Erk ir akt signalizacijos bendradarbiauja translyčiai reguliuodamos išgyvenamino raišką metastazavus gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžį | onkogenas

Erk ir akt signalizacijos bendradarbiauja translyčiai reguliuodamos išgyvenamino raišką metastazavus gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžį | onkogenas

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių signalizavimas
  • Kolorektalinis vėžys
  • Metastazės

Anotacija

Mitogeno suaktyvinta tarpląsteliniu signalu reguliuojama kinazė / tarpląstelinio signalo reguliuojama kinazė (MEK / ERK) ir fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) / AKT keliai dažnai tuo pačiu metu suaktyvinami atskirais genetiniais kolorektalinio vėžio (CRC) pokyčiais, kurie yra susiję su CRC eiga ir blogas išgyvenimas. Vis dėlto neaišku, kaip reikia suaktyvinti abu būdus, kad CRC vyktų metastazavusi progresija. Mūsų neseniai atliktas tyrimas parodė, kad tiek ERK, tiek AKT signalizacija yra būtina norint suaktyvinti nuo eukariotinio transliacijos inicijavimo faktoriaus 4E (eIF4E) inicijuotą nuo dangtelio priklausomą vertimą, naudojant konvergencinį reguliatorių, susijusį su 4E-rišančiojo baltymo baltymu 1 (4E-BP1), kad palaikytų CRC transformaciją. Čia mes nustatėme, kad kooperatyvo ERK ir AKT signalizacijos metu aktyvuoti nuo dangtelio priklausomą vertimą yra būtina CRC judrumo ir metastazių skatinimui. CRC ląstelėse, kuriose kartu vyksta mutacija, aktyvinanti ERK ir AKT kelius, vien tik MEK arba AKT slopinimas parodė ribotą aktyvumą, slopindamas ląstelių migraciją ir invaziją, tačiau kartu slopinimas turėjo stiprų poveikį. Genetinis vertimo inicijavimo komplekso blokavimas, vykstant eIF4E numušimui ar vyraujančio aktyvaus 4E-BP1 mutanto ekspresijai, efektyviai slopino CRC ląstelių migraciją, invaziją ir metastazes, tuo tarpu eIF4E ekspressija arba 4E-BP1 numušimas turėjo priešingą poveikį ir žymiai sumažino jų priklausomybę. dėl ERK ir AKT signalų apie ląstelių judrumą. Mechaniškai mes nustatėme, kad šis poveikis daugiausia priklausė nuo padidėjusio rapamicino komplekso 1 (mTORC1) tarpininkaujamo išgyvenamino vertimo žinduolių organizme per ERK ir AKT signalus. Nepaisant nedidelio išgyvenamino numalšinimo įtakos naviko augimui, translyčiai sureguliuoto išgyvenamino sumažėjimas smarkiai slopino CRC judrumą ir metastazes. Šie atradimai atskleidžia kritinį mechanizmą, kuriuo grindžiamas CRC metastazavusio progreso transliacinis reguliavimas, ir leidžia manyti, kad tikslingas vertimas, atsižvelgiant į nuo kapilito priklausomą vertimą, gali būti perspektyvi išplėstinio CRC gydymo strategija.

Įvadas

Kolorektalinis vėžys (CRC) yra antra pagrindinė su vėžiu susijusio mirštamumo priežastis JAV. 1 Nors išgyvenant ankstesnės ligos stadiją padaryta pažanga, pacientams, sergantiems sisteminėmis metastazėmis, pagerėjimas pastebėtas tik minimaliai. Pacientams, sergantiems pažengusiu metastazavusiu CRC, gydymo galimybės, įskaitant tradicinę citotoksinę chemoterapiją ir naujai paskirtą gydymą epidermio augimo faktoriaus receptorių ir kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus inhibitoriais, yra ribotos. 2 Todėl šiems pacientams reikia naujų gydymo strategijų.

Mutageninio signalizacijos suaktyvinimas yra dažnas įvykis sergantiems žmonių vėžiu, įskaitant CRC. Mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės tarpląstelinės signalizacijos kaskadą sudaro RAS, RAF, mitogeno aktyvuota tarpląstelinio signalo reguliuojama kinazė (MEK) ir tarpląstelinio signalo reguliuojama kinazė (ERK). KRAS ir BRAF mutacijos, dėl kurių padidėja MEK / ERK signalizacijos, įvyksta atitinkamai 45% ir 10% CRC. 3, 4 Be ERK kelio aktyvavimo, fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) / AKT signalizacijos kelio disreguliacija dėl suaktyvinančių PI3K, p110α ( PIK3CA ) katalizinio subvieneto mutacijų ir neveikiančių mutacijų ar sumažėjusios funkcijos. fosfatazės ir tenzino homologas ( PTEN ), įvyksta CRC dažniu. 4, 5 Be to, PIK3CA mutacija CRC paprastai egzistuoja kartu su KRAS ar BRAF mutacijomis. Manoma, kad nekontroliuojamas ERK ir AKT takų aktyvavimas naviko ląstelėse vaidina svarbų vaidmenį palaikant jų dauginimąsi, užkertant kelią apoptozei ir palaikant procesus, reikalingus transformuotiems ir metastazavusiems fenotipams. Keletas klinikinių ir ikiklinikinių CRC gydymo tyrimų buvo išbandyti keli mažų molekulių inhibitoriai, nukreipti į RAF / MEK / ERK ir PI3K / AKT komponentus, tačiau jie įrodė tik ribotą atskiro agento aktyvumą. 6, 7, 8, 9, 10

Mes ir kiti neseniai parodėme, kad storosios žarnos navikai, kartu suaktyvinantys MEK / ERK ir PI3K / AKT kelius atskiromis mutacijomis, visada yra atsparūs vien tik kelių būdų slopinimui, tačiau yra jautrūs abiejų kelių kartu slopinimui. 6, 8, 9 mes sužinojome, kad atsparumas bet kurio kelio slopinimui yra susijęs su pertekliniu suaktyvinimo nuo nuo dangtelio priklausančio vertimo, kurį sąlygoja konvergencinis fosforilinimas, ir vėlesnio ERK-4E jungiančio baltymo 1 (4E-BP1) funkcijos slopinimo. ir AKT keliai. 8 Mes parodėme, kad norint efektyviai slopinti 4E-BP1 fosforilinimą ir nuo dangtelio priklausomą transliaciją, būtinas bendras abiejų kelių slopinimas, taip slopindamas CRC navikogenezę in vivo .

