Nuo ero1α priklausomas endoplazminis retikulumas - mitochondrijų kalcio srautas sukelia procaspazę suaktyvinantį 1 junginį (pac-1), sukeldamas stresą ir mitochondrijų permeabilizaciją | ląstelių mirtis ir liga

Nuo ero1α priklausomas endoplazminis retikulumas - mitochondrijų kalcio srautas sukelia procaspazę suaktyvinantį 1 junginį (pac-1), sukeldamas stresą ir mitochondrijų permeabilizaciją | ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Apoptozė
  • Vėžys
  • Prekyba membranomis
  • Streso signalizavimas

Anotacija

Prokaspazę aktyvinantis junginys-1 (PAC-1) yra pirmasis tiesioginis kaspazę aktyvinantis junginys. naudojant in vitro ląstelių be kaspazės aktyvavimo sistemą. Vėliau buvo įrodyta, kad šis junginys sukelia apoptozę daugelyje vėžio ląstelių, pasižyminčioje perspektyviu priešnavikiniu aktyvumu šunų limfomos modelyje. Neseniai mes pranešėme apie jo sugebėjimą sunaikinti atsparias vaistams, Bcl-2 / Bcl-xL ekstensyviai veikiančias ir Bax / Bak turinčias ląsteles, nepaisant esminio mitochondrijų citochromo c (cyt. C ) atpalaidavimo reikalavimo kaspazės aktyvavimui, nurodant, kad pagrindinis PAC-1 molekuliniai taikiniai vėžio ląstelėse dar nėra nustatyti. Čia mes nustatėme nuo Ero1 α priklausomo endoplazminio retikulumo (ER) kalcio nutekėjimą į mitochondrijas per mitochondrijomis susijusias ER membranas (MAM) ir ER luminalinę hiperoksidaciją kaip kritinius PAC-1 medijuojamų ląstelių mirties įvykius. Gydymas PAC-1 padidino Ero1 α reguliavimą keliose ląstelių linijose, o Ero1 α nutildymas reikšmingai slopino kalcio išsiskyrimą iš ER ir ląstelių žūtį. ER kalcio praradimas ir ER liumenų hiperoksidacija dėl Ero1 α kartu sukelia ER stresą. GRP78 reguliavimas ir X-box rišančio baltymo 1 (XBP1) mRNR suskaidymas keliose vėžio ląstelėse pasiūlė ER stresą kaip bendrą PAC-1 sukeltą įvykį. XBP1 mRNR splaisingas ir GRP78 padidėjęs reguliavimas patvirtino ER stresą net „Bax / Bak“ dvigubo išmušimo ir PAC-1 atsparių „Apaf-1“ nokautų ląstelėse, nurodant ER streso sąlygotos mitochondrijų apoptozės indukciją PAC-1. Be to, mes nustatėme tik BH3 baltymo p53 atnaujintą apoptozės moduliatorių (PUMA) kaip pagrindinį molekulinį ryšį, kuris orkestruoja per didelį ER stresą iki mitochondrijų tarpininkaujamos apoptozės, apimančios mitochondrijų reaktyviąsias deguonies rūšis, nepriklausomai nuo p53. PUMA tylėjimas vėžio ląstelėse veiksmingai sumažino cyt. c išsiskyrimas ir ląstelių mirtis dėl PAC-1.

Pagrindinis

Kaspazės, esančios kaip zimogenai ląstelės viduje, veikia kaip pagrindinės veikėjos inicijuojant ir vykdant apoptozę po jų aktyvavimo proteolizės būdu. Priešvėžinių vaistų sukelti mirties signalai perduodami iš mitochondrijų į tokias pasroviuose esančias kaspazes kaip kaspazės-3, -7 ir -6, ir manoma, kad ląstelės pasiduoda mirčiai dėl kelių substratų baltymų suskaidymo aktyvuotose šių vykdytojų kaspazių formose. 1, 2 Tačiau dalis vėžinių susirgimų neveikia priešvėžinių vaistų dėl sugedusios apoptozės. 3, 4 Apskritai, vaistams atsparios vėžio ląstelės turi apoptozės defektų prieš kaspazės aktyvaciją, mitochondrijų membranos permeabilizacijos lygyje. Taigi mažų molekulių junginių, galinčių tiesiogiai suaktyvinti procaspazę-3 pasroviui po mitochondrijų, nustatymas yra daug žadanti priemonė, skirta klinikiniam atsparumui vaistams nustatyti. 6, 7

Prokapazę suaktyvinantis 1-asis junginys (PAC-1) yra pirmasis mažas junginys, kuris in vitro konvertuoja procaspazę-3 į aktyviąją kaspazę-3, sudarydamas iš procaspazės-3 slopinamuosius cinko jonus ir taip sukeldamas veiksmingą ląstelių žūtį naviko ląstelėse. taip pat pelių ksenografų modeliai. 8, 9 Šis junginys neseniai sulaukė didesnio dėmesio dėl selektyvaus vėžio ląstelių aktyvumo ir perspektyvaus priešvėžinio aktyvumo šunų limfomos modelyje. 10 Naujausias mūsų pranešimas, kuriame mes panaudojome keletą eksperimentinių ląstelių modelio sistemų, norėdami apibrėžti tiesioginį kaspazės aktyvavimą, parodė, kad PAC-1 iš esmės reikalauja citochromo c (cit. C ) išsiskyrimo iš mitochondrijų ir Apaf-1, norint paskatinti kaspazės aktyvaciją. Be to, tyrimas nustatė galimą PAC-1 aktyvumą sukeliant cititą. c išsiskyrimas nuo Bax / Bak nepriklausomu būdu ir apeinant atsparumą vaistams, kuriuos sukelia Bcl-2 šeimos baltymai. In vivo priešnavikinis aktyvumas ir biologinio prieinamumo tyrimai suteikia PAC-1 kaip stiprų kandidatą priešvėžinį agentą; be to, ikiklinikiniai PAC-1 darinių tyrimai vykdomi kituose navikų modeliuose. Nepaisant jų žadamo priešvėžinio aktyvumo, ląstelių žūties mechanizmas ir svarbūs šių junginių taikiniai ląstelėse vėžio ląstelėse dar nėra nustatyti.

Šioje ataskaitoje mes apibrėžėme ląstelių mirties mechanizmą, kurį sukėlė PAC-1. Tyrimas rodo, kad PAC-1 sukeltas mitochondrijų permeabilizavimas vyksta per mitochondrijų kalcio perteklių ir mitochondrijų reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS), padedamas endoplazminio retikulumo (ER) oksidoreduktino-1 alfa (Ero1 α ) priklausomo kalcio išsiskyrimo iš ER. Mūsų tyrimas taip pat atskleidė nuo p53 nepriklausomo p53 apoptozės moduliatoriaus (PUMA) padidėjusį reguliavimą, kuris padeda mitochondrijų permeabilizacijai ir veikia kaip molekulinis ryšys tarp ER ir mitochondrijų ląstelių mirties metu.

Rezultatai

PAC-1 sukelia apoptozinę ląstelių mirtį, G1 sustojimą ir autofagiją keliose vėžio ląstelių linijose, net nesant kaspazės-3

Apoptozės ir ląstelių ciklo sustabdymo, sukelto PAC-1, tyrimui buvo naudojamos kelios vėžio ląstelių linijos. Chromatino kondensacijos ir propidium jodido (PI) dažymo duomenys (1a pav. Ir papildomas S1a paveikslas) rodo, kad SKOV3, U2OS ir ADR-RES ląstelės yra palyginti atsparios PAC-1, nei kitos naudojamos ląstelių rūšys. Remiantis mūsų ankstesne ataskaita, MCF7 ląstelės išliko jautrios PAC-1, palyginti su kitomis ląstelių rūšimis, nepaisant kaspazės-3 trūkumo. 11 MCF7 ląstelėse buvo pastebėtas reikšmingas aneksino V jungimasis ir kaspazės-3 pakartotinė ekspresija MCF7 ląstelėse sustiprino apoptozę (1b ir c pav.). Ląstelių ciklo analizė ankstyvuoju laiko momentu (12 val.) Rodo, kad gydymas PAC-1 sukėlė G1 sulaikymą prieš sukeldamas ląstelių mirtį (1d pav.). Dažniausias signalas, prisidedantis prie ląstelių ciklo sulaikymo ir ląstelių mirties, yra atsakas į DNR pažeidimą. 13 Todėl mes ištyrėme, ar PAC-1 sukelia DNR pažeidimą, naudodamas fosfo-H2AX kaip DNR pažeidimo rodiklį HeLa ląstelių linijoje (1e pav.). Gydymas PAC-1 nesugebėjo sukelti DNR pažeidimo reakcijos HeLa ląstelėse, o tai rodo, kad PAC-1 sukelia ląstelių mirtį ne tiesiogiai pažeisdamas DNR. Norėdami išanalizuoti, ar PAC-1 sukelia autofagiją, kitą ląstelių žūties formą, mes ištyrėme autofagijos žymeklį, susijusį su mikrotubuliais, susijusiais su 1A / 1B baltymo 3 lengvosios grandinės (LC3B) ekspresija tiek esant, tiek nesant kaspazės-3 dėl jo asociacijos su autofaginėmis pūslelėmis. Įdomu tai, kad gydant PAC-1, abiejose ląstelių linijose (1f pav.) Buvo pastebėtas LC3 agregacija. Be to, LC3-I ir LC3-II virsmas taip pat buvo pastebėtas Western blot tyrime (1g paveikslas). Laiko intervalas, naudojant MCF7 ląsteles, ekspresuojančias EGFP-LC3, parodė nuo laiko priklausomą LC3 agregaciją, susijusią su autofagosomų formavimu (Papildomas vaizdo įrašas S1). PAC-1 taip pat sukėlė autofagiją pelių embriono fibroblastų (MEF) Bax / Bak dvigubo išmušimo (DKO) ląstelėse (papildomas paveikslas S1b). Nors rezultatai patvirtino autofagijos buvimą PAC-1 apdorotose ląstelėse, neaišku, ar ląstelės naudoja šį „savęs virškinimą“ kaip išgyvenimo ar mirties priemonę. Tačiau autofagijos slopinimas negalėjo slopinti PAC-1 sukeltos ląstelių mirties, tačiau ją sustiprino (1h pav.), Parodydamas, kad PAC-1 sukelta autofagija yra prisitaikymas prie streso ir neprisideda prie ląstelių mirties.

Image
Image

PAC-1 sukelia G1 sulaikymą, ląstelių žūtį ir autofagiją, neatsižvelgiant į kaspazės-3 raišką ir be DNR pažeidimo požymių. ( a ) PAC-1 sukėlė chromatino kondensaciją keliose vėžio ląstelių linijose, tokiose kaip HCT116, SiHa, HeLa, SKOV3, ADR-RES, T47D, U2OS, T47D ir kaspazės-3 turinčiose MCF7 ląstelėse. Kondensuotų branduolių procentas pateikiamas grafiškai ( n = 3, vidurkis ± SD). ( b ) Western blot, parodantis stabiliai transfekuotos procaspazės-3 ekspresiją MCF7 ląstelėse, kuriose trūksta kaspazės-3. c ) FACS apoptozės MCF7 ir MCF7C3 analizė tirpinant aneksinu V po apdorojimo PAC-1 (75 μM , 24 val.). ( d ) PAC-1 (75 μM , 12 val.) sulaikė MCF7, MCF7C3, SiHa ir HeLa ląsteles ląstelių ciklo G1 fazėje prieš sukeldami apoptozę. ( e ) Imunofluorescencinis dažymas naudojant H2AX antikūną HeLa ląstelėse parodė, kad PAC-1 (100 μM , 24 val.) nesukėlė jokio DNR pažeidimo. Cisplatinos buvo naudojamos kaip teigiama kontrolė, kuri sukėlė DNR pažeidimą, akivaizdų padidėjusia raudona fluorescencija, pastebėta nei negydytų ląstelių. ( f ) LC3 aptikimas imunofluorescenciniu būdu leido manyti, kad PAC-1 sukėlė didžiulę autofaginę LC3 granuliaciją tiek MCF7, tiek MCF7C3 ląstelėse. ( g ) PAC-1 sukelta sustiprinta LC3-II baltymo ekspresija buvo nustatyta atliekant Western blot analizę tiek MCF7, tiek MCF7C3 ląstelėse. β- aktinas buvo naudojamas kaip apkrovos kontrolė. ( h ) Autofagijos inhibitoriaus 3-metiladenino (3-MA; 5 mM) pridėjimas kartu su PAC-1 negalėjo slopinti ląstelių mirties. Ląstelių mirtis buvo tiriama tiriant PI dažais, naudojant FACS, ir PI teigiamų ląstelių procentas grafiškai parodytas tiek MCF7, tiek MCF7C3 ląstelėms ( n = 3, vidurkis ± SD)

Visas dydis

UPR ir ER streso reguliuojamų baltymų, taip pat MEF Apaf-1 KO ir Bax / Bak DKO ląstelių linijų, indukcija

Chemoterapijos sukelta apoptozė yra organizuojama dėl daugelio proapopotinių ir antiapoptozinių išgyvenimo baltymų įsitraukimo. Tačiau pagrindinių baltymų Western blot analizė parodė, kad Bcl-2, Bak, Bax, XIAP, Hsp90, Hsp27 ir Hsp70 ekspresija PAC-1 apdorotose ląstelėse nesiskiria nuo neapdorotų ląstelių (2a pav.). Keista, bet tiek MCF7, tiek MCF7C3 ląstelėse buvo pastebėtas ER-chaperonų GRP78 ir 94 padidėjęs reguliavimas, rodantis išsiskleidusio baltymo atsako (UPR), atsirandančio reaguojant į ER stresą, indukciją. Norint toliau apibūdinti ER stresą, įvairūs ER streso reguliatoriai, tokie kaip p-eIF2 α , CHOP, inozitolis, kuriam reikalinga α kinazė (IRE1 α ), Ero1 α ir kalneksinas, buvo analizuojami atliekant Western blot analizę (2b paveikslas). Gydymas PAC-1 paskatino CHOP, p-eIF2 α , IRE1 α ir Ero1 α reguliavimą , palaikydamas jo gebėjimą sukelti ER stresą nepriklausomai nuo kaspazės-3. Gydant PAC-1, GRP78 buvo sureguliuotas keliose vėžio ląstelių linijose (2c paveikslas), įskaitant PAC-1 atsparias ląsteles, tokias kaip SKOV3 ir U2OS. GRP78 reguliavimas taip pat buvo pastebėtas Bak / Bax DKO ląstelėse ir Apaf-1-nokauto (KO) ląstelėse (2e ir f paveikslai). Kaupdamas klaidingai sulankstytus baltymus ER, BiP / GRP78 išsiskiria ir leidžia oligomerizuoti IRE1 α ir į baltymų kinazes panašų ER kinazę (PERK), suaktyvindami abu. Suaktyvinta IRE1 α turi vidinį endoribonukleazės aktyvumą, kuris tarpininkauja netradiciškai sujungiant X dėžutę rišančio 1 baltymo (XBP1) mRNR. 15 Po gydymo PAC-1 visose ląstelėse buvo pastebėtas XBP1 mRNR susipynimas, įskaitant ląsteles, turinčias Apaf-1- ir Bax / Bak trūkumų (2d – f pav.). „Apaf-1“ trūkumas užkirto kelią PAC-1 tarpininkaujamų ląstelių mirčiai, bet ne XBP1 suskaidymui, pagrindžiant „Apaf-1“ reikalavimą dėl ER sukeliamos stresinės mediacijos apoptozės.

Image

PAC-1 sukelia UPR ir ER stresą daugelio tipų ląstelėse, įskaitant apoptozės pažeistas ląstelių linijas. ( a ) Western blot rodo, kad PAC-1 reikšmingai nepakeitė XIAP, Bak, Bak, Bcl-2, Hsp27, Hsp70 ir Hsp90 baltymų ekspresijos, tačiau tai galėjo sukelti reikšmingą ER streso žymens GRP78 ir GRP94 baltymų padidėjimą abiejuose MCF7 ir MCF7C3 ląstelės. β- aktinas buvo naudojamas kaip apkrovos kontrolė. ( b ) PAC-1 sukėlė kelių UPR indikatorių baltymų, tokių kaip CHOP, IRE1 α , Ero1 α ir p-eIF2 α , ekspresiją tiek MCF7, tiek MCF7C3 ląstelėse. β- aktinas buvo naudojamas kaip apkrovos kontrolė. ( c ) gydymas PAC-1 atnaujino ER streso žymens baltymą GRP78 keliose vėžio ląstelių linijose, tokiose kaip MCF7, HCT116, U2OS, SKOV3, SiHa ir HeLa. β- aktinas buvo naudojamas kaip apkrovos kontrolė. ( d ) XBP1 mRNR suskaidymas buvo pastebėtas RT-PGR būdu keliose vėžio ląstelėse, tokiose kaip MCF7, HCT116, SiHa ir Hela, po gydymo PAC-1. Thapsigargin buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. ( e ) Ląstelių mirtis buvo analizuojama tiriant prisijungimą prie aneksino V ir dažant PI MEF WT ir Bax / Bak DKO ląstelėse, naudojant FACS. PI ir aneksino teigiamų ląstelių procentas yra nurodytas Q2 kvadrante, vaizduojančiame apoptozines ląsteles. Western blot ir RT-PGR rezultatai rodo, kad PAC-1 sukėlė GRP78 padidėjusį reguliavimą, taip pat XBP1 mRNR splaisą tiek MEF WT, tiek DKO ląstelėse. β- aktinas buvo naudojamas kaip apkrovos kontrolė. ( f ) Ląstelių žūtis buvo tiriama tirpalu PI dažant MEF WT ir MEF Apaf-1 KO ląstelėse, naudojant FACS po apdorojimo PAC-1 (50 μM ). Apaf-1 KO ląstelėse mirė nereikšmingai nei jos WT kolegos. PI teigiamų ląstelių procentas yra parodytas P2 vartuose. Be to, Western blot ir RT-PCR rezultatai rodo, kad PAC-1 sukėlė XBP1 mRNR splaisą ir efektyviai padidino GRP78 reguliavimą WT, taip pat Apaf-1 KO ląstelėse, nors ląstelių mirties nebuvo Apaf-1 KO ląstelėse

Visas dydis

GRP78 slopinimas sustiprina, o gydymas cikloheksimidu sumažina PAC-1 sąlygojamų ląstelių žūtį

Tinkamam besiformuojančių baltymų sulankstymui, brendimui ir stabilizavimui ER padeda ir juos kontroliuoja keli nuolatiniai chaperonai, tokie kaip GRP78 ir GRP94. UPR metu šie chaperonai yra sureguliuojami kaip išgyvenimo mechanizmas, siekiant atkurti ląsteles nuo ER streso. Anksčiau buvo pranešta, kad nutildžius GRP78, ląstelės tampa jautrios ER sukeltam apoptozės poveikiui. 16, 17 Todėl ląstelių žūtis buvo analizuota GRP78 nutildytose MCF7 ir HeLa ląstelėse, dažant PI, naudojant srauto citometriją (3a ir b paveikslai). Kaip parodyta, PAC-1 sukėlė daugiau ląstelių žūties GRP78 nutildytose ląstelėse. Baltymų transliacijos slopinimas naudojant cikloheksimidą (2 μg / ml) gali palengvinti ER streso poveikį sumažindamas baltymų krūvį ER ir sumažindamas ER streso sukeltą apoptozę. Todėl MCF7 ir HeLa ląstelės, ekspresuojančios kaspazės skaidomą specifinį fluorescencinio rezonanso energijos perdavimo (FRET) zondą, CFP-DEVD-YFP, buvo gydomos PAC-1, esant arba neturint cikloheksimido. Kaip parodyta 3c paveiksle, gydymas cikloheksimidu sumažino ląstelių skaičių su aktyvacija kaspaze, palyginti su gydymu vien PAC-1. Be to, mes įvertinome ląstelių žūtį PAC-1 jautriose HCT116 ir MCF7 ląstelėse tiek su cikloheksimidu, tiek be jo, atlikdami PI dažymo ir klonogeniškumo testą (3d ir e paveikslai), kurie dar kartą pagrindė ląstelių mirties sumažėjimą prieš tai gydant cikloheksimidu. Aukščiau aprašyti rezultatai rodo, kad PAC-1 sukelia ER streso sukeltą apoptozę, kurią gali sumažinti ER streso inhibitoriai.

Image

GRP78 slopinimas sustiprina, tuo tarpu transliacinis inhibitorius cikloheksimidas sumažina ląstelių žūtį, kurią sukelia PAC-1. ( a ir b ) MCF7 ir HeLa ląstelės buvo transfekuotos siGRP78. GRP78 nutildymas buvo patvirtintas blotu. Ląstelių mirtis buvo analizuojama tirpalo dažymu PI, naudojant FACS, nutildžius GRP78. PI teigiamų ląstelių palyginimas ir procentas pateikiami grafiškai ( n = 3, vidurkis ± SD). c ) ER stresas buvo slopinamas naudojant cikloheksimidą (CHX; 2 μg / ml) kartu su PAC-1, o kaspazės aktyvumas buvo vertinamas naudojant FACS, naudojant kaspazės-3 ir -7 specifinį FRET zondą, CFP-DEVD-YFP, stabiliai transfekuoti HeLa ir MCF7 ląstelėse. DEVD sekos sunaikinimas aktyvuotomis kaspazėmis sukels FRET praradimą, kuris atsispindi kaip CFP / YFP santykio padidėjimas. Kaip parodyta vartuose (FRET prarasta populiacija), cikloheksimidas sumažino ląstelių procentą, kai FRET netenka, ir tai rodo, kad ER streso slopinimas sumažina PAC-1 sukeltą kaspazės aktyvaciją. ( d ) Ląstelių žūtis buvo analizuojama tirpalo dažymu PI, naudojant FACS MCF7 ir HCT116, po gydymo PAC-1, esant arba neturint cikloheksimido. PI teigiamų ląstelių procentas nurodytas atitinkamose histogramose, leidžiančiose manyti, kad cikloheksimidas slopino PAC-1 sukeltą ląstelių mirtį. e ) Ląstelių išgyvenimas buvo tiriamas atliekant klonogeniškumo testą PAC-1 apdorotose MCF7 ir HCT116 ląstelėse, su cikloheksimidu ir be jo. Kaip pažymėta paveikslėliuose, transliacinis inhibitorius cikloheksimidas išgelbėjo ląsteles nuo PAC-1 sukeltos ląstelių mirties, kai jos buvo naudojamos kartu su PAC-1. Išmatuotas tirpintos dėmės absorbcija, o santykinis klonogeniškumo procentas pateiktas grafike ( n = 3, vidurkis ± SD)

Visas dydis

Antiapoptoziniai Bcl-2 šeimos baltymai daro antiapoptozinį poveikį slopindami citito išsiskyrimą. c iš mitochondrijų, neatsižvelgiant į jos erdvinę lokalizaciją ER ar mitochondrijose. 18 Anksčiau pranešėme, kad PAC-1 gali apeiti atsparumą vaistams nuo Bcl-2 ir Bcl-xL. 11 Tačiau keli tyrimai rodo, kad su ER susijęs Bcl-2 baltymas gali slopinti apoptozę, kurią sukelia būtent ER stresą sukeliantys agentai, tokie kaip thapsigarginas ir tunicamicinas. 19, 20 Todėl mes sukūrėme MCF7C3 ląsteles, stabiliai transfekuotas Bcl-2Cb5-EGFP plazmidėmis (papildomas S2a paveikslas). Įvertinus ląstelių mirtį kondensavus branduolį, paaiškėjo, kad į ER nukreiptas Bcl-2 reikšmingai slopina branduolio kondensaciją apdorojant PAC-1 (papildomas paveikslas S2b). Tai taip pat atidėjo cyt. c atpalaidavimas ir kaspazės aktyvavimas (papildomi S2c – e paveikslai). Šie rezultatai rodo, kad su ER susijęs Bcl-2 gali sukelti atsparumą PAC-1 tarpininkaujamai apoptozei, vykstančiai per mitochondrijas, kaip teigiama mūsų ankstesniame pranešime. 21

PUMA sukelta mitochondrijų permeabilizacija susieja ER stresą ir mitochondrijų mirties signalus

Naviko slopintuvas p53 vaidina svarbų vaidmenį koordinuojant įvairius ląstelių procesus, tokius kaip ląstelių ciklas, apoptozė ir ER sukelta streso sukelta apoptozė, indukuojant proapoptotinius Bcl-2 šeimos baltymus PUMA ir NOXA. 15, 22 Norėdami išsiaiškinti p53 svarbą PAC-1 sukeltai ląstelių žūtimi, po PAC-1 gydymo buvo įvertinta p53 būklė keliose vėžio ląstelių linijose, kurios įrodė jo gebėjimą iš naujo reguliuoti p53 (4a pav.). Tačiau PAC-1 sukėlė ląstelių mirtį net p53 KO HCT116 ląstelėse, nors tai buvo iš dalies slopinama nei jo laukinio tipo (WT) atitikmenyje, kaip buvo padaryta atlikus branduolinio kondensacijos ir klonogeniškumo tyrimus (4b ir c pav.), Reiškiančius nuo p53 nepriklausomą mirtį. signalizacijos. Mitochondrijų permeabilizaciją ląstelių žūties metu pirmiausia reguliuoja evoliucija išsaugoti Bcl-2 šeimos baltymai. Tik BH3 Bcl-2 šeimos baltymų pogrupio baltymai, tokie kaip PUMA, Bim ir Bik, yra pagrindiniai veiksniai, perduodantys mirties signalus iš ER į mitochondrijas ER streso metu. 23, 24 Todėl šių baltymų kiekis buvo įvertintas keliose vėžio ląstelių linijose, tokiose kaip MCF7, SiHa ir HCT116, po gydymo PAC-1 (4d pav.). Nors po gydymo PAC-1 Bim ir Bik lygiai kinta priklausomai nuo ląstelių, nustatyta, kad PUMA buvo nuosekliai reguliuojamas visose ląstelių linijose. Yra žinoma, kad PUMA genotoksinio streso metu aktyvuoja p53. 25 PUMA taip pat suaktyvina kiti transkripcijos veiksniai, kad būtų inicijuotos nuo p53 nepriklausomos apoptozinės reakcijos į negenotoksinius dirgiklius, įskaitant augimo faktoriaus / citokinų trūkumą, ER stresą ir išemiją / reperfuziją. 25

Image

Nuo P53 nepriklausomas PUMA reguliavimas PAC-1 skatina mitochondrijų sukeltą apoptozę. ( a ) Western blot analizė parodė, kad p53 buvo sureguliuotas keliose vėžio ląstelėse, gydant PAC-1. ( b ) PAC-1 sukėlė reikšmingą branduolio kondensaciją HCT116 ir p53 KO HCT116 ląstelėse, kaip matyti reprezentatyviuose mikroskopiniuose vaizduose ir diagramoje ( n = 3, vidurkis ± SD). „Western blot“ nustatė p53 nokauto būseną HCT116. ( c ) Klonogeninių ląstelių išgyvenimo tyrimas atskleidė, kad PAC-1 veiksmingai naikino HCT116 p53 KO ląsteles, nors šiek tiek mažiau nei jos WT atitikmuo. Pateikti tipiniai vaizdai ir diagrama ( n = 3, vidurkis ± SD). ( d ) PAC-1 sukėlė PUMA reguliavimą keliose vėžio ląstelių linijose. Kaip matyti dėmėse, PUMA yra sureguliuojamas net nesant p53 (HCT116 p53 KO). Bimas ir Bikas taip pat buvo sureguliuoti SiHa ląstelėse, bet ne MCF7 ir HCT116 ląstelėse, o tai rodo atsako reakciją į ląstelių specifiškumą. e ) Reprezentatyvus vesternų blotumas, rodantis PUMA nutylėjimą MCF7 cyt. c- EGFP ląstelės. ( f ) Ląstelių mirtis buvo analizuojama tirpalo PI dažymu, naudojant FACS MCF7 cyt. c- EGFP ląstelės, taip pat PUMA nutildytas MCF7 cyt. c- EGFP ląstelės. Kaip pastebėta, PUMA nutildymas reikšmingai slopino PAC-1 sukeltą ląstelių mirtį. Nurodomi PI teigiamų ląstelių procentai. ( g ) PUMA slopinimas slopina cyt. c išsiskyrimas iš mitochondrijų ir branduolinis kondensatas MCF7 cyt. c- EGFP ląstelės, apdorotos PAC-1. Parodomi tipiški fluorescenciniai mikroskopiniai vaizdai (mastelio juosta: 50 μm ). Difuzinis EGFP modelis ląstelėse rodo citito išsiskyrimą. c iš mitochondrijų

Visas dydis

Kadangi PAC-1 užmušė p53 KO ląsteles, nepaisant jo sugebėjimo sustiprinti p53 reikšmę keliose vėžio ląstelių linijose, mes ištyrėme p53 vaidmenį PUMA atnaujinime. Keista, bet PUMA buvo labai sureguliuotas net nesant p53 (4d paveikslas), rodantis apie PAC-1 sukeltą nuo P53 nepriklausomą PUMA reguliavimą įvairiose vėžio ląstelių linijose, kuris, atrodo, yra bendras molekulinis ryšys tarp ER streso ir mitochondrijų apoptotijos. kelias. Norėdami dar kartą patvirtinti esminį PUMA vaidmenį tarpininkaujant mitochondrijų permeabilizacijai ir citoms. c atpalaiduoja, MCF7 ląