Epcam tarpląstelinis domenas skatina kiaulių ląstelių perprogramavimą padidindamas pluripotento geno ekspresiją per beta-katenino signalus | mokslinės ataskaitos

Epcam tarpląstelinis domenas skatina kiaulių ląstelių perprogramavimą padidindamas pluripotento geno ekspresiją per beta-katenino signalus | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Židinio sukibimas
  • Perprogramuoti

Anotacija

Ankstesnis tyrimas parodė, kad epitelinių ląstelių adhezijos molekulės (EpCAM) ekspresija buvo reikšmingai padidinta kiaulių sukeltose pluripotencinėse kamieninėse ląstelėse (piPSC). Tačiau EpCAM reguliavimo mechanizmas ir paskesni tiksliniai genai nebuvo gerai ištirti. Šiame tyrime mes nustatėme, kad EpCAM nebuvo aptinkamas fibroblastų srityje, bet labai išreikštas piPSC. EpCAM promotorius buvo sureguliuotas zigotomis aktyvuotais veiksniais LIN28 ir ESRRB, tačiau juos slopino motinos veiksniai OCT4 ir SOX2. EpCAM numušimas shRNR reikšmingai sumažino pluripotento geno ekspresiją. Priešingai, per didelis EpCAM ekspresija reikšmingai padidino šarminių fosfatazių teigiamų kolonijų skaičių ir padidino endogeninių pluripotentinių genų ekspresiją. Kaip pagrindinis paviršiaus į branduolį veiksnys, EpCAM atpalaiduoja savo tarpląstelinį domeną (EpICD), atlikdamas nuoseklų dviejų etapų proteolitinį apdorojimą. Inhibitorių TAPI-1 ir DAPT užblokuotas proteolitinis perdirbimas gali sumažinti EpICD tarpląstelinį lygį ir sumažinti OCT4, SOX2, LIN28 ir ESRRB išraiškas. Pastebėjome, kad padidėjęs intraląstelinis EpICD nesugebėjo pagerinti EpCAM nukreiptų genų aktyvumo, tačiau blokuodamas GSK-3 signalus ir stabilizuodamas beta-katenino signalus, EpICD tada galėtų žymiai stimuliuoti promotoriaus aktyvumą. Šie rezultatai parodė, kad EpCAM tarpląsteliniame domene reikėjo beta-katenino signalizacijos, kad būtų galima patobulinti kiaulių ląstelių perprogramavimą.

Įvadas

Kiaulių kiaulių daugialąsčių kamieninių ląstelių generavimas gali ne tik įrodyti naminių gyvūnų pluripotenciškumo sampratą, bet ir išlaikyti didžiulį gyvūnų dauginimosi ir transliacinės medicinos potencialą. Per pastaruosius kelerius metus kiaulių sukeltos pluripotentinės kamieninės ląstelės (piPSC) buvo generuojamos daugelyje tyrimų grupių, įskaitant mūsų laboratoriją 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 . Kadangi bona fide kiaulių embriono kamieninės ląstelės dar nebuvo prieinamos, dauguma manipuliavimo sąlygų palaikant piPSC buvo vertinamos atsižvelgiant į pelių iPS 9 ir žmogaus iPS ląstelių 10 sąlygas . Todėl pranešti piPSC parodė skirtingas morfologijas ir biologinius ypatumus. Kai kurios piPSC linijos buvo priklausomos nuo bFGF ir parodė pelių epiblastų kamienines ląsteles, pavyzdžiui, morfologija 2, 11 ; kitos linijos buvo priklausomos nuo LIF ir parodė pelių ESC panašią morfologiją 3 . Taigi, piPSC generavimo ir priežiūros optimalios kultūros sąlygos ir reguliavimo schema nėra standartizuota, o naivių valstybinių piPSC generavimas ir priežiūra vis dar yra svarbi problema, kurią reikia išspręsti. Ankstesnėse ataskaitose buvo įsitikinta, kad signalizacijos keliai, naudojami palaikant žmogaus ir pelės iPSC, neatlaikė kiaulių iPSC atsinaujinimo ir daugiapotencijos 12, 13 . Tikėtina, kad kiaulėms ir kitiems gyvūnams bus taikomas su rūšimis susijęs signalizacijos kelias, gautas naudojant pelių ir žmogaus pluripotencines kamienines ląsteles (PSC) 14, kuriuose PI3K / AKT signalizacijos ir TGF-beta signalizacijos keliai vietoj LIF ir bFGF signalų būdas gali palaikyti kiaulių kamieninių ląstelių daugiaplaniškumą 15 .

Epitelinių ląstelių adhezijos molekulė (EpCAM) yra transmembraninis glikoproteinas, koduojamas TACSTD1 geno, ir yra labai ekspresuojamas epitelio ir epitelio išvestose neoplazmose16. Žmogaus ir pelių iPSC EpCAM taip pat buvo labai ekspresuojamas ir vaidina lemiamą vaidmenį perprogramuojant ląsteles 17, 18, 19, 20 . Nuosekliai mūsų ankstesnis tyrimas parodė, kad EpCAM yra labai išreikštas kiaulių iPSC 13 . Todėl kaip EpCAM, kaip adhezijos tarp ląstelių molekulė, dalyvauja ląstelių signalizavime, migracijoje, proliferacijoje ir diferenciacijoje 19, 20, 21 . Naujausi tyrimai parodė, kad EpCAM buvo pagrindinis paviršiaus receptorius, galintis persikelti į branduolį ir sureguliuoti pasroviui taikomo geno ekspresiją 22 . Dviejų etapų proteolitinio apdorojimo metu EpCAM yra nuosekliai skaidomas naviko nekrozės faktoriaus alfa konvertuojančio fermento (TACE / ADAM17) ir presenilino 2 (PS-2), gama-sekretazės komplekso proteazės komponento, ir atpalaiduoja N-galinį tarpląstelinį domeną. (EpEX) ir 5 kDa C-galinio viduląstelinio domeno (EpICD). EpICD fragmentas, kuris yra nestabilus citoplazmoje, sugeba persikelti į branduolį ir yra kartu su ko-transkripcijos aktyvatoriais, skatinančiais genų ekspresiją ir ląstelių proliferaciją 23 . Tyrimas parodė, kad EpICD su FHL2, beta-kateninu ir Lef-1 sudarė branduolinį kompleksą, kuris susisiekė su DNR Lef-1 sutarimo vietose ir stimuliavo c-Myc raišką 24 . Todėl verta ištirti EpCAM vaidmenį kiaulių ląstelių proliferacijoje ir jo ryšį su perprogramavimu.

Tyrimai parodė pagrindinę EpCAM funkciją reguliuojant žmogaus ir pelės pluripotentines kamienines ląsteles 17, 18 . Norėdami sužinoti apie epigenetinį kiaulių pluripotenciacijos reguliavimą, išsamiai išanalizavome kiaulių EpCAM geną ir ištyrėme EpCAM reguliavimo funkciją kiaulių ląstelių perprogramavimui ir pluripotenciacijos palaikymui. Mūsų atradimai padėtų nustatyti naivią kiaulių pluripotentinių kamieninių ląstelių būklę.

