Epigenetinis hdac1 sumoilinimo, kaip endogeninio neuroprotekcijos nuo β toksiškumo, reguliavimas pelių alzheimerio ligos modelyje | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Epigenetinis hdac1 sumoilinimo, kaip endogeninio neuroprotekcijos nuo β toksiškumo, reguliavimas pelių alzheimerio ligos modelyje | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Dalykai

  • Pažintinis senėjimas
  • Nervų senėjimas

Anotacija

Amiloidas β (A β ) sukelia neurotoksiškumą smegenyse ir sukelia neuronų mirtį, tačiau endogeninis gynybos mechanizmas, suaktyvinamas dėl A β įžeidimo, yra mažiau žinomas. Čia mes nustatėme, kad ūmus A β padidina PIAS1 ir Mcl-1 raišką, suaktyvindamas MAPK / ERK, o A β indukcija PIAS1 sustiprina HDAC1 SUMOyliaciją žiurkių hipokampuose. Nuslopinus PIAS1, sumažėja endogeninis HDAC1 SUMOilinimas ir blokuojama β Mcl-1 indukcija. Sumoilintas HDAC1 sumažina jo susiejimą su CREB, padidina CREB prisijungimą prie Mcl-1 promotoriaus ir tarpininkauja A β indukcijai Mcl-1 ekspresijai. SUMO modifikuoto lenti-HDAC1 vektoriaus perkėlimas į APP / PS1 pelių hipokampą gelbsti erdvinio mokymosi ir atminties trūkumą bei ilgalaikį APP / PS1 pelių potencijos sutrikimą. Tai taip pat sumažina amiloidinių apnašų kiekį ir apoptozinių ląstelių skaičių APP / PS1 pelių CA1 srityje. Tuo tarpu HDAC1 SUMOylation sumažina HDAC1 prisijungimą prie neprilizino promotoriaus. Šie rezultatai kartu parodo svarbų HDAC1 SUMOylation, kaip natūraliai atsirandančio gynybos mechanizmo, saugančio nuo A β toksiškumo, vaidmenį ir pateikia alternatyvią terapinę strategiją nuo AD.

Pagrindinis

Alzheimerio liga (AD) sergančio paciento smegenims būdingas senatvinių plokštelių kaupimasis, o amiloidiniai β peptidai (A β 1-40 ir A β 1-42 ) yra pagrindiniai šių senatvinių plokštelių komponentai. Yra žinoma, kad β sukelia lipidų peroksidaciją, laisvųjų radikalų gamybą, kaspazės 3 aktyvaciją ir DNR pažeidimus, kurie galiausiai lemia neuronų mirtį. 1, 2, 3 Be to, A β peptidas arba per didelis A β ekspresija sukelia gyvūnams pažinimo sutrikimus. 4, 5 Šis pažinimo sutrikimas koreliuoja su 4, 6 amiloidinių plokštelių susidarymu arba yra prieš jį. 7, 8 Be to, natūraliai išskiriamas Aβ arba Aβ peptidas taip pat slopina ilgalaikį hipokampo potencijavimą (LTP) in vivo ir sutrikdo sinapsinę bei tinklo funkciją. 9, 10 Visai neseniai mes nustatėme, kad A β sukelia aktyvuoto signalo keitiklio ir transkripcijos-1 (STAT1) aktyvatoriaus išraišką, o A β STAT1 indukcija sukelia A β atmintį mažinantį poveikį. 11 Kita vertus, įsivaizduojama, kad kai A β sukelia toksiškumą, neuronai sukuria gynybos mechanizmus, kad galėtų susidoroti su A β toksiškumu. Pavyzdžiui, parodyta, kad amiloidogeninis neurotrofinis peptidas sAPP α suaktyvina neuroprotektiną D1 ir skatina ląstelių išgyvenimą. 12 Be to, mes nustatėme, kad A β suaktyvina MAPK / ERK-SGK (serumo ir gliukokortikoidų indukuojamos kinazės) signalų kelią neuroprotekcijai nuo A β įžeidimo. 13 Tačiau, atsižvelgiant į A β sukelto toksiškumo vaidmenį ir mechanizmą, buvo išsamiai ištirtas, A β sukeltas endogeninis apsaugos mechanizmas yra mažiau žinomas.

Histonų acetilinimas yra vienos rūšies epigenetiniai reguliavimai, atliekantys svarbų vaidmenį atliekant įvairias smegenų funkcijas ir sutrikimus, o histono deacetilazės (HDAC) reguliuojančios histono acetilinimo homeostazę. HDAC šeimoje yra 18 HDAC baltymų, priklausančių skirtingoms klasifikacijoms. Nustatyta, kad I klasės HDAC slopinimas (apimantis HDAC1, HDAC2, HDAC3 ir HDAC8) panaikina atminties trūkumą pelių AD modelyje. HDAC inhibitorius SAHA ir kurkuminas sukuria sinergetinį poveikį apsaugant nuo A β toksiškumo. Šie atradimai patvirtina sampratą, kad HDAC inhibitoriai yra neuroprotekciniai ir yra potencialūs pažinimo stiprintojai. 16, 17, 18 Bet daugumoje šių tyrimų buvo tiriamas vienos klasės HDAC baltymų vaidmuo vietoj specifinio HDAC baltymo. Be to, jie dažnai sutelkia dėmesį į HDAC aktyvumo slopinimą arba HDAC ekspresijos mažinimą, kitos HDAC1 modifikacijos yra mažiau tiriamos.

HDAC1 priklauso I klasės HDAC baltymams ir tai buvo pirmasis nustatytas žinduolių HDAC baltymas. 19 Keli pranešimai parodė HDAC1 modifikaciją ląstelėje po transliacijos, pvz., Fosforilinimą, 20 ubikvitinaciją 21 ir SUMOylation. 22 HDAC1 buvo rastas sumoilintas Lys-444 ir Lys-476 ląstelėse, o HDAC1 SUMOylation moduliuoja jo biologinį aktyvumą. Visai neseniai HDAC1 buvo rastas SUMO modifikuotas tiek SUMO1, tiek SUMO2. SUMO1 modifikuotas HDAC1 skatina HDAC1 ubikvitinaciją ir skilimą, tuo tarpu SUMO2 modifikavimas HDAC1 padidina HDAC1 stabilumą krūties vėžio ląstelėse. Nepaisant svarbaus HDAC1 vaidmens, susijusio su neurodegeneracinėmis ligomis ir pažintinėmis funkcijomis, HDAC1 SUMOylation centrinėje nervų sistemoje nebuvo ištirtas, taip pat nežinoma jo fiziologinė reikšmė. Aktyvuoto STAT1 baltymo inhibitorius (PIAS1) yra SUMO E3 ligazė, sustiprinanti įvairių baltymų SUMOilinimą. Be to, įrodyta, kad PIAS1 apsaugo nuo H 2 O 2 sukeltų ląstelių žūties, 25 parodant, kad PIAS1 atlieka antiapoptozinį vaidmenį. Šiame tyrime siekėme ištirti HDAC1 SUMOylation, kurį sukelia PIAS1, vaidmenį ir mechanizmą apsaugant nuo A β toksiškumo, pritaikant APPswe / PS1dE9 (APP / PS1) peles kaip AD pelių modelį.

Rezultatai

Ūmus A β padidina PIAS1 raišką tarpininkaujant MAPK / ERK ir kad PIAS1 tarpininkauja A β sukeliančiai Mcl-1 raišką

Kadangi buvo pasiūlyta, kad PIAS1 turi apsauginį vaidmenį nuo H 2 O 2 sukeltų ląstelių žūties 25, o antiapoptozinis genas Mcl-1 smegenyse turi neuroprotekcinį poveikį, 13, 26, pirmiausia mes ištyrėme, ar ūmus A β gydymas padidina PIAS1 ir Mcl-1 raišką. Žiurkės buvo suskirstytos į tris grupes ir gavo 1% NH4OH (kontrolinė grupė), A β (14 μg ) injekcijos ir buvo paaukotos po 30 minučių ir A β injekcijos (14 μg ), tačiau po 1 valandos buvo užmuštos. Β buvo tiesiogiai įšvirkštas į žiurkės smegenų CA1 sritį. Jų smegenys buvo pašalintos, o jų CA1 audinys buvo išpjaustytas Western blot analizei. Western blotai buvo atlikti naudojant antikūnus prieš PIAS1, Mcl-1, ERK1 / 2, pERK1 / 2 ir aktiną. Tipiškas gelio modelis parodytas 1a paveiksle. Rezultatai atskleidė, kad A β injekcija padidino PIAS1 ekspresiją abiem tirtais laiko momentais, tačiau jos poveikis ryškesnis po 1 valandos (1b pav.). Tuo tarpu A β padidino ERK1 ir ERK2 fosforilinimo lygį, tačiau šis poveikis buvo reikšmingas tik po 30 min. (1b pav.). Β taip pat padidino Mcl-1 ekspresiją, tačiau šis poveikis buvo akivaizdus tik po 1 valandos (1b paveikslas). Kadangi Mcl-1 ekspresijos indukcija gali neįvykti iškart po PIAS1 ekspresijos, kitame eksperimente mes ištyrėme A β (14 μg ) poveikį PIAS1 ir Mcl-1 ekspresijai ilgesniais laiko intervalais (8, 16 ir 48 val.), Tačiau kaip teigiamą kontrolę taip pat įtraukėme 1 val. Intervalą. Western blot buvo atlikti naudojant anti-PIAS1 ir anti-Mcl-1 antikūnus. Tipinis gelio modelis parodytas 1c paveiksle. Rezultatai atskleidė, kad A β padidino PIAS1 ekspresiją po 1, 8 ir 16 valandų, tačiau maksimalus poveikis pasireiškė po 1 valandos. PIAS1 ekspresija buvo grąžinta į kontrolinį lygį po 48 val. (1d pav.). Bet A β sukėlė nuo laiko priklausomą Mcl-1 ekspresijos padidėjimą, o maksimalus efektas buvo pastebėtas po 48 val. (1d pav.).

Image

Ūmus A β padidina PIAS1 raišką tarpininkaujant MAPK / ERK ir kad PIAS1 tarpininkauja A β indukuojant Mcl-1 raišką. a ) Western blot buvo atliktas siekiant nustatyti ūmų Aβ poveikį PIAS1, pERK1 / 2, ERK1 / 2 ir Mcl-1 ekspresijai žiurkių hipokampuose po 30 min. ir 1 val. Keturios skirtingos juostos kiekvienoje grupėje žymi keturias atskiras žiurkių smegenis (CA1 sritis). ( b ) Parodomi kiekybiškai įvertinti rezultatai ( n = 6 kiekvienoje grupėje; PIAS1, F 2, 15 = 90, 57, P <0, 001; jei pERK1 / ERK1, F 2, 15 = 166, 16, P <0, 001; jei nustatyta pERK2 / ERK2, F) 2, 15 = 68, 75, P <0, 001; Mcl-1, F 2, 15 = 7, 26, P <0, 01). c ) Ūmaus A β poveikis PIAS1 ir Mcl-1 ekspresijai hipokampo metu. Du skirtingi kiekvienos grupės takeliai žymi dvi atskiras žiurkių smegenis (CA1 sritis). ( d ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 5 kiekvienoje grupėje; PIAS1 atveju F 4, 20 = 30, 13, P <0, 001; Mcl-1, F 4, 20 = 22, 27, P <0, 001). e ) ERK slopinimo (esant U0126 ribinei koncentracijai) poveikis A β PIAS1 ekspresijos hipokampo indukcijai. Du skirtingi kiekvienos grupės takeliai žymi dvi atskiras žiurkių smegenis (CA1 sritis). ( f ) Parodomi kiekybiškai įvertinti rezultatai ( n = 6 kiekvienoje grupėje; PIAS1 atveju F 3, 20 = 71, 39, P <0, 001; pERK1 / ERK1, F 3, 20 = 260, 16, P <0, 001; pERK2 / ERK2, F) 3, 20 = 114, 18, P <0, 001). g ) PIAS1 numušimo (esant mažesnėms nei PIAS1 siRNR koncentracijai) poveikis A β indukcijai Mcl-1 ekspresijai. Trys skirtingi kiekvienos grupės takeliai žymi tris atskiras žiurkių smegenis (CA1 sritis). ( h ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 5 kiekvienoje grupėje; PIAS1 atveju F 3, 16 = 43, 14, P <0, 001; q = 9, 19, P <0, 001; Mcl-1, F 3, 16 = 86, 29, P < 0, 001; q = 13, 03, P <0, 001). Duomenys yra vidurkis ± sem ** P <0, 01 ir # P <0, 001

Visas dydis

Tarpininkaujant neuroprotekcijai nuo A β toksiškumo, buvo pasiūlyta MAPK / ERK perduodama signalizacija. 13 ir PIAS1 ekspresiją reguliuoja MAPK / ERK signalizacija. 27 Čia mes ištyrėme, ar A β indukcija PIAS1 ekspresijai yra tarpininkaujant A β sukeltai MAPK / ERK aktyvacijai. U0126 buvo naudojamas kaip MAPK / ERK aktyvavimo inhibitorius, o A01 signalo blokavimui buvo naudojama U0126 ribinė koncentracija. Žiurkės buvo padalytos į keturias grupes ir gavo DMSO (15%) + NH4OH (1%), DMSO + A β (14 μg ), U0126 (0, 7 μg ) + NH 4OH ir U0126 (0, 7 μg ) +. Β (14 μg ) injekuojama tiesiai į jų CA1 sritį. Laiko tarpas tarp dviejų injekcijų buvo 30 min., O gyvūnai buvo paaukoti 30 min. Po antrosios injekcijos. Western blot buvo atlikti naudojant anti-PIAS1, anti-ERK1 / 2 ir anti-pERK1 / 2 antikūnus. Tipinis gelio modelis parodytas 1e paveiksle. Rezultatai atskleidė, kad A β nuolat didino PIAS1 raišką ir ERK1 / 2 fosforilinimo lygį, tačiau šį poveikį blokavo U0126 išankstinis apdorojimas esant U0126 koncentracijai (1 μg / μl), kuris šioms reikšmingo poveikio nedavė. matuoja pati (1f pav.). Kitame eksperimente mes nustatėme, kad PI β indukcijos β indukciją taip pat blokavo PI-3 kinazės inhibitorius wortmanninas (papildomas paveikslas S1a). Šie rezultatai rodo, kad tiek MAPK / ERK signalizacija, tiek PI-3 K signalizacija tarpina A β poveikį PIAS1 ekspresijai. Aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad A β padidino PIAS1 ir Mcl-1 raišką keliais ištirtais laiko intervalais. Čia mes ištyrėme, ar Aβ beta indukcija Mcl-1 raiškai yra tarpininkaujama per PIAS1. Žiurkės buvo padalytos į keturias grupes ir gavo kontrolinę siRNR + NH4OH (1%), kontrolinę siRNR (4 pmol) + A β (14 μg ), PIAS1 siRNR (4 pmol) + NH4OH ir PIAS1 siRNR (4 pmol). ) + A β (14 μg ) injekcijos. Panašiai buvo nustatyta ir PIAS1 siRNR ribinė koncentracija, ribojanti A β sukeltą signalizaciją. Laiko tarpas tarp dviejų injekcijų buvo 24 valandos, o gyvūnai buvo nužudyti 24 valandas po antrosios injekcijos. Western blot buvo atlikti naudojant anti-PIAS1 ir anti-Mcl-1 antikūnus. Tipinis gelio modelis parodytas 1g paveiksle. Rezultatai parodė, kad A β injekcija po 24 val. Nuosekliai padidino Mcl-1 ekspresiją, tačiau šį poveikį blokavo ankstesnė PIAS1 siRNR transfekcija (1h pav.). Β šiek tiek padidino PIAS1 ekspresiją, tačiau šio poveikio išvengė ankstesnė PIAS1 siRNR transfekcija (1h pav.). PIAS1 siRNR transfekcijos efektyvumą patvirtino reikšmingas PIAS1 ekspresijos sumažėjimas (1h pav.). Antiapopotinis Mcl-1 poveikis buvo parodytas smarkiai sumažinus A β sukeltos kaspazės 3 aktyvaciją, esant mažesnei kaip Flag-Mcl-1 plazmidės transfekcijos koncentracijai (0, 7 μg / μl) (papildoma S1b pav.). Kadangi yra ir kitų PIAS baltymų šeimos narių, įskaitant PIAS2, PIAS3 ir PIAS4, 28, mes taip pat ištyrėme, ar A β taip pat padidino šių PIAS baltymų ekspresiją. Rezultatai atskleidė, kad ūmi A β (14 μg ) ir atvirkštinio A β (rA β , rA β 42-1, 14 μ g) injekcija nepakeitė PIAS2, PIAS3 ir PIAS4 išraiškos (papildomas S2 paveikslas).

Ūmus A β padidina HDAC1 SUMOylation pagal PIAS1 hipokampo srityje

Aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad ūmus gydymas A β padidino PIAS1 ekspresiją po 24 val. Kadangi PIAS1 yra SUMO E3 ligazė, o HDAC1 susijęs su neurodegeneracinėmis ligomis, čia mes ištyrėme, ar HDAC1 gali būti sumoiluotas PIAS1 žiurkės smegenyse ir ar HDAC1 SUMOylation yra moduliuojamas gydant A β . Pirmiausia atlikome SUMOylation testą in vitro . Į reakciją buvo pridėta rekombinantinių E1, E2 ir skirtingų baltymų, pažymėtų His arba GST, ir buvo atliktas Western blot tyrimas. Rezultatai parodė, kad HDAC1 SUMOylation buvo stebimas, kai buvo E1, E2, SUMO1 ir HDAC1 baltymai, tačiau HDAC1 SUMOylation sustiprėjo, kai buvo pridėtas ir PIAS1 baltymas. Bet HDAC1 SUMOylation buvo visiškai užblokuotas pridedant sentrinui būdingos proteazės 1 (SENP1) - fermento, kuris pašalina sumo molekulę iš sumo-konjuguotų baltymų (2a pav.). Tuomet atlikome bendro imunoprecipitacijos (bendro IP) eksperimentą ir rezultatas parodė, kad PIAS1 yra susijęs su HDAC1 endogeniniu būdu žiurkių CA1 srityje (2b paveikslas). Toliau mes ištyrėme, ar PIAS1 ir HDAC1 yra tuose pačiuose neuronuose žiurkės smegenų hipokampuose. Smegenų skyriai, kuriuose yra CA1 sritis, buvo dažyti imunohistocheminiu būdu. Rezultatai parodė, kad PIAS1 (žalia), HDAC1 (raudona) ir DAPI (mėlyna) imunofluorescencija buvo vaizduojama neuronuose CA1 srityje (2c paveikslas, viršutinė plokštė). Kai šie CA1 neuronai buvo vizualizuoti didesniu padidinimu, PIAS1 ir HDAC1 buvo rasti ir lokalizuoti tų pačių CA1 neuronų branduolyje (2c paveikslas, apatinė plokštė). Toliau mes ištyrėme, ar gydymas A β nekeičia PIAS1 ir HDAC1 ryšio. Rezultatai parodė, kad ūmi A β injekcija padidino ryšį tarp PIAS1 ir HDAC1 CA1 srityje per 1 valandą vėliau (2d pav.). Kiekybinis rezultatas parodytas dešinėje skydelyje. Šie rezultatai rodo, kad HDAC1 tikriausiai SUMO modifikuoja PIAS1 hipokampo srityje, o A β gali padidinti HDAC1 SUMOyliaciją PIAS1. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes perkėlėme kontrolinę siRNR ir PIAS1 siRNR (8 pmol) į žiurkės CA1 plotą, o endogeninė HDAC1 SUMOylation buvo ištirta 48 valandas vėliau. Rezultatai atskleidė, kad PIAS1 siRNR transfekcija žymiai sumažino endogeninio HDAC1 SUMOylation lygį, kai ląstelių lizatas buvo imuniškai nusodintas anti-HDAC1 antikūnu ir imunoblotuotas anti-HDAC1 antikūnu (2e paveikslas, kairysis skydelis) arba anti-SUMO1 antikūnu (2e paveikslas, dešinė panelė). ). Tuo tarpu PIAS1 siRNR transfekcija sumažino PIAS1 ekspresijos ir Mcl-1 ekspresijos lygius (2e paveikslas, apatinė kairioji panelė). Kiekybiškai įvertinti rezultatai pateikti 2f paveiksle.

Image

Ūmus A β padidina HDAC1 SUMOylation pagal PIAS1 hipokampo srityje. a ) SUMOilinimo tyrimas in vitro, parodantis HDAC1 SUMOilinimą PIAS1. Į šio tyrimo reakciją buvo įtraukti rekombinantiniai E1, E2 baltymai (iš SUMO rinkinio) ir išgryninti GST-PIAS1, His-SUMO1, His-HDAC1 ir GST-SENP baltymai. b ) Bendras IP eksperimentas, rodantis PIAS1 ir HDAC1 ryšį žiurkių hipokampuose. c ) Imunohistochemija, rodanti PIAS1 ir HDAC1, yra tų pačių neuronų branduolyje žiurkės smegenų CA1 srityje. N = 3. Mastelio juosta, 20 μm (viršutinė plokštė); 10 μm (apatinė plokštė). d ) Bendras IP eksperimentas, parodantis ryšį tarp PIAS1 ir HDAC1 su ūminiu A β gydymu ir be jo, pateikiant kiekybinius rezultatus ( n = 3 kiekvienoje grupėje, t 1, 4 = 6, 5, P <0, 01). e ) PIAS1 numušimo poveikis endogeninės HDAC1 SUMOylation, Mcl-1 ir PIAS1 ekspresijai žiurkių hipokampuose. ( f ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 5 kiekvienoje grupėje; esant HDAC1 SUMOylation, t 1, 8 = 4, 02, P <0, 01; Mcl-1, t 1, 8 = 11, 69, P <0, 001; esant PIAS1, t 1)., 8 = 9, 6, P <0, 001). ( g ) A β ir atvirkštinio A β poveikis žiurkių hipokampo HDAC1 SUMOilinimui ( n = 5 kiekvienoje grupėje; F 2, 12 = 62, 07, P <0, 001). h ) PIAS1 numušimo (esant mažesnėms nei PIAS1 siRNR koncentracijai) poveikis A β indukcijai HDAC1 SUMOylation žiurkių hipokampuose. ( i ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 5 kiekvienoje grupėje; HDAC1 SUMOylation, F 3, 16 = 44, 88, P <0, 001; PIAS1, F 3, 16 = 49, 61, P <0, 001). rA β : atvirkštinis A β . Duomenys yra vidurkis ± sem * P <0, 05, ** P <0, 01 ir # P <0, 001

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme, ar ūmus A β padidina HDAC1 SUMOylation per PIAS1. Žiurkės buvo padalytos į tris grupes ir gavo NH4OH (1%), atvirkštinę A β (14 μg ) ir A β (14 μ g) injekcijas tiesiai į jų CA1 sritį. Gyvūnai buvo nužudyti po 1 valandos, o jų CA1 audinys buvo tiriamas HDAC1 SUMOylation. Rezultatai atskleidė, kad A β , bet ne rA β , žymiai padidino HDAC1 SUMOylation lygį hipokampyje (2g paveikslas). Kiekybinis rezultatas rodomas dešiniajame skydelyje. Toliau mes ištyrėme, ar HDAC1 SUMOylation A β indukciją tarpininkauja PIAS1. Aliuminio PIAS1 siRNR koncentracija buvo slenkstinė, kad blokuotų A β signalizaciją. Žiurkės buvo padalytos į keturias grupes ir buvo gydomos tokiu būdu: kontrolinė siRNR (4 pmol) + NH 4OH (1%), kontrolinė siRNR + A β (14 μg ), PIAS1 siRNR (4 pmol) + NH 4 OH ir PIAS1 siRNR (4 pmol) + A β (14 μg ). Laiko tarpas tarp dviejų injekcijų buvo 47 valandos, o gyvūnai buvo nužudyti praėjus 1 valandai po antrosios injekcijos. Jų smegenys buvo pašalintos, o jų CA1 audinys buvo tiriamas HDAC1 SUMOylation. Ląstelių lizatui buvo atlikta Western blot analizė, naudojant anti-PIAS1 antikūnus. Rezultatai atskleidė, kad A β injekcija nuosekliai padidino HDAC1 SUMOylation lygį hipokampyje po 1 valandos vėliau, tačiau šį poveikį blokavo ankstesnė PIAS1 siRNR transfekcija esant PIAS1 siRNR koncentracijai, kuri, matyt, neturėjo įtakos vien HDAC1 SUMOylation (4 pmol) ( 2h pav.). Be to, ūmus A β nuolat didino PIAS1 ekspresijos lygį, tačiau šį poveikį taip pat reikšmingai sumažino ankstesnė PIAS1 siRNR transfekcija. Tipinis gelio modelis parodytas 2h paveiksle. Kiekybiniai rezultatai parodyti 2i paveiksle. PIAS1 siRNR, esant 4 pmol, taip pat sumažino PIAS1 ekspresijos lygį, tačiau PIAS1 ekspresijos skirtumas tarp kontrolinės siRNR + A β grupės ir PIAS1 siRNR + A β grupės buvo daug didesnis nei tarp kontrolinės siRNR grupės ir PIAS1 siRNR grupės (2i paveikslas). .