Nuo dangtelio priklausomas vertimas yra procesas, kurio metu dauguma uždengtų mRNR virsta baltymais. Įrodyta, kad tam tikrų pagrindinių onkogeninių mRNR, turinčių labai struktūrizuotą 5′-netransliuojamą sritį (5′-UTR), vertimas labai priklauso nuo mRNR dangtelį rišančio baltymo eIF-4E, vertimo inicijavimo komplekso eukariotinį greitį ribojančio komponento. transliacijos iniciacijos faktorius 4E (eIF4F), kuris taip pat apima pastolių baltymą eIF4G ir RNR helikazę eIF4A. 11 Todėl šioms onkogeninėms mRNR daro lemiamą ir neproporcingą poveikį eIF4E prieinamumas ir yra jautrios eIF4E lygio pokyčiams. 12, 13, 14 Laisvojo eIF4E kiekį vėžinėse ląstelėse galima iš esmės padidinti įvairiais mechanizmais, įskaitant padidintą eIF4E ekspresiją, sumažintą eIF4E slopinamųjų baltymų, 4E-BP ekspresiją ir eIF4E išsiskyrimą iš 4E-BP, inaktyvinant fosforilinimą. iš 4E-BP. EIF4E reguliavimas, 4E-BP raiškos sumažėjimas ir 4E-BP hiperfosforilinimas, atsirandantis dėl onkogeninio signalizacijos kelių aktyvavimo, yra reikšmingai randamas CRC ir susijęs su CRC progresu. 15, 16, 17, 18 Šių tyrimų ir ankstesnių išvadų 8 suma leidžia manyti, kad nuo eIF4E priklausomas vertimas reiškia kritinį konvergencijos mazgą onkogeniniam ERK ir AKT signalizacijos kelių aktyvavimui ir netinkamai aukštą vertimo greitį. iniciacija gali būti mechaninis CRC metastazavimo progreso bruožas. Pateikiame įrodymų, kad ERK ir AKT signalizacijos poveikį metastazavusiai CRC progresui daug lemia jų suderintas suaktyvinimas, priklausantis nuo dangtelio priklausomo vertimo, selektyviai didinant išgyvenivino mRNR vertimą. Mūsų duomenys rodo, kad kontrolinė kontrolė yra kritinis CRC progresavimo iki metastazių etapas ir kad geriau suprantant ryšį tarp baltymų gamybos vėžio ląstelėse ir metastazių vystymosi, gali būti sukurtos naujos strategijos, kaip užkirsti kelią ir (arba) kontroliuoti pažengusį CRC.

Rezultatai

Norint palaikyti CRC ląstelių migraciją ir invaziją kartu suaktyvinant kelią, reikia ERK ir AKT signalų

Migracija ir invazija yra kritiniai pradinės vėžio progresavimo žingsniai, palengvinantys metastazes. Kartu RAS / RAF / MEK / ERK ir PI3K / AKT kelių aktyvinimas įvyksta didelėje dalyje žmogaus CRC. 4 Norėdami išsiaiškinti abiejų kelių koaktyvacijos vaidmenį CRC metastazėse, pirmiausia ištyrėme MEK inhibitoriaus PD0325901 (3 nuoroda 3) (toliau - PD901) ir AKT inhibitoriaus MK2206 (nuoroda 1919) poveikį atskirai ir CRC migracijos ir invazijos derinys, naudojant Boydeno kameros tyrimus. Anksčiau mes parodėme, kad tiek PD901, tiek MK2206 gali veiksmingai slopinti ERK ir AKT fosforilinimąsi ir atitinkamai signalizaciją paskesnėje vėžio srityje, įskaitant CRC audinių kultūroje ir in vivo . 8, 9, 20 CRC ląstelėse su kartu egzistuojančiomis KRAS ir PIK3CA mutacijomis (HCT116, DLD-1 ir HCT15), gydymas vien PD901 arba MK2206 6 valandas turėjo tik nedidelį poveikį ląstelių migracijai. Tačiau abiejų vaistų derinys buvo veiksmingas norint smarkiai slopinti jų migraciją (1a ir b pav.). Panašūs rezultatai buvo stebimi šių ląstelių, kurios įsiveržia per Matrigel praėjus 30 h po vaisto vartojimo, gebėjimui (1c pav.), Tuo tarpu ląstelių ciklo kinetika ar ląstelių gyvybingumas per tą patį laiko tarpą nebuvo paveikti. 8, 9 Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad ERK ir AKT signalizacijos keliai bendradarbiauja palaikant CRC ląstelių, kuriose aktyvuojami abu keliai, migraciją ir invaziją.

Image

Norint veiksmingai slopinti CRC ląstelių migraciją ir invaziją kartu su egzistuojančiomis KRAS ir PIK3CA mutacijomis, reikalingas kombinuotas MEK ir AKT slopinimas. ( a, b ) HCT116, DLD-1 ir HCT15 ląstelių transwellio migracijos analizė, naudojant 50 nM PD0325901 (PD901) ir 1 μM MK2206, atskirai arba kartu, arba dimetilsulfoksidą (DMSO) kaip kontrolę 6 valandas . Rezultatai rodo vidutinį perkeltų ląstelių skaičių viename lauke ± sem ( n = 3). Masto juosta = 500 μm. c ) HCT116 ir DLD-1 ląstelių transvero invazijos analizė, naudojant vaistus, nurodytus a, b punktuose, 30 valandų. Rezultatai rodo vidutinį įsibrovusių ląstelių skaičių viename lauke ± sem ( n = 3). * P <0, 02, kai derinami PD901 ir MK2206, palyginti su DMSO kontrole, PD901 arba MK2206.

Visas dydis

ERK ir AKT signalizacijos reguliuoja CRC ląstelių migraciją ir invaziją, nes jos konvergentiškai įjungia nuo dangtelio priklausomą vertimą

Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad CRC ląstelėse kartu su ERK ir AKT signalizacijos kelių aktyvacija abu keliai bendradarbiauja palaikydami naviko augimą konvergentiškai aktyvindami eIF4E inicijuotą nuo dangtelio priklausomą vertimą. 8 Norint nustatyti, ar transliacinis suaktyvinimas taip pat reikalingas CRC ląstelių migracijai ir invazijai, nuo dangtelio priklausomas transliacijos aktyvumas buvo modifikuotas perdėta eIF4E ir 4E-BP1 ekspresija ar numušimu. Boydeno kameros tyrimai parodė, kad per didelis eIF4E ekspresija arba 4E-BP1, kuris suaktyvina nuo dangtelio priklausomą vertimą, numušimas žymiai padidino migraciją ir invaziją HCT116 ląstelėse (2a ir b paveikslai). Panašūs rezultatai buvo gauti ir kitose trijose CRC ląstelių linijose (DLD-1, HT29 ir SW480), nurodžius 4E-BP1 ekspresiją (2c paveikslas). Stebėdami vienos ląstelės judėjimą gyvų ląstelių vaizdavimu, mes taip pat patvirtinome, kad 4E-BP1 numušimas žymiai padidino HCT116 ląstelių migraciją (papildomas paveikslas S1). Priešingai, nuo dangtelio priklausomo vertimo slopinimas numušant eIF4E arba 4E-BP1-4A mutanto, bet ne laukinio tipo (WT) 4E-BP1 ekspresija, turėjo priešingą efektą (2d – f pav.). Palyginti su 4E-BP1 WT, mes anksčiau parodėme, kad 4E-BP1-4A mutantas, kuriame keturios žinomos jo fosforilinimo vietos (T37, T46, S65 ir T70) buvo pakeistos alaninu, negali būti fosforilinamas ir jungiasi konstituciškai su eIF4E, tokiu būdu slopinant nuo dangtelio priklausomą vertimą. 8 Visi šie duomenys rodo, kad nuo dangtelio priklausomo vertimo aktyvavimas vaidina lemiamą vaidmenį stimuliuojant CRC ląstelių migraciją ir invaziją.

Image

Nuo dangtelio priklausomas vertimo aparatas tarpininkauja ERK ir AKT aktyvavimo padariniams CRC ląstelių migracijai ir invazijai. ( a - c ) Per didelis eIF4E ekspresija ( a ) arba nutildyta 4E-BP1 raiška ( b ir c ) skatino CRC ląstelių migraciją ir invaziją. Egzogeninė eIF4E ekspresija ( a, kairėje) ir 4E-BP1 numušimo efektyvumas naudojant shRNR ( b ir c, kairėje) nurodytose ląstelių linijose buvo patikrinti imunobloto analize. ( d ) HCT116 ląstelės, turinčios stabilią kontrolinės (ctrl) shRNR arba eIF4E shRNR išraišką, buvo imunoblotuojamos nurodytais antikūnais. ( e ir f ) slopinanti eIF4E išraišką ( e ) arba 4E-BP1 4A, bet ne 4E-BP1 WT ( f ) raišką, slopino HCT116 ląstelių invaziją. ( g ) 4E-BP1 ekspresijos slopinimas reikšmingai sumažino slopinamąjį poveikį ląstelių migracijai, kurį sukelia bendras MEK ir AKT slopinimas. HCT116 ląstelių migracijos analizė su stabilia kontrolinės shRNR arba 4E-BP1 shRNR išraiška buvo atlikta, naudojant 50 nM PD901 ir 1 μM MK2206, atskirai arba kartu su dimetilsulfoksidu (DMSO), kaip kontrolę, 6 valandas. Rezultatai išreiškiami kaip migracijos slopinimas, palyginti su DMSO apdorotomis kontrolinėmis medžiagomis. Grafikuose pateikti duomenys parodo vidurkį ± sem ( n = 3). * P <0, 02 eIF4E, palyginti su vektoriu; 4E-BP1 4A, palyginti su 4E-BP1 WT arba vektoriu; sh eIF4E arba sh 4E-BP1 palyginti su sh Ctrl; ir PD901 ir MK2206 derinys sh 4E-BP1 ląstelėse, palyginti su sh ctrl ląstelėmis.

Visas dydis

Norint patikrinti, ar nuo dangtelio priklausomas vertimo aparatas tarpininkauja ERK ir AKT aktyvacijos poveikiui CRC judrumui, MEK ir AKT slopinimo poveikis atskirai arba kartu buvo nustatytas HCT116 ląstelėse stabiliai numušiant 4E-BP1 arba išreiškiant trumpąją kontrolę. plaukų segtuko RNR (shRNR). Kaip parodyta 2g paveiksle, bendras ERK ir AKT kinazių slopinimas sukėlė 73% ląstelių migracijos slopinimą kontrolinėse ląstelėse, tačiau turėjo daug mažesnį poveikį (31%) ląstelėse, kuriose buvo slopinama 4E-BP1 ekspresija. Panašūs rezultatai buvo gauti ir atliekant ląstelių invazijos testus (duomenys neparodyti). Šie duomenys rodo, kad 4E-BP1 arba eIF4E inicijuotas vertimo procesas yra svarbus ERK ir AKT aktyvavimo pasroviui veiksnys, atsakingas už CRC ląstelių migraciją ir invaziją.

Survivino ekspresija yra selektyviai reguliuojama vertimo lygmeniu per ERK ir AKT signalus

Norėdami suprasti, kaip transliacinis aktyvavimas ERK ir AKT signalizacijos būdu veikia CRC progresavimą, mes nustatėme kelių pagrindinių baltymų, kurie, kaip žinoma, dalyvauja apoptozės, proliferacijos ir metastazių reguliavime, ekspresiją. Įspūdingai, mes nustatėme, kad antiapoptotinis ir su metastazėmis susijęs baltymas, išgyvenivinas, 21, 22, 23, 24, 25, buvo sureguliuotas derinant MEK ir AKT kinazių slopinimą, bet ne slopinant vien tik kinazes 12 val. Po vaisto pridėjimo, HCT116. ir T84 CRC ląstelės su kartu egzistuojančiomis KRAS ir PIK3CA mutacijomis (3a paveikslas ir papildomas S2 paveikslas). Priešingai, kitų antiapoptotinių baltymų, tokių kaip XIAP, c-IAP, Bcl-2 ir Bcl-xL, ekspresijai įtakos neturėjo net ir kombinuotas slopinimas. Mažesnis išgyvenamino ekspresijos reguliavimas nebuvo susijęs su transkripcijos lygio ar baltymų stabilumo pokyčiais, analizuojamais kiekybiniu realaus laiko atvirkštinės transkripcijos – PGR (RT – PGR) arba baltymų skilimo greičiu, atitinkamai naudojant cikloheksimido (CHX) chase testą (3b pav. –D). Pabrėžėme, kad nuo dangtelio priklausomo vertimo suaktyvinimas atliekant 4E-BP1 numušimą, naudojant mažą trukdančią RNR (siRNR) arba shRNR su skirtingais taikymo sekomis, padidino išgyvenivino baltymo ekspresiją, tačiau jo mRNR lygis nepakito 4E-BP1 knockdown ląstelėse, palyginti su kontroline. ląstelės (4a – c paveikslai). Priešingai, nuo dangtelio priklausomo vertimo slopinimas išreiškiant 4E-BP1-4A, bet ne 4E-BP1 WT, arba eIF4E numušimas sumažino išgyvenamino baltymą (4d ir e paveikslai). Naudodami nuo dangtelio priklausomą vertimo reporterio luciferazės (Luc) mRNR, sujungtą su išgyvenamino arba β-aktino 5′-UTR, kad įvertintumėte nuo dangtelio priklausomą transliacijos aktyvumą, mes taip pat nustatėme, kad vien tik MEK arba AKT kinazės slopinimas turėjo nedidelį slopinamąjį poveikį. (5–7%) dėl išgyvenamino – Luc transliacijos 5′ – UTR 12 valandų po vaisto ekspozicijos, tuo tarpu bendras slopinimas pastebimai slopino aktyvumą (25%), bet neturėjo jokio poveikio β-aktino-Luc 5′-UTR vertimo veikla (4f pav.). Svarbiausia, kad 4E-BP1 ekspresija buvo sustabdyta, todėl buvo išvengta išgyvenamino sumažėjimo, kurį sukėlė MEK ir AKT slopinimas (4g paveikslas). Priešingai, kombinuotas slopinimas veiksmingai slopino 4E-BP1 fosforilinimą ir sumažino išgyvenamino kontrolinėse ląstelėse sumažėjimą (4g paveikslas). Visi šie duomenys rodo, kad ERK ir AKT signalizacijos bendradarbiauja, norėdamos konkrečiai sureguliuoti ekspresiją per CRC ląstelių, priklausančių nuo dangtelio, vertimo mechanizmą kartu suaktyvindamos kelią.

Image

Kombinuotas MEK ir AKT slopinimas sumažina išgyvenivino ekspresiją baltymų lygiu, bet ne bendrą mRNR ar baltymo stabilumą. ( a ) HCT116 ląstelės 12 val. buvo gydomos 50 nM PD901 ir 1 μM MK2206, atskirai arba kartu, arba dimetilsulfoksidu (DMSO). Ląstelių lizatai buvo imunoblotuojami nurodytais antikūnais. ( b ) Kiekybinė išgyvenamino mRNR ekspresijos RT-PGR analizė, palyginti su β-aktinu, HCT116 ląstelėse, kurios 12 valandų buvo gydomos vaistais, kaip nurodyta a punkte ( n = 3). c ) HCT116 ląstelės buvo apdorotos 50 nM PD901 ir 1 μM MK2206 arba DMSO deriniu kaip kontrolė 30 minučių, po to nurodytu laiku pridedant 20 μg / ml CHX. Ląstelių lizatai buvo imunoblotuoti su survivino ir β-aktino antikūnais. ( d ) Imunoblotai, išgyvenami, kaip parodyta c punkte, buvo kiekybiškai įvertinti naudojant „FluorChem“ skaitmeninę vaizdo gavimo sistemą (Alpha Innotech, Santa Clara, CA, JAV). Likęs išgyvenamino lygis buvo gaunamas normalizuojant β-aktino lygį kiekvienu metu, o rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± sem ( n = 3). XIAP, su X susijęs apoptozės baltymo inhibitorius.

Visas dydis

Image

Surviviną translyčiai reguliuoja ERK ir AKT signalizacijos CRC ląstelėse kartu suaktyvindamos kelią. ( a ) HCT116 ląstelės buvo transfekuotos nurodytomis 4E-BP1 siRNR koncentracijomis arba kontrolinėmis (Ctrl) netikslinėmis siRNR 48 valandas. Ląstelių lizatai buvo imunoblotuojami nurodytais antikūnais. ( b ) Vien HCT116 ląstelių imunoblot analizė arba stabili kontrolinės shRNR arba 4E-BP1 shRNR ekspresija su skirtingais taikymo sekomis, naudojamomis a punkte. c ) Kiekybinė išgyvenamino mRNR ekspresijos RT-PGR analizė, palyginti su β-aktinu, HCT116 ląstelėse su stabilia kontrolinės shRNR arba 4E-BP1 shRNR išraiška ( n = 3). ( d ) HCT116 ląstelių imunoblot analizė su stabilia vektoriaus, HA-4E-BP1 WT arba HA-4E-BP1 4A, ekspresija. e ) vien HCT116 ląstelių imunoblot analizė arba stabili kontrolinės shRNR arba eIF4E shRNR išraiška. ( f ) HCT116 ląstelės buvo transfekuotos bicistroninės luciferazės reporteriu, kuris nustato „capilla“ priklausomą Renilla luciferazės geno, sujungto su survivino arba β-aktino 5'-UTR, ir nuo dangtelio nepriklausomą poliomielito vidinės ribosomos įvedimo vietą (IRES), vertimą. tarpininkaujant židinio liuciferazės genui. Transfekuotos ląstelės 12 val. Buvo apdorotos 50 nM PD0325901 ir 1 μM MK2206, atskirai arba kartu. Liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas dvigubos luciferazės tyrimu, o apskaičiuotas „ Renilla“ ir „Firefly“ liuciferazės liuminescencijos santykis, atsižvelgiant į nuo dangtelio priklausomą transliacinį aktyvumą. Rezultatai išreiškiami nuo nuo dangtelio priklausomo transliacijos slopinimu, palyginti su dimetilsulfoksidu (DMSO) apdorotomis kontrolėmis, ir pateikiami kaip vidurkis ± sem ( n = 3). * P <0, 01 PD901 ir MK2206 deriniui, palyginti su PD901 arba MK2206. g ) HCT116 ląstelių, turinčių stabilią kontrolinės shRNR arba 4E-BP1 shRNR ekspresiją, imunobloto analizė, kurios 12 h buvo apdorotos 50 nM PD901 ir 1 μM MK2206, atskirai arba kartu. HA, hemaglutininas; XIAP, su X susijęs apoptozės baltymo inhibitorius.

Visas dydis

Survivinas tarpininkauja dėl ERK ir AKT aktyvavimo poveikio CRC ląstelių migracijos ir invazijos transliaciniam reguliavimui

HCT116 ląstelėse, kuriose išgyvenamino baltymas buvo ekspresuotas per daug, buvo nustatyta išgyvenamino sumažėjusio reguliavimo reikšmė tarpininkaujant kombinuoto MEK ir AKT kelio slopinimo poveikiui (5a pav.). Šios ląstelės neparodė ląstelių proliferacijos pokyčių (papildomas S3a paveikslas), tačiau, palyginti su vektorių kontroliuojančiomis ląstelėmis, padidino ląstelių migraciją ir invaziją du ar tris kartus (5b ir c pav.). Be to, šiose ląstelėse bendro MEK ir AKT slopinimo poveikis ląstelių migracijos slopinimui buvo žymiai mažesnis, palyginti su kontrolinių ląstelių poveikiu (5d pav.). Be to, per didelis išgyvenivino ekspresija galėtų užkirsti kelią ląstelių invazijos, kurią sukelia nuo dangtelio priklausomas transliacijos inhibitorius 4E-BP1-4A, slopinimui (5e pav.). Atvirkščiai, nutildęs išgyvenivino ekspresiją 48 valandas po transferavimo siRNR, tai smarkiai slopino ląstelių invaziją tiek kontrolinėse, tiek 4E-BP1 numušimo ląstelėse, nors 4E-BP1 numušimas sukėlė išgyvenivino ekspresiją ir paskatino ląstelių invaziją (5f ir g pav.). Ląstelių invazijos slopinimas sumažėjus išgyvenamino ekspresijai nebuvo susijęs su poveikiu ląstelių gyvybingumui ir apoptozės indukcijai tuo pačiu laiko intervalu (5h ir i paveikslai bei papildoma S3b pav.). Išgyvenęs išgyvenamino ekspresiją dėl tet indukuotos shRNR, lėmė ląstelių augimą, tačiau nesukėlė apoptozės audinių kultūroje po 48 valandų doksiciklino ekspozicijos. Taigi, šie duomenys leidžia manyti, kad survivinas vaidina svarbų vaidmenį tarpininkaujant ERK ir AKT aktyvavimo poveikiui CRC ląstelių migracijos ir invazijos transliacijos kontrolei.

Image

Survivinas yra svarbus ERK ir AKT signalų skleidėjas, atsakingas už CRC ląstelių migracijos ir invazijos transliacijos kontrolę. a ) HCT116 ląstelių imunobloto analizė, stabiliai ekspresijuojanti vektorių arba su vėliava pažymėtu survivinu. ( b, c ) HCT116 ląstelių migracijos ( b ) arba invazijos ( c ) analizė stabilia vektoriaus ar survivino ekspresija. d ) HCT116 ląstelių, turinčių stabilią vektoriaus arba survivino ekspresiją, migracijos analizė, esant 50 nM PD901 ir 1 μM MK2206, atskirai arba kartu su dimetilsulfoksidu (DMSO), kaip kontrolė, 6 valandas. Rezultatai išreiškiami kaip migracijos slopinimas, palyginti su DMSO apdorotomis kontrolinėmis medžiagomis. ( e ) HCT116 ląstelių, turinčių stabilią vektoriaus 4E-BP1 4A arba 4E-BP1 4A, invazijos analizė, kartu išgyvenant išgyvenant per 30 h. ( f, g ) HCT116 ląstelės, turinčios stabilią kontrolinės (Ctrl) shRNR arba 4E-BP1 shRNR išraišką, 48 valandas buvo transfekuotos kontroline siRNR arba survivino siRNR, po to atlikta imunobloto analizė nurodytais antikūnais ( f ) ir invazijos analizė per 30 h. ( g ). ( h, i ) HCT116 ląstelės, turinčios stabilią tet indukuotos išgyvenamino shRNR ekspresiją, nurodytą laiką buvo gydomos 50 ng / ml doksiciklinu (dox) arba be jo, po to atlikta imunobloto analizė nurodytais antikūnais ( h ) ir ląstelių proliferacijos analizė ( i ). Grafikuose pateikti duomenys parodo vidurkį ± sem ( n = 3). * P <0, 01.

Visas dydis

mTORC1 daugiausia tarpininkauja dėl ERK ir AKT aktyvacijos transliacijos išgyvenamumo ir judrumo reguliavimui

Rapamicino (mTOR) kinazės taikinys žinduoliams sudaro du skirtingus kompleksus: rapamicino 1 komplekso (mTORC1) ir mTORC2 taikinius žinduoliams. Jie atlieka savo veiksmus reguliuodami kitas svarbias kinazes ir substratus, tokius kaip mTORC1 transliaciniai reguliatoriai p70S6 kinazė (S6K) ir 4E-BP1, o mTORC2 - AKT (ant S473). Įrodyta, kad AKT ir ERK reguliuoja mTORC1 aktyvumą fosforilindami TSC2. 27, 28 Taigi, mes ištyrėme, ar mTORC1 tarpininkauja AKT ir ERK aktyvacijos poveikiui CRC ląstelių judrumo transliacinei kontrolei. Remiantis ankstesniais atradimais, 8 AKT ar MEK slopinimas neturėjo jokios įtakos p70S6K ar 4E-BP1 fosforilinimo vietoms nė vienoje iš jo keturių fosforilinimo vietų HCT116 ir T84 ląstelėse su kartu egzistuojančiomis KRAS ir PIK3CA mutacijomis (6a paveikslas ir papildomas S2 paveikslas). . Tačiau bendras AKT ir MEK slopinimas smarkiai slopino visų šių vietų fosforilinimąsi, o tai rodo, kad AKT ir ERK bendradarbiauja norėdami reguliuoti mTORC1 aktyvumą. Rapamicinas yra selektyvus alosterinis mTORC1 inhibitorius, tačiau jis yra daug mažiau efektyvus nei AKT ir MEK slopinimas, slopindamas 4E-BP1 fosforilinimą ir ląstelių invaziją (papildomas S4 paveikslas). Įrodyta, kad mTOR kinazės inhibitoriai yra geresni mTORC1 inhibitoriai nei rapamicinas. 29, 30, kaip parodyta 6a ir b paveiksluose, mTOR kinazės inhibitorius AZD8055 (31 pav. 31) buvo toks pat efektyvus kaip ir bendras MEK ir AKT slopinimas slopindamas 4E-BP1 fosforilinimą, mažindamas išgyvenamino ekspresiją ir slopindamas ląstelių migraciją (duomenys nepateikti). ir invazija į HCT116 ląsteles. Tačiau AZD8055 taip pat slopino mTORC2, kaip rodo p-AKT praradimas S473 (6a pav.).

Image

ERK ir AKT aktyvavimo poveikį transkripciniam išgyvenamino ir ląstelių invazijos reguliavimui daugiausia lemia mTORC1. ( a, b ) imunobloto ( a ) ir invazijos ( b ) analizės HCT116 ląstelės, kurios buvo apdorotos 50 n M PD901, 1 μM MK2206 ir 500 n M AZD8055, atskirai arba kartu su 12 h ( a ) ir 30 h b ) atitinkamai. ( c, d ) Imunobloto ( c ) ir invazijos ( d ) analizė HCT116 ląstelėse su stabilia kontrolinės shRNR (Sh Ctrl) arba raptorio shRNR ekspresija, kurios buvo apdorotos 50 nM PD901 ir 1 μM MK2206, atskirai arba kartu Atitinkamai 12 h ( c ) ir 30 h ( d ). Grafikuose pateikti duomenys parodo vidurkį ± sem ( n = 3). * P <0, 02. NS, nereikšminga.

Visas dydis

Norint konkrečiai nustatyti mTORC1 vaidmenį, shRNR buvo naudojamos sunaikinti raptorį, privalomą mTORC1 komponentą. 32, 33 raptoriaus išeikvojimas HCT116 ląstelėse pastebimai slopino 4E-BP1 fosforilinimą ir išgyvenivino ekspresiją tokiu laipsniu, kuris prilygtų MEK ir AKT kombinuoto slopinimo poveikiui kontrolinėse ląstelėse (6c paveikslas). Be to, raptorio numušimas taip pat smarkiai slopino ląstelių invaziją, nors šis poveikis buvo žymiai mažesnis nei slopinant kontrolinėse ląstelėse tiek MEK, tiek AKT (6d pav.). Įdomu tai, kad raptorio numušimas suaktyvino AKT padidindamas p-AKT ant S473, tuo tarpu AKT slopinimas sukėlė gilesnį 4E-BP1 fosforilinimo ir ląstelių invazijos slopinimą raptoriaus numušimo ląstelėse (6c ir d pav.). Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad AKT ir ERK aktyvacijos poveikį transkripciniam išgyvenamino ekspresijos reguliavimui ir CRC ląstelių judrumui bent jau didžiąja dalimi įtakoja nuo mTORC1 priklausomas mechanizmas.

Tikslinis vertimas, priklausomas nuo dangtelio ar jo priklausomos išgyvenamosios ekspresijos, slopina CRC metastazes.

Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad didelę dalį ERK ir AKT aktyvavimo biologinio poveikio sukelia 4E-BP1 funkcijos slopinimas dėl jų konvergencinio 4E-BP1 fosforilinimo, o nefosforilintas mutantas 4E-BP1-4A daro panašų slopinantį dangtelį. -priklausomas vertimas ir naviko augimas kaip kombinuotas ERK ir AKT slopinimas CRC. 8 Mūsų dabartiniai duomenys taip pat rodo, kad 4E-BP1 ir jo translyčiai reguliuojamas baltymas, išgyvenivinas, integruoja ERK ir AKT kelių funkcijas CRC ląstelių migracijoje ir invazijoje. Taigi tikslinis 4E-BP1-4A slopinamas nuo dangtelio priklausomas vertimas arba nutildoma išgyvenivino ekspresija gali reikšmingai slopinti CRC metastazes. Norėdami ištirti šią galimybę, mes panaudojome eksperimentinius plaučių ir kepenų metastazių modelius in vivo . Liuciferaze ir žaliuoju fluorescenciniu baltymu (GFP) pažymėtos HCT116 ląstelės, turinčios stabilią 4E-BP1-4A ekspresiją ar išgyvenamino numušimą, naudojant tet indukuojamą shRNR, buvo švirkščiamos į veną arba intralplentiškai į atletines nuogas peles, o plaučių ar kepenų metastazių susidarymas buvo įvertintas bioliuminescencinių ir fluorescencinių vaizdų nustatymas ir histologinis tyrimas. Palyginti su WT 4E-BP1 ir vektoriaus kontrole, 4E-BP1-4A raiška smarkiai slopino pelių plaučių ir kepenų metastazes (7a ir 8a, b paveikslai) ir išgyvenivino ekspresiją metastazavusiose ląstelėse (papildomas S5 pav.). Panašūs rezultatai buvo stebimi nutildžius išgyvenamino ekspresiją pelėms, kurios buvo gydomos doksiciklinu geriamajame vandenyje, kad būtų indukuotos į išgyvenaminą nukreiptos shRNR (7c – e ir 8c – e paveikslai). Doksiciklinas veiksmingai slopino išgyvenivino ekspresiją, tačiau reikšmingai nesukėlė apoptozės, kaip parodyta galo deoksinukleotidiltransferazės tarpininkaujant slaptojo galo žymėjimui (TUNEL) ir suskaidžius poli (ADP-ribozės) polimerazės raišką, ir turėjo tik nedidelį poveikį naviko augimui (7d ir 7 pav. 8d paveikslai). Šie radiniai rodo, kad nuo ERK / AKT suaktyvinamas vertimas, priklausantis nuo dangtelio, ir jo transliacinis taikinys, išgyvenamumas vaidina lemiamą vaidmenį nustatant CRC metastazes in vivo .

Image

Genetinė nuo dangtelio priklausomo vertimo blokada arba nutildyta išgyvenivino ekspresija slopina CRC metastazes plaučiuose. ( a ) Bioliuminescencija, GFP vaizdai ir plaučių metastazių H&E dažymas pelėms, kurioms buvo nuogąsta nuogų ląstelių, kurioms į veną buvo švirkščiamos HCT116-Luc / GFP ląstelės, ekspresuojančios vektorių, 4E-BP1 WT arba 4E-BP1 4A, 8 savaitę po injekcijos. b ) Kiekybinė bioliuminescencijos analizė atliekant metastazes plaučiuose, kaip parodyta a punkte ( n = 6 pelės kiekvienoje grupėje). ( c ) Bioliuminescenciniai ir GFP vaizdai iš plaučių metastazių atletiškose nuogose pelėse, į veną suleistomis HCT116-Luc / GFP ląstelėmis, ekspresuojančiomis tet nesukeliančias išgyvenamosios shRNR, po to palaikomomis su doksiciklinu (Dox) ar be jo (0, 5 mg / ml) geriant vanduo 8 savaites. d ) Reprezentatyvios plaučių metastazių sekcijos, kaip parodyta c punkte, histologiškai įvertintos H&E, survivino, TUNEL ir 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolio (DAPI) atžvilgiu. e ) Kiekybinė bioliuminescencijos analizė atliekant metastazes plaučiuose, kaip parodyta c punkte ( n = 6 pelės kiekvienoje grupėje). f ) TUNEL dažymo įvertinimas, kaip parodyta d punkte. Rezultatai rodo vidutinį TUNEL teigiamų naviko ląstelių skaičių viename lauke ± sem ( n = 4). ( g ) Pelės ( n = 2), turinčios nusistovėjusius HCT116 ksenografus, išreiškiančius tet indukuojamą išgyvenimo shRNR, nurodytą laiką buvo gydomos Dox (0, 5 mg / ml) geriamajame vandenyje. Naviko lizatai buvo imituojami naudojant nurodytus antikūnus. ( h ) Pelės, turinčios nusistovėjusius HCT116 ksenografus, išreiškiančius tet indukuojamą išgyvenimo shRNR, buvo laikomos geriamajame vandenyje su Dox arba be jo (0, 5 mg / ml). Rezultatai rodo vidutinį naviko tūrį ± sem ( n = 6 pelės kiekvienoje grupėje). * P <0, 03, kai 4E-BP1 4A, palyginti su 4E-BP1 WT arba vektoriais, ir + Dox, palyginti su − Dox; # P <0, 05. NS, nereikšminga.

Visas dydis

Image

Tikslinis nuo dangtelio priklausomo vertimo slopinimas arba tylėjęs išgyvenamino ekspresija slopina CRC metastazes kepenyse. ( a ) Bioliuminescencija, GFP atvaizdai ir H&E dažymas kepenų metastazėms atletiškose nuogose pelėse, kurioms į intarpą buvo suleistos HCT116-Luc / GFP ląstelės, ekspresuojančios vektorių, 4E-BP1 WT arba 4E-BP1 4A, 3 savaitę po injekcijos. b ) Kiekybinė bioliuminescencijos analizė atliekant metastazes kepenyse, kaip parodyta a punkte ( n = 5 pelės kiekvienoje grupėje). c ) Bioliuminescenciniai ir GFP vaizdai iš kepenų metastazių atletiškose nuogose pelėse, kurioms į intarpą buvo sušvirkštos HCT116-Luc / GFP ląstelės, ekspresuojančios tet nesukeliančią išgyvenimo shRNR, po to palaikant jas su ar be doksiciklino (Dox) (0, 5 mg / ml) geriant vanduo 3 savaites. d ) Tipiški kepenų metastazių skyriai, kaip parodyta c punkte, kurie histologiškai įvertinti H&E, survivino, TUNEL ir 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolio (DAPI) atžvilgiu. e ) Kiekybinė bioliuminescencijos analizė atliekant metastazes kepenyse, kaip parodyta c punkte ( n = 5 pelės kiekvienoje grupėje). f ) TUNEL dažymo įvertinimas, kaip parodyta d punkte. Rezultatai rodo vidutinį TUNEL teigiamų naviko ląstelių skaičių viename lauke ± sem ( n = 4). * P <0, 03, kai 4E-BP1 4A, palyginti su 4E-BP1 WT arba vektoriais, ir + Dox, palyginti su − Dox. NS, nereikšminga.

Visas dydis

Diskusija

Neseniai atlikta išsami genominė analizė rodo, kad tuo pačiu RAS / ERK ir PI3K / AKT kelių aktyvinimas atskirais genetiniais pokyčiais yra dažnas CRC požymis, susijęs su prastais rezultatais ir metastazavusiu progresu. 4 Tačiau selektyvus abiejų CRC progresavimo ir metastazių aktyvavimo būdų pranašumas nežinomas. Be to, buvo tiriamas tiek ERK, tiek AKT signalizacijos kelių vaidmuo vėžiui išsivystyti, daugiausia dėmesio skiriant transkripcijos ir posttransliacijos mechanizmams, tuo tarpu vėžio vystymosi, ypač metastazių proceso, vystymosi kontrolė liko nepakankamai ištirta. Ankstesniame mūsų tyrime 8 nustatėme, kad norint palaikyti transformuotą CRC fenotipą konvergentiškai suaktyvinant vertimą nuo dangtelio, reikalingas ir ERK, ir AKT signalizacijos kelių mutacijos aktyvavimas. Mes nustatėme, kad vien tik abiejų būdų slopinimas turi nedidelį poveikį nuo dangtelio priklausomai transliacijai ir naviko augimui, tačiau bendras abiejų kelių slopinimas turi sinergetinį slopinamąjį poveikį. Šiame tyrime mes taip pat parodome, kad nuo dangtelio priklausomas vertimas taip pat turi lemiamą vaidmenį tarpininkaujant ERK ir AKT aktyvavimo CRC ląstelių migracijai ir invazijai in vitro bei metastazavimo sklaidai in vivo . Mūsų tyrimas rodo, kad nuo cap-cap-translacijos aktyvinimas yra esminis žingsnis CRC progresuojant iki metastazių. Genetinis eIF4E inicijuoto vertimo slopinimas labai blokuoja CRC migraciją, invaziją ir metastazes. Atvirkščiai, abejotinas vertimo suaktyvinimas eIF4E amplifikacija arba 4E-BP1 redukcija sukelia priešingą efektą ir giliai sumažina CRC ląstelių priklausomybę nuo ERK ir AKT signalų apie migraciją ir invaziją. Atsižvelgiant į tai, kad nuo viršutinio dangtelio priklausomo vertimo reguliavimo panaikinimas dėl per didelės eIF4E ekspresijos arba 4E-BP1 funkcijos praradimo dažnai įvyksta CRC 15, 16, 17, 18 ir buvo įrodyta, kad tai sukelia atsparumą onkogeninių signalų priešakyje slopinimui, 34, 35, 36 mūsų išvados rodo, kad tiesiogiai nukreipimas į ERK ir AKT signalų konvergenciją į transliacijos inicijavimą gali būti veiksminga alternatyva abiejų kinazės inhibitorių deriniui išplėstiniame ir skleistame CRC. Norint patvirtinti šią hipotezę, reikia atlikti papildomus klinikinius koreliacinius tyrimus ir laukti kliniškai efektyvių vertimo inicijavimo slopinimo.

