliniu PEDOT-S, ištirpintu MilliQ vandenyje, po to 30 s skalaujant grynu MilliQ vandeniu, neturėjo jokio laidumo. Norėdami parodyti, kad P-: DOPC gali būti atsakingas už išmatuotas sroves, mes taip pat atlikome C-AFM. Tam buvo paruoštos didesnės P-: DOPC struktūros, ekstruzijos procese panaudojant 400 nm angas, nes priešingu atveju būtų buvę sunku pasiekti skiriamąją gebą, reikalingą patikimiems rezultatams gauti. Kaip laidų pagrindą mes panaudojome Pt ​​metalo plėvelę, ant kurios buvo adsorbuotos P-: DOPC struktūros, kaip ir antrame QCM-D eksperimente. C-AFM atskleidė sugriuvusias 400 nm struktūras, kurių aukštis buvo apie 20 nm (3b pav.). Taikant iki 100 mV įtampą, per šias konstrukcijas buvo galima išmatuoti keletą nA (3b pav.), O tai nebūtų buvę įmanoma, jei jie nebūtų laidūs, nes aukščiai viršija kvantinio tuneliavimo diapazoną. Mažas aplinkinių lipidų dvisluoksnės storis vis dėlto leidžia tunelį, o tai paaiškina didesnes šių dėmių sroves. Apytikslis įvertinimas, pagrįstas elektriniais matavimais ir mėginių geometrijomis naudojant nanoelektrodus (5 nm dvisluoksniai Au-piršto elektrodai, kurių 10 pirštų yra 20 μm iš kiekvienos pusės su 100 nm tarpais), gaunamas vidutinis P-: DOPC struktūrų šoninis laidumas. esant 10–3–10 –2 S / cm.

Image

a ) Paremti lipidiniai dvisluoksniai sluoksniai buvo paruošti ant nanodalelių elektrodų su 100 nm tarpais, o po to adsorbuotos 100 nm P-: DOPC struktūros (500 μg / ml DOPC, 50 μg / ml PEDOT-S), paruoštos esant pH 7, 4. Laiko eilutė per 300 s su įjungta 0, 5 V įtampa rodo stabilias elektronines sroves ( A ). Nuorodos į tik lipidinius dvisluoksnius sluoksnius ( B ) arba lipidinius dvisluoksnius sluoksnius, apdorotus PEDOT-S, ištirpintais MilliQ (100 μg / ml) per 15 min. ( C ), nebuvo laidžios, o matavimai buvo nutraukti po 7 s. ( D ) rodo P-: DOPC struktūrų įtampos svyravimą tarp 0–1 V. b) 400 nm P-: DOPC struktūros (500 μg / ml DOPC, 50 μg / ml PEDOT-S) buvo naudojamos Pt substratai ir matuojami C-AFM. i) parodo dvi reprezentatyvias 400 nm struktūras, kurios sugriuvo ant paviršiaus ir kurių aukštis buvo atitinkamai 17 nm ir 21 nm. ii) parodo įvairius išmatuotus taškus; iii) parodo vidutines srovių įtampos bangas, svyruojančias nuo –100 iki 100 mV, kad abi struktūros (17 nm juoda, 21 nm raudona), aplinkiniai lipidų dvisluoksniai (žali) ir švarūs Pt substratas (mėlynas).

Visas dydis

PEDOT-S ir DOPC maišymas su Nilo raudonojo skysčio numalšinimu

Tikslaus P-: DOPC struktūrų pobūdžio negalima išvesti iš aukščiau pateiktų duomenų. Hidrofobinis PEDOT-S kompleksas gali būti (i) įtrauktas į liposomų membranas, (ii) į liposomos vidinį skyrių, (iii) arba į struktūras, primenančias micelius, stabilizuotus fosfolipidų. Galimas ir šių scenarijų derinys. Todėl spektroskopiniam PEDOT-S integracijos į liposomas būdo įvertinimui panaudojome fluorescencinius dažus, kurie užsidega hidrofobinėje aplinkoje, tačiau pasižymi ypač maža fluorescencija vandenyje. Šiuose eksperimentuose buvo naudojama šiek tiek modifikuota apdorojimo seka (žr. Metodus), o hidrofobinis dažas „Nile Red“, kuris, kaip nustatyta, integruojasi į hidrofobines lipidų pūslelių sritis, buvo naudojamas kaip fluorescencinis zondas 48, 49 . Lipidų aplinkoje Nilo raudonoji skleidžia šviesą, kurios didžiausias dažnis yra maždaug 630 nm, ir buvo išanalizuoti jos fluorescencijos pokyčiai dėl PEDOT-S buvimo. Kai sužadinimo bangos ilgis buvo 550 nm, mes pastebėjome, kad Nilo raudonos spalvos dažytose liposomose, kurios buvo paruoštos kartu su PEDOT kompleksais, sumažėjo fluorescencija (4a pav.). Mes taip pat išmatuojome fluorescencijos gyvavimo laiką, sužadindami esant 500 nm bangos ilgiui, ir pastebėjome pasikeitimą iš monoeksponentinio skilimo ( τ = 3, 5 ns) į greitesnį daugiaeksponentinį skilimą, atsižvelgiant į sumažintą fluorescencijos kvantinį išeigą (4b pav.). Stebėtą greitą numalšinimą gali sukelti Nilo raudonojo spinduliuotės sužadinimo numalšinimas sąveikaujant su metaliniu PEDOT-S nedideliu atstumu 50 arba naudojant Förster rezonanso energijos perdavimo mechanizmą. Trumpas atstumas tarp „Nile Red“ ir „PEDOT-S“ reikalingas abiems šiems mechanizmams. Tai reiškia, kad PEDOT-S turi būti glaudžiai koordinuojamas su liposomų membrana arba jos viduje.

Image

a ) Kai P-: DOPC struktūros yra paruošiamos kartu su Nilo raudonuoju, fluorescencija žymiai sumažėja, palyginti su etaloninėmis DOPC liposomomis, dažytomis Nilo raudonuoju, bet be PEDOT - amonio. b ) Nilo raudonojo fluorescencinis skilimas yra greitesnis (daugiapakopis) P-: DOPC struktūrų atžvilgiu nei monoeksponentinis Nilo raudonojo skilimas DOPC liposomose ( τ = 3, 5 ns), o tai rodo numalšinimą. Žadinimo bangos ilgis buvo 550 nm a ) ir 500 nm b ).