Toliau mes ištyrėme, ar padidėjęs HDAC1 SUMOylation buvo sukeltas tik per trumpą laiką po gydymo A β, kad jis tarnautų kaip endogeninis gynybos mechanizmas. Atskira gyvūnų grupė panašiai buvo įšvirkšta NH4OH (1%) arba A β (14 μg ) į jų CA1 plotą, tačiau jie buvo paaukoti po 14 dienų. Šis laiko intervalas leidžia A β toksiškumui kauptis ląstelėje ir gali būti per vėlu sukelti endogeninę neuroprotekciją. Rezultatai atskleidė, kad A β reikšmingai sumažino HDAC1 SUMOylation lygį po 14 dienų (papildomas S3 paveikslas).

SUMO kandidatų vietų identifikavimas HDAC1 ląstelėje ir hipokampo srityje

Aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad HDAS1 gali SUMO modifikuoti PIAS1. Čia mes apžiūrėjome kandidatas į SUMO svetaines HDAC1. Pirmiausia pritaikėme bioinformatikos metodą ir analizei naudojome programinę įrangą SUMO 2.0 („CUCKOO Workgroup“, Hefei, Kinija). Remiantis šios programinės įrangos prognozėmis, yra keturi lizino liekanos, turinčios aukštą rezultatą, ir du iš jų (Lys-444 ir Lys-476) tinka SUMO-substrato bendro sutarimo motyvui. Trys lizino liekanos rodo vidutinį balą, o dvi lizino liekanos - mažą rezultatą (1 lentelė). Kito tyrimo rezultatai taip pat atskleidžia, kad Lys-444 ir Lys-476 yra kandidatinės sumo vietos HDAC1 ląstelėje; Todėl tolesniems tyrimams mes sukūrėme atskirus HDAC1 sumo mutantus prieš kiekvieną iš šių devynių liekanų ir dvigubą sumo mutantą (K444RK476R). Vėliava pažymėta HDAC1WT plazmidė ir kiekviena atskira HDAC1 mutantinė plazmidė buvo kartu transfekuota su EGFP-PIAS1WT plazmidėmis ir Myc-SUMO1WT plazmidėmis į HEK293T ląsteles, o ląstelių lizatai buvo imunoblotuoti anti-Flag antikūnu. Kaip įkrovos kontrolė buvo atlikti Western blot, naudojant antikūnus prieš EGFP ir Myc. Rezultatai atskleidė, kad transfekuojant Flag-HDAC1WT plazmidę, buvo stebimos dvi gretimos SUMO-HDAC1 juostos. Tačiau žemesnės SUMO-HDAC1 juostos nebuvo, kai buvo transfekuota Flag-HDAC1K444R, palyginti su Flag-HDAC1WT transfekcija (3a pav.). Nors viršutinės SUMO-HDAC1 juostos trūko, kai buvo transfekuota „Flag-HDAC1K476R“, palyginti su „Flag-HDAC1WT“ transfekcija (3b pav.). Norėdami dar labiau ištirti, ar Lys-444 ir Lys-476 yra dvi pagrindinės SUMO vietos kandidatėse HDAC1, mes perkėlėme vėliavos žymėtą HDAC1WT plazmidę, kiekvieną atskirą HDAC1 mutanto plazmidę ir HDAC1 dvigubo mutanto plazmidę kartu su EGFP-PIAS1 plazmidė ir Myc-SUMO1. plazmidė į HEK293T ląsteles. Ląstelių lizatai buvo imuniteto nusodinti ir implantai išpjaustyti anti-Flag antikūnu. Rezultatai taip pat parodė, kad kai buvo transfekuota HDAC1K444R, apatinė SUMO-HDAC1 juosta nebuvo pastebėta, kaip rodo apatinė strėlės galvutė (3c paveikslas, kairysis skydas). Kai buvo transfekuota „Flag-HDAC1K476R“, viršutinės SUMO-HDAC1 juostos nebuvo, kaip rodo viršutinė strėlės galvutė (3c paveikslas, kairysis skydelis). Bet kai buvo transfekuota Flag-HDAC1K444RK476R, SUMO-HDAC1 juostos intensyvumas buvo dar labiau sumažintas, palyginti su kiekvieno atskiro mutanto transfekcija, tačiau HDAC1 SUMOylation signalas visiškai neišnyko (3c paveikslas, kairysis skydelis). Tie patys rezultatai buvo gauti, kai ląstelių lizatai buvo imituojami naudojant anti-SUMO1 antikūnus (3c paveikslas, dešinė panelė). Western blotai su antikūnais prieš EGFP ir Myc buvo atlikti kaip įkrovos kontrolė (3c paveikslas, apatinė kairioji plokštė). Kadangi ubikvitinacija taip pat vyksta su lizino liekanomis ir buvo pranešta apie HDAC1 ubikvitinaciją, 21 tada mes ištyrėme, ar HDAC1 ubikvitinacija taip pat gali vykti Lys-444 ir Lys-476. Vėliava pažymėta HDAC1WT plazmidė arba HDAC1K444RK476R plazmidė buvo kartu transfekuota su His-ubiquitin plazmidėle į HEK293T ląsteles, o ląstelių lizatai buvo imuniteto nusodinti anti-Flag antikūnais ir imunoblotai su anti-Flag antikūnais arba anti-His antikūnais. Rezultatai atskleidė, kad panašios visur esančio HDAC1 juostos ir intensyvumas buvo stebimi tarp Flag-HDAC1WT grupės ir Flag-HDAC1K444RK476R grupės, kai imunoblotuotas bet kuris iš antikūnų (3d paveikslas).

Pilno dydžio lentelė

Image

SUMO kandidatų vietų identifikavimas HDAC1 ląstelėje ir hipokampo srityje. ( a ir b ) EGFP-PIAS1WT ir Myc-SUMO1WT buvo kartu transfekuoti su Flag-HDAC1WT arba skirtingais Flag-HDAC1 lizino mutantų plazmidėmis į HEK293T ląsteles. HDAC1 SUMOylation buvo ištirtas imunoblotu (IB) naudojant anti-Flag antikūnus. Rodyklė rodo „Lys-444“ juostą a ir „Lys-476“ juostą b punkte . ( c ) EGFP-PIAS1WT ir Myc-SUMO1WT buvo kartu transfekuoti su Flag-HDAC1WT, Flag-HDAC1K444R, Flag-HDAC1K476R arba Flag-HDAC1 dvigubų sumo-mutantų plazmidėmis į HEK293T ląsteles, o HDAC1 SUMOylation buvo ištirti imunoprecipitacija (IP). -Flag antikūnas ir IB su anti-Flag antikūnu (kairėje) arba anti-SUMO1 antikūnu (dešinėje). Viršutinė rodyklė žymi „Lys-476“ juostą, o apatinė rodyklė - „Lys-444“ juostą. ( d ) Flag-HDAC1WT arba Flag-HDAC1K444RK476R plazmidė buvo kotransfekuota su His-Ubiquitin į HEK293T ląsteles, o ląstelių lizatai buvo imunosistemiškai nusodinti anti-Flag antikūnu ir imunoblotuoti anti-Flag arba anti-His antikūnais. Eksperimentai a - d yra du kartojimai. e ) Vėliavos vektorius, Flag-HDAC1WT (su SUMOylation reakcija pridedant sumo1 mutantų baltymų arba jų nepridedant), Flag-HDAC1K444R, Flag-HDAC1K476R ar Flag-HDAC1K444RK476R plazmidės buvo perkeltos į žiurkės CA1 plotą ir atliktas SUMOylation test. Po 48 val., Kad būtų galima nustatyti HDAC1 SUMOyliaciją hipokampo Lys-444 ir Lys-476. (kairėje) imunoblotuotas anti-HDAC1 antikūnu. (dešinėje) imunoblotuotas anti-SUMO1 antikūnu. ( f ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 4 kiekvienoje grupėje; F 5, 18 = 119, 04, P <0, 001). ( g ) PBS, BDNF, IGF-1 arba CRF buvo sušvirkšta į žiurkės CA1 plotą, o HDAC1 SUMOylation buvo nustatytas po 45 min (IGF-1) arba 1 h (BDNF ir CRF). ( h ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 4 kiekvienoje grupėje; F 3, 12 = 1262, 4, P <0, 001). Duomenys yra vidurkis ± sem # P <0, 001

Visas dydis

Aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad Lys-444 ir Lys-476 yra dvi pagrindinės SUMO vietos kandidatės HDAC1 HEK293T ląstelėse. Toliau mes ištyrėme, ar HDAC1 SUMOylation taip pat vyksta prie šių dviejų smegenų liekanų. Žiurkės buvo suskirstytos į šešias grupes ir gautos taip, kad jų CA1 sritis būtų transfekuota plazmidėmis: Vėliavos vektorius, Flag-HDAC1WT, Flag-HDAC1K444R, Flag-HDAC1K476R, Flag-HDAC1K444RK476R ir Flag-HDAC1WT su išvalytu SUMO1 mutanto baltymu, pridėtu prie reakcijos. Gyvūnai buvo nužudyti 48 valandas po plazmidės transfekcijos. Jų smegenys buvo pašalintos, o jų CA1 audinys buvo išpjaustytas ir jiems atliktas HDAC1 SUMOylation test. Ląstelių lizatai buvo imuniniu būdu nusodinti anti-HDAC1 antikūnais ir imunoblotai nustatyti anti-HDAC1 antikūnais. Rezultatai parodė, kad transfekuojant Flag-HDAC1WT plazmidę, palyginti su kontroline grupe, buvo pastebėtas sustiprėjęs HDAC1 SUMOylation. SUMO-HDAC1 juostos intensyvumas sumažėjo, kai buvo transfekuota bet kuri mutantinė plazmidė, tačiau HDAC1 SUMOylation buvo visiškai užblokuota, kai transfekuota dviguba sumo-mutantinė plazmidė. SUMOylation signalo taip pat nebuvo, kai buvo transfekuota Flag-HDAC1WT plazmidė ir prie reakcijos pridėtas SUMO1 mutantinis baltymas (3e paveikslas, kairysis skydelis). Panašūs rezultatai buvo gauti, kai ląstelių lizatai buvo imituojami naudojant anti-SUMO1 antikūnus (3e paveikslas, dešinė panelė). Kiekybinis rezultatas parodytas 3f paveiksle.

BDNF, IGF-1 ir CRF padidina HDAC1 SUMOylation hipokampo srityje

Galiausiai mes ištyrėme, ar HDAC1 SUMOylation gali būti reguliuojamas endogeninėmis molekulėmis, kurios, kaip žinoma, turi neurotrofinį ar neuroprotekcinį poveikį. Įrodyta, kad smegenų išvestinis neurotrofinis faktorius (BDNF) turi neuroprotekcinį ir terapinį poveikį gyvūnų modeliams, sergantiems AD ir kitais neurologiniais sutrikimais. 29 Įrodyta, kad į insuliną panašus augimo faktorius-1 (IGF-1) apsaugo hipokampo neuronus nuo A β toksiškumo, jis taip pat gelbsti hipokampo neuronus, kurie yra veikiami amiloidogeninių peptidų. 30 Buvo žinoma, kad neuropeptido kortikotropiną atpalaiduojantis faktorius (CRF) gyvūnams pagerina pažinimo funkciją ir Bdnf geno ekspresiją; 31 todėl mes ištyrėme šių trijų molekulių poveikį HDAC1 SUMOylation. Žiurkės buvo suskirstytos į penkias grupes ir į jų CA1 sritį buvo švirkščiamos tiesiogiai: PBS, BDNF (0, 7 μg ), IGF-1 (70 psl.) Ir CRF (70 ng). Gyvūnai buvo nužudyti praėjus 45 minutėms po IGF-1 injekcijos ir 1 valandą po BDNF ir CRF injekcijos, o jų CA1 audiniams buvo atliktas HDAC1 SUMOylation testas. Rezultatas atskleidė, kad gydymas BDNF, IGF-1 ir CRF žymiai padidino HDAC1 SUMOylation lygį žiurkių hipokampuose (3g paveikslas). Kiekybinis rezultatas parodytas 3h paveiksle. Mes taip pat ištyrėme sintetinio gliukokortikoido deksametazono poveikį HDAC1 SUMOylation. Rezultatai parodė, kad deksametazono injekcija į žiurkės hipokampą (21 μg ) neturėjo įtakos HDAC1 SUMOylation (papildomas S4 paveikslas).

HDAC1 SUMOylation sumažina jo ryšį su CREB, padidina CREB DNR prisijungimą prie Mcl-1 promotoriaus ir tarpininkauja A β indukuojant Mcl-1 ekspresiją.

Aukščiau pateikti rezultatai parodė HDAC1 SUMOilinimą tiek ląstelės, tiek žiurkės smegenyse, ir kad HDAC1 SUMOilinimą reguliuoja keli endogeniniai dirgikliai. Šioje eksperimentų serijoje mes ištyrėme HDAC1 SUMOylation molekulinį mechanizmą. Yra žinoma, kad HDAC1 sudaro kelių baltymų kompleksus, kuriuose yra HDAC1-HDAC1 homodimerai arba HDAC1-HDAC2 heterodimerai. HDAC1-HDAC1 homodimerai, kartu su Sin3 šerdies kompleksu ir kitais baltymais, sudaro vieno tipo ko-represoriaus kompleksą. 32 Be to, nustatyta, kad HDAC1 susijęs su CREB, o HDAC1 sutrikdo CREB fosforilinimąsi sąveikaudamas su baltymo fosfataze 1. Be to, HDAC inhibitoriai sustiprina CREB aktyvumą, pailgindami CREB fosforilinimą. Šie rezultatai kartu rodo, kad HDAC1 slopina CREB aktyvumą ir CREB tarpininkaujamą genų transkripciją. Remdamiesi šiais stebėjimais, mes iškėlėme hipotezę, kad HDAC1 SUMOylation išskiria HDAC1 su CREB ir atpalaiduoja CREB iš bendro represoriaus komplekso, kuris leidžia CREB prisijungti prie DNR promotoriaus, kad būtų galima transkripcijai reguliuoti genų ekspresiją. Ši hipotezė buvo išnagrinėta čia. Žiurkės buvo suskirstytos į keturias grupes ir gautos taip plazmidės pernešamos į CA1 sritį: Flag-vector, Flag-HDAC1WT, Flag-HDAC1K444RK476R ir Flag-HDAC1WT-SUMO1 fusion plazmidės. Jų CA1 audinys buvo išpjaustytas, o ląstelių lizatai buvo imuniniu būdu nusodinti anti-Flag antikūnu ir imunoblotuojami anti-CREB antikūnais. Rezultatai parodė, kad HDAC1 yra susijęs su CREB hipokampo srityje. Šis ryšys padidėjo dėl HDAC1 sumo mutantų transfekcijos, bet sumažėjo dėl HDAC1-SUMO1 sulietos plazmidės transfekcijos (4a paveikslas, kairysis skydelis). Kiekybinis rezultatas parodytas 4b paveiksle. Ląstelių lizatai taip pat buvo imunoprecipifuoti ir imunoblotuoti su anti-Flag antikūnu, siekiant patikrinti plazmidės transfekciją ir ekspresiją CA1 srityje. Norėdami patvirtinti, kad pasislinkusi juosta „Flag-HDAC1-SUMO1“ transfekcijos grupėje iš tikrųjų yra sumo-HDAC1 juosta, ląstelės lizatas taip pat buvo imunoprecipicuotas anti-Flag antikūnu ir imunoblotuotas anti-SUMO1 antikūnu. Tik Flag-HDAC1-SUMO1 transfekcijos grupėje buvo pastebėta viena juosta, turinti tą pačią sumo-HDAC1 juostos molekulinę masę (4a paveikslas, dešinė panelė).

Image

HDAC1 SUMOylation sumažina jo ryšį su CREB, padidina CREB DNR prisijungimą prie Mcl-1 promotoriaus ir tarpininkauja A β indukcijai Mcl-1 ekspresijai. ( a ) „Flag-vector“, „Flag-HDAC1WT“, „Flag-HDAC1K444RK476R“ arba „Flag-HDAC1WT-SUMO1“ sulietos plazmidės buvo transfekuotos žiurkės CA1 srityje, o ląstelių lizatai buvo paveikti IP su anti-Flag antikūnu ir IB su anti-Flag ir anti-CREB antikūnai (kairėje). Tie patys ląstelių lizatai taip pat buvo tiriami IP su anti-HDAC1 antikūnais ir IB su anti-SUMO1 antikūnais (dešinėje). ( b ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 3 kiekvienoje grupėje; F 3, 8 = 374, 94, P <0, 001). ( c ) Tos pačios plazmidės, aprašytos a punkte, buvo perkeltos į žiurkės CA1 plotą, o CA1 audinys buvo tiriamas CREB DNR surišimo tyrimu, o IP ir IB - su anti-Flag antikūnu. ( d ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 5 kiekvienoje grupėje; F 3, 16 = 84, 76, P <0, 001). ( e ) Tos pačios aukščiau aprašytos plazmidės buvo perkeltos į žiurkės CA1 plotą ir CA1 audinys buvo patikrintas ChIP PGR tyrimu, siekiant nustatyti CREB jungtį prie Mcl-1 promotoriaus. Ląstelių lizatai taip pat buvo IP ir IB su anti-Flag antikūnais. Eksperimentai yra du pakartojimai. ( f ) Kontrolinė siRNR arba CREB siRNR buvo transfekuota į žiurkės CA1 plotą, o Mcl-1 ir CREB ekspresija buvo nustatyta Western blot būdu. ( g ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 6 kiekvienoje grupėje; t 1, 10 = 11, 52, P <0, 001 Mcl-1 ir t 1, 10 = 13, P <0, 001 CREB). ( h ) Aukščiau aprašytos plazmidės buvo perkeltos į žiurkės CA1 plotą. Β buvo įšvirkštas į CA1 sritį 24 valandas po plazmidės transfekcijos, o CA1 audinys buvo išpjaustytas 24 valandas po A β injekcijos (vėliavos vektorius + NH4OH tarnavo kaip kontrolinė grupė). Mcl-1 ekspresija buvo nustatyta naudojant Western blot. Ląstelių lizatai taip pat buvo paveikti IP ir IB su anti-Flag antikūnais. ( i ) Parodyti kiekybiniai rezultatai ( n = 5 kiekvienoje grupėje; F 4, 20 = 83, 54, P <0, 001). Duomenys yra vidurkis ± sem * P <0, 05 ir # P <0, 001

Visas dydis

Jei HDAC1 SUMOylation metu, kaip mes hipotezuojame, CREB išsiskiria iš bendro represoriaus komplekso, įsivaizduojama, kad daugiau „laisvo CREB“ taps prieinama DNR surišimui. Šis klausimas buvo nagrinėtas čia. Žiurkės buvo padalintos į keturias grupes ir joms buvo atliktos tokios pačios plazmidės, kaip aprašyta aukščiau. Jų CA1 audinys buvo išpjaustytas, o ląstelių lizatams buvo atliktas CREB DNR surišimo tyrimas. Rezultatai atskleidė, kad Flag-HDAC1WT plazmidės transfekcija sumažino CREB DNR jungimąsi su kontroline grupe. CREB DNR surišimą dar labiau sumažino „Flag-HDAC1K444RK476R“ transfekcija, palyginti su „Flag-HDAC1WT“ grupe, tačiau tai sustiprino „Flag-HDAC1-SUMO1“ sulietos plazmidės transfekcija, palyginti su „Flag-HDAC1WT“ grupe (4c paveikslas). Kiekybinis rezultatas parodytas 4d paveiksle. Ląstelių lizatai buvo imunosistemiškai nusodinami ir implantai imituojami anti-Flag antikūnais, kad būtų galima patikrinti plazmidės transfekciją ir ekspresiją CA1 srityje. Western blot prieš CREB parodė vienodą CREB ekspresijos kiekį kiekvieno mėginio lizate (4c paveikslas). Šie rezultatai atskleidė, kad HDAC1 SUMOylation padidino CREB DNR surišimą hipokampyje, tačiau nežinoma, ar HDAC1 SUMOylation padidina CREB prisijungimą prie DNR promotoriaus tiesiogiai. Norėdami išnagrinėti šią problemą, atlikome ChIP PGR, kad nustatytume CREB prisijungimą prie hipokampo „ Mcl-1“ promotoriaus. Žiurkės buvo padalintos į keturias grupes ir joms buvo atliktos tokios pačios plazmidės, kaip aprašyta aukščiau. Jų CA1 audinio ląstelių lizatams buvo atliktas ChIP PGR tyrimas. Rezultatai atskleidė endogeninį CREB prisijungimą prie Mcl-1 promotoriaus vėliavos-vektoriaus transfekcijos grupėje. Dėl „Flag-HDAC1WT“ transfekcijos sumažėjo šis surišimas, o „Flag-HDAC1K444RK476R“ transfekcija jį dar labiau sumažino. Bet dėl ​​Flag-HDAC1-SUMO1 sulietos plazmidės transfekcijos padidėjo CREB surišimas su Mcl-1 promotoriumi, palyginti su kontrolinės grupės ir Flag-HDAC1WT grupės tirpalais (4e pav.). Imunoprecipitacija ir imunoblotavimas naudojant anti-Flag antikūnus atskleidė panašų plazmidės transfekcijos ir ekspresijos kiekį CA1 srityje (4e paveikslas, apatinė plokštė). Šie rezultatai kartu rodo, kad HDAC1 SUMOylation padidina CREB prisijungimą prie Mcl-1 promotoriaus CA1 srityje. Toliau mes ištyrėme, ar CREB reguliuoja Mcl-1 raišką hipokampo srityje. Žiurkės buvo suskirstytos į dvi grupes ir gautos kontrolinės siRNR arba CREB siRNR (8 pmol) transfekcijos į jų CA1 sritį. Gyvūnai buvo nužudyti 48 vėliau, o jų CA1 audinys buvo išpjaustytas ir atlikta Western blot analizė, siekiant nustatyti Mcl-1 ir CREB raišką. Tipinis gelio modelis parodytas 4f paveiksle. Kiekybinė rezultatų analizė parodė, kad CREB siRNR transfekcija žymiai sumažino tiek Mcl-1, tiek CREB raišką (4g paveikslas).

Aukščiau pateikti rezultatai kartu parodė, kad CREB reguliuoja Mcl-1 ekspresiją, o HDAC1 SUMOylation sustiprina CREB prisijungimą prie Mcl-1 promotoriaus hipokampyje, tačiau nežinoma, ar HDAC1 SUMOylation tarpininkauja A β indukcijai Mcl-1 ekspresijai. Šis klausimas buvo nagrinėtas čia. Žiurkės buvo suskirstytos į penkias grupes ir gautos taip transfekuojant ir injekuojant: vėliavos vektorius + NH 4OH (1%), vėliavos vektorius + A β (14 μg ), Flag-HDAC1WT + A β (14 μg ), „Flag-HDAC1K444RK476R + A β“ (14 μg ) ir „Flag-HDAC1WT-SUMO1 + A β“ (14 μ g). Laiko tarpas tarp dviejų injekcijų buvo 24 valandos, o gyvūnai buvo nužudyti 24 valandas po antrosios injekcijos. Jų smegenys buvo pašalintos, o jų CA1 audinys buvo išpjaustytas ir atlikta Western blot analizė, siekiant nustatyti Mcl-1 raišką. Tipinis gelio modelis parodytas 4h paveiksle. Kiekybinė rezultatų analizė parodė, kad A β nuolat padidino Mcl-1 raišką, palyginti su kontroline grupe. „Flag-HDAC1WT“ plazmidės blokuoto A β indukcija Mcl-1 transfekcija. „Flag-HDAC1“ sumo mutantų plazmidės transfekcija dar labiau sumažino Mcl-1 A β indukciją, palyginti su Flag-HDAC1WT + A β grupe, tačiau „Flag-HDAC1WT-SUMO1“ sulietos plazmidės transfekcija padidino A β indukciją Mcl-1 raiškai. vėliavos-HDAC1WT + A β grupė (4i paveikslas). Ląstelių lizatai buvo imunosistemiškai nusodinti ir imunoblotai tiriami su anti-Flag antikūnu, kad būtų patvirtinta plazmidės transfekcija ir ekspresija CA1 srityje (4h pav.).

HDAC1 SUMOylation gelbsti sinapsių ir atminties trūkumą APP / PS1 pelėms

Aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad HDAC1 SUMOylation leidžia daugiau CREB prisijungti prie Mcl-1 promotoriaus ir tarpininkauja Aβ indukcijai Mcl-1 ekspresijai. Šioje eksperimento serijoje atlikome funkcinius tyrimus, norėdami išsiaiškinti, ar HDAC1 SUMOylation APP / PS1 pelėms (9 mėnesių amžiaus) gelbėja sinapsių deficitas ir atminties sutrikimas. Pirmiausia atlikome „Morris“ vandens labirinto eksperimentą. APP / PS1 pelės buvo suskirstytos į tris grupes ir gautos lenti-vektoriaus pernešimu, lenti-Flag-HDAC1WT vektorių perdavimu ir lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1 sulietų vektorių perdavimu į jų CA1 sritį. Kita laukinio tipo pelių grupė gavo lenti-vektoriaus transdukciją ir buvo kontrolė. Vandens labirinto treniruotės pradėtos praėjus 10 dienų po lenti-vektoriaus perkėlimo. Rezultatai atskleidė, kad APP / PS1 pelėms, palyginti su laukinio tipo gyvūnais, buvo didelis erdvės įgijimo sutrikimas. APP / PS1 pelėms, gaunančioms „Lenti-Flag-HDAC1WT“ vektoriaus transdukciją, buvo panašus erdvinio mokymosi deficitas kaip ir APP / PS1 pelėms, tačiau „lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1“ sintezės vektoriaus transdukcija sėkmingai išgelbėjo erdvinio mokymosi deficitą APP / PS1 pelėms (5a pav. ). Panašūs rezultatai buvo gauti atliekant sulaikymo testą (5b paveikslas). Mes taip pat norėjome išsiaiškinti, ar HDAC1 SUMOylation gelbėja atminties trūkumas atliekant kitą mokymosi užduotį. Rezultatai atskleidė, kad APP / PS1 pelės, gavusios lenti-vektorių ir lenti-Flag-HDAC1WT vektorių, rodė mažiau šalčio reakcijų, palyginti su laukinio tipo gyvūnais, atsižvelgiant į kontekstinę baimę sąlygojančią mokymosi užduotį. Šis sulaikymo deficitas APP / PS1 pelėse buvo visiškai išgelbėtas perduodant vektorių lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1 (papildomas S5 pav.). Toliau ištyrėme HDAC1 SUMOylation lygį šiems gyvūnams. Rezultatai parodė, kad HDAC1 SUMOylation reikšmingai sumažėjo APP / PS1 pelėms, palyginti su laukinio tipo pelėmis, tačiau lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1 perdavimas APP / PS1 pelėms panaikino šį reiškinį, palyginti su APP / PS1 pelėmis. Per didelis HDAC1WT išraiška turi panašų poveikį kaip ir HDAC1WT-SUMO1 per didelis išraiška (5c paveikslas). Kiekybinis rezultatas parodytas 5d paveiksle. Norėdami patikrinti, ar minėti lenti-Flag-vektoriai iš tikrųjų buvo perduoti ir ekspresuoti CA1 srityje, gyvūnai buvo nužudyti, o jų CA1 audinys imuniniu būdu nusodintas anti-Flag antikūnu ir imunoblotas su anti-Flag antikūnu. Rezultatai atskleidė, kad perkeltas HDAC1 vektorius yra išreikštas abejomis „Lenti-Flag-HDAC1“ ekspresijos grupėmis, kaip rodo akivaizdžios „Flag“ žymėtos juostos, tačiau „Lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1“ perraiškos grupėje „Flag“ pažymėta juosta paslinksta aukštyn, nurodant sumoilinto HDAC1 išraišką (5e pav.). The above results showed that SUMOylation of HDAC1 rescued learning and memory deficits in APP/PS1 mice. Next we examined the effect of HDAC1 SUMOylation on synaptic plasticity in APP/PS1 mice by adopting the LTP paradigm. The hippocampal tissue slice of animals receiving the same lenti-vector transductions as described in Figure 5a were subjected to extracellular recording of field excitatory post-synaptic potential (fEPSP). Results revealed that the induction and expression of LTP was significantly impaired in the CA1 area of APP/PS1 mice compared with wild-type mice. Transduction of lenti-Flag-HDAC1WT vector in APP/PS1 mice more apparently impaired late phase LTP induction and LTP expression compared with wild-type mice. But transduction of lenti-Flag HDAC1WT-SUMO1 vector in APP/PS1 mice completely rescued the impairment in both LTP induction and expression in APP/PS1 mice (Figure 5f).

Image

HDAC1 SUMOylation rescues synaptic and memory deficits in APP/PS1 mice. APP/PS1 mice (9 months old) receiving lenti-vector, lenti-Flag-HDAC1WT vector or lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1 vector, and WT mice receiving lenti-vector tranductions were subjected to ( a ) water maze learning ( n =9–10 each group; F 3, 34 =36, P <0.001) and ( b ) probe trial test (F 3, 34 =12.36, P <0.01). ( c ) Hippocampal HDAC1 SUMOylation level was determined in these animals and ( d ) the results are quantified ( n =3 each group; F 3, 8 =14.15, P <0.01). ( e ) The CA1 tissue of animal from a and b was dissected out and the cell lysate was subjected to IP and IB with anti-Flag antibody for verification of lenti-Flag-HDAC1 transductions ( n =2 each group). ( f ) Hippocampal tissue slice of animals receiving the same lenti-vector transductions as described in a were subjected to LTP recording under HFS paradigm ( n =5 each group; F 3, 16 =5.71, P <0.01). HFS, high-frequency stimulation. Lenti-F-HDAC1WT: Lenti-Flag-HDAC1WT. Data are mean±sem * P <0.05, ** P <0.01 and # P <0.001

Visas dydis

HDAC1 SUMOylation reduces amyloid plaque and apoptotic cells in APP/PS1 mice

The brains of AD patients and in mouse model of AD are characterized by amyloid plaque accumulation followed by neuronal death. Next, we examined whether HDAC1 SUMOylation has a rescuing effect against these pathologies in APP/PS1 mice. Different APP/PS1 mice were used for this purpose. Antibody against A β was used to detect the presence of A β and thioflavin S staining was used to detect A β aggregation and amyloid plaque formation. Results from immunohistochemistry indicated the presence of A β (Figure 6a, left panel) and amyloid plaque (Figure 6a, middle panel) in the CA1 area of APP/PS1 mice, and these two images overlapped (Figure 6a, right panel). ProteoStat dye staining was also used to confirm the presence of amyloid plaque and its co-localization with A β in the same area (Figure 6b). Further immunohistochemical results of thioflavin-S staining revealed that transduction of lenti-Flag-HDAC1WT vector to APP/PS1 mice showed slightly higher amount of amyloid plaque, as indicated by the arrowheads, as that of APP/PS1 mice receiving lenti-vector transduction (Figure 6c, lower-left panel versus upper-right panel), but amyloid plaque was significantly reduced in APP/PS1 mice receiving lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1 vector transduction compared with APP/PS1 mice receiving lenti-vector transduction (Figure 6c, lower-right panel versus upper-right panel). The quantified result is shown in the right panel. Similar results were obtained when ProteoStat dye staining was used as a measure of amyloid plaque (Figure 6d). Moreover, lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1 vector transduction also showed a rescuing effect in reducing amyloid plaque in older APP/PS1 mice (12 months old), but this effect was less significant due to more amyloid plaque formation in animals at this age (Supplementary Figure S6).

Image

HDAC1 SUMOylation reduces amyloid plaque and the number of apoptotic cells in APP/PS1 mice. APP/PS1 mice (9 months old) receiving lenti-vector, lenti-Flag-HDAC1WT vector or lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1 vector, and WT mice receiving lenti-vector tranductions were subjected to ( a ) immunohistochemistry with antibody against A β and thioflavin S staining were carried out in CA1 tissue of APP/PS1 mice (9 months old) ( n =3). Svarstyklės, 100 μm . ( b ) Immunohistochemistry with antibody against A β and ProteoStat dye staining were carried out in the same mice ( n =3). Svarstyklės, 100 μm . Animals receiving the same lenti-vector transductions described in Figure 5a were also subjected to ( c ) thioflavin S staining and quantified ( n =4 each group; F 3, 12 =80.81, P <0.001). Arrowheads indicate cells showing thioflavin S staining. Scale bar, 200 μ m and ( d ) ProteoStat dye staining and quantified ( n =4 each group; F 3, 12 =201.15, P <0.001). Arrowheads indicate cells showing ProteoStat dye staining. Scale bar, 200 μ m and ( e ) TUNEL staining and quantified ( n =4 each group; F 3, 12 =60.4, P <0.001). Cells in brown color indicated by arrowheads are the apoptotic cells. Mastelio juosta, 50 μm . ( f ) Flag-vector, Flag-HDAC1WT plasmid, Flag-HDAC1 sumo-mutant plasmid or Flag-HDAC1-SUMO1 fusion plasmid was transfected to rat CA1 area and ChIP PCR for HDAC1 binding to the neprilysin promoter was determined. Plasmid transfection and expression was confirmed by immunoprecipitation and immunoblotting using anti-Flag antibody (lower panel). Experiments are in duplicates. Lenti-F-HDAC1WT: Lenti-Flag-HDAC1WT. Data are mean±sem # P <0.001

Visas dydis

We next examined whether HDAC1 SUMOylation also reduces neuronal cell death in APP/PS1 mice. Separate animals were divided to the same groups as described above and TUNEL staining was used to measure cell apoptosis. Results revealed that the number of apoptotic cells was significantly higher in APP/PS1 mice receiving lenti-vector transduction compared with wild-type animals also receiving lenti-vector transduction. This measure was further slightly increased in APP/PS1 mice receiving lenti-Flag-HDAC1WT transduction compared with that of APP/PS1 mice receiving lenti-vector transduction. But the number of apoptotic cells was dramatically decreased in APP/PS1 mice receiving lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1 vector transduction compared with that of APP/PS1 mice receiving lenti-vector transduction (Figure 6e). In studying the mechanism of the rescuing effect of HDAC1 SUMOylation on neuronal death, we have examined the effect of HDAC1 SUMOylation on HDAC1 binding to the promoter of neprilysin , an A β -degrading enzyme, in the CA1 area using ChIP PCR assay. Results revealed that transfection of Flag-HDAC1WT plasmid to rat CA1 area increased HDAC1 binding to the neprilysin promoter compared with the Flag-vector transfected group. This effect was further enhanced upon Flag-HDAC1 sumo-mutant transfection, but it was apparently diminished upon Flag-HDAC1WT-SUMO1 fusion plasmid transfection (Figure 6f). Plasmid transfection and expression was confirmed by immunoprecipitation and immunoblotting using anti-Flag antibody (Figure 6f, lower panel).

Diskusija

The present study examined the physiological role of HDAC1 SUMOylation in the hippocampus and the results revealed that HDAC1 SUMOylation functions as an endogenous defense mechanism protecting against A β -toxicity by releasing CREB from the HDAC1 repressor complex and by increasing CREB binding to the Mcl-1 promoter to enhance Mcl-1 expression. These results are consistent with the report that PIAS1 has an anti-apoptotic role. 25 But they are incongruent with the studies showing that PIAS1 is pro-apoptotic. 34, 35 One possible explanation for this discrepancy is that for the study showing an anti-apoptotic role of PIAS1, low concentration of PIAS1 plasmid DNA was transfected to HEK293T cells; however, for the studies showing a pro-apoptotic role of PIAS1, inducible PIAS1 expression was adopted. But other mechanisms may also account for this discrepancy. The present results are also consistent with the finding that A β activation of MAPK/ERK has a neuroprotective role 13 and the notion that ERK1/2 activation acts as a defense mechanism against neuronal damage. 36 This result is also congruent with the finding that PIAS1 expression is regulated by MAPK/ERK-mediated signaling. 27 In addition, we have found that A β also activates Akt, and inhibition of PI-3 K signaling blocked A β induction of PIAS1 expression. These results suggest that A β activation of PI-3 K signaling also mediates neuroprotection against A β toxicity through enhanced PIAS1 expression. These results are consistent with the report that MAPK/ERK and PI3-K activation both mediate the neuroprotective effect of BDNF against glutamate neurotoxicity. 37 Moreover, we have found that A β does not increase the expression of PIAS2, PIAS3 and PIAS4. This result indicated that A β specifically induces PIAS1 expression. But this result does not exclude the possibility that HDAC1 could also be SUMO-modified by PIAS2, PIAS3 or PIAS4. Whether PIAS2, PIAS3 and PIAS4 are induced by other stimuli that also enhance the SUMOylation of HDAC1 remain to be investigated.

The present result is consistent with the previous finding that HDAC1 is SUMO-modified at Lys-444 and Lys-476 in the cell. 23 It is also consistent with the result from SUMO Software prediction because Lys-444 and Lys-476 both fit to the sequence of consensus SUMO substrate motif. But in our study, transfection of HDAC1K444RK476R did not completely block HDAC1 SUMOylation in HEK293T cells (Figure 3c). It is possible that there are more than two SUMO residues on HDAC1 in HEK293T cells. On the other hand, our result is incongruent with the finding that SUMO1 modification of HDAC1 promotes HDAC1 ubiquitination 24 because blockade of HDAC1 SUMOylation did not affect HDAC1 ubiquitination in the brain. This discrepancy may be partially explained by different cells adopted in these studies and HDAC1 SUMOylation may produce more complicated effects in the brain than in the cell line. In addition, HDAC1 was found phosphorylated by protein kinase A and casein kinase II in vitro 38 and HDAC1 phosphorylation at Ser-421 and Ser-423 promotes HDAC1 enzyme activity and complex formation. 20 In examination of the relationship between HDAC1 SUMOylation and HDAC1 phosphorylation in the brain, our result showed that HDAC1 SUMOylation is not dependent on HDAC1 phosphorylation (Supplementary Figure S7). This result is consistent with an earlier report showing that overexpression of HDAC1 phosphorylation mutant does not affect HDAC1 SUMOylation in NIH 3T3 cells. 22 This result suggests that HDAC1 phosphorylation and HDAC1 SUMOylation may be induced by different stimuli. In studying the molecular mechanism underlying the neuroprotective effect of HDAC1 SUMOylation, we have found that HDAC1 SUMOylation releases CREB from the repressor complex that allows more 'free CREB' to bind to the Mcl-1 promoter and to enhance Mcl-1 expression. These events result in decreased caspase 3 activity in A β -treated animals and decreased neuronal death in APP/PS1 mice. HDAC1 is known to interact with other transcription factors as well in addition to CREB, such as NF-κB 39 and Sp1, 40 and HDAC1 interaction with these transcription factors negatively regulates gene expression. SUMOylation of HDAC1 may also change its association with these transcription factors that leads to enhanced expression of certain anti-apoptotic genes and/or decreased expression of certain pro-apoptotic genes. HDAC1 SUMOylation also decreased the amount of amyloid plaque in APP/PS1 mice. HDAC1 is known to compete with amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) for binding to the promoter of an A β degrading enzyme neprilysin 41 and an A β clearance protein transthyretin. 42 The transthyretin mRNA level is higher in APP 695 cell line compared with that of control cell line due to higher expression level of AICD. But transthyretin mRNA expression is further increased in APP 695 cells treated with the HDAC inhibitor valproic acid, 42 suggesting that HDAC binding to the transthyretin promoter suppresses transthyretin expression. Our results revealed that HDAC1 sumo-mutant transfection increased, whereas HDAC1-SUMO1 fusion plasmid transfection decreased HDAC1 binding to the neprilysin promoter. These results suggest that sumoylated HDAC1 diminishes HDAC1 suppression of neprilysin expression. Upregulation of neprilysin consequently reduces A β accumulation and amyloid plaque formation. But other possibilities may also exist to account for the effect of HDAC1 SUMOylation in reducing amyloid plaque. In addition to HDAC1, other HDAC family proteins were found to be SUMO-modified as well. For example, the SUMO E3 ligase RanBP2 was found to promote the SUMOylation of HDAC4 and blockade of HDAC4 SUMOylation slightly impairs the transcriptional repression and enzyme activity of HDAC4. 43 Our preliminary result showed that HDAC2 could also be SUMO-modified by PIAS1 in rat hippocampus and HDAC2 SUMOylation is increased after water maze training (Supplementary Figure S8). Because HDACs, particularly HDAC2, are involved in cognitive impairments under A β insult, in AD patients and in animal models of AD, 18, 44, 45 it is worth examining whether SUMOylation of HDAC proteins other than HDAC1 is also involved in neuroprotection against A β toxicity. Moreover, because HDAC proteins are implicated in other brain disorders as well, 46 it is worth to also examine the role of SUMOylation of other HDAC proteins possibly involved in these disorders.

In addition to HDAC1, PIAS1 is known to SUMO-modify many other proteins. We also examined whether the A β -dependent induction of PIAS1 affects the SUMOylation of other target proteins. We have chosen STAT1, p65 subunit of NF-κB, p53 and c-Myc as the alternative targets of PIAS1. The results revealed that A β induction of PIAS1 also increased the SUMOylation of STAT1 and p65 (Supplementary Figure S9a and S9b), but it did not affect the SUMOylation of p53 (Supplementary Figure S9c). c-Myc and c-Myc SUMOylation were not detected in the brain (Supplementary Figure S9d). STAT1 SUMOylation and NF-κB translocation to the nucleus were shown to facilitate spatial learning. 47, 48 Whether SUMOylation of STAT1 and NF-κB protects against A β- toxicity requires further investigation.

Accumulative evidence has indicated that dysregulation of several sumoylated proteins is involved in the pathogenesis of AD. 49 On the other hand, overexpression of SUMO3 in HEK293T cells was shown to reduce A β production whereas SUMO3 mutant transfection increases A β production. 50 SUMOylation of APP was found to negatively regulate the level of A β aggregation and overexpression of Ubc9 and SUMO1 decreases A β aggregation in cells transfected with mutant APP. 51 These results together suggest that up-regulated SUMOylation may be neuroprotective against AD. This speculation is supported by our finding that HDAC1 SUMOylation rescued the behavioral and synaptic deficits in APP/PS1 mice. It also reduced amyloid plaque and the number of apoptotic cells in APP/PS1 mice. But in another study, the global SUMO1 or SUMO2/3 conjugation levels were found unaltered in Tg2576 mice compared with wild-type mice. 52 This latter result may not be inconsistent with the above results because SUMOylation of specific target proteins may be confounded by global SUMOylation. It is worth examining whether HDAC1 SUMOylation also protects against A β toxicity in different animal models of AD in future studies.

In examination of a few endogenous molecules, we have found that BDNF, IGF-1 and CRF all enhanced the SUMOylation of HDAC1. Previous report revealed that the neuroprotective effect of BDNF in animal models of AD is mediated through amyloid-independent mechanisms. 29 The present result partially supports this notion by showing a novel protective mechanism of BDNF acting on enhanced SUMOylation of HDAC1. IGF-1 belongs to another family of growth factors that influence neuronal development and with its receptors enriched in the hippocampus. 53 A previous study has shown that IGF-1 could protect and rescue hippocampal neurons against A β toxicity and amyloid-related neurotoxicity. 30 In a more recent study, a human cortex-derived neural stem cell line modified to express IGF-1 was shown to exhibit neuroprotective capacity in vitro and persists in targeted brain regions in an animal model of AD. 54 In studying the molecular mechanism of IGF-1, we have found that IGF-1 increased the SUMOylation of HDAC1 in rat hippocampus. This result suggests that HDAC1 SUMOylation is a novel mechanism underlying the neuroprotective action of IGF-1. Because we have demonstrated that A β induction of PIAS1 expression is also regulated through PI3-K signaling, this result is consistent with the notion that the neurotrophic effect of IGF-1 is mediated through PI3-K/Akt pathway upon activation of the IGF-1 receptors. 55 Furthermore, the neuropeptide CRF was shown to induce synaptic plasticity and enhance cognitive function in animals and the memory-enhancing effect of CRF is mediated, at least in part, through increased Bdnf gene expression. 31, 56 Here we have demonstrated that CRF-enhanced HDAC1 SUMOylation and this may provide a novel molecular mechanism of CRF. In a recent study, we have found that IGF-1 and CRF both enhance the SUMOylation of MeCP2 that results in alleviation of Rett syndrome in Mecp2 conditional knockout mice. 57 The present result implicates that IGF-1 and CRF may also alleviate the pathology of AD through enhanced SUMOylation of HDAC1. But dexamethasone, a synthetic glucocorticoid that binds to the glucocorticoid receptor, did not affect HDAC1 SUMOylation. This result suggests that different steroid hormones may have different mechanisms in regulation of protein SUMOylation.

In summary, we have presently found that HDAC1 could be SUMO-modified by PIAS1 at Lys-444 and Lys-476. Acute A β -treatment significantly increases the level of HDAC1 SUMOylation in the hippocampus through MAPK/ERK-mediated signaling at 1 h, but not 14 days later. Enhanced HDAC1 SUMOylation decreases its association with CREB, increases CREB binding to the Mcl-1 promoter and increases Mcl-1 expression. HDAC1 SUMOylation also decreases HDAC1 binding to the neprilysin promoter (Figure 7). These mechanisms together reduce the number of apoptotic cells and the amount of amyloid plaque in the CA1 area of APP/PS1 mice. These mechanisms also rescue the cognitive impairment and synaptic deficit in APP/PS1 mice. Thus, HDAC1 SUMOylation functions as an endogenous defense mechanism protecting against A β- toxicity. Stimuli such as BDNF, IGF-1 and CRF that increase the level of HDAC1 SUMOylation without altering the HDAC1 expression level may serve as an alternative therapeutic strategy against AD.

Image

An illustration shows the relationship among A β , HDAC1 SUMOylation, HDAC1 association with CREB and other proteins in the repressor complex, CREB binding to the Mcl-1 promoter, Mcl-1 gene expression and HDAC1 binding to the neprilysin promoter in the hippocampus. This illustration also indicates that a few endogenous stimuli could activate HDAC1 SUMOylation in the brain

Visas dydis

medžiagos ir metodai

Gyvūnai

Adult male Sprague-Dawley rats (250–300 g) and adult male APP/PS1 transgenic mice were used in this study. The APP/PS1 mice were purchased from Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) (strain name: B6.Cg-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax, stock number: 005864). They were all bred at the Animal Facility of the Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica in Taiwan. All the animals were housed and maintained on a 12/12 h light/dark cycle (light on at 0630 hours) with food and water continuously available. Experimental procedures followed the Guidelines of Animal Use and Care of the National Institute of Health and were approved by the Animal Committee of IBMS, Academia Sinica.

Hippocampal lysate and cell lysate preparation

Animals were killed by decapitation, and their hippocampal tissue was dissected out. Rat hippocampal tissue and HEK293T cells were lysed by brief sonication in lysis buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA and 1% IGEPAL CA-630. One tablet of protease inhibitor cocktail (Catalog No. 05892791001, cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack, Roche, Mannheim, Germany) and one tablet of phosphatase inhibitor (Catalog No. 04906837001, PhosSTOP, Roche) were added to each 10 ml of the lysis buffer.

Immunoprecipitation (IP) and western blot

For IP PIAS1, HDAC1, HDAC2 and Flag, the clarified lysate (0.5 mg) was immunoprecipitated with 3 μ l of rabbit anti-PIAS1 antibody (Catalog No. 2474-1, Epitomics, Burlingame, CA, USA), 3 μ l of mouse anti-HDAC1 antibody (Catalog No. 5356, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) or 3 μ l of rabbit anti-HDAC1 N-terminal antibody (Catalog No. A0238, ABclonal, College Park, MD, USA), 3 μ l of mouse anti-HDAC2 antibody (Catalog No. 5113, Cell Signaling) and 3 μ l of mouse anti-Flag M2 antibody (Catalog No. F1804, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) at 4 °C for overnight. Three microliters of rabbit or mouse IgG was used in the control group. The protein A or G magnetic beads (30 μ l, 50% slurry, GE Healthcare, Barrington, IL, USA) were added to the IP reaction product to catch the immune complex at 4 °C for 3 h. The immune complex on beads were washed three times with washing buffer containing 20 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1 mM DTT, 50 mM β -glycerophosphate, 50 mM NaF, 10 mg/ml PMSF, 4 μ g/ml aprotinin, 4 μ g/ml leupeptin and 4 μ g/ml pepstatin before boiling at 95 °C for 10 min and subjected to 8%, 10% or 15% SDS-PAGE followed by transferring onto the PVDF membrane (Millipore, Bedford, MA, USA). Western blot was conducted using the following antibodies: rabbit anti-PIAS1 (1:10 000, Catalog No. 2474-1, Epitomics), rabbit anti-PIAS2 (1:1000, Catalog No. ab58404, Abcam, Cambridge, UK), rabbit anti-PIAS3 (1:1000, Catalog No. 4164, Cell Signaling), rabbit anti-PIAS4 (1:1000, Catalog No. 4392, Cell Signaling), rabbit anti-MAPK (ERK1/2) (1:5000, Catalog No. 4695, Cell Signaling), rabbit anti-phospho-MAPK (pERK1/2) (1:5000, Catalog No. 4376, Cell Signaling), rabbit anti-Akt (1:2000, Catalog NO. 9272, Cell Signaling), rabbit anti-phospho308-Akt (1:2000, Catalog No. 4056, Cell Signaling), rabbit anti-Mcl-1 (1:500, Catalog No. sc-819, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), mouse anti-HDAC1 (1:1000, Catalog No. 5356S, Cell Signaling), rabbit anti-HDAC1 N-terminal (1:1000, Catalog No. A0238, ABclonal), rabbit anti-CREB (1:1000, Catalog No. 9197, Cell Signaling), rabbit anti-SUMO1 (1:4000, Catalog No. 40120 SUMOlink kit, Active Motif, Carlsbad, CA, USA), mouse anti-Myc (1:5000, Catalog No. 05-419, Millipore), mouse anti-GFP (1:5000, Catalog No. 11814460001, Roche), mouse anti-Flag M2 (1:5000, Catalog No. F1804, Sigma-Aldrich), mouse anti-His (1:5000, Catalog No. OB05, Millipore) and mouse anti-actin (1:200000, Catalog No. MAB1501, Millipore) antibodies. The secondary antibody used was HRP-conjugated goat-anti-rabbit IgG antibody or goat-anti-mouse IgG antibody (1:6500, Catalog No. 111-035-003 or 115-035-003, Jackson ImmunoResearch). Membrane was developed by reacting with chemiluminescence HRP substrate (Millipore) and exposed to the LAS-3000 image system (Fujifilm, Tokyo, Japan) for visualization of protein bands. The protein bands were quantified using the NIH Image J Software (National Institute of Health, MD, USA).

