Aplinkos DNR atskleidžia, kad upės yra biologinės įvairovės informacijos konvejeriai gamtos komunikacijos

Aplinkos DNR atskleidžia, kad upės yra biologinės įvairovės informacijos konvejeriai gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Ekologija
  • Molekulinė ekologija

Anotacija

Iš aplinkos paimta DNR (eDNR) yra naudingas būdas atskleisti biologinės įvairovės pokyčius. Derindami koncepcinį modelį ir empirinius duomenis, mes patikrinsime, ar upių tinkluose gabenama eDNA gali būti naudojama kaip integruotas būdas įvertinti eukariotinę biologinę įvairovę plačiose erdvėse ir visoje žemės ir vandens sąsajoje. Taikydami eDNA metabarcode metodą, mes aptikome 296 eukariotų šeimas, apimančias 19 fitų per upės baseiną. Šių šeimų pogrupiui parodėme, kad eDNR pavyzdžiai įveikia erdvinės autokoreliacijos paklaidas, susijusias su klasikiniais bendruomenės vertinimais, integruodami informaciją apie biologinę įvairovę erdvėje. Be to, mes parodome, kad aptikta daug sausumos rūšių; taigi siūlydamas eDNA upių vandenyje taip pat įtraukia informaciją apie biologinę įvairovę sausumos ir vandens biomuose. Upių tinkluose gabenamos aplinkos DNR yra naujas ir erdviškai integruotas būdas įvertinti bendrą visų kraštovaizdžių biologinę įvairovę ir pavers biologinės įvairovės duomenų įgijimą ekologijoje.

Įvadas

Nors upės užima <1% žemės masės, jos yra neįkainojamos biologinei įvairovei ir ekosistemų funkcijoms, tokioms kaip geriamasis vanduo ir energijos gamyba 1 . Dėl būdingos dendritinės tinklo struktūros upės taip pat integruoja informaciją apie kraštovaizdį rinkdamos ir nešdamos nuosėdas, organines medžiagas, maistines medžiagas, chemines medžiagas ir energiją. Pavyzdžiui, nuosėdose esanti informacija leidžia mums suprasti, kaip keičiasi upių drenažas dėl klimato ir tektoninių jėgų 4 . Upės taip pat veikia kaip kraštovaizdžio plaučiai, išskirdamos didelius CO 2 srautus, gautus iš sausumos augalų makromolekulių, tokių kaip ligninas ir celiuliozė, suskaidydamos ir transportuodamos šiurkščias ir smulkias kietąsias daleles 5 . Upių tinklai taip pat vaidina svarbų vaidmenį formuojant daugelio peizažų organizmų genetinę ir rūšių įvairovę, diktuojant pasklidimo kelius 6, 7 .

Organinės medžiagos, esančios DNR pavidalu, gaminamos iš organizmų, jos taip pat pernešamos per upes per ląsteles, audinius, lytines ląsteles ar organelius, ir yra vadinamos aplinkos DNR (eDNR) 8, 9, 10 . Iš šių organizme esančių liekanų vandenyje DNR gali būti išskirta, padalijama į seką ir perduodama atgal kilmės rūšims, naudojant eDNR metabolitą 10, 11 . Šis elegantiškas rūšies DNR rinkimo ir aptikimo procesas tampa labai vertingas imant biologinę įvairovę ekologijoje ir saugant 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 . EDNA erdvinis signalas buvo neseniai ištirtas ir parodo, kad upėse eDNR gali būti pernešta didesniais atstumais 8, 18 . Todėl mes iškėlėme hipotezę, kad upės, kaupdamos ir transportuodamos eDNR, veikia kaip konvejeriai su biologinės įvairovės informacija, kurią galima naudoti norint įvertinti rūšių turtingumą plačiomis erdvinėmis skalėmis ir potencialiai visoje žemės ir vandens sąsajoje.

Biologinės įvairovės mėginių ėmimas naudojant upių vandenyje randamą eDNR yra dvejopas. Pirma, biologinės įvairovės taškų nustatymas yra neįkainojamas, norint suteikti pirmenybę pasaulinėms ir regioninėms išsaugojimo pastangoms 19 . Apskaičiuotas turtingumas nustatyti vietą kaip viešosios interneto prieigos tašką ar ne, jei jai nebuvo paimta imčių 20 . Nepakankamas biologinės įvairovės mėginių ėmimas turi daug priežasčių (ir pasekmių) išsaugojimui ir ekologijai apskritai, tačiau daugiausia kyla iš mėginių ėmimo metodų, naudojamų turtingumui įvertinti tokiu būdu, kuris būtų apibendrinamas atsižvelgiant į erdvę 21 . Pvz., Klasikinis vandens makroin stuburinių gyvūnų turtingumui upėse įvertinti metodas yra kikneto metodas, kai visi individai tam tikroje apibrėžtoje upelio vietoje yra surenkami tinkle 22 . Tada paimama daug tokių mėginių, kurie vėliau sujungiami, siekiant parodyti viso upės ruožo ar baseino turtingumą. Tokių erdviniu būdu autokoreliuotų pavyzdžių, kaip šis, telkimas sukelia nepakankamą biologinės įvairovės vertinimą, palyginti su tuo, jei kiekvienos rūšies mėginiai būtų imami atskirai. Kadangi paprastai neįmanoma visų rūšių mėginių imti savarankiškai, rekomenduojama statistinį mėginių ėmimo artefaktą pašalinti 21 . Biologinės įvairovės įvertinimas naudojant eDNA yra galimas būdas paimti kiekvienos rūšies, nepriklausančios nuo kosmoso, DNR, kaupiantis ir pernešamas per upės tinklą.

Antra, eDNA biologinės įvairovės stebėjimo upėse metodas turi keletą pranašumų, nes jis yra nemirtinas daugumai klasikinių imčių taksonominių grupių, sumažina buveinių ardymą ir gali įvertinti įvairovę visame gyvenimo medyje naudodamas vieno lauko mėginių ėmimo protokolą, todėl jis yra labai brangus. efektyvus. Taigi, parodydami šios priemonės galią stebėti svarbių upių rodiklių grupes biologinę įvairovę, bus sukurta greita, mirtina ir nebrangi alternatyvi priemonė, palyginti su klasikiniais metodais.

Visos bendruomenės aptikimas naudojant eDNA buvo vadinamas „žaidimo keitikliu“ imant biologinės įvairovės mėginius 16, o šiame tyrime šią idėją perkeliame iš teorijos į praktiką. Tikriname hipotezę, kad upėse pernešta eDNR gali būti naudojama precedento neturinčiu būdu įvertinti eukariotų biologinę įvairovę. Mes patvirtiname eDNA metabolinio kodavimo metodo gebėjimą in vitro ir in situ įvertinti globaliai svarbias makroekonominių bestuburių bendruomenes ir pateikiame taksonominio turtingumo įvertinimus, kurie atspindi upių baseino biologinę įvairovę. Galiausiai mes parodysime, kad daugybė eukariotinių fitų iš vandens ir sausumos taksonų gali būti įvertinti iš upių vandenyje esančios eDNA ir pateikiame hipotezę, kad upės yra peizažų biologinės įvairovės informacijos konvejeriai.

Rezultatai

eDNR aptikti metazoaninius eukariotus

Iš viso aptikome 296 šeimas, apimančias 19 eukariotinių fiilų iš Glatt upės baseino Šveicarijoje (1 pav.). Visos šeimos buvo nepriklausomai geografiškai patikrintos, kaip žinoma, kad jos yra Šveicarijoje ar keturiose kaimyninėse šalyse (2a pav.; 1 papildomi duomenys). Didžioji dalis aptiktų šeimų buvo Arthropoda ( N = 196). Aptiktų šeimų skaičiaus įvairovė nebuvo proporcinga skaitymui, o mažesni organizmai sudarė žymiai didesnę gautų sekų dalį (Rotifera; 2b pav.). Pvz., Dvi rūšis, priklausančias Rotifera prieglaudai, sudarė 39% (92 907 sekos) mūsų duomenų rinkinio. Daugumai šeimų buvo atstovaujama> 10 sekų ( N = 140; 1 papildomi duomenys). Didžiausias duomenų mažinimo žingsnis bioinformatinėje darbo eigoje buvo susiejant taksonominį pavadinimą su mūsų sekomis (papildomas 1 pav.; E žingsnis), todėl gautų sekų buvo tik 4% (240 340 sekos), kurios galėtų būti panaudotos mūsų tyrimo išvadoms ( 1 lentelė). Iš sekų, kurios buvo identifikuotos rūšims ir kurios buvo nepriklausomai geografiškai patikrintos kaip tokios, kurių pasitaiko Šveicarijoje, daugelis yra antžeminės ( N = 255; 3 pav.; 3 papildomi duomenys 2).

Image

Glato upės srauto kryptis yra šiaurės vakarų kryptimi (mėlyna rodyklė). Pagrindinis upės stiebas yra išplaukęs iš Greifensee ežero. Mastelio baras, 2 km. Spalvoti regionai žymi baseiną prieš kiekvieną mėginių ėmimo vietą. Raidės naudojamos nurodyti vietą upių tinkle, pradedant nuo ištekėjimo „a“ iki „f“ ir dviejų imčių intakų „ab“ ir „cd“. GIS duomenų šaltiniai buvo iš „Swisstopo“ (DHM25, „Gewässernetz Vector 25“) ir perspausdinti gavus leidimą.

Visas dydis

Image

a ) Šeimų skaičius pagal vieną prieglobstį ( N = 296), iš kurių imami mėginiai ir patvirtinta, kad jie yra Šveicarijoje arba yra žinomi iš visų keturių kaimyninių šalių (Austrijos, Prancūzijos, Vokietijos ir Italijos). Intarpas dar labiau suskaido gausiausią sambūrį (Arthropoda) į šeimų, paimtų iš klasės, skaičių ( N = 196). b ) Pilkos spalvos brūkšniai rodo sekų, kurioms taksonominis identifikavimas suteiktas šeimos lygiu, skaičių kiekvienam prieglaudai.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Image

Buvo patvirtinta, kad rūšys yra Šveicarijoje arba yra žinomos iš visų keturių kaimyninių šalių (Austrijos, Prancūzijos, Vokietijos ir Italijos; N = 255). Skaičius skliausteliuose nurodo kiekvienai prieglaudai patvirtintą rūšių skaičių.

Visas dydis

eDNA aptikimas makroin stuburinių

Iš 296 šeimų, kurioms nustatyta eDNR dėl eukariotų, 65 yra naudojamos Šveicarijos biologinio stebėjimo programoje 23 . Tik kikneto mėginiais buvo aptiktos trylika papildomų šeimų, iš viso 78 Glatt upės mėginių ėmimo vietose aptiktos 78 makroabininių šeimos (papildomas 2 pav.). Iš eDNR mes atgavome nuo 23 iki 40 šeimų kiekvienoje vietoje (papildomas 2 pav.). Taikydami klasikinį kikneto metodą, mes atrinkome 17–24 šeimų kiekvienoje vietoje (papildomas 2 pav.). Iš visų aptiktų 78 šeimų 33 buvo aptiktos abiem būdais ir dažnai toje pačioje vietoje (papildomas 2 pav.). Iš likusių 45 šeimų 32 buvo aptiktos tik naudojant eDNR, o 13 - tik aptiktos kikneto pavyzdžiu. Vienuolika iš šių 13 šeimų, aptiktų tik kiknetu, buvo aptiktos eDNA duomenų rinkinyje, tačiau neatitiko bioinformatinių slenksčių, naudojamų priskyrimo vertėms filtruoti (pavyzdžiui, kai mažesnis nei 90% sekos panašumas arba lygiavimo ilgis <100 bazinių porų (bp) ), 1 papildoma lentelė). Dvi nenustatytos šeimos (Potamanthidae ir Aphelocheiridae) greičiausiai neturėjo pakankamai duomenų apie „GenBank“ sekas, kad galėtų nustatyti savo DNR seką iš eDNR (1 papildoma lentelė). Iš 32 šeimų, aptiktų tik eDNR, 8 buvo rasta ankstesnių mėginių ėmimo metu per 18 stebėjimo metų (2 papildoma lentelė), o dar 2 (Molannidae, Notonectidae) yra Greifensee ežere, kuris patenka į upę. Glatt, bet nežinomi iš Glatt upės (2 papildoma lentelė).