Visas dydis

P-: DOPC struktūrų poveikis purtyklės K kanalams ksenopuso oocitų membranose

Galiausiai P-: DOPC struktūros buvo panaudotos eksperimentuose su Xenopus oocitais. Lieka klausimas, ar P-: DOPC struktūros gali būti įtrauktos į biologines lipidų membranas. Jei taip, jie gali paveikti ląstelėse ekspresuojamus membraninius baltymus. Tokiems eksperimentams tinka membraniniai baltymai, turintys įtampos jonų kanalus; jie vykdo specifinius jonus per lipidinį dvisluoksnį, todėl yra atsakingi už nervinius impulsus ir širdies jaudrumą, o atidarymo-uždarymo vartai yra labai jautrūs fiksuotiems ir mobiliesiems krūviams 51, 52, 53 . Įkrauti lipofiliniai junginiai greičiausiai patenka į lipidų sluoksnius per hidrofobinę uodegą; iš šios padėties įkrauta junginio grupė elektrostatiškai veikia teigiamai įkrautą įtampos jutiklį S4 įtampos jutiklių jonų kanalų įtampos jutiklio srityje (VSD) ir taip daro įtaką kanalo atidarymo tikimybei ir atitinkamai fiziologinėms funkcijoms 51, 54, 55, 56, 57 . Norėdami ištirti PEDOT-S poveikį jonų kanalams, išreiškėme Shaker K kanalą Xenopus oocituose ir išmatuojome K + sroves dviejų elektrodų įtampos spaustuko metodu. Pirminiai eksperimentai su PEDOT-S vandens fazėje neparodė jokio poveikio kanalams, tai rodo, kad reikalinga tiekimo sistema į membraną. Nors į tarpląstelinį tirpalą pridėtas 0, 33 μM P-: DOPC (pateiktos koncentracijos yra pagrįstos PEDOT-S monomeru) neturėjo įtakos neinjekuotiems (kontroliniams) oocitams, jis greitai padidino K + srovę esant –20 mV oocituose, išreiškiančiuose Shakerį. K kanalai (5a, b pav.). Dabartinį padidėjimą daugiausia lėmė pakitusi kanalo priklausomybė nuo įtampos (5c pav.); 0, 33 μM P-: DOPC įtampos priklausomybė pasislinko -2, 9 ± 0, 6 mV (n = 10, P = 0, 0005). Maksimalus laidumas neturėjo įtakos. Poslinkis priklausė nuo dozės, kai akivaizdus maksimalus poslinkis yra –5, 0 mV, o tariamoji KD vertė yra 0, 30 μM (5d pav.). Taikant tik DOPC liposomas (esant tokiai koncentracijai, kuri atitiktų DOPC koncentraciją 0, 33 μM P-: DOPC), Shaker K kanalo priklausomybė nuo įtampos nepasikeitė (vidutinis poslinkis: –0, 3 ± 0, 7 mV (n = 7, P>). Ankstesni tyrimai rodo, kad lipofiliškai įkrauti junginiai glaudžiai sąveikauja (~ 5 Å) su Shaker K kanalo 54 VSD. Kritinis šios hipotezės testas yra tas, kad dviejų teigiamai įkrautų argininų įvedimas į tarpląstelinį S4 galą (356R). ir 359R) daro įtaką lipofilinių krūvių junginių poveikiui 56. Ši mutacija visiškai panaikino 0, 33 μM P-: DOPC poslinkio efektą (vidutinis poslinkis: +0, 1 ± 0, 2 mV, n = 6, P> 0, 5), kas rodo, kad kompleksas su PEDOT-S yra lipidų membranoje arba arti kanalo įtampos jutiklio, tačiau mutacijos poveikis P-: DOPC jautrumui buvo priešingas tam, kuris nustatytas polinesočiosioms riebalų rūgštims 54, 56 ; du teigiamai įkrauti likučiai tarpląsteliniame įtampos jutiklio S4 galas padidino polinesočiųjų riebalų rūgščių poveikį, tuo tarpu sumažino PEDOT-S poveikį. Jei darome prielaidą, kad yra elektrostatinis poveikis ir kai aktyvioji junginių forma yra neigiamai įkrauta, tai rodo skirtingas orientacijas PEDOT-S įtampos jutiklio S4 ir polinesočiųjų riebalų rūgščių atžvilgiu.

Image

( a ) 0, 33 μM P-: tarpląsteliniam tirpalui tepamas DOPC padidina pastoviąją K + srovę esant –20 mV. b ) Srovės pėdsakai esant –20 mV nuo –80 mV laikomosios įtampos. Tas pats įrašymas kaip ir a punkte. c ) pastovus K + laidumas, palyginti su membranos įtampa. d ) sukelto poslinkio dozės ir kreivės kreivė. Geriausiai pritaikyta kreivė yra ΔV = ΔVmax / (1 + (K D / c) n ), kur ΔVmax = −5, 0 mV, K D = 0, 30 μM , o n = 3, 2. Nei kontroliniai mėginiai, turintys DOPC liposomas be PEDOT - amonio, nei PEDOT-S į vandens fazę, reikšmingų poslinkių neparodė. Duomenys pateikti kaip vidutinis ± SEM, n = 4-10. Visos pateiktos koncentracijos yra pagrįstos PEDOT-S monomeru, o visų tyrimų pH buvo 7, 4.

Visas dydis

Diskusija

Sukūrėme PEDOT-S ir alkil-amonio druskų elektrostatinius kompleksus, kuriuos galima ištirpinti organiniuose tirpikliuose su išsaugotu dopingo ir elektroniniu laidumu. Naudojant heksadecil-trimetil-amonį, gautas kompleksas, kurio laidumas yra šiek tiek didesnis, palyginti su dioktilo-amonio. Tiksli šio skirtumo kilmė šiuo metu nežinoma. Tačiau mūsų sukurti kompleksai leido mums sudaryti laidžias hibridines struktūras su PEDOT - amoniu, įterptu į DOPC fosfolipidų liposomas, galbūt per dvisluoksnį membraną. Įrodžius efektyvų „Nile Red“ membranos dažų gesinimą, kai jie buvo įtraukti į P-: DOPC struktūras, tai rodo, kad PEDOT-S yra glaudžiai koordinuojamas liposomų membranose arba ant jų. QCM-D eksperimentai atskleidė, kad šios struktūros adsorbuojasi ant palaikomų lipidų dvisluoksnių sluoksnių, ir mes sugebėjome išmatuoti sroves per juos dviem skirtingais būdais. Tai yra pirmasis laidžių lipidų membranų, galinčių perduoti elektroninę srovę per membraną, taip pat ir į šoną, didesniais atstumais, demonstracija. Minkštos elektrinės sąsajos, tokios kaip laidūs lipidiniai dvisluoksniai sluoksniai, gali būti naudojami daugelyje sričių, tokių kaip biojutimas, kontroliuojamas atpalaidavimas, nukreiptas ląstelių augimas ir bioprocesų zondavimas - tik reikia paminėti keletą. Šiame darbe taip pat pademonstruojame, kad pagamintos struktūros gali veikti kaip transporto priemonės, pernešančios metalinį poliotiofeną PEDOT-S į gyvų ląstelių membranas, galbūt sujungiant membraną. Kai tai buvo panaudota Xenopus oocituose, išreikštuose „Shaker K“ kanalais, buvo pakeistas šių kanalų atotrūkis, kuris yra pavyzdys, kad su elektroniniu lipidu galima pasiekti ir kontroliuoti gyvų ląstelių membranų struktūras: hibridines struktūras, kurias mes sukurta. Tai yra didelis žingsnis link šių savaime daromų laidžių polioelektrolitų įtraukimo į lipidų membranas ir tokiu būdu sukuriamas naujas būdas padaryti laidžią MMS ir pasiekti elektroninę prieigą prie redokso aktyviųjų elementų biologinėse sistemose.

Metodai

Chemikalai

Nonilaminas, dioktilaminas, tetraetil-amonio chloridas, tetrabutilo-amonio fluoridas ir heksadecil-trimetil-amonio chloridas buvo naudojami paruošiant 2, 5 mM alkil-amonio druskos tirpalus MilliQ vandenyje, kurių pH buvo pakoreguotas iki 4–9, atsižvelgiant į eksperimentuoti. Aminai, amonio druskos ir Nilo raudonojo membranos dažai buvo įsigyti iš Sigma Aldrich. Nesočiosios DOPC, ištirpintos chloroforme, buvo įsigytos iš „Avanti Polar Lipids“. PEDOT-S buvo susintetinta Linköpingo universiteto organinės chemijos skyriuje pagal anksčiau aprašytus protokolus 27, 31, 43 .

PEDOT - amonio kompleksų ir P-: DOPC struktūrų paruošimas

200 μl PEDOT-S MilliQ (1 mg / ml) įpilama į 1, 3 ml paruošto alkil-amonio druskos tirpalo (2, 5 mM) ir mišinys trumpam kaitinamas iki ~ 60 ° C, susidarant mėlynoms nuosėdoms, kurios centrifuguota (10000 g, 5 min.), po to supernatantas buvo pašalintas. Norint išplauti alkil-amonio druskos perteklių, nuosėdos buvo pakartotinai suspenduotos eksperimentui sureguliuotame MilliQ pH ir pakartotas centrifugavimo žingsnis. Po to nuosėdos buvo išdžiovintos N2 dujomis ir ištirpintos 200 μl chloroformo: metanolio (2: 1), tokiu būdu gaunant galutinę PEDOT-S koncentraciją 1 mg / ml PEDOT-S (iškrito iš nonilo ir tetrabutilo-amonio). turėjo ribotą tirpumą ir tetraetil-amonis ištirpsta visai). PEDOT - amonio kompleksai buvo naudojami P-: DOPC struktūroms gaminti. 200 μl šio tirpalo tirpalas buvo sumaišytas su 2 ml DOPC (1 mg / ml) chloroformo: metanolio (2: 1) santykiu. Lipidinis tortas susidarė pučiant N2 dujomis, kol tirpiklis visiškai išgaravo. Lipidinis tortas buvo suspenduotas 2 ml PBS, kurio pH buvo 7, 4 (šis pH buvo naudojamas visiems vėlesniems eksperimentams su struktūromis). Suspensija maišoma (1100 aps./min.) 30 min., 60 min. Laikoma 4 ° C temperatūroje ir maišoma (1100 aps./min.) 30 min., Prieš tai ji buvo išspaudžiama polikarbonato membranomis, turinčiomis 100 nm angas. Etaloninės liposomos buvo paruoštos tokiu pačiu būdu, tačiau nepridedant PEDOT - amonio komplekso.

PEDOT - ammoinum kompleksų ultravioletinių spindulių spektroskopija ir elektrinis apibūdinimas

PEDOT-amonio kompleksai buvo praskiedžiami iki 100 μg / ml chloroformo: metanolio (2: 1) santykiu, o įvairių mėginių absorbcija buvo matuojama UV-Vis spektrofotometru 400–800 nm diapazone. Plėvelės buvo padengtos mikroskopo stiklo plokštelėmis ašmenimis iš atitinkamai koncentruoto PEDOT - amonio ir PEDOT - amonio tirpalų, o plėvelės storiai buvo išmatuoti profilometru (~ 100 nm). Ant plėvelių su sidabro pasta buvo paruošti 1 cm ilgio elektrodai, o srovės matuojamos dviem zondo matavimais 0–1 V įtampos svyravimų metu naudojant Keithley 4200 parametrų analizatorių. Tada buvo apskaičiuotas laidumas pagal plėvelės geometriją ir gautų IV kreivių nuolydį.

QCM-D

QCM-D buvo atliktas naudojant SiO 2 jutiklius naudojant „Q-Sense E4“ instrumentą ir „Ismatec Reglo Digital M2-2 / 12“ siurblį, nustatytą ties 100 μl / min. Pateikti grafikai yra 5-osios viršūnės. Pirmajame eksperimente pirmiausia buvo suformuotas palaikomasis lipidų sluoksnis, įvedant DOPC etalonines liposomas (500 μg / ml). Po to mėginio tirpalas su P-: DOPC struktūromis (500 μg / ml DOPC, 50 μg / ml PEDOT-S) buvo įpiltas per 18 minučių, po to sistema buvo plaunama PBS buferiu 40 minučių. Antrame eksperimente iš anksto nebuvo sukurtas lipidų dvisluoksnis sluoksnis, tačiau mėginio tirpalas buvo įvestas tiesiai į jutiklį. Po bandinio paleidimo 16 min., Sistema 50 minučių buvo praplaunama PBS buferiu.

AFM

Ant SiO2 substrato su DOPC liposomomis (500 μg / ml) per 10 min buvo suformuotas palaikomasis lipidų dvisluoksnis sluoksnis. Po to paviršius buvo praplaunamas, 10 minučių panardinant į PBS buferį, o po to ant viršaus buvo pridėtas mėginio tirpalas su P-: DOPC struktūromis (500 μg / ml DOPC, 50 μg / ml PEDOT-S). Po 15 minučių inkubacijos paviršius buvo praplaunamas panardinant jį į MilliQ 30 s. Po džiovinimo kambario sąlygomis paviršius buvo nufotografuotas naudojant „Dimension 3100 SPM“ sistemą.

Elektrinis nanoelektrodų apibūdinimas

Giotenburgo Chalmerso technologijos universitete buvo gaminami au nanoelektrodai ant silicio paviršių su 10 pirštų iš kiekvienos pusės - 20 μm, o elektrodų tarpai - 100 nm. Kaip ir aukščiau aprašytame AFM eksperimente, ant jų buvo sukurti palaikomi lipidų sluoksniai, ant kurių tada buvo adsorbuotos P-: DOPC struktūros. Buvo paruošti dviejų tipų kontroliniai mėginiai: (i) gryni palaikomi lipidų dvisluoksniai sluoksniai ant nanoelektrodų ir (ii) palaikomi lipidų dvisluoksniai sluoksniai ant nanoelektrodų, apdoroti PEDOT-S, ištirpintu MilliQ (100 μg / ml) per 15 minučių inkubacijos laiką. 30 s skalaujant MilliQ. Įvairių mėginių laidumas buvo matuojamas dviem zondo matavimais, naudojant Keithley 4200 parametrų analizatorių.

C-AFM

Pt plėvelės buvo apipurškiamos SiO 2 substratais. Ant jų buvo pridėtos P-: DOPC struktūros (500 μg / ml DOPC, 50 μg / ml PEDOT-S), kurios buvo paruoštos polikarbonato membranomis, turinčiomis 400 nm angas ekstruzijos procese. Po 15 minučių inkubacijos paviršiai buvo skalaujami panardinant į MilliQ 30 s. Vietinis elektrinis apibūdinimas buvo atliktas „Dimension 3100“ (Bruker) mikroskopu, naudojant „Nanoscope IV“ valdiklį su C-AFM moduliu (1 nA / V srovės jautrumas). Commercial Pt/Ir coated silicon probes having nominal spring constant of 0.2 N/m were used to perform imaging and measure local current-voltage characteristics in contact mode, by applying load forces of 2–5 nN.

Quenching

For the quenching experiments, pure chloroform was used as solvent and 10 μ L Nile Red (1 mg/mL in chloroform) was added in the preparation of the P-:DOPC lipid cake. Also, the samples were ultra-sonicated for 5 min, before extrusion. The fluorescence measurements were acquired using a Horiba Jobin Yvon Fluoromax 4 spectrofluorometer. Lifetime data were collected with a time-correlated single photon counting spectrometer (Mini- τ , Edinburgh Instruments). A longpass filter was used in order to absorb the scattered light above 540 nm and a gray filter having absorbance 1.0 was used in order to attenuate the laser intensity. All the measurements have been performed in air.

Expression of ion channels and electrophysiological recordings

Experiments were performed on the Shaker H4 channel 58 and the Shaker 3R channel (ie 356R/359R; 56 ) made incapable of fast inactivation by the Δ(6–46) deletion 59 . Mutagenesis, cRNA synthesis, Xenopus oocyte preparation, cRNA injection and oocyte storage follows the procedures described previously 54, 55 . Animal experiments were approved by the local Animal Care and Use Committee at Linköping University. Ion currents were recorded by the two-electrode voltage-clamp technique (CA-1B amplifier, Dagan Corporation, Minneapolis, MN), Digidata TM 1440A digitizer and pClamp TM 10 software (Molecular Devices, Union City, USA) 1–6 days after injection of RNA. The amplifier′s leak and capacitance compensation were used and currents low-pass filtered at 5 kHz. All experiments were done at room temperature (20–23 °C) and at pH 7.4. The holding voltage was set to −80 mV and steady-state currents measured at voltages between −80 and +50 mV. The control solution contained (in mM): 88 NaCl, 1 KCl, 15 HEPES, 0.4 CaCl 2, and 0.8 MgCl 2 . pH was adjusted to 7.4 with NaOH yielding a final sodium concentration of ~100 mM. Pure control solution was added using a gravity-driven perfusion system. All chemicals were from Sigma-Aldrich (Stockholm, Sweden). The K conductance G K (V) was calculated as G K (V) = I K / (V–V rev ), where I K is the steady-state current at the end of a ~80-ms pulse, V the absolute membrane voltage, and V rev the reversal potential for the K channel, set to −80 mV. The PEDOT-S-induced shift of the G K (V) curve was quantified at the 10% level as previously described 57 .

Statistinė analizė

Vidutinės vertės išreiškiamos kaip vidurkis ± SEM. Statistinė G (V) poslinkių reikšmių statistinė analizė buvo atlikta naudojant dvipusį vieno pavyzdžio t-testą, kuriame vidutinės vertės buvo palygintos su hipotetine verte 0. P <0, 05 laikoma reikšminga.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Johansson, PK ir kt. Elektroniniai polimerai lipidų membranose. Mokslas. Rep. 5, 11242; „doi“: 10.1038 / srep11242 (2015).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.