Metastazė yra sudėtingas procesas, reikalaujantis suderinto daugelio baltymų, sukeliančių naviko invaziją, tarpininkavimo angiogenezėje, slopinančių apoptozinių reakcijų atsiradimą ir sukeliančio proliferaciją nesusijusiose mikroaplinkose, veiksmų. Skirtingai nuo klasikinių onkogenų ir naviką slopinančių genų, daugelis genų, skatinančių pirminį naviko progresavimą iki metastazių, mutacijos nekeičia, bet yra netinkamai išreikšti. Tyrimai daugiausia buvo skirti dereguliuotos genų ekspresijos identifikavimui transkripcijos, susijusios su metastazavimo procesu, lygiu. 37 Tačiau kiti tyrimai parodė, kad mRNR pokyčiai ne visada tiksliai koreliuoja su giminingų baltymų ekspresija. 38 mRNR transliacijos reguliavimas yra tiesioginė ir greita priemonė baltymų ekspresijai reguliuoti. 13 Gausus kiekis įrodymų rodo, kad eIF4E gausa neriboja bendro transliacijos greičio, tačiau yra ypač svarbi tam tikrų mRNR, turinčių labai struktūruotą 5′-UTR, transformacijai, pavyzdžiui, proto onkogenų ir kitų augimo faktorių, transliacijai. 12, 13, 14 Taigi, eIF4E funkcijos reguliavimas pasroviui teikiant signalus gali suteikti tiesioginį ekspresijos lygio valdymą nuorašui specifiniuose genuose ir pakeisti ląstelės fenotipą. Šiame darbe mes nustatėme, kad išgyvenaminas, turintis didesnį GC kiekį (74%) ir turintis stabilią antrinę struktūrą savo 5′-UTR, yra specialiai reguliuojamas ERK ir AKT signalizacijos per eIF4E priklausomą vertimo mechanizmą CRC ląstelėse, kuriose abu signalizacijos keliai yra suaktyvinami (4 paveikslas). Įrodyta, kad išgyvenivino ekspresijos reguliavimas yra susijęs su CRC metastazavimu. 25, 39 Biologinis išgyvenivino poveikis žinomas dėl apoptozinio slopinimo, mitozinių chromosomų sulyginimo ir neseniai apibūdintos funkcijos: ląstelių judrumo ir metastazių skatinimo. 21, 22, 23, 24 duomenys rodo, kad translyčiai sureguliuota išgyvenamino išraiška daugiausia susijusi su CRC ląstelių judrumo ir metastazių skatinimu, kaip pažymima šiais aspektais: (1) CRC ląstelėse labai sumažėjo migracija, invazija ir metastazės. pasišalino iš išgyvenivino tokiomis sąlygomis, kurios nepaveiktų apoptozės; (2) padidėjęs išgyvenimo padidėjęs judrumas, bet ne ląstelių augimas; ir (3) išgyvenamino ekspresijos sumažėjimas smarkiai slopino CRC metastazes, bet tik lėmė naviko augimą. Be to, per didelis išgyvenivino ekspresija žymiai išgelbėjo ląstelių judrumo slopinimą, kurį sukėlė bendras ERK ir AKT slopinimas arba kryptingas vertimo slopinimas. Visi šie duomenys patvirtina išvadą, kad nenutrūkstamas išgyvenamino vertimas ERK ir AKT signalais yra kritinis CRC progresas į metastazes. Mūsų rezultatai neatmeta galimybės, kad kiti bendri ERK ir AKT signalizacijos tikslai prisideda prie čia aprašytų padarinių. Tikėtina, kad sudėtinga, kaip translyčiai sureguliuotas išgyvenivinas sąveikauja su tais tikslais, kad būtų tarpininkaujama metastazavusiam CRC progresui, ir jį reikia ištirti toliau.

mTORC1 yra tiek AKT, tiek ERK signalizacijos 27, 28 pasroviui taikinys ir reguliuoja nuo dangtelio priklausomą vertimą fosforilinant 4E-BP1. 40 Taigi pagrįsta spėlioti, kad mTORC1 integruoja ERK ir AKT signalizacijos kelių poveikį CRC transliacijos kontrolei, kai abu keliai yra suaktyvinti. Mes parodome, kad norint kartu slopinti 4E-BP1 fosforilinimą, išgyvenivino ekspresiją ir ląstelių invaziją, reikalingas bendras AKT ir MEK slopinimas tokiu laipsniu, kuris yra beveik lygus mTOR slopinimo poveikiui su ATP vietos inhibitoriumi AZD8055. Mes nustatėme, kad mTORC1 slopinimas kartu su raptoriaus išeikvojimu didžiąja dalimi prisideda prie AZD8055 padarinių arba kombinuoto AKT ir MEK slopinimo, tuo tarpu mTORC2 slopinimas, sunaikinant rictorių, neturi įtakos 4E-BP1 fosforilinimui ir išgyvenivino ekspresijai (duomenys nepateikti). Be to, mes jau anksčiau parodėme, kad tikslingas mTORC1 slopinimas per raptorio numušimą turi ryškų slopinantį poveikį CRC metastazėms. Taigi, mūsų duomenys tvirtai rodo, kad mTORC1 veikia kaip pagrindinis AKT ir ERK aktyvacijos efektorius transkripciniam CRC invazijos ir metastazių reguliavimui. Šie duomenys patvirtina neseniai atlikto tyrimo duomenis, rodančius, kad mTORC1 vaidina kritinį vaidmenį atliekant prostatos vėžio progresavimo metastazavimo geno ekspresijos programos transliacinį reguliavimą. Taigi, nukreipimas į mTORC1 gali suteikti terapinės naudos blokuojant vėžio invaziją ir metastazes. Tačiau žinoma, kad mTORC1 slopinimas suaktyvina neigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmus, sukeliančius padidėjusį formavimąsi. MTORC2, kuris fosforilina ir aktyvuoja AKT, 33, 43, 44, o tai gali susilpninti jo terapinį poveikį. Mūsų išvados, kad bendras mTORC1 ir AKT aktyvumo slopinimas arba dvigubas mTORC1 ir mTORC2 taikymas su mTOR kinazės inhibitoriumi sukelia gilesnį 4E-BP1 fosforilinimo ir ląstelių migracijos bei invazijos slopinimą nei vien mTORC1 slopinimas HCT116 ląstelėse atitinka šią hipotezę. Kiti tyrimai taip pat palaiko šią mintį ir įrodo, kad mTOR kinazės inhibitoriai arba mTORC1 slopinimas kartu su dvigubais PI3K / mTOR arba AKT kinazės inhibitoriais rodo didesnį aktyvumą slopinant 4E-BP1 fosforilinimą ir nuo dangtelio priklausomą vertimą, 42, 45 ir padidinantį priešvėžinio gydymo efektyvumas. 42, 45, 46, 47

Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų tyrimas suteikia naujų įžvalgų apie translytinės kontrolės biologinę ir terapinę reikšmę CRC metastazavusiam progresui. Mūsų išvados rodo, kad nuo dangtelio priklausomas vertimas veikia kaip kritinis reguliavimo mazgas, integruojantis ERK ir AKT signalizacijos kelių onkogeninio aktyvavimo signalus, skatinančius ląstelių migraciją ir invaziją bei CRC metastazes. Mechaniškai mes nustatėme, kad survivinas yra pagrindinis abiejų kelių, per konvergencijos mTORC1 / 4E-BP1 / eIF4E ašį, taikinys, translyčiai kontroliuojamas, o nuolatinis išgyvenivino vertimas ERK ir AKT signalizacijos būdu yra esminis CRC progresui iki metastazių. Taigi, nukreipimas, priklausomas nuo nuo dangtelio priklausančio vertimo, kuris tuo pat metu galėtų blokuoti aukščiau esančius onkogeninius signalus ir jų pasroviui taikomus tikslus, turėtų potencialą kaip būsima terapinė strategija kovojant su metastazavusiu CRC progresu.

medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūra, plazmidės, siRNR ir shRNR

Žmogaus storosios žarnos vėžio ląstelių linijos buvo gautos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC, Manassas, VA, JAV) ir palaikomos tinkamoje terpėje su papildais, kaip siūlo ATCC. PD0325901, MK2206 ir AZD8055 buvo gauti iš Selleck (Hiustonas, TX, JAV). Žmogaus išgyvenivino ekspresijos plazmidė, pažymėta pCMV6, pažymėta „myc“, buvo įsigyta iš Origene (Rockville, MD, JAV). HCT116 cells were transfected with the pCMV6-survivin or pCMV6 empty vector and selected by G418 (500 μg/ml) to generate stable transfectants. HCT116 cells with stable expression of HA-tagged 4E-BP1 and 4E-BP1-4A were generated previously. 8 siRNA pool against human 4E-BP1 (L-003005), survivin (L-003459) or non-targeting control siRNA pool (D-001810-10) was from Dharmacon (Chicago, IL, USA). The human 4E-BP1, eIF4E and survivin shRNA expression plasmids were purchased from Open Biosystems (Lafayette, CO, USA). The human raptor and rictor shRNA expression plasmids were obtained from Addgene (Cambridge, MA, USA), and the specificity of the targeting sequences has been verified and described previously. 33 For establishing stable transfectants with knockdown of specific protein expression, cell lines were lentivirally infected with the indicated shRNA construct followed by selection with puromycin (2 μg/ml) for 1 week. For bioluminescent tracking, cell lines were retrovirally infected with a reporter construct encoding firefly luciferase and GFP. 48 GFP-positive cells were enriched by fluorescence-activated cell sorting.

Migracijos ir invazijos testai

Migration and invasion assays were performed in Boyden chambers with coated collagen or Matrigel, respectively, as instructed by the manufacturer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) and described previously. 41 Details are provided in the Supplementary Information.

Imunobloto analizė

Cells were lysed in NP-40 lysis buffer, and equal amounts of total protein were immunoblotted as described previously. 8 All antibodies used are provided in the Supplementary Information.

Kiekybinis RT – PGR

Total cellular RNA was isolated using the RNeasy plus mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Equal amounts of RNA were used as templates for all reactions. Double-stranded cDNA was generated by using the SuperScript III First Strand Synthesis System (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Real-time PCR reactions were carried out with specific probes for human survivin (Hs00153353_m1) and β-actin (no. 4352935E) using the StepOne Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

CHX chase assay

Cells were treated with CHX (20 μg/ml) and harvested at indicated time points. The cells were lysed in NP-40 lysis buffer and equal amounts of total protein were analyzed by immunoblot. To examine the effect of combination with PD0325901 and MK2206, one set of cells was pretreated with the combination of both drugs for 30 min before the addition of CHX.

Proliferacijos ir apoptozės tyrimai

The cell proliferation was analyzed by counting the number of viable cells in response to the treatment with the indicated drugs. The apoptosis assay was performed by flow cytometric analysis as described previously. 8 Details are provided in the Supplementary Information.

Quantification of cap-dependent translation

The 5′-UTR cDNAs of human survivin and β-actin were obtained by RT–PCR from a HCT116 cDNA library using the primers as described in Supplementary Table S1. These 5′-UTR cDNAs were each inserted immediately upstream from the translation start codon of the Renilla luciferase gene in the bicistronic luciferase reporter vector pcDNA3-rLuc-Polio IRES-fLuc, which directs cap-dependent translation of the Renilla luciferase gene and cap-independent Polio IRES-mediated translation of the firefly luciferase gene. 49 All sequences were verified by automated sequencing. Cells (80 000) were transfected with each the constructed bicistronic luciferase reporter plasmid (0.2 μg) in 12-well plates using X-tremeGENE Transfection Reagent (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). After 24 h transfection, cells were treated with kinase inhibitors for the indicated times, and cell lysates were assayed for Renilla luciferase and firefly luciferase activities as described. 8 Cap-dependent Renilla activity was normalized against cap-independent firefly activity as the internal control. The Renilla /firefly luciferase luminescence ratio was calculated for cap-dependent translational activity.

Tyrimai su gyvūnais

Male athymic nude mice (5–6 weeks old) were purchased from Taconic (Hudson, NY, USA) and maintained and treated under specific pathogen-free conditions. To established CRC xenografts, mice were subcutaneously injected with tumor cells (3 × 10 6 per mouse) in a 1:1 mixture of media and Matrigel. Before initiation of treatment, mice were randomized among control and treated groups ( n =6 per group). For induction of survivin shRNA expression, mice received doxycycline (0.5 mg/ml) in the drinking water. Tumor volume was measured and calculated as described previously. 8 For the experimental lung and liver metastasis assays, cells with coexpression of firefly luciferase and GFP were injected into the tail vein (1 × 10 6 per mouse) or spleen (5 × 10 6 per mouse) of athymic nude mice ( n =5 or 6 per group), respectively, as described. 50 To monitor metastasis, mice were imaged with luciferase signals using the IVIS Spectrum and results were analyzed by the Living Image 3.0 software (Caliper Life Science, Hopkinton, MA, USA). 50 The lung and liver metastatic lesions were further examined by GFP imaging in paraffin-embedded sections stained with hematoxylin and eosin (H&E). Immunohistochemical analysis of survivin expression was performed using the Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). For the TUNEL apoptosis assay, the In Situ Cell Death Detection Kit (Roche Applied Science) was used according to the manufacturer's instruction as we have reported previously. 51

Statistinė analizė

The experiments were repeated at least two times. Results are expressed as mean±sem, as indicated. An independent Student's t -test was performed to analyze the luciferase assay; a two-tailed Student's t -test was used to compare the intergroup. P <0, 05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Žodynas

4E-BP1

4E-binding protein 1

CRC

gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys

DMSO

dimetilsulfoksidas

eIF4E

eukaryotic translation initiation factor 4E

ERK

tarpląsteliniu signalu reguliuojama kinazė

MEK

mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase

mTOR

žinduolių rapamicino taikinys

mTORC1

rapamicino komplekso 1 žinduolių taikinys

PI3K

fosfatidilinozitolio 3-kinazė

PIK3CA

p110α catalytic subunit of PI3K

UTR

untranslated region.

Prie šio dokumento pridedama papildoma informacija „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)