Rezultatai

EpCAM yra labai ekspresuojamas kiaulės daugianarėse kamieninėse kamieninėse ląstelėse

EpCAM raiškos profilis kiaulės audiniuose iš naujagimio paršelio buvo atliktas atliekant RT-PGR analizę. Kaip aprašyta anksčiau 25, 26, EpCAM yra labai ekspresuojamas epitelio ląstelėse. Mūsų tyrime EpCAM žinutė buvo aptinkama visuose tirtuose mėginiuose. Tai gali būti dėl paplitusių epitelio ląstelių daugumoje organų. Tuose epiteliais praturtintuose organuose, pavyzdžiui, plaučiuose, inkstuose ir plonojoje žarnoje, EpCAM buvo palyginti gausiai nei kituose audiniuose (1A pav.). Aštuonių piPSC linijų ir dviejų pirminių kiaulės odos fibroblastų mikrogramų duomenų (pastaba: NANOG ir SOX2 genai nebuvo įtraukti į „Affymetrix Pig GeneChipe 13“ ) schema parodė, kad EpCAM ir šerdies pluripotentiniai genai, tokie kaip OCT4, LIN28, UTF1 ir ZFP42 , buvo labai išreikštos, o linijai būdingų genų išraiška buvo sumažinta (1 pav. B), kas rodo, kad EpCAM gali atlikti svarbų vaidmenį kiaulių ląstelių perprogramavimo metu. Be to, EpCAM ir daugelio epitelio genų išraiškos lygis buvo aiškiai aukštesnis piPSC nei fibroblastų, o mezenchiminių žymenų išraiškos lygis buvo aiškiai sumažintas piPSC (1 pav. B). Šie rezultatai parodė, kad kiaulės ląstelių perprogramavimo metu įvyko mezenchiminis perėjimas prie epitelio, o tai buvo svarbus įvykis perprogramuojant ląsteles, kaip pranešta pelių ir žmonių iPSC 27, 28 .

Image

( A ) EpCAM (EPC ) raiška kiaulės audiniuose ir epitelio ląstelėse PK-15. Kaip vidinė kontrolė buvo naudojama GAPDH (GAP ). ( B ) Pluripotenciškumo ir trijų gemalų sluoksnių (viršutinio) ir MET / EMT žymeklių (apatinio) gyvybiškai svarbių genų raiška kiaulių somatinėse ir pluripotentiškose ląstelėse. C ) EpCAM ir pluripotentinių genų ekspresijos profilis kiaulių oocituose ir ankstyvosios stadijos embrionuose, subrendusiuose in vivo ir in vitro . ( D ) EpCAM (žalios) imunofluorescencijos piPS, PK-15 ir PEF ląstelėse. Branduoliai buvo nudažyti Hoechst 33342 (mėlyna spalva). Mastelio juosta, 50 μm.

Visas dydis

Kadangi iš vidinių ląstelių masės (ICM) gaunamos embriono kamieninės ląstelės (ESC) yra išsamiausiai ištirtos pluripotentinės kamieninės ląstelės 29, buvo išanalizuoti kiaulių kiaušialąsčių ir ankstyvųjų embrionų, subrendusių in vivo ir in vitro , transkriptų duomenys. EpCAM išraiškos lygis buvo žemas oocitų ir 2 ląstelių stadijose, tačiau reikšmingai padidėjo 4/8 ląstelių stadijoje iki blastocistos stadijos (1 pav. C), kas rodo, kad EpCAM yra zigotiškai aktyvuotas genas. Pastebėjome, kad aukšto lygio zigotai aktyvuotų pluripotentinių genų LIN28 30 ir ESRRB 31 ekspresija taip pat buvo pristatyta morulos stadijoje in vivo embrionuose, nors pluripotentinių genų ekspresijos profilis parodė šiek tiek skirtingus ekspresijos modelius in vitro embrionuose. Laikydamiesi transkriptominės ir RT-PGR analizės, imunofluorescencinis dažymas patvirtino, kad EpCAM baltymas buvo ekspresuojamas ir perkeltas į ląstelės membraną piPSC, tačiau jo nebuvo galima aptikti neprogramuojamose PEF ląstelėse (1 pav. D). Šie rezultatai atskleidė, kad EpCAM gali būti žymeklis stebint kiaulių somatinių ląstelių perprogramavimą.

EpCAM suaktyvina Zygotic suaktyvinti daugialypiai faktoriai

Norėdami toliau tirti EpCAM reguliavimą piPSC, aptikome EpCAM raišką kiaulių ląstelių perprogramavimo metu. Per pirmąsias keturias dienas po žmogaus OCT4, SOX2, KLF4 ir c-MYC (hOSKM) transfekcijos endogeninis EpCAM buvo labai žemas. Po šešių dienų po transfekcijos EpCAM raiška buvo žymiai padidėjusi (2A pav.). Norėdami ištirti, kaip buvo suaktyvintas EpCAM, buvo klonuotas 3, 8 kb DNR fragmentas („GenBank“ prieigos numeris KY218795), kuriame yra promotoriaus sritis, 5 ′ UTR seka ir EpCAM ATG kodonas, patvirtintas DNR seka ir subklonuotas į reporterių vektorius pTRIP-EGFP ir pGL3-basic, kad sudarytų pTRIP-EpCAM-EGFP ir pGL3-EpCAM-Pro konstrukcijas (S2 lentelė). Rezultatai parodė, kad PK-15 ir piPSC ląstelėse buvo pastebėta stipri EGFP fluorescencija, tačiau kontrolinėse PEF ląstelėse fluorescencinis signalas nebuvo aptinkamas (2 pav. B). Liuciferazės tyrimas parodė, kad EpCAM promotorius buvo žymiai suaktyvintas PK-15 epitelio ir PEF fibroblastų (2 pav. C), rodantis klonuotų EpCAM promotoriaus specifiškumą ląstelėms.

Image

. ( A ) EpCAM ekspresijos qRT-PCR analizė kiaulių fibroblastų perprogramavimo metu naudojant HOSKM 14 dienų. ( B ) pTRIP-EpCAM-EGFP ir pTRIP-CAGG-EGFP (Ctrl) perdavimas atitinkamai į PEF, PK-15 ir piPS ląsteles, siekiant nustatyti EpCAM promotoriaus aktyvaciją. Svarstyklės, 100 μm. ( C ) Liuciferazės tyrimas. Žurnalistės pGL3-EpCAM-Pro (Exp) ir pGL3-Basic (Ctrl) buvo atitinkamai perkrautos į PEF ir PK-15 ląsteles 36 valandas. ( D ) EpCAM promotoriaus aktyvacijos luciferazės tyrimas, reguliuojamas vien žmogaus pluripotento faktoriaus (kairėje) arba derinio (dešinėje) 293 T ląstelėse. Ctrl, ląstelės buvo transfekuotos pGL3-EpCAM-Pro ir pMXs-EGFP. ( E ) EpCAM promotoriaus aktyvacijos luciferazės tyrimas, kurį reguliavo kiaulių pluripotenciniai veiksniai. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, * P <0, 05, ** P <0, 01, n = 3.

Visas dydis

Norėdami ištirti, ar EpCAM tiesiogiai reguliavo pluripotenciniai veiksniai, reporteris pGL3-EpCAM-Pro su hOSKM vektoriais buvo kartu transfekuoti atitinkamai į 293 T ląsteles. Pastebėjome, kad EpCAM promotoriaus aktyvumą smarkiai slopino OCT4 ir SOX2 (2 pav. D). Kadangi OCT4 ir SOX2 gali sudaryti kompleksą, prisijungti prie pasroviuose esančių genų ir palaikyti 32 daugiapotenciumą, buvo pritaikytas daugialypis OSKM faktorių perdavimas. Rezultatai parodė, kad OCT4-SOX2 kompleksas, taip pat OSK ir OSM deriniai galėjo žymiai sumažinti EpCAM promotoriaus aktyvumą, tačiau OCT4-KLF4, OCT4-c-MYC, SOX2-KLF4, SOX2-c-MYC ir KLF4-c-MYC deriniai. neturėjo įtakos EpCAM veiklai. Tačiau c-MYC ir SKM derinys sugebėjo sustiprinti EpCAM promotoriaus aktyvumą (2 pav. D). Tada mes nustatėme, ar EpCAM galima sureguliuoti į kiaulę nukreiptais pluripotentais. Panašiai kaip žmogaus veiksniai, kiaulės OCT4 ir SOX2 slopino EpCAM promotoriaus aktyvumą (2 pav. E). Be to, zigotai suaktyvinti daugiakrypčiai veiksniai LIN28 ir ESRRB galėtų reikšmingai padidinti EpCAM aktyvumą, o tai rodo, kad EpCAM padidina zigotai suaktyvinti pluripotentiniai veiksniai.

„Knockdown EpCAM“ sumažina perprogramavimo efektyvumą

Norėdami numušti EpCAM raišką, mes sukūrėme tris shRNR, nukreiptus į EpCAM tarpląstelinio domeno seką, ir sukūrėme tris lentivirusinius shRNR vektorius (pav. S1). Kai PK-15 ląstelės buvo transfekuotos lentivirusine shRNR, endogeninės EpCAM išraiška sumažėjo 70–90 procentų, palyginti su kontrole tiek RNR lygyje (3 pav.), Tiek baltymų lygyje (3 pav. B). Ląstelių perprogramavimo schema naudojant keturis veiksnius hOSKM ir shRNR buvo parodyta 3C pav. PEF ląstelės, kurios buvo transfekuotos lentivirusinėmis shRNR, buvo perprogramuotos hOSKM (3 pav. C). Dviejų savaičių indukcija ir gydymas shRNR perprogramuotoms ląstelėms parodė šarminės fosfatazės (AP) dažymo teigiamas kolonijas (3D pav., Viršutinė dalis), o EpCAM numuštų ląstelių morfologija parodė daug neatitikimų (3D pav. Apatinė). AP-teigiamų kolonijų kiekybinis įvertinimas parodė, kad perprogramavimo efektyvumas žymiai sumažėjo, kai EpCAM išraiška buvo numušta shRNR (3 pav. E). Tada mes aptikome EpCAM poveikį piPSC. ShRNR konstrukcijos buvo transfekuotos į DOX-iPSC, DOX indukuotos piPSC liniją, aprašytą anksčiau 11, atitinkamai 60 valandų. ŠRNR apdorotų iPSC klonų morfologija buvo daug laisvesnė ir plokštesnė, palyginti su kontroliniais klonais (3 pav. F). Kiekybinė RT-PGR analizė parodė, kad EpCAM numuštų ląstelių pluripotencinių genų, įskaitant motinos faktorius OCT4, Sox2 ir SALL4, ir zigotos aktyvuotų faktorių LIN28 ir ESRRB ekspresijos lygis buvo žymiai sumažėjęs (3G pav.), Kas rodo, kad EpCAM kaip raktas paviršiaus ir branduolio faktorius vaidina svarbų vaidmenį reguliuodamas kiaulių pluripotentinio geno raišką.

Image

( A, B ) Kiekybinė RT-PGR ( A ) ir Western blotting ( B ) analizė EpCAM ekspresijos numušimo shRNR pagalba PK-15 ląstelėse 60 valandų. b-aktas, beta-aktinas buvo naudojami kaip vidinė kontrolė. ( C ) ląstelių perprogramavimo schema, naudojant hOSKM ir apdorojimą shRNR. ( D ) Šarminių fosfatazių dažymas ląstelėse, kurios buvo perprogramuotos shRNR 13 dienų (viršutinė), ir perprogramuotų ląstelių kolonijos morfologija (apatinė). ( E ) AP teigiamų kolonijų skaičius po gydymo shRNR 13 dienų. ( F ) PiPSC, kurie buvo transfekuoti shRNR, morfologija. ( G ) plRipotencinių genų ekspresijos qRT-PGR analizė. DOX-iPSC buvo transfekuoti shRNR 60 valandų. Ctrl, ląstelės buvo apdorotos be shRNR. Mastelio juosta, 50 μm. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, * P <0, 05, ** P <0, 01, n = 3.

Visas dydis

Per didelis EpCAM raiška padidina perprogramavimo efektyvumą

Norėdami toliau ištirti EpCAM reguliavimo funkciją, mes klonavome kiaulių EpCAM koduojančią DNR seką („GenBank“ prieigos Nr. KX904866) ir sukonstravome du perreguliavimo vektorius. Konstruktas pSIN-EpCAM buvo gautas iš pSIN lentiviralinės plazmidės, pasižyminčios puromicino atsparumu, o konstruktas pSIN-fEpCAM buvo gautas iš pSIN-EpCAM su ECFP (sustiprinto ciano fluorescencinio baltymo) įterpimu į EpCAM baltymo N-galą (4A pav.). PFS ląstelių, stabiliai perkeltų pSIN-EpCAM ir parinktų puromicino, Western blot analizė parodė, kad klonuotas genas koduoja EpCAM baltymą ir per daug ekspresuojamas transfekuotose PEF ląstelėse (4B pav.). Tada mes transfekavome pSIN-fEpCAM į PK-15 ląsteles ir atlikome imunofluorescencinį dažymą, kuris parodė, kad fEpCAM sulietas baltymas ir endogeninis EpCAM buvo lokalizuoti ląstelių plazmos membranoje (4 pav. C), parodant, kad klonuotas EpCAM išlaikė biologinę funkciją, ir konstrukcijas buvo galima panaudoti sekantiems eksperimentams.

Image

( A ) Lentivirusinių vektorių, skirtų ekspresuoti EpCAM ir ECFP-EpCAM sulietą baltymą (fEpCAM), schema. SP, signalo peptidas. TM, transmembraninis domenas. EpEX, tarpląstelinis domenas. ICD, tarpląstelinė sritis. ( B ) Western blot analizė. Baltymai buvo paruošti iš PEF (Ctrl) ir PEF + EpCAM (Exp) ląstelių, kurios buvo transfekuotos pSIN-EpCAM lentivirusu 60 valandų. Imunoblotams nustatyti buvo naudojami anti-EpCAM antikūnai ir anti-b-aktino antikūnai. ( C ) Imuninis EpCAM padengimas anti-EpCAM antikūnais (raudonaisiais) PK-15 ląstelėse, kurios buvo transfekuotos pSIN-fEpCAM (žalia). Branduoliai buvo nudažyti Hoechst 33342 (mėlyna spalva). Svarstyklės, 25 μm. ( D ) ląstelių AP dažymas, perprogramuotas OSKM pagalba 13 dienų (viršutinė) ir gautų kolonijų morfologija (apatinė). Buvo suskaičiuotos AP teigiamos kolonijos (dešinė panelė). Mastelio juosta, 50 μm. ( E ) qRT-PGR analizė pluripotencinių genų ekspresijai DOX-iPSC. Ctrl, ląstelės buvo transfekuotos pSIN-EGFP. Atvirai, ląstelės buvo transfekuotos pSIN-EpCAM. ( F ) geno žymenų, gautų spontaniškai diferencijuojant į ektodermą ( NESTIN ), mezodermą ( CD34 ) ir endodermą ( FOXA1 ), genų žymenų qRT-PCR analizė. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, * P <0, 05, ** P <0, 01, n = 3.

Visas dydis

Norėdami nustatyti EpCAM reguliavimą ląstelių perprogramavimo metu, pSIN-EpCAM buvo perneštas į PEF ląsteles, kurias vėliau suaktyvino retrovirusiniai vektoriai, nešini su hOSKM. 13 dienų indukcijai buvo suformuotos kompaktiškos kolonijos (4D pav., Apatinė dalis), kuriose buvo pastebėtas AP teigiamas dažymas (4D pav., Viršutinė). Kiekybinis įvertinimas parodė, kad per didelis EpCAM ekspresija žymiai padidino AP teigiamų kolonijų skaičių, palyginti su kontroline grupe (4 pav. D). Didelis EpCAM ekspresija DOX-iPSC, palaikomas pridedant doksiciklino, taip pat gali žymiai padidinti endogeninių pliuripotentinių genų, įskaitant SOX2, SALL4, LIN28 ir ESRRB, raišką (4 pav. E). Pastebėjome, kad OCT4 išraiška šiek tiek padidėjo, bet nebuvo statistiškai reikšminga - tai gali būti dėl aukšto lygio DOX sukeltos OCT4 buvimo DOX-iPSC. Mes taip pat nustatėme piPS ląstelių, kurios buvo per daug ekspresuotos EpCAM, diferenciacijos potencialą. Rezultatai parodė, kad per didelis EpCAM ekspresija palaikė piPS ląstelių atsinaujinimą ir kliudė ląstelėms diferencijuotis į tris gemalo sluoksnius (4 pav. F).

EpCAM išpjaustymas ir EpICD generavimas

Norėdami stebėti EpCAM baltymų perdirbimą, baltymai buvo dvigubai paženklinti ECFP N-gale ir mCherry C-terminale. N-galinį domeną EpEX (žalią) ir C-galinį domeną EpICD (raudoną) galima skilti nuosekliai TACE / ADAM17 ir PS-2 (5A pav.). PSIN-fEpCAM-mCherry vektorius buvo atitinkamai perkeltas į kiaulės (PEF ir PK15), pelės (NIH3T3 ir P19) ir žmogaus (293 T ir Hela) ląsteles. „FEpCAM-mCherry“ sulietas baltymas buvo labai išreikštas epitelio ir pluripotencinėse ląstelėse, bet mažas - fibroblastų išraiška (S2 pav.). PSIN-fEpCAM-mCherry transfekcijos į PK-15 ląsteles rezultatai parodė, kad EpICD (raudonasis) išsiskiria iš citoplazmos membranos ir perkeliamas į kontrolinių (DMSO) ląstelių branduolius. Tačiau EpICD skilimas buvo blokuojamas pridedant proteazės inhibitorių TAPI-1 ir DAPT, nes fEpCAM-mCherry sulietas baltymas liko citoplazmos membranoje (geltona) (5B pav.). Western blotting tyrimas parodė, kad endogeninis EpCAM ir ektopetiškai ekspresuotas fEpCAM-mCherry buvo aptiktas anti-EpCAM antikūnais, turinčiais apytiksliai 39 kDa subrendusių EpCAM ir EpEX baltymų juostą, o ektopetiškai išreikštas EpICD-mCherry buvo aptiktas anti-mCherry antikūnais (Fig. 5C). Kai fEpCAM-mCherry ekspresuotos PK-15 ląstelės buvo gydomos gama-sekretazės komplekso inhibitoriumi DAPT, EpICD frakcija sumažėjo ir iš dalies suskaidyta tarpląstelinio domeno frakcija buvo sukaupta, o to nebuvo galima nustatyti gydant TAPI-1, TACE / ADAM17 inhibitoriumi. kuris neleidžia proteolitiškai skaidyti EpCAM tarpląstelinio domeno. Tačiau taikant tiek TAPI-1, tiek DAPT, EpICD lygis branduoliniame ekstrakte buvo žymiai sumažėjęs, tai rodo, kad abu veiksniai blokuoja EpCAM skilimą (5 pav. D). Tada mes ištyrėme EpICD skilimą ir funkciją kiaulių iPS ląstelėse. TAPI-1 ir DAPT pridėjimo DOX-iPSC ląstelėse rezultatai parodė, kad žymiai sumažėjo pluripotentinių veiksnių, įskaitant OCT4, SOX2, LIN28 ir ESRRB , išraiška (5 pav. E), parodant panašų rezultatą, kai buvo numušta EpCAM išraiška. pagal shRNR (3G pav.). Šis pastebėjimas rodo, kad EpICD yra pagrindinis transkripcijos aktyvatorius, reguliuojantis kiaulių pluripotencinių veiksnių raišką.

Image

( A ) Lentivirusinio vektoriaus pSIN-fEPCAM-mCherry, gabenančio su ECFP / mCherry dvigubai pažymėtu EpCAM, schema. Funkcinius domenus EpEX ir EpICD gali paleisti paeiliui TACE ir PS-2. ( B ) EpEX (žali) ir EpICD (raudoni) fluorescenciniai vaizdai PK-15 ląstelėse, kurie buvo perdaryti pSIN-fEpCAM-mCherry ir apdoroti TAPI-1 / DAPT arba be jų. Branduoliai buvo nudažyti Hoechst 33342 (mėlyna spalva). Svarstyklės, 25 μm. ( C ) Western blotting buvo atliktas atitinkamai su anti-EpCAM ir anti-mCherry antikūnais. PK-15 ląstelės buvo transfekuotos atitinkamai pSIN-EGFP (Ctrl) ir pSIN-fEpCAM-mCherry (Exp). ( D ) Western blotting buvo atliktas naudojant anti-mCherry antikūnus, apdorojant TAPI-1, DAPT ir DMSO PK-15 ląstelėse. b-aktinas (b-aktas) buvo vidinė kontrolė. Rodyklė rodo dalinį tarpląstelinio domeno frakcijos skilimą. ( E ) qRT-PGR analizė pluripotento geno išraiška piPSC, pridedant arba nepridedant TAPI-1 ir DAPT. Ctrl, ląstelės buvo apdorotos DMSO. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, * p <0, 05, ** p <0, 01, n = 3.

Visas dydis

EpICD reguliuoja daugialypio genų ekspresiją, reikalaujančią beta-katenino signalizacijos

Kadangi EpICD-mCherry sulietų baltymų dydis yra ypač didesnis nei EpICD ir sukelia sunkumų persikėlimui į branduolius, kaip parodyta S2 pav., Kad EpICD-mCherry buvo susikaupusi aplink branduolį (pav. S2, 5B), tada sukūrėme pSIN-EpICD. vektorius, kuriame buvo EpICD peptidas, sulietas su Jo žyma. Kaip anksčiau buvo pranešta, kad EpICD gali suskaidyti dėl proteasomos 33, proteasomų inhibitorius PS-341 buvo naudojamas, kai per didelis EpICD ekspresija PEF, kuriame dauguma ektopiškai išreikšto EpICD buvo skaidoma, jei nepridėta PS-341 (6 pav.), Nurodant. kad EpICD buvo nestabilus PEF ląstelėse. Norint nustatyti EpICD reguliavimo funkciją transkripcijos aktyvacijai sustiprinti, OCT4 (4, 2 kb, KY218798), SOX2 (3, 0 kb, KY218799), LIN28 (3, 3 kb, KY218797) ir ESRRB (3, 3 kb, KY218796) promotorių sekos buvo subklonuoti į pGL3. -Pagrindinis reporterio vektorius. Kai pSIN-EpICD buvo transfekuotas kartu su reporterių vektoriais į PEF, promotoriaus aktyvumas nebuvo aktyvuotas. Siekiant išvengti EpICD skilimo pagal proteasomas, inhibitorius PS-341 buvo pridėtas į kultūrinę terpę, kad padidėtų EpICD peptido lygis, tačiau promotoriaus aktyvumas vis tiek nebuvo suaktyvintas (6 pav. B), kas rodo, kad EpICD kiekis nebuvo būtinas pluripotento aktyvavimui. genai. Tada į terpę pridėjome inhibitorių CHIR99021, kuris slopina GSK-3 aktyvumą ir todėl stabilizuoja tarpląstelinį beta-kateniną 34 . Promotoriaus veiklos rezultatai parodė, kad OCT4 (2, 8 karto), SOX2 (4, 0 karto), LIN28 (2, 6 karto) ir ESRRB (3, 4 karto) išraiška buvo žymiai padidėjusi (6 pav. B), rodanti, kad EpICD reikalavo beta-katenino signalizacijos į skatinti pluripotento genų ekspresiją. Tada mes ištyrėme EpCAM ir beta-katenino signalus, susijusius su genų ekspresija fibroblastų, epitelio ir piPS ląstelėse. Išskyrus EpCAM ir reguliuojamą vidinį membraninį proteolizės iniciatoriaus geną ADAM17 , kurie buvo labai mažai ekspresuojami PEF, kitą reguliuojamą vidinį membraninį proteolizės iniciatoriaus geną PS2 , ICD rišančiojo partnerio geną FHL2, GSK3, beta-kateniną ir LEF1 , stiprinantįjį rišamąjį faktorių. sudarė kompleksą su beta-kateninu, buvo stabiliai ekspresuojamos visose trijose ląstelių linijose (6 pav. C). Šis pastebėjimas rodo, kad tarp ląstelių tipų gali būti skirtingi skilimo modeliai ir signalizacijos keliai. Vakarų blotinimo tyrimas patvirtino, kad branduolinėje frakcijoje buvo aktyvesnis beta-kateninas, kai PEF buvo naudojamas GSK3 inhibitorius CHIR99021, o citozolyje neaktyvaus beta-katenino baltymų lygis iš esmės buvo vienodas trijose procedūrose (6 pav. D). Šie rezultatai atkreipė dėmesį į tai, kad GSK3 inhibitoriaus CHIR99021 gali reikėti kaip pagrindinės terpės sudedamosios dalies, siekiant palaikyti kiaulių iPSC atsinaujinimą.

Image

( A ) EpICD ekspresijos Vakarų blotinimas PEF su proteasomų inhibitoriumi PS-341 arba be jo. ( B ) Liuciferazės tyrimas. PSIN-EpICD su pGL3-OCT4-Pro, pGL3-SOX2-Pro, pGL3-LIN28-Pro ir pGL3-ESRRB-Pro buvo kartu transfekuoti į PEF 36 valandas terpėje su PS-341 ir CHRI99021 (CHIR), atitinkamai. DMSO buvo naudojamas kaip kontrolė. ( C ) genų, susijusių su EpCAM signalizavimu, RT-PCR analizė. GAPDH buvo naudojamas kaip kontrolė. ( D ) Vakarų b-catenino (b-kat) baltymo blotinimas citoplazmoje ir branduolyje. PEF ląstelės buvo apdorotos atitinkamai DMSO, CHRI99021 (CHIR) ir PS-341. Beta-aktinas (b-aktas) ir histonas H3 (H3) buvo nustatyti kaip vidinės kontrolinės medžiagos. ( E ) PEF ląstelės buvo perprogramuotos hOSKM pagalba 13 dienų su (Ctrl) arba be (EpICD) bendro transfekcijos pSIN-EpICD. AP dažymas (viršutinė dalis), išvestų kolonijų morfologija (apatinė) ir AP teigiamų kolonijų skaičius (dešinė panelė). ( F ) qRT-PCR analizė pluripotentinių genų ekspresijai piPSC, kurios buvo perkeltos pSIN-EpICD. Ctrl, ląstelės buvo transfekuotos pSIN-EGFP. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, * p <0, 05, n = 3, ** p <0, 01, n = 3.

Visas dydis

Norėdami patvirtinti, ar EpICD ir CHIR99021 gali pagerinti ląstelių perprogramavimą, PEF sukėlė retrovirusiniai vektoriai, nešini su hOSKM ir EpICD 13 dienų terpėje, papildytoje CHIR99021. AP dažymas ir AP teigiamų kolonijų skaičius žymiai padidėjo EpICD išreikštoje grupėje nei kontrolinėje grupėje (6 pav. E). Kiekybinė RT-PGR analizė parodė, kad EpICD reikšmingai padidino endogeninio pluripotento geno raišką, įskaitant OCT4 (3, 2 karto), SOX2 (2, 4 karto), SALL4 (3, 3 karto), LIN28 (4, 6 karto) ir ESRRB (7, 5 karto) (6F pav.). .

Remdamiesi šiuo tyrimu ir kitomis laboratorijos ataskaitomis 24, 35, mes nurodome, kad epitelio ląstelėse iš EpCAM išsiskyrusi EpICD molekulė yra nedelsiant pašalinama proteasomų skilimo metu, o perprogramuotose ląstelėse EpICD su beta-kateninu ir FHL2 sudaro kompleksą, persikelia į branduolį ir vėliau skatina pasroviui pluripotentuojančio geno ekspresiją (7 pav.).

Image

Visas dydis

Diskusija

EpCAM, kaip vienkartinis transmembraninis glikoproteinas, yra vienas pagrindinių su naviku susijusių antigenų 36 ir yra įvairių vėžio formų diagnozė ir terapinis tikslas37. Tačiau neseniai atliktas tyrimas parodė, kad norint išlaikyti savęs atsinaujinimą pelių ES ląstelėse reikėjo aukšto lygio EpCAM ekspresijos, ypač esant diferenciacijos sąlygoms nesant LIF, negimdinė EpCAM ekspresija galėtų iš dalies kompensuoti ir išlaikyti ES fenotipą 33 . Tolesnis tyrimas parodė, kad dalinai perprogramuotose kamieninėse ląstelėse EpCAM nebuvo suaktyvinta, tačiau visiškai perprogramuotose pelių iPSC ląstelėse EpCAM buvo labai ekspresuotas, tai rodo, kad EpCAM gali būti atpažįstamas kaip naujas paviršiaus žymeklis veiksmingai identifikuoti visiškai perprogramuotus iPSC 20 . Taip pat buvo pranešta apie aukšto lygio ir selektyvią EpCAM ekspresiją diferencijuotose, o ne diferencijuotose hES ląstelėse18. Kai numuša endogeninį EpCAM, hESC sumažino ląstelių augimą ir padidino genų ekspresiją endodermos ir mezodermos linijose 19 . Ankstesniame tyrime mes nustatėme, kad nesvarbu, kokios indukcijos sąlygos buvo naudojamos, EpCAM buvo padidintas ir labai išreikštas kiaulių iPSC 13 . Tolesnė ankstyvojo amžiaus embrionų, subrendusių in vivo ir in vitro , transkriptų duomenų analizė parodė, kad EpCAM ekspresija buvo maža oocitų ir 2 ląstelių stadijose, tačiau reikšmingai padidėjo 4/8 ląstelių stadijoje (1 pav.), Tai yra laikas motinos ir zigotinis perėjimas kiaulių embriogenezėje 38, 39 . Šiame tyrime mes nustatėme, kad EpCAM raiškos lygis buvo susijęs su pluripotentinių genų ekspresija. Sumažėjęs EpCAM ekspresijos reguliavimas, naudojant ShRNR interferenciją, arba negimdinė ekspresija. EpCAM galėjo reikšmingai paveikti endogeninio pluripotencinio geno raišką ir AP teigiamų kolonijų susidarymą (3 ir 4 pav.). Remdamiesi tyrimų su pelėmis ir žmonėmis 18, 20 duomenimis, mes patvirtinome, kad OSKM tarpininkaujant sukeliamoms pluripotencinėms kamieninėms ląstelėms EpCAM gali būti kritinis žymeklis, stebintis perprogramuotų ląstelių pluripotentinę būseną.

Tyrimai su pelių ir žmogaus pluripotencinėmis kamieninėmis ląstelėmis parodė, kad EpCAM ir jo tarpląstelinis domenas gali tiesiogiai reguliuoti pluripotentinių genų, tokių kaip Oct4, Sox2, Nanog ir kt., Aktyvinimą. 17, 18 . Kiaulių iPS ląstelėse per didelis EpCAM ekspresija reikšmingai padidino OCT4 ir SOX2 aktyvatorių aktyvaciją. Be to, LIN28 , kuris yra naudojamas kaip vienas iš perprogramavimo veiksnių hiPSCs 10 ir kuris yra svarbus nukleologenezės veiksnys ankstyvojo embriono vystymosi metu 30, promotoriaus aktyvumas ir ESRRB, atliekanti pagrindinį vaidmenį reguliuojant naivią daugialypę būseną 40, buvo taip pat žymiai stimuliuojamas EpCAM. Kita vertus, EpCAM promotoriaus aktyvaciją taip pat reguliavo pluripotenciniai veiksniai. Pastebėjome, kad zigotai suaktyvinti pluripotentiniai faktoriai LIN28 30 ir ESRRB 40 reikšmingai stimuliavo EpCAM promotoriaus aktyvaciją. Netikėtai motinos daugialypiai veiksniai OCT4 ir SOX2, taip pat OS, OSK ir OSM deriniai žymiai slopino EpCAM promotoriaus aktyvaciją. Šis atradimas rodo, kad kaip zigotiniu būdu aktyvuotas genas EpCAM su kitais zigotai aktyvuotais pluripotentais faktoriais sudaro teigiamą grįžtamąjį ryšį reguliuojančią schemą, kad suaktyvintų pluripotento geno raišką ir palaikytų iPS ląstelių pluripotenciškumą. Atliekant hOSKM tarpininkaujamą PEF perprogramavimą, EpCAM ekspresija ne iš karto padidėjo, bet buvo atidėta iki 6 dienų po indukcijos. Šis pastebėjimas parodė, kad EpCAM gali būti naudojamas kaip atrankos žymeklis perprogramuojant kiaulių ląstelių perprogramavimą.

Dviejų etapų proteolitinis perdirbimas, palaikant tinkamą ryšį tarp ląstelių, EpCAM yra nuosekliai skaidomas ir atlieka signalų, perduodamų nuo paviršiaus iki branduolio, funkciją 22 . Skaldant TACE / ADAM17, tarpląstelinis domenas EpEX išsiskiria kaip tirpus ligadas, o gama-sekretazės komplekso skaidymas išskiria C-galinį viduląstelinį domeną EpICD, kuris yra derinyje su keturių su puse LIM domenų 2 ir beta baltymais. -kateninas ir skatina ląstelių dauginimąsi 24 . Mes nustatėme, kad EpICD fragmentas buvo nestabilus citoplazmoje dėl proteasomų skilimo; tačiau EpICD skilimą galima sumažinti naudojant proteasomų inhibitorių (6 pav.). Šis pastebėjimas gali iš dalies paaiškinti, kodėl epitelio ląstelėse rastas aukšto lygio endogeninis EpCAM nesuaktyvino pluripotento geno ekspresijos.

EpCAM signalizacijos kelią sudaro EpEX, EpICD, E-kadherino, Cldn7, beta-katenino, presenilino-2 (PS2) ir ADAM17 17, 41 nariai . Mes nustatėme, kad tik padidinus EpICD kiekį citoplazmoje, EpCAM signalizavimas nebuvo funkcionuojantis, nes nebuvo suaktyvinti EpCAM pasroviui skirtų genų promotoriai (6 pav.). Tačiau stabilizuodamas tarpląstelinį beta-cateniną blokuodamas GSK-3 aktyvumą, EpCAM signalizacija galėtų paskatinti pluripotentinių genų OCT4, SOX2, LIN28 ir ESRRB aktyvavimą ir padidinti perprogramavimo efektyvumą. Taigi, EpICD reikalavo, kad beta-cateninas vaidintų vaidmenį reguliuojant piPSC daugiapotenciškumą, o Wnt / beta-katenino signalų išsaugojimas slopinant GSK3 aktyvumą buvo būtinas pridedant CHIR99021 kaip pagrindinę sudedamąją dalį mitybinėje terpėje. Be to, EpCAM promotoriaus regione buvo Tcf surišimo elementų. Tcf / beta-katenino kompleksas galėtų jungtis prie EpCAM promotoriaus ir reguliuoti EpCAM geno ekspresiją, nurodydamas, kad EpCAM yra Wnt / beta-katenino 35 genas. Todėl, be LIF ir bFGF kelių, Wnt / beta-katenino signalizacijos kelias gali būti pagrindinis kiaulių pluripotencinių kamieninių ląstelių pluripotencinį stiprumą palaikantis kelias.

Apibendrinant, mes patvirtinome, kad EpCAM buvo svarbi piPSCs paviršiaus ir branduolio signalinė molekulė. Atlaisvindami tarpląstelinį domeną, EpCAM komplekso baltymai suaktyvino pluripotento geno ekspresiją ir paskatino ląstelių perprogramavimą. Šis tyrimas padeda suprasti kiaulių ląstelių perprogramavimo reguliavimo mechanizmą ir palengvina naivių kiaulių iPSC generavimą.

Metodai

Ląstelių kultūros

Ląstelių linijos HEK-293, HEK-293T, Hela, PK-15 ląstelės ir NIH3T3 ląstelės buvo kultivuojamos DMEM, papildyta 10% FBS, 1 mM L-glutamino (Gibco, JAV), 0, 1 mM neesminių amino rūgščių (NEAA, Gibico)., JAV). Kiaulės embriono fibroblastų (PEF) ir pelių embrionų fibroblastų (MEF) ląstelės buvo kultivuojamos DMEM terpėje, papildytoje 15% FBS. Pelės embrioninės karcinomos ląstelė P19 buvo auginama α-MEM, papildyta 2, 5% FBS. Ląstelės buvo kultivuojamos 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2 drėgnoje atmosferoje. Kad būtų išlaikytas kiaulių DOX-iPSC, tetraciklino operatoriaus (TetO) indukuojamas kiaulių indukuotas pluripotentinių ląstelių linijas, apie kurį anksčiau buvo pranešta 11, ląstelės buvo pasodintos ant MEF tiektuvų, kurios buvo gautos iš C57 pelių ir buvo mitotiškai inaktyvuotos, ir buvo auginamos iPS terpėje. sudarė DMEM, 15% FBS, 1 mM L-glutamino, 0, 1 mM NEAA, 0, 1 mM β-merkaptoetanolio, 10 ng / ml žmogaus LIF (LIF1050, Millipore), 10 ng / ml žmogaus bazinio FGF (100–18B, PeproTech), 3 μM CHIR99021 (S1263, Selleck Chemicals), 2 μM SB431542 (S1067, Selleck Chemicals) ir 4 μg / ml doksiciklino (D9891-25G-9, Sigma Aldrich), esant 37 ° C, 5% CO2. Proteazės aktyvumui slopinti naudojami 50 μM TAPI-1 (TACE / ADAM17, S7434, Selleck Chemicals inhibitoriai), 50 μM DAPT (gama sekretazės komplekso inhibitorius, S2215, Selleck Chemicals) ir 20 μM PS-341 ( proteasomų inhibitorius S1013, Selleck Chemicals) buvo naudojami terpėse, kur reikia atitinkamo eksperimento.

RNR ekstrahavimas ir RT-PGR

Bendras RNR iš kiaulių ląstelių ir audinių buvo išgautas reagentu Trizol (Invitrogen). RNR buvo tiriamos matuojant OD260 / 280 santykį, o mėginiai, kurių santykis buvo maždaug 2, 0, buvo naudojami atvirkščiai transkripcijai. Dviejų mikrogramų RNR buvo transkribuotos atvirkščiai, naudojant oligo-dT pradmenis (Thermo Fisher), naudojant RevertAid TM atvirkštinę transkriptazę (Thermo Fisher). RT-PGR buvo atlikti naudojant 2 × Es Taq MasterMix, 2 × Taq MasterMix (CW Biotech, Kinija) 32 ciklų metu esant 94 ° C 30 s, 57 ° C 30 s ir 72 ° C 45 s. Neigiama kontrolė buvo atlikta tiesiogiai atliekant PGR su visomis RNR, siekiant patikrinti genomo DNR užterštumą. Kiekybiniai RT-PGR (qRT-PGR) buvo atlikti naudojant 10 kartų praskiestą cDNR su SYBR Green PCR pagrindiniu mišiniu (Takara Biotechnology, Kinija), ir aptikti naudojant „StepOnePlus“ realaus laiko PGR sistemą („Applied Biosystems“). Reakcijos buvo atliekamos 40 ciklų esant 95 ° C 15 s ir 60 ° C 60 s, matavimai buvo atlikti su trim biologiniais pakartojimais ir kiekviena reakcija buvo atlikta trimis egzemplioriais. Tikslinio geno ekspresijos lygis buvo normalizuotas iki beta-aktino ekspresijos lygio. Tirpumo kreivės analizė buvo atlikta siekiant patvirtinti specifiškumą. Šiame tyrime naudojami gruntai yra išvardyti papildomoje S1 lentelėje.

Vektorinė konstrukcija

Norėdami klonuoti kiaulės EpCAM cDNR, visa RNR buvo ekstrahuota iš PK-15 ląstelių. EpCAM koduojanti DNR seka (CDS) buvo amplifikuota RT-PGR naudojant CloneAmp ™ HiFi PCR Premix (# 639298, Clontech). PGR fragmentas buvo klonuotas į pGEM-T Easy vektorių (A1360, Promega) ir patvirtintas DNR seka. Kiaulės EpCAM cDNR seka buvo pateikta „GenBank“ (registracijos numeris KX904866). Norėdami sukonstruoti ekspresijos vektorių, EpCAM ir EpICD fragmentai buvo subklonuoti į BamHI / EcoRI linearizuotą pSIN-EF2-PuroR vektorių, naudojant atitinkamai „In-Fusion ® HD“ klonavimo rinkinį (# 639642, Clontech), kad būtų suformuoti pSIN-EpCAM ir pSIN-EpICD vektoriai. Norint sukonstruoti pSIN-fEpCAM ekspresijos vektorių, kuriame yra ECFP-EpCAM sulietas baltymas, ECFP genas buvo įterptas į EpCAM signalo peptido pasrovią ir sulietas su EpCAM tarpląsteliniu domenu (EpEX) vektoriuje pSIN-EpCAM. Norėdami sukonstruoti ekspresijos vektorių pSIN-fEpCAM-mCherry, kuriame yra mCherry baltymas, C-terminale pasroviui nuo EpICD, fEpCAM buvo subklonuotas į pmCherry-N1, o fEpCAM-mCherry fragmentas buvo subklonuotas į pSIN-EF2-PuroR vektorių. OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, LIN28, SALL4 ir ESRRB ekspresijos vektoriai iš kiaulių iPSC buvo sukonstruoti naudojant pMXs vektorių, apie kuriuos anksčiau buvo pranešta 9 . Visos šiame tyrime naudojamos konstrukcijos buvo išvardytos S2 lentelėje.

Ląstelių perprogramavimas

Retrovirusinėms dalelėms paruošti 2x10 6 293 T ląstelės buvo pasodintos į 60 mm kultūrinį indą. Kai ląstelės pasiekia iki 80% santakos, pMXs vektoriai (4 μg / plazmidėje), turintys žmogaus OCT4, SOX2, KLF4 ir c-MYC, buvo pernešti į 293 T ląsteles kartu su 4 μg pCL-Eco ir 2 μg pCMV-VSV-G esant santykiu 5: 3: 2 naudojant „Lipofectamine 2000“ („Invitrogen“). Lentivirusinėms dalelėms paruošti 4 μg shRNR pSIH (-), pSIH259i, pSIH409i ir pSIH727i bei 4 μg EpCAM konstrukcijos pSIN-EpCAM ir pSIN-EpICD konstrukcijose buvo pernešti į 293 T ląsteles su 4 μg 2PPAX2 ir 2 μg. G, atitinkamai. Praėjus 48 valandoms po transdukcijos, terpė su viruso dalelėmis buvo surenkama ir filtruojama per 0, 45 μm filtrą (Millipore). Norėdami paskatinti ląstelių perprogramavimą, toks pat hOSKM viruso supernatantų, sumaišytų su 8 mg / ml polibreno, kiekis buvo užkrėstas PEF ląstelėmis 12 valandų. Infekcijos efektyvumui padidinti, priklausomai nuo eksperimentinių poreikių, buvo taikoma antra infekcija. Tada užkrėstos PEF ląstelės buvo pakartotinai ištirtos 2 x 104 ląstelių / cm2 ir kultivuojamos iPS terpėje 13 dienų.

piPS ląstelių diferenciacija

Norint aptikti diferenciacijos potencialą, kai buvo sunaikintas EpCAM ar per didelis jo ekspresija, DOX-iPSC buvo perneštos viruso dalelėmis, turinčiomis pSIN-EpCAM arba pSIH-409i. Po vieno pasėlimo ląstelės buvo atskirtos nuo tiektuvų 1 mg / ml IV tipo kolagenazės pavidalu ir perkeltos į ypač mažo stiprumo kultūros indą su terpe be augimo faktorių ir mažų molekulių. 3 dienas auginant suspensiją, buvo suformuoti embrionų kūneliai, kurie po to perkeliami į auginimo indą, padengtą želatinu, ir 5 dienas buvo nuolat auginami įprastoje terpėje (DMEM + 15% FBS). Spontaniškai diferencijuotos ląstelės buvo surinktos ir panaudotos RT-PGR analizei.

Liuciferazės tyrimas

EpCAM promotoriaus aktyvumo tyrimui PK-15 ir PEF ląstelės buvo pasodintos 96 šulinėlių plokštelėje. Kai ląstelės pasiekia 80% santakos, atitinkamai 1 μg pGL3-EpCAM-pro ir pGL3-Basic su 0, 01 μg pRL-TK vektoriu, kuris yra vidinė kontrolė, buvo transfekuoti į ląsteles. Norėdami nustatyti EpCAM promotoriaus aktyvaciją, kurią suaktyvino žmogaus OSKM, ir kiaulės OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, LIN28, SALL4 ir ESRRB, 293 T ląstelės buvo pasodintos 96 šulinėlių plokštelėje. Kai ląstelės pasiekia 80% santakos, mišrūs pMXs vektoriai (0, 5 μg) su 0, 5 μg pGL3-EpCAM-pro ir 0, 01 μg pRL-TK buvo atitinkamai transfekuoti į ląsteles.

Norėdami nustatyti EpICD reguliavimo funkciją, PEF ląstelės buvo pasodintos į 96 šulinėlių plokštelę. Kai ląstelės pasiekia 80% santakos, 0, 5 μg pGL3-OCT4-pro, pGL3-SOX2-pro, pGL3-LIN28-pro ir pGL3-ESRRB-pro su pSIN-EpICD, pSIN-EGFP ir 0, 01 μg pRL-TK kartu perkraunami į PEF. Transfekcija buvo atlikta naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Norint patvirtinti EpICD signalizacijos kelią, atitinkamai po 12 val. Po transfekcijos į terpę buvo įpilama 3 μM CHIR99021 (GSK3 inhibitorius), 20 μM PS-341 (proteasomų inhibitorius) ir kontrolinės DMSO. Ląstelės buvo surinktos praėjus 36 val. Po transfekcijos ir lizuotos kambario temperatūroje 10 min., Naudojant pasyvų lizės buferį (E1941, Promega). Liuciferazės aktyvumas buvo aptiktas naudojant luciferazės tyrimo reagentus (E1960, Promega) 96 šulinėlių kieto balto plokščio dugno mikroplate (# 3917, Corning), naudojant BHP9504 mikrotekinių plokštelių luminometrą (D04407H, Hamamatsu, Kinija). Kiekvieno gydymo metu buvo matuojami trigubai egzemplioriai, o duomenų analizei buvo naudojamos vidutinės žvirblinės luciferazės vienetų ir Renilla luciferazės vienetų santykio vertės.

Imunofluorescencinis tyrimas ir šarminės fosfatazės dažymas

Norėdami dažyti imunofluorescenciniu būdu, ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu PBS 15 minučių ir užblokuotos 1% BSA kambario temperatūroje 1 valandą. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su pirminiu anti-EpCAM antikūnu (1: 200, ab71916, Abcam) per naktį 4 ° C temperatūroje. Tris kartus perplautos PBS, ląstelės buvo inkubuotos su FITC konjuguotu antriniu anti-triušio antikūnu 1 valandą. Branduoliai 2 minutes buvo dažomi 10 ug / ml Hoechst 33342. Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant „Nikon“ fluorescencinį mikroskopą. Šarminės fosfatazės (AP) dažymas buvo nustatytas AST Fast Red TR ir α-naftiolio AS-MX fosfatu (Sigma Aldrich), kaip aprašyta anksčiau 4 . Vaizdai buvo užfiksuoti skaitmeniniu fotoaparatu „Pentax K-50“.

Vakarų balinimas

Norėdami nustatyti endogeninę EpCAM raišką, PK-15 ląstelės, apdorotos shRNR 60 valandų, ir PEF ląstelės, perkeltos pSIN-EpCAM, 10 minučių buvo lizuotos RIPA buferiu (Thermo Scientific), pakartotinai suspenduotos 5 × SDS-PAGE įkrovimo buferyje (50). mM Tris-HCl, pH 6, 8, 2% SDS, 10% glicerolio, 2% β-merkaptoetanolio ir 0, 05% bromfenolio mėlynojo) ir kaitinamas 100 ° C 5 minutes. 15 μL ląstelių lizato buvo įpilta į 10% SDS-PAGE gelį. Po elektroforezės baltymai buvo perkelti į PVDF membraną (LC2002, Invitrogen) pusiau elektroforeziniu perdavimu (Bio-Rad) 45 minutes esant 15 V įtampai. Membrana užblokuota blokuojančiu buferiu (20 mM Tris / HCl, pH 7, 6, 137 mM). NaCl, 0, 1% Tween 20 ir 8% lieso pieno) 25 ° C temperatūroje 2 valandas, tada inkubuojami su pirminiu anti-EpCAM antikūnu (1: 1000, ab71916, Abcam) blokuojančiame buferyje 4 ° C temperatūroje per naktį. Po tris kartus plaunant TBS-T buferiu (20 mM Tris / HCl, pH 7, 6, 137 mM NaCl, 0, 1% Tween 20), membrana buvo inkubuota su HRP konjuguotu antriniu anti-triušio antikūnu (1: 2000) kambario temperatūroje. 1 val. After washing three times in TBS-T at room temperature, the membrane was incubated in the enhanced chemiluminescent substrate (#32106, Pierce) and detected with a Chemiluminescent Imaging System (ZY058176, Tanon-4200, China). To monitor the fEpCAM-mCherry fusion protein cleavage, PK-15 cells were transduced with pSIN-fEpCAM-mCherry for 12 h, and then TAPI-1 and DAPT was added to media. At 48 h post transduction, cells were directly lysed by RIPA buffer for 10 min on ice, and protein blotting were performed as mentioned above with anti-mCherry antibody (1:1000, KM8017, Sungene Biotech, China) and anti-EpCAM antibody (1:1000), respectively. The HRP-conjugated secondary anti-mouse antibody (1:2000) was applied following with the incubation with the enhanced chemiluminescent substrate. To verify the EpICD expression, PEF cells were transduced with pSIN-EpICD for 12 h, and then PS-341 was added to medium. Cells were harvested at 60 h post transduction. The anti-His antibody (1:1000, #12698, Cell Signaling) were used to detect EpCAM-His fusion protein. To dissect the beta-catenin and EpICD signaling, PEF cells treated with 3 μM CHIR99021 or 20 μM PS-341 for 24 h were harvested, and nuclear proteins were extracted by the Nuclear Protein Extraction kit (R0050, Solarbio, China). The anti-beta-catenin antibody (1:1000, ab23671, Abcam) was applied following above procedure. The anti-beta-actin antibody (1:2000, KM9001, Sungene Biotech, China) and anti-histone H3 antibody (1:1000, #5192 Cell Signaling) were used as internal controls for the total proteins and nuclear proteins, respectively.

Bioinforminė analizė

The microarray data were acquired from GEO database as previously described 13, and GEO numbers are: GSE48434 for PEF 4, 42, PS24 4, 30 AC5 4, iPF4-2 42, and piPSCs-w 2, GSE26369 for pESK 7, and GSE15472 for IC1, ID4, and ID6 43 . Pluripotent genes, lineage specific genes, and MET (mesenchymal-epithelial transition)/EMT (epithelial–mesenchymal transition) markers were chosen for this study. R software for windows was used to draw the heatmap. Sequencing data of mRNA from porcine early stage embryo were acquired from the Lab Archive (www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) under accession number SRA076823 as described previously 44, and the pluripotency related genes were chosen and charted using GraphPad Prism™ 5.0 for windows.

Statistinė analizė

Statistical analyses were performed with the SPSS 16.0 for windows. Two-way ANOVA were used to study differences between grouped data, Student's T tests were performed with one way analysis. Statistical significance was accepted at P < 0.05.

Papildoma informacija

How to cite this article : Yu, T. et al . EpCAM Intracellular Domain Promotes Porcine Cell Reprogramming by Upregulation of Pluripotent Gene Expression via Beta-catenin Signaling. Mokslas. Rep. 7, 46315; doi: 10.1038/srep46315 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomos medžiagos

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.