Šeimos turtingumas (α įvairovė) padidėjo atsižvelgiant į kaupiamąjį baseiną, iš kurio imami eDNR, o to nebuvo pastebėta kikneto mėginiuose ( F 1, 6 = 5, 45, P = 0, 058, r 2 = 0, 95, eDNR; F 1, 6). = 0, 0001, P = 0, 99, r 2 = 0, 92, kiknetas; 4a pav.). Šeimos ir teritorijos santykio nuolydis buvo skirtingas (nuolydžio kiknetas = 0, 0006; nuolydis eDNA = 0, 1077; F 1, 12 = 29, 87, P = 0, 0001), o y įsikišimas buvo didesnis eDNA, palyginti su kiknetu ( F 1, 13 = 25, 99, P = 0, 0002; 4a pav.). β-įvairovė bendruomenės skirtumo forma nepadidėjo kaip atstumo funkcija eDNR ( r = 0, 02, P = 0, 44), tuo tarpu imdami kikneto mėginius stebėjome skirtumo (β įvairovės) kaip atstumo funkcijos padidėjimą. tarp mėginių ėmimo vietų ( r = 0, 52, P = 0, 005; 4b pav.).

Image

a ) kiekvienoje vietoje išmatuota α įvairovė ir eDNR bei kikneto pavyzdžių log 10 transformuoto taksono ir ploto santykis. EDNR linijų ir y įsikišimo kampai yra žymiai didesni, palyginti su kiknetu (atitinkamai P <0, 0001, P = 0, 0002), tai rodo, kad eDNA imasi didesnio įvairovės didesniame plote, palyginti su kiknetais. b ) Bendruomenės skirtumo ir geografinių atstumų tarp mėginių vietų koreliacija. Tinklavietės β įvairovės vientisa linija rodo reikšmingą teigiamą ryšį su srauto atstumu ( P = 0, 005). EDNR β įvairovės punktyrinė linija rodo reikšmingo ryšio su atstumu nebuvimą ( P = 0, 44).

Visas dydis

In vitro testas, naudojant pavyzdžių bendruomenę

Iš viso po bioinformatinio filtravimo mes išgavome 57 641 seką iš maketų bendruomenės ir šios sekos buvo identifikuotos 25 iš 33 bestuburių taksonų, įtrauktų į maketų bendruomenę (1 lentelė; 3 papildoma lentelė). Iš šių sekų 99, 97% buvo teisingai priskirti vienam iš šių taksonų, įtrauktų į maketų bendruomenę (4 papildoma lentelė; 5 papildoma lentelė). Neteisingai priskirtų sekų skaičius buvo 0, 03% (20 / 57, 641) ir visos šios sekos priklausė dviem taksonams (Tabanidae ir Leuctridae; 4 papildoma lentelė). Tai lėmė klaidingai teigiamą 8% (2/25) procentą. Padidinus mūsų bioinformatikos slenksčių, nustatytų priskyrimui priimti iki tokio lygio, kuris pašalina visus klaidingus teigiamus pavyzdžių pavyzdžius bendruomenėje, lygį (pavyzdžiui, padidinant užduoties panašumą iki> 92%), klaidingai nebūna 16% (4/25). tyčinė bendruomenė, tai yra, pašalinant iš taksonų, kurie buvo mėgėjų bendruomenėje, tačiau jų priskyrimo panašumas buvo <92% (papildoma 4 lentelė). Taikydami 92% panašumo slenkstį duomenims, gautiems iš eDNR vandens mėginiuose, galimai klaidingam buvimui įvertinti nepakeitėme pagrindinių išvadų (papildomas 3 pav.).

Diskusija

Mes pademonstravome, kad upės, rinkdamos ir gabendamos eDNR, gali būti naudojamos mėginių surinkimo lygio biologinei įvairovei imti visoje žemės ir vandens sąsajoje. Vandens makro bestuburiams, palyginti su klasikiniu kikneto metodu, toje pačioje mėginio vietoje radome didesnį šeimų, aptiktų eDNR, skaičių (4a pav.). Manoma, kad padidėjęs jautrumas atsiranda dėl DNR pernešimo per upės tinklą proceso. DNR pernešimas per upių tinklą sumažina paklaidas, susijusias su erdvine autokoreliacija (arba ribotais padariniais), būdingomis klasikiniam kikneto bendruomenės mėginių ėmimui. Mūsų darbo duomenys patvirtina, kad upėse randama eDNA yra erdviškai integruota biologinės įvairovės matas, ir šis atradimas siūlo ekologams naują ir precedento neturintį įrankį, leidžiantį paimti kraštovaizdžio biologinę įvairovę su mažiau mėginių ėmimo ir galimai įvertinti eukariotų bendruomenių turtingumą biomuose.

Mes hipotezuojame, kad šis koncepcinis modelis yra mūsų duomenų paaiškinimas. Paprastai bendruomenių mėginių ėmimo metodai užfiksuoja tik dalį vietinės α įvairovės dėl netobulo aptikimo ir mėginių ėmimo paklaidų (5 pav.):

Image

Nors klasikinis mėginių ėmimas nustato tik dalį tikrosios vietinės įvairovės, iš dalies dėl erdvinės autokoreliacijos, eDNA mėginių ėmimas leidžia įvertinti baseino įvairovę, įskaitant vandens ir antžeminius taksonus, ir integruoti šią informaciją erdvėje dėl eDNA gabenimo pasroviui.

Visas dydis

Image

su

Image
vaizduoja išmatuotą α įvairovę erdvinėje vietoje x upių tinkle, naudojant klasikinius mėginių ėmimo metodus,
Image
kaip realioji α įvairovė šioje vietoje ir δ klasikinė kaip mėginių ėmimo metodo aptikimo dažnis. Norint išsamiai įvertinti upės baseino biologinę įvairovę, reikia daug tokių mėginių. Jei pavyzdžiai yra erdviniu būdu autokoreliuojami, sujungus bendruomenės pavyzdžius bus nepakankamai įvertintas tikrasis vietos turtingumas 21 .

Upių upių tinklai gali surinkti šią informaciją už mus, 2, 3, jei naudosime tinkamą mėginių ėmimo metodą, kuriam neobjektyvus erdvinis autokoreliacija tiriamoje srityje. Būdingos upių savybės, tokios kaip specifinis biologinės įvairovės pasiskirstymas 24 ir eDNR pernešimas vandens srautu 8, yra mechanizmai, įgalinantys eDNA metabolinio kodavimo metodą įvertinti baseino baseino lygio biologinę įvairovę, imant mėginius tik vienoje ar keliose vietose:

Image

su

Image
kaip integruotas baseino α įvairovės matas (5 pav.). Suma užfiksuota upių sistemos integruota informacija apie visas vietas y (Strahlerio upelio tvarka) prieš mėginių ėmimo vietą x . Vietinė įvairovė Strahlerio upelio eilės vietoje y turi būti įvertinta pagal Hortono įstatymą, kad būtų galima užfiksuoti šios Strahlerio upelio eilės srautų skaičių ( N y ) 3, taip pat pagal Strahlerio srauto eiliškumą būdingą β įvairovę ( β y ). Biologinės įvairovės nuotėkio baseine lygis padidėja didėjant β įvairovei tarp mėginių ėmimo vietos ir visų aukštupio vietų ( β x, y ), taip pat didėjant transportavimo atstumui ( τ x, y ; grynoji norma, įskaitant išsiskyrimą ir degradaciją). Atkreipkite dėmesį, kad eDNR specifinė aptikimo tikimybė ( δ eDNR ) paprastai yra didelė, nes norint sėkmingai aptikti iš principo reikia tik labai nedaug DNR molekulių.

Mūsų koncepcinis modelis išskiria tris svarbius pranešimus apie eDNR kaip genomo įrankio biologinės įvairovės vertinimui naudingumą. Pirmiausia, eDNA aptikdamas rūšis iš upių vandens, rūšis atskirtos nuo fizinės buveinės buveinėje, gabenant pasroviui. Transportavimo atstumas empirinėse sistemose buvo matuojamas nuo 240 m iki 12 km (nuorodos 8, 25), ir tai leidžia padidinti jautrumą aptikant pataisytas ar sunkiai paskirstytas rūšis. Be to, eDNA gabenimas leidžia įvertinti turtingumą ir imti mažiau mėginių, nes integruotas signalas yra erdvėje. Antra, eDNA greičiausiai atspindės didesnės įvairovės pavyzdį, palyginti su klasikiniais mėginių ėmimo metodais bet kurioje vietoje, tačiau tai priklauso nuo vietinio rūšių pasiskirstymo ir nuo veiksnių, turinčių įtakos eDNA transportavimui ir skilimui. Trečia, rūšių, esančių upėje iš eDNA mėginio, aiškinimas skiriasi nuo klasikinių mėginių ėmimo metodų. Būtent eDNA rūšių aptikimas turėtų būti aiškinamas kaip integruotas buvimo signalas, o tinkama erdvinė skalė nustatoma atsižvelgiant į galimą sistemos pernešimo atstumą. Taigi, mūsų modelis rodo, kad eDNR upėse yra efektyvi plataus masto biologinės įvairovės įvertinimo priemonė, kuri, atsižvelgiant į atstumą tarp vandens mėginių, yra mažiau patikima labai lokaliems turtingumo įvertinimams.

Mūsų duomenys, lyginantys eDNR su kikneto pavyzdžiais kiekvienoje vietoje, išryškina kelis svarbius veiksnius, kurie parodo eDNA naudojimą biologinės įvairovės vertinimui ir galią, ir dabartinius apribojimus. Abiem metodais buvo aptikta daugybė makroabininių stuburinių šeimų kiekvienoje vietoje ir jos labai sutampa. Šeimos buvo aptiktos kartu. Tačiau visose svetainėse eDNA atgavo daugiau makroinvestorių šeimos, palyginti su kikneto mėginiais. Mes hipotezuojame, kad tai greičiausiai dėl integruoto signalo iš gabenamos DNR, ir tai akivaizdu tuo, kad bendruomenės sudėtis beveik nesikeičia (tai yra, β įvairovė išlieka pastovi per atstumą), palyginti su kikneto įvertinta β įvairove, kuri padidėjo toks pat upės atstumas mūsų tyrimo srityje. Šis skirtumas reiškia, kad du mėginių ėmimo metodai pateikia skirtingą informaciją toje pačioje vietoje. Klasikiniai mėginių ėmimo metodai suteikia informacijos, kuri yra lokalizuota, tuo tarpu eDNA metabolinio kodavimo metodas upėse matuoja rūšių buvimą platesnėje erdvėje. Padidinus klasikinį visuomenės atrankos metodą, įvairovė greičiausiai visada bus nepakankamai įvertinta 21, eDNA siūlo empirinį metodą, kaip įveikti šį apribojimą, ir tai yra neprilygstamas būdas įvertinti turtingumą didesnėms teritorijoms. Šis naujas atradimas yra labai svarbus, nes daugeliu atvejų siekiama įvertinti didelėje teritorijoje esančią įvairovę, pavyzdžiui, biologinės įvairovės karstams 19, draustiniams ar visoms upių baseinams 26 .

Dabartinė upių buveinių būklės blogėjimo tendencija yra upės baseinas, todėl jos negalima priskirti vienam taškui ar šaltiniui 1 . Biologinis stebėjimas šiuo metu yra pagrįstas brangiais ir mirtinais makro bestuburių mėginiais iš daugelio vietų, kad būtų galima suprasti upių ekosistemų būklę 27, o šių erdvės ir laiko pokyčių stebėjimas yra labai įdomus 28 . Biologinis stebėjimas atėjo į naują erą ir jo naudojimo poreikis išteklių agentūroms sukūrė nepagrįstą naštą. Pavyzdžiui, JAV, Anglija ir Šveicarija iš viso kasmet išleidžia 117, 4–206, 6 mln. JAV dolerių vandens sistemų biologiniam stebėjimui (6 papildoma lentelė). Šis skaičius atspindi tik nedidelę dalį to, ką šalys išleidžia biomonitorializacijai daugiau vietos lygmeniu, tačiau apibūdina vertę, kurią mes suteikiame rūšių naudojimui jų aplinkoje vandens ekosistemų sveikatai stebėti. Biologinis stebėjimas yra brangus dėl skirtingų metodų ir žinių, reikalingų rinkti informaciją apie kiekvieną tikslinę taksonominę grupę (pavyzdžiui, 6 papildomą lentelę) 22, 27 . Makro bestuburių eDNA signalas gali būti naudojamas tiksliau įvertinti baseino įvairovę, naudojant daug mažiau mėginių ėmimo pastangų, ir dėl to sumažėtų biomonitoringo išlaidos, kai siekiama išmatuoti ekosistemų būklę dideliais masteliais upių sistemose.

Pavyzdžiui, norint suprasti vietinius turtingumo pokyčius restauravimo vietoje, vis tiek gali prireikti klasikinių mėginių ėmimo naudojant tinklus. Įdomu tai, kad eDNA transportavimo atstumai yra panašūs, kai vietinių rūšių telkiniai pripažįstami svarbiais atkuriant pataisas upių sistemoje (0–5 km) 29 . Todėl eDNR galėtų būti naudojama kaip būdas išmatuoti rūšių baseiną, kurį galima rekronizuoti. Tačiau eDNR nulemtų pasekmių skalė gali būti> 5 km dėl didelių pernešimų baseinuose ir tarp baseinų dėl kitų vektorių, tokių kaip plėšrūnų išmatos. Metodų papildomumas padės nustatyti prioritetus upių atkūrimo pastangoms, nustatant regionus, kuriuose yra didelis tikslinių rūšių rekolonizacijos potencialas, ir galbūt nustatys lūkesčius, kokių pokyčių tikimasi jau atsigaunančiose atkūrimo vietose.

Mūsų rezultatai taip pat nustato būdą, kaip empiriškai išmatuoti bendruomenės eDNA transportavimą upėse. Mūsų β-įvairovės analizė šioje tyrimų sistemoje rodo, kad bendruomenės eDNR greičiausiai bus pernešta ir aptinkama <12 km mastu. Norint nustatyti upių sistemos bendruomenės eDNR pernešimo mastelį, reikia nustatyti mastelį, kuriame yra teigiama erdvinė autokoreliacija su β įvairove (pavyzdžiui, 4b pav.). Šis empirinis pernešimo matas yra reikalingas, nes, kaip parodyta mūsų koncepciniame modelyje, eDNA biologinės įvairovės nustatymas yra ne tik transportavimo atstumo, bet ir rūšių pasiskirstymo tinkle funkcija. Pačiam transportui taip pat daro įtaką vietiniai veiksniai, tokie kaip eDNR skilimas dėl ultravioletinių spindulių, pH ir temperatūros 30, taip pat išsiskyrimo greitis 25 . Todėl eDNA nebūtinai turi būti gabenama ir aptinkama tuo pačiu atstumu visoms upių sistemoms arba nuosekliai laiku dėl ekstremalių įvykių, tokių kaip gausu kritulių ar sausros. Naudojant koreliaciją tarp eDNR β įvairovės įvertinimo ir upės atstumo tarp mėginių ėmimo vietų; tačiau gali būti atliktas in situ testas ir bet kurios sistemos bendruomenės apimties eDNA gabenimo mastas gali būti atidengtas ir gali būti pakartotinai matuojamas per tam tikrą laiką, norint patikrinti, ar sistemoje stabilus eDNA pernešimo atstumas.

Vis dar yra svarbių eDNA metabolinio kodavimo metodo apribojimų. Šie iššūkiai yra susiję su tokiais veiksniais, kaip pradinio ar žymeklio pasirinkimo svarba, amplikono sekos ilgis ir aptikta biologinė įvairovė, kaip atskaitos duomenų, turimų sekoms 31, 32 identifikuoti, funkcija. Pvz .: žuvys, plokščiosios kirmėlės ir diatomos mūsų duomenų rinkinyje yra nepakankamai atstovaujamos tam, kas, mūsų žiniomis, yra tiriamoje sistemoje. Tai greičiausiai lemia pradmenų pasirinkimas, genetinis žymeklis ir pamatinė duomenų bazė. Šiame tyrime naudojami pradmenys yra universalūs „Folmer“ pradmenys, skirti citochromo c oksidazės I (COI) 33 5 ′ galai, ir yra žinoma, kad šie pradmenys labai gerai nepatinkliuoja žuvų ir plokščiųjų kirminų DNR - 34, 35 ; atitinkamai. Be to, diatomoms yra žinoma, kad PKI nėra geriausias genetinis žymeklis, tinkantis rūšims nustatyti 36 . Todėl akivaizdu, kad norint tinkamai įvertinti gyvybės medžio biologinę įvairovę, reikia daugiau nei vieno žymeklio ir (arba) grunto rinkinio37. Tačiau norint naudoti eDNA metabolinio kodo metodą, nereikia papildomų mėginių ėmimo lauke. Atvirkščiai, tai sukuria vieno lauko mėginių ėmimo metodą, kai kruopštus daugelio genetinių žymenų amplifikavimas laboratorijoje leis integruotai nustatyti bendrą biologinę įvairovę iš vieno mėginio 38 .

Papildomas iššūkis, su kuriuo susiduria tolesnis šio požiūrio taikymas, yra poreikis toliau kurti įvairias, bet kuruojamas duomenų bazes su taksonomiškai klasifikuotomis sekomis. Mūsų pavyzdžių bendruomenės analizė patvirtino, kad sekų priskyrimas buvo labai tikslus, palyginus su pamatinėmis sekomis, generuojamomis iš DNR, naudojamų apgaulingų žmonių bendruomenei (panašumas 96, 4–99, 9%). Priskyrimo tikslumo dispersija padidėjo iki (90, 1–99, 8%), palyginti su NCBI nukleotidų duomenų baze. NCBI nukleotidų duomenų bazės spragas, skirtas tikslinėms grupėms, pavyzdžiui, makro bestuburiams, naudojamiems biologiniam stebėjimui, reikės padidinti ir įvertinti, kol įrankį bus galima plačiau pritaikyti valdyme. Dėl neaiškumų duomenų bazėje pašalinome daugybę sekų, kurių nebuvo galima užtikrintai priskirti šeimos taksonominiam lygiui. Dabartiniu filtravimo lygiu mes jau priimame klaidingą nebuvimą 14% (1 papildoma lentelė). Sumažinus mūsų duomenų rinkinį, naudojant griežtesnius kriterijus, padidėjo II tipo klaida, sukuriant daug daugiau klaidingų taksonų nebuvimo atvejų, kuriuos mėginių ėmimo metu faktiškai surinkome savo pagrindinio tinklo pavyzdžiuose (1 papildoma pastaba). Todėl šiame eDNA metabolinio kodavimo metodo diegimo etape tyrėjai turi stengtis sumažinti melagingą nebuvimą ir melagingą buvimą, tuo tarpu suprantant, kad įrankis sparčiai tobulėja, o melagingų su šiuo metodu susijusių klaidingų klaidų lygis vis dar nežinomas, nei apskaičiuota. duota čia. Tačiau, palyginti su morfologiniais makro bestuburių vertinimais šeimos lygmeniu, nustatyta, kad identifikavimo paklaida svyruoja nuo 22, 1% (nuoroda 39) iki 33, 8% (nuoroda 40), o tai rodo, kad vienintelė alternatyva, naudojama reguliavimo stebėjimo parametruose, jau turi didelis klaidingai teigiamų buvimo / nebuvimo procentas. Didžioji dalis sekų iš mūsų duomenų rinkinio buvo pašalinta, nes nepavyko atlikti taksonominės priskyrimo. Sprendimas yra didinti sekų nusėdimą kuruojamose duomenų bazėse, tokiose kaip „The Barcode of Life Database 41“, nuolat bendradarbiaujant molekuliniams ekologams ir taksonomistams. Pavyzdžių skaitmeninimas sekų pavidalu yra svarbus žingsnis, kuris žymiai pagerins mūsų galimybes tiksliai identifikuoti aplinkoje rastas DNR.

Mes parodėme, kad upės, rinkdamos ir gabendamos eDNA, perduoda precedento neturintį kiekį informacijos apie biologinę įvairovę kraštovaizdžiuose. Mūsų tyrimas rodo, kad eDNA gali būti naudojama imant upių baseinų bendruomenės struktūrą ir tai daroma visoje žemės ir vandens sąsajoje. Eukariotinės faunos aptikimas su upėse rasta ir pernešta DNR gali sujungti istoriškai atskirtas vandens ir sausumos ekologijos tyrimų sritis ir pateikti integruotą bendros biologinės įvairovės matavimą, kad būtų galima greitai įvertinti vieną iš labiausiai paveiktų pasaulio biomų.

Metodai

eDNA mėginių ėmimas ir bibliotekos paruošimas sekančios kartos sekos nustatymui

Vandens mėginiai buvo imami iš aštuonių vietų, esančių palei Glatt upių tinklą, tai yra Reino upės poskyris Šveicarijoje (1 pav.). Tyrimo vietos buvo pasirinktos, nes jos žymi upių tinklo mazgus, kuriuose vanduo iš pagrindinių poskyrio intakų jungiasi ir teka į pagrindinį Glatt upės kamieną. Jie taip pat turi žinomą pastaruosius 15 metų makro bestuburių stebėjimo istoriją 42 . Kiekvienoje vietoje DNR buvo paimta iš 840–900 ml upės vandens, iš kurio buvo paimti mėginiai. DNR mėginių ėmimo, gavimo ir ekstrahavimo metodas buvo toks, kaip Deiner ir kt . 43, kur filtravimo gaudymo metodas buvo sujungtas su fenolio – chloroformo izoamilo DNR ekstrakcija. Griežtai laikantis užterštumo kontrolės, buvo laikomasi kontroliuojamos laboratorijos eDNR išskyrimui ir paruošimo prieš PGR paruošimo 43 . Buvo atlikti trys nepriklausomi ekstraktai, kurių tūris buvo 280–300 ml, ir po to sujungti į lygias DNR, paimtas ir išgrynintas nuo 840 iki 900 ml vandens. Bendras filtruoto vandens tūris kiekvienam ekstrakcijos pakartojimui priklausė nuo suspenduotų kietų medžiagų, kurių mėginys užkimšo filtrą. Vanduo šiam tyrimui buvo renkamas keletą minučių prieš imant vandens makroabininius stuburinius gyvūnus, naudojant klasikinį mėginių ėmimo metodą, tinklą (aprašymas pateiktas žemiau ir (nuorodos 24, 42)), todėl buvo galima palyginti kikneto ir eDNR metodus vandens makroįstuburių bendruomenėms nustatyti. tame pačiame baseine tuo pačiu metu.

PGR buvo atlikta tiksliniam genui, COI, naudojant standartinius COI pradmenis 33 atliekant jungtines eDNR ekstrakcijas kiekvienai iš aštuonių vietų ir amplifikuojant 658 bp fragmentą, išskyrus pradmenų sekas. PGR buvo atlikti 15 μl tūrio su galutinėmis 1x tiekiamo buferio (Faststart TAQ, Roche, Inc., Bazelis, Šveicarija), 1 000 ng μl −1 galvijų serumo albumino koncentracijomis (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA). JAV), 0, 2 mM dNTP, 2, 0 mMol MgCl 2, 0, 05 U μl −1 Taq DNR polimerazės (Faststart TAQ, Roche, Inc., Bazelis, Šveicarija) ir 0, 50 μMol kiekvieno iš priekio ir atvirkštinio pradmenų 33 . Pridėta 2 μl išimties ekstrahuotos eDNR. Šiluminis ciklo režimas buvo 95 ° C 4 minutes, po to sekė 35 ciklai, kai temperatūra 95 ° C 30 s, 48 ​​° C 30 s ir 72 ° C 1 min. Galutinis prailginimas 72 ° C 5 minutes buvo atliktas, o PGR buvo aušinamas iki 10 ° C, kol pašalinamas ir laikomas -20 ° C temperatūroje, kol bus patvirtinti produktai. PGR produktai buvo patvirtinti gelio elektroforeze naudojant 1, 4% agarozės gelį, dažytą GelRed (Biotium Inc., Hayward, CA, JAV). Kiekviename iš aštuonių eDNR mėginių iš mūsų tyrimo vietų buvo atlikti trys PGR pakartojimai, o trijų pakartojimų produktai buvo sujungti. Bet kokiam užteršimui molekulinės darbo eigos metu stebėti buvo naudojami neigiami filtravimo, ekstrahavimo ir PGR kontroliniai bandymai, kurie taip pat buvo pakartoti tris kartus. Po to reakcijos buvo išvalytos naudojant „AMPure XP“ granules pagal rekomenduojamą gamintojo protokolą, išskyrus 0, 6 x granulių koncentraciją, o ne 1, 8 x, remiantis rekomenduojamu protokolu fragmentų dydžiui išlaikyti> 500 bp (31 psl., „Nextera XT DNA 96“ rinkinys, Illumina, Inc.)., San Diegas, CA, JAV). Kiekvieną sujungtą reakciją mes įvertinome kiekybiškai, naudodamiesi fluorometru „Qubit“ (1.0), laikydamiesi rekomenduojamų dsDNR didelio jautrumo DNR tyrimo protokolų, kurių tikslumas dvigubai grandine DNR yra nuo 0, 005 iki 0, 5 pg μl −1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV). . Šiame etape neigiamos kontrolinės DNR neturėjo kiekybiškai įvertinamos DNR, todėl mes jų toliau neperdirbėme.

Po to aštuonios reakcijos buvo praskiedžiamos molekulinio lygio vandeniu („Sigma-Aldrich, Co. LLC. St. St. Lewis, MO, JAV) iki 0, 2 ng μl −1 pagal rekomenduojamą bibliotekos sudarymo protokolą („ Nextera XT DNA 96 kit “, Illumina, Inc., San Diegas, CA, JAV). Aštuonių vietų bibliotekos buvo paruoštos naudojant „Nextera XT DNR rinkinį“ pagal gamintojo rekomenduojamus protokolus ir dvigubai indeksuojamos naudojant „Nextera XT“ indekso rinkinį A („Illumina Inc.“, San Diegas, CA, JAV). Trumpai tariant, šis protokolas naudoja procesą, vadinamą žymėjimu, kai amplikonas yra suskaidomas pirmiausia iš 5 ′ ir 3 ′ galų, o rodyklė ir adapteris sujungiami ant amplikono. Žyminimo procesas sukuria kiekvienos vietos (tai yra, bibliotekos) amplikono fondą su atsitiktinai suskaidytais fragmentais, kurių ilgis vidutiniškai 300 bp, kurie vėliau yra indeliuojami. Kiekvienai svetainei suprojektuota biblioteka buvo sujungta ir sudedama poromis (2 x 250 bp) ant „Illumina MiSeq“ Genominės įvairovės centre, ETH, Ciuriche, Šveicarijoje pagal gamintojo vykdomus protokolus („Illumina, Inc.“, San Diegas, CA, JAV). Pirminei analizei ir neapdorotų tekstų atstatymui buvo naudojama „MiSeq Control Software 2.2“ versija, įskaitant „MiSeq Reporter 2.2“.

Bioinforminė analizė

Proceso eiga pateikta 1 paveiksle. Paleidimo kokybė buvo įvertinta naudojant FastQC 0.10.1 versiją. Pirmyn ir atgalinės sekos buvo sujungtos, naudojant mažiausiai 25 bp persidengimą ir mažiausiai 100 bp ilgį, naudojant „SeqPrep 44“ . Sekos, kurių nebuvo galima sujungti, nebuvo įtrauktos į tolesnę analizę. Sujungtos sekos, kurių kokybės balai pašalinami mažiau nei vidutiniškai 25. Po to sujungtos sekos buvo pakartotos, pašalinant tikslius dubliavimus, pašalintos iš triukšmo, naudojant sekos tapatumo slenkstį 99%, ir buvo iškirptos į kairę ir dešinę 28 bp kokybe, naudojant „PrinSeq Lite“ versiją 0.20.3, kad būtų pašalinta bet kokia pradmenų seka 45 . Sequences were then mapped to the COI Barcode of Life Database (iBOL phase 4.00) 41 using a map_reads_reference.py script with the minimum per cent identity to consider a match as 50% and the minimum sequence length match to a reference of 50% to remove any sequences not likely of COI origin. Subsequent sequences were then chimera checked using usearch version 6 (ref. 46). Remaining sequences <100 bp in length were then taxonomically identified using customized Blast searches against the NCBI non-redundant nucleotide database using the package blast 2.2.28, build on 12 March 2013 16:52:31 (ref. 47). Taxonomic assignment of a sequence was done using the best blast hit based on a bit score calculated using the default blastn search of a −3 penalty for a nucleotide mismatch and a reward of +1 for a nucleotide match. Sequences that did not match eukaryotes, were <90.0% sequence similarity, had <100 bp overlap with query, had a taxonomic name not assigned below the level of family, matched best with unknown environmental samples and/or had a bit score <100 were excluded from biodiversity detection analysis for all sites. These parameters were used because they removed likely taxonomic identification errors or exclude data that was unidentified at the family level used for analysis 43, 48 .

After identification of sequences with the NCBI nucleotide sequence database, each uniquely identified taxon from any site was geographically verified as known to be present in Switzerland to the lowest level of taxonomy, or if no data was available for Switzerland, it was also considered present when the taxon was known to be present in Austria, France, Germany and Italy. We excluded the one and very rare case (that is, Culicoides fascipennis ), where it is known for sure that a species is not in Switzerland, but found in all four neighbouring countries. Geographic verification was done in consultation with 25 expert taxonomists for various groups, primary literature and through database repositories as described in Supplementary Tables 1 and 2. If the species could be confidently confirmed as being present in Switzerland or in all four neighbouring countries, their known habitat use was identified as being freshwater (defined as having at least one life stage inhabiting water) or terrestrial (which included species that inhabit riparian or wet habitats or typically feed in aquatic habitats, but do not have full life stages or reproduce in the water; Supplementary Table 2). In addition, because we used bovine serum albumin as an additive in PCR, we cannot rule out that detections of Bos taurus or Bos indicus were due to this reagent and therefore excluded them from analysis.

Mock community analysis

A mock community approach was used to verify that our laboratory methods and bioinformatics pipeline were capable of correctly detecting the taxa of interest. We composed a mock community of invertebrate taxa from 33 different families spanning three phyla (all known to be present in our study area, Supplementary Table 3). We individually extracted their DNA, pooled and sequenced the mock community in accordance with the same methods used for analysis of eDNA samples from the river Glatt (see Supplementary Note 1 for complete methods). We additionally Sanger sequenced all 33 DNA extractions from taxa following that of Mächler et al . 49 to generate a sequence reference database to assess the assignment errors when using NCBI's nucleotide database 47 .

Kicknet sampling and identification

Macroinvertebrates were detected using a standard kicknet sampling design described for federal and cantonal guidelines in Switzerland 23, 24 and represent our positive control for each site. In brief, we took eight independent kicknet samples per site on 29 October 2012. Large inorganic and organic debris was removed, and samples were pooled into a single collection jar with 70% EtOH. Jars were then stored at room temperature until morphological identification. This method and time of year has been shown to reflect the different microhabitats and provides a robust presence measure for many macroinvertebrates in Switzerland 23 . Since eDNA has been shown to decay over short time periods of a few days to a few months; 30, using a single time point from a kicknet sample to compare with that of what is detected in the eDNA is valid. However, it is known that kicknet samples taken at different times of year, such as in the spring, can detect different species due to the morphological constraints in the identification of specimens at young life stages or that their physical presence in the water is limited due to timing for their life cycle 23 . Specimens from each site were sorted to the lowest taxonomic level possible (family, genus or species level), using dichotomous keys agreed upon by the Swiss Federal Office of the Environment 23 . Specimens that could not be identified to at least to the taxonomic rank of family were excluded from further analysis.

Comparison of eDNA and kicknet macroinvertebrate detection

For each site, we summarized the number of eDNA detected families of macroinvertebrates and number of families observed for the classical kicknet method, including only aquatic taxa on the standardized list of macroinvertebrates for biomonitoring of Swiss waters by the Federal Office for the Environment 23 . Using this standardized list, we calculated each site's observed α-diversity (local richness) for macroinvertebrates and visualized it on a heatmap of incidence. The estimated catchment area sampled for each position in the network was calculated as the cumulative sum of the area of all subcatchments into which all surface waters (excluding the lake) drain above the sampling point (Fig. 1). Topological distance between the sampling sites was calculated along the river's path. Catchment area and distance between the sampling sites were calculated using Quantum Geographic Information System in version 2.8 (ref. 50). The number of families detected (considered here as α-diversity) by each sampling method (eDNA and kicknet) was log 10 transformed and regressed against the log 10 of the river area to test for the taxon–area relationship. We were interested in whether or not the two sampling methods differ in the magnitude of diversity detected due to the transport of DNA ( y intercept of the taxon–area relationship), and that the rate of increase in number of taxa for a given area was faster for eDNA compared with the kicknet (slope of the regression lines), as predicted from our conceptual model. Slopes and y intercepts of the two regressions for the taxon–area relationship were tested using an analysis of covariance.

To test for a spatial autocorrelation in community dissimilarity (β-diversity, using the Jaccard dissimilarity index) and between sampling locations, we used a Mantel's test with 9, 999 permutations. Here we exclude the tributaries as it is not possible for eDNA to flow into these locations (for example, cd into a). The Jaccard measure of β-diversity was used as it has been shown to estimate community dissimilarity for incidence data with less biases because of nestedness that is expected for the eDNA estimate of β-diversity due to transport 51 . All statistical analyses were performed in R version 3.1.0 (ref. 52).

Duomenų prieinamumas

All raw data associated with this study have been deposited on the NCBI's Sequence Read Archive (SRA) under the BioProject PRJNA291617. Details for each individual file are given in Supplementary Table 7. All other intermediate processed data files are available from the authors upon request.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary Figures 1-3, Supplementary Tables 1-7, Supplementary Notes 1 and Supplementary References

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildomi duomenys 1

    Families that were geographically verified as occurring in Switzerland or known from all four neighboring countries. For each family their higher order classification (Phylum, Class and Order) is given. Furthermore, we give for each macroinvertebrate family recorded the number of sequences, the average number of identical base pairs matched (and standard deviation sd) to Genbank sequences (in percent), the average (and standard deviation sd) alignment length with the Genbank sequence (# number of base pairs), as well as the geographic confirmation source. For a detailed list of all confirmation sources, see sheet "Confirmation sources" of this Excel file. Not applicable is abbreviated as "na".

  2. 2.

    Supplementary Data 2

    Confirmation sources used for identifying families that were geographically verified as occurring in Switzerland or known from all four neighboring countries.

  3. 3.

    Supplementary Data 3

    Species that were geographically verified as occurring in Switzerland or known from all four neighboring countries. For each species their higher order classification (Phylum, Class, Order, Family, and Genus) is given. Furthermore, we give for each macroinvertebrate species their habitat, number of sequences, the average number of identical base pairs matched (and standard deviation sd) to Genbank sequences (in percent), the average (and standard deviation sd) alignment length with the Genbank reference (base pairs), as well as the geographic confirmation source. For a detailed list of all confirmation sources, see sheet "Confirmation sources" of this Excel file.

  4. 4.

    Supplementary Data 4

    Confirmation sources used for identifying species that were geographically verified as occurring in Switzerland or known from all four neighboring countries.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.