Plasmid construction, cell culture and DNA transfection

For construction of the Flag-tagged Hdac1 plasmid, full-length Hdac1 was cloned by amplifying the rat hippocampal Hdac1 cDNA (accession # NM_001025409) with primers 5′-ATCGGGATCCATGGCGCAGACTCAGGGC-3′ (forward) and 5′-ATCGCTCGAGTCAGGCCATCTTGACCTCTTC-3′ (reverse). The PCR product was sub-cloned between the BamHI and XhoI sites of the mammalian expression vector pCMVTag2B. Flag-tagged Hdac1 mutant plasmids were generated using the QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA). For construction of the EGFP-tagged pias1 and His-tagged ubiquitin plasmids, the procedure used was the same as that described previously. 25 For construction of the Myc-tagged sumo1 plasmid, the procedure used was the same as that described elsewhere. 57 For construction of the Flag-Mcl-1 plasmid, the procedure used was the same as that described previously. 13 For construction of the Flag-tagged Hdac1 - sumo1 fusion plasmid, the previously cloned Flag-tagged Hdac1 plasmid and Myc-tagged sumo1 plasmid were used as templates and the Hdac1 sequence was amplified with primers 5′-ATCGGGATCCATGGCGCAGACTCAGGGCA-3′ (forward) and 5′-ATCGGATATCGGCCATCTTGACCTCTTCT-3′ (reverse). The sumo1 sequence was amplified with primers 5′-ATCGGTCGACATGTCTGACCAGGAGGCAA-3′ (forward) and 5′-ATCGGGGCCCCTAAACCGTCGAGTGACCC-3′ (reverse). The Hdac1 PCR product was sub-cloned between the BamHI and EcoRV sites of the mammalian expression vector pCMVTag2B. The sumo1 PCR product was sub-cloned between the SalI and ApaI sites downstream of the Hdac1 sequence from the previously cloned Flag-tagged Hdac1 plasmid. HEK293T cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum and incubated at 37 °C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 . Plasmid transfection was made by using the Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in 12-well culture plates according to the manufacturer's instructions. IP and western blot were conducted 48 h after plasmid transfection.

Lentiviral vector construction and preparation

For construction of the pLenti-Tri-cistronic-GFP lentiviral vector, the GFP construct was cloned by amplifying the GFP gene from pLenti-CMV-GFP-2A-Puro-Blank (ABM, Richmond, BC, Canada) and sub-cloned into the pLenti-Tri-cistronic lentiviral vector (ABM) between the ScaI and KpnI sites downstream of the PGK promoter. The primers used for GFP vector were 5′-ATCGAGTACTGCCACCATGGAGATCGAGTGCCGCATC-3′ (forward) and 5′-ATCGGGTACCGGCGAAGGCGATGGGGGTC-3′ (reverse). For construction of the pLenti-Flag-tagged Hdac1WT GFP and pLenti-Flag-tagged Hdac1WT-sumo1 GFP lentivitral vectors, full-length Hdac1 and Hdac1-sumo1 fusion sequences were sub-cloned into the pLenti-Tri-cistronic-GFP lentiviral vector by amplifying the rat Flag- Hdac1 plasmid and rat Flag -Hdac1 - sumo1 fusion plasmid, respectively, with different primers. The forward primer used for obtaining the rat Flag-tagged Hdac1 lentivitral vector was: 5′-TCGCCCGGGGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGATGGCGCAGACTCAGGGC-3′ and the reverse primer used was: 5′-ATCGCCTAGGGGCCATCTTGACCTCTTCT-3′. The PCR product was sub-cloned between the XmaI and AvrII sites of the pLenti-Tri-cistronic-GFP lentiviral vector downstream of the mini CMV promoter. The forward primer used for obtaining the rat Flag-tagged Hdac1 - sumo1 lentivitral vector was: 5′-TCGCCCGGGGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGATGGCGCAGACTCAGGGC-3′ and the reverse primer used was: 5′-ATCGCCTAGGCTAAACCGTCGAGTGACCC-3′. The PCR product was sub-cloned between the XmaI and AvrII sites of the pLenti-Tri-cistronic-GFP lentiviral vector downstream of the mini CMV promoter. For lentivirus packaging, HEK293LTV cells (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) were transfected with 1.5 μ g of psPAX2 (Addgene plasmid #12260), 0.5 μ g of pMD2.G (Addgene plasmid #12259), 2 μ g of pLenti-Flag-tagged Hdac1WT GFP or 2 μ g of pLenti-Flag-tagged Hdac1WT-sumo1 GFP or 2 μ g of pLenti-Tri-cistronic-GFP lentiviral vector coding for GFP as control using 10 μ l of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in six-well cell culture dish. Lentiviral particles were collected using the speedy lentivirus purification solution (ABM) according to the manufacturer's protocols. Cell culture medium containing lentiviral particles can be harvested for two to three times at 12 h interval until 36 h after transfection, and it was kept at 4 °C for the collecting period. The collected culture medium was further clarified by centrifugation at 2500 × g for 10 min and filtrated through a 0.45 μ m syringe filter. The speedy lentivirus purification solution (ABM) was added into filtrated supernatant (1:9, v/v) containing lentiviral particles and mixed thoroughly by inversion. The lentiviral supernatant was centrifuged at 5000 × g at 4 °C for 10 min. Supernatant was then discarded and the viral pellet was re-suspended in ice-cold PBS. After titration, the viral stock was stored at −80 °C in aliquots. The lentivirus titer was determined by lentivirus qPCR Titer Kit (ABM) according to the manufacturer's protocols. The titer of the pLenti-Flag-tagged Hdac1WT GFP lenti-vector and pLenti-Flag-tagged Hdac1WT-sumo1 GFP lenti-vector transducted to mice was 1 × 10 8 IU/ml.

In vitro SUMOylation assay for recombinant HDAC1 protein

The in vitro SUMOylation assay was performed in a total volume of 20 μ l containing 3 μ g of His-tagged recombinant HDAC1 protein (Catalog No. BML-SE456-0050, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), 3 μ l of GST-tagged recombinant PIAS1 protein (Catalog No. BML-UW9960, Enzo Life Sciences), 1 μ g of GST-tagged recombinant SENP1 enzyme (Catalog No. BML-UW9760-0100, Enzo Life Sciences), 1 μ l of E1 activating enzyme, 1 μ l of E2 conjugating enzyme and 0.5 μ l of SUMO1 protein in SUMOylation buffer provided in the SUMO link kit. In vitro SUMOylation assay was performed by using the SUMO link kit according to the manufacturer's instructions (Active Motif). Reactions were incubated at 30 °C for 3 h, stopped by adding sample buffer, and products were examined by SDS-PAGE separation.

HDAC1 SUMOylation in the brain

Hippocampal CA1 tissue lysate was prepared in the same way as that prepared for western blot analysis. For IP HDAC1 and HDAC2, the clarified lysate (0.5 mg) was immunoprecipitated with 3 μ l of mouse anti-HDAC1 antibody (Catalog No. 5356, Cell Signaling) or 3 μ l of rabbit anti-HDAC1 N-terminal antibody (Catalog No. A0238, ABclonal), or 3 μ l of mouse anti-HDAC2 antibody (Catalog No. 5113, Cell Signaling) at 4 °C overnight. The protein A or G magnetic beads (30 μ l, 50% slurry, GE Healthcare) were added to the IP reaction product to catch the immune complex at 4° C for 3 h. The immune complex on beads were washed three times with washing buffer containing 20 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1 mM DTT, 50 mM β -glycerophosphate, 50 mM NaF, 10 mg/ml PMSF, 4 mg/ml aprotinin, 4 mg/ml leupeptin and 4 mg/ml pepstatin and subjected to SUMOylation reaction with the addition of recombinant PIAS1 protein (3 μ l, Catalog No. BML-UW9960, Enzo Life Sciences), E1 (1 μ l), E2 (1 μ l) and the SUMO1 (0.5 μ l) proteins provided in the kit. SUMOylation assay was performed using the SUMO link kit according to the manufacturer's instructions (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) and boiled in Laemmli sample buffer at 95 °C for 10 min. The SUMOylation reaction product was subjected to 8% SDS-PAGE followed by transferring onto the PVDF membrane (Millipore). The membrane was immunoblotted with anti-HDAC1 antibody (1:1000, Catalog No. 5356, Cell Signaling), anti-HDAC1 N-terminal antibody (1:1000, Catalog No. A0238, ABclonal), anti-HDAC2 antibody (1:1000, Catalog No. 5113, Cell Signaling) or anti-SUMO1 antibody (1:4000, Catalog No. 40120, Active Motif). For determination of endogenous HDAC1 SUMOylation after PIAS1 siRNA transfection, no E1, E2, SUMO1 and PIAS1 proteins were added to the IP reaction product. The remaining procedures were the same as that described above.

HDAC1 SUMOylation in HEK293T cells

For HDAC1 SUMOylation determination in HEK293T cells, different Flag-tagged HDAC1 plasmids were co-transfected with EGFP-PIAS1 and Myc-SUMO1 plasmids to HEK293T cells. Forty-eight hours later, the cell lysate was subjected to western blot analyses by using anti-Flag (1:5000, Catalog No. F1804, Sigma-Aldrich) and anti-SUMO1 (1:4000, Catalog No. 40120 SUMOlink kit, Active Motif) antibodies.

Biotinylated oligonucleotides pull-down assay for CREB DNA-binding activity

DNA oligonucleotides containing two CRE elements (underlined) (5′-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAGGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3′ for the sense strand and 5′-CTAGCTCTCTGACGTCAGGCAATCCTAGCTCTCTGACGTCAGGCAATCTCT-3′ for the antisense strand) were conjugated with a 5′-biotin on the sense strand according to the method described elsewhere. 58 Both complementary oligonucleotides were re-suspended in the annealing buffer (10 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). For annealing the sense and antisense oligonucleotides, 10 μ l each of the complementary oligonucleotides together with 80 μ l of the annealing buffer were mixed in a 0.5 ml microtube and the tube was placed in a heating block at 90 °C. The heating block was allowed to gradually cool down to room temperature and stored on ice or at −20 °C until use. For the CREB pull-down assay, the clarified hippocampal CA1 tissue lysate (0.4 mg) was added with 6 μ l duplex oligonucleotides (100 μ M) and poly dI-dC (1 μ g/ml, GE Healthcare) at 4 °C for overnight. The streptavidin agarose beads (10 μ l, Sigma-Aldrich) were added to the pull-down reaction product to catch the CREB-DNA oligonucleotide complex at 4 °C for 3 h. The pull-down reaction complex on beads was then washed three times with PBS and boiled in Laemmli sample buffer at 95 °C for 10 min. For analysis of CREB DNA-binding activity, the pull-down assay product was subjected to 8% SDS-PAGE followed by transferring onto the PVDF membrane and immunoblotted with anti-CREB antibody (1:2000, Catalog No. 9197, Cell Signaling).

Chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) tyrimas

ChIP assay was performed according to the protocol of Millipore ChIP assay kit (Catalog No. 17-10085). For plasmid DNA transfection, 0.7 μ l plasmid DNA complex (1.5 μ g/ μ l) was injected to the rat CA1 area bilaterally 48 h before killing. CA1 tissues were washed using × 1 ice-cold PBS and fixed with 1% formaldehyde by adding formaldehyde to the × 1 ice-cold PBS for 10 min. After adding glycine to quench the un-reacted formaldehyde, tissue were homogenized and re-suspended in cell lysis buffer plus protease inhibitor cocktail II, then changed to nuclear lysis buffer plus protease inhibitor cocktail II for sonication. The chromatin was immunoprecipitated using rabbit anti-CREB antibody (Cell Signaling) and rabbit anti-HDAC1 N-terminal antibody (ABclonal). DNA purified from the immunoprecipitated samples was subjected to PCR reaction. The forward primer for the Mcl-1 promoter is: 5′-CGGAAGAGCCACGGAGTGG-3′ (nucleotide −200 to −182) and the reverse primer for the Mcl-1 promoter is: 5′-CCAGACTCGAGGCAGGCG-3′ (nucleotide −68 to −51). The forward primer for the neprilysin promoter is: 5′-GACACGGTTTTCATTGTCCA-3′ (nucleotide −1264 to −1245) and the reverse primer for the neprilysin promoter is: 5′-TGAGACTCAGCAGGCAGGTA-3′ (nucleotide −1107 to −1088). The PCR product for the Mcl-1 promoter is 150 bps and that for the neprilysin promoter is 177 bps in length. The PCR products were separated by agarose gel electrophoresis.

Extracellular field potentiation recording

APP/PS1 mice transducted with lenti-vector, lenti-Flag-HDAC1WT vector or lenti-Flag-HDAC1WT-SUMO1 vector in their CA1 area were subjected to electrophysiological recording. Wild-type mice transducted with lenti-vector served as the control. Animals were sacrificed and their brain slices were transferred to an immersion-type recording chamber, perfused with ACSF containing 100 μM picrotoxin at a rate of 2 ml/min at room temperature. An incision was made between the CA1 and CA3 areas to remove afferent input from CA3. For extracellular field potential recording, a glass pipette filled with 3 M NaCl was positioned in the CA1 stratum radiatum area to record fEPSP. Bipolar stainless steel stimulating electrodes (Frederick Haer Company, Bowdoin, ME, USA) were placed in the striatum radiatum to stimulate the Schaffer collateral pathway. Stable baseline fEPSP activity was recorded by applying a short-duration current stimulation pulse (~40 μs) at a predetermined intensity every 15 s for 20 min. LTP was induced using the high-frequency stimulation paradigm by delivering three 100 Hz tetani (1 s) with an inter-tetanus interval of 60 s.

Narkotikai

U0126 was purchased from Millipore (Catalog No. 662005). A β (1-42) and reverse A β (42-1) were purchased from Anaspec (Catalog No. AS-20276 and AS-27275, Fremont, CA, USA). BDNF was purchased from PeproTech (Catalog No. 450-02, Rocky Hill, NJ, USA). Wortmannin, IGF-1, CRF and dexamethasone were purchased from Sigma-Aldrich. IGF-1 and CRF were dissolved in PBS immediately before use. U0126, wortmannin and dexamethasone was dissolved in 15% DMSO and diluted with PBS before injection. BDNF was dissolved in PBS. A β and reverse A β were dissolved in 1% NH 4 OH before injection.

Intra-hippocampal drug infusion, plasmid DNA transfection and siRNA injection

Rats were anesthetized with pentobarbital (40 mg/kg) and subjected to stereotaxic surgery. Two 23-gauge, stainless steel, thin-wall cannulae were implanted bilaterally to the CA1 area of rat brain at the following coordinates: 3.5 mm posterior to the bregma, ±2.5 mm lateral to the midline and 3.4 mm ventral to the skull surface. After recovery from the surgery, A β (20 μ g/ μ l), U0126 (1 μ g/ μ l), wortmannin (1 μ g/ μ l), BDNF (1 μ g/ μ l), IGF-1 (100 ng/ml), CRF (100 ng/ μ l) and dexamethasone (30 ng/ μ l) were directly injected to the CA1 area at a rate of 0.1 μ l/min. A total of 0.7 μ l was injected to each side. For transient Hdac plasmid DNA transfection, 0.7 μ l plasmid DNA complex (1.5 μ g/ μ l) was injected directly to CA1 area bilaterally in the rat brain using the non-viral transfection agent polyethyleneimine (PEI) which we have previously demonstrated that it does not produce toxicity to hippocampal neurons. 59 Before injection, plasmid DNA was diluted in 5% glucose to a stock concentration of 2.77 μ g/ μ l. Branched PEI of 25 kDa (Sigma) was diluted to 0.1 M concentration in 5% glucose and added to the DNA solution. Immediately before injection, 0.1 M PEI was added to reach a ratio of PEI nitrogen per DNA phosphate equals to 10. The mixture was subjected to vortex for 30 s and allowed to equilibrate for 15 min. For siRNA injection, 0.7 μ l of PIAS1 siRNA (8 pmol), CREB siRNA (8 pmol) or control siRNA was transfected to CA1 area bilaterally in the rat brain also using the transfection agent PEI. The sense and antisense sequences used for PIAS1 siRNA were adopted from that of a previous study. 47 The sequence for PIAS1 siRNA sense strand is: 5′-UCCGGAUCAUUCUAGAGCUtt-3′ and that for PIAS1 siRNA antisense strand is: 5′-AGCUCUAGAAUGAUCCGGAtt-3′. The sequence for CREB siRNA sense strand is: 5′-GCACUUAAGGACCUUUACUtt-3′ and that for CREB siRNA antisense strand is: 5′- AGUAAAGGUCCUUAAGUGCtt-3′.The Silencer Negative Control number 1 siRNA was used as a control. They were all synthesized from Ambion, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). The inner diameter of the injection needle is 0.31 mm and the wall thickness of the injection needle is 0.12 mm. The injection needle was left in place for 5 min to limit the diffusion of injected agent. Animals were sacrificed 45 min after IGF-1 injection and 1 h after CRF, dexamethasone and BDNF injection. Animals were killed 48 h after plasmid and siRNA transfection and they were killed at different time points after A β injection. Their brains were removed and cut by a brain slicer. Their CA1 tissue was further punched out by using a stainless punch with 2 mm inner diameter. Tissues were frozen at −80 °C until biochemical experimentation.

Water maze learning

The water maze used was a plastic, circular pool, 1.2 m in diameter and 25 cm in height that was filled with water (25±2 °C) to a depth of 16 cm. A circular platform of 8 cm in diameter was placed at a specific location away from the edge of the pool. The top of the platform was submerged 0.6 cm below the water surface. Water was made cloudy by adding milk powder. Distinctive, visual cues were set on the wall.

For spatial learning, animals were subjected to three trials a day with one given early in the morning, one given in the early afternoon and another one given in the late afternoon. The training procedure lasted for 5 days and a total of 15 trials were given. For these trials, animals were placed at different starting positions spaced equally around the perimeter of the pool in a random order. Animals were given 60 s to find the platform. If an animal could not find the platform, it was guided to the platform and was allowed to stay on the platform for 20 s. The time that each animal took to reach the platform was recorded as the escape latency. The total distance that animals traveled in the target region as well as their swim speed was also recorded. A probe trial of 60 s was given on day 6 to test their memory retention. Animals were placed in the pool with the platform been removed and the time they spent in each quadrant (target quadrant, left quadrant, opposite quadrant and right quadrant) was recorded.

Contextual fear conditioning learning

Fear conditioning learning was preformed 7–10 days after the probe trial test. One day before conditioning, mice were placed in the conditioning chamber (46 × 30 × 46 cm, L × W × H) for 5 min for adaptation. Twenty-four hours later, these animals were placed into the same chamber for fear conditioning training. After 3 min of free exploration, they were trained with 5 foot shocks (0.5 mA, 1 s) randomly during the following 90 s. At the end of the footshock, immediate freezing response was measured and calculated as the percentage of time that animals spent freezing during the 30 s period. Twenty-four hours later, these animals were placed into the same chamber (but no footshock was delivered) for the retention test. Freezing response was measured and calculated as the percentage of time that animals spent freezing during the 5-min recording period.

Imunohistochemija

For immunohistochemical staining of PIAS1 and HDAC1 in CA1 area of the rat brain, rats were anesthetized with pentobarbital (100 mg/kg, ip) and perfused with ice-cold phosphate-buffered saline followed by 4% paraformaldehyde. Brains were removed and post fixed in 30% sucrose/4% paraformaldehyde solution for 20–48 h. Brains were then frozen, cut into 30- μ m sections on a cryostat and mounted on gelatin-coated slides. Brain sections were rinsed with 1 × PBS for 10 min and antigen was retrieved with 0.1 M citric acid/0.1 M sodium citrate buffer at 95 °C for 45 min followed by 1 × PBS for 10 min for three times. The sections were pre-incubated in a blocking solution containing 3% normal goat serum, 3% BSA and 0.5% Triton X-100 in 1 × PBS for 1 h. For visualization of endogenous PIAS1 and HDAC1 in hippocampal CA1 neurons, brain sections were incubated with rabbit anti-PIAS1 antibody (1:200, Catalog No. 2474-1, Epitomics) and mouse anti-HDAC1 antibody (1:200, Catalog No. 5356, Cell Signaling) at 4 °C overnight. Brain sections were then washed with 1 × PBS for 10 min for three times and then incubated with goat anti-rabbit secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 (1:500, Catalog No. 111-545-003, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) and Dylight 549-conjugated goat anti-mouse antibody (1:500, Catalog No. 115-505-003, Jackson ImmunoResearch) for 1 h and then washed with 1 × PBS for 10 min for three times. For immunofluorescence detection of the nucleus, tissue sections were added with 20 μ l of the DAPI Fluoromount-G mounting medium (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA). Photomicrographs were taken using a Zeiss LSM700 Stage confocal microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

For immunofluorescence detection of amyloid plaque in the CA1 area, mice were anesthetized with pentobarbital (100 mg/kg, ip) followed by the same procedures described above. For visualization of endogenously expressed amyloid plaque in APP/PS1 mice, brain sections containing the CA1 region were incubated with mouse anti-human Aβ antibody (1:250, Catalog No. sc-58508, Santa Cruz Biotechnology) at 4 °C overnight. Brain sections were then washed with 1 × PBS for 10 min for three times and incubated with Dylight 549-conjugated goat anti-mouse antibody (1:500, Catalog No. 115-505-003, Jackson ImmunoResearch) or FITC-conjugated goat anti-mouse antibody (1:500, Catalog No. 115-095-062, Jackson ImmunoResearch) for 1 h and further washed with 1 × PBS for 10 min for three times. The ProteoStat Amyloid Plaque Detection Kit (Enzo Life Sciences) was then used to detect amyloid plaque formation. To verify that the endogenously expressed Aβ forms aggregates, brain sections containing the CA1 region were subjected to 0.01% thioflavin S staining (Sigma-Aldrich) for 15 min and washed with 1 × PBS for 10 min for three times. These sections were then mounted with 20 ml of the DAPI Fluoromount-G mounting medium (SouthernBiotech). Photomicrographs were taken using a Zeiss LSM700 Stage confocal microscope. The number of plaques showing thioflavin-S staining and ProteoStat dye were counted separately in an area of 1.28 mm 2 .

Kaspazės 3 aktyvumo tyrimas

Caspase 3 activity was performed according to the protocol of Caspase 3 assay kit from Abcam (Catalog No. ab39383). The hippocampal tissue was homogenized in cell lysis buffer to lyse for 10 min. Tissue lysate was mixed with reaction buffer containing DTT and the DEVD-AFC substrate at 37 °C for 2.5 h. The samples were read in a Gemini EM fluorescence microplate reader system (Device, Sunnyvale, CA, USA) using a filter with the excitation wavelength set at 400 nm and emission wavelength set at 505 nm.

TUNEL tyrimas

TUNEL assay was performed according to the protocol of ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Kit to detect the apoptotic cell (Catalog No. S7101, Millipore). As mentioned previously, brain sections were fixed in 4% paraformaldehyde and retrieved with 0.1 M citric acid/0.1 M sodium citrate buffer at 95 °C for 15 min followed by proteinase K (20 μg/ml) for 10 min at room temperature. Brain sections were permeabilized with pre-cooled ethanol/acetic acid (2:1) for 5 min at −20 °C, followed by reacting with 3% H 2 O 2 for 5 min at room temperature to quench the endogenous peroxidase. Brain sections were then incubated with the TdT enzyme for 1 h at 37 °C followed by incubation with anti-digoxigenin peroxidase conjugate for 30 min at room temperature. Apoptotic nuclei developed brown color with DAB peroxidase substrate. The slides were then counterstained with 0.5% (w:v) methyl green for visualization of both non-apoptotic and apoptotic cells. The number of apoptotic cells was counted separately by using a Leica DM IL LED light microscope in an area of 653 × 489 μ m 2 from a given hippocampal tissue section.

Statistinė analizė

Behavioral data were analyzed with one-way or two-way analysis of variance (ANOVA) with repeated measure followed by post-hoc Newman–Keuls multiple comparisons (represented by q- value). Biochemical data were analyzed with the Student's t -test or one-way ANOVA followed by Newman–Keuls comparisons. Electrophysiological data were analyzed with two-way ANOVA with repeated measure followed by Newman–Keuls comparisons. Values of P <0.05 were considered statistically significant (* P <0.05, ** P <0.01, # P <0.001).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomos figūros Legendos

  2. 2.

    Papildomi paveikslai 1

  3. 3.

    2 papildomi paveikslai

  4. 4.

    Papildomi 3 paveikslai

  5. 5.

    Supplementary Figures 4

  6. 6.

    Supplementary Figures 5

  7. 7

    Supplementary Figures 6

  8. 8.

    Supplementary Figures 7

  9. 9.

    Supplementary Figures 8

  10. 10.

    Supplementary Figures 9

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento ląstelių mirties ir diferenciacijos svetainėje (//www.nature.com/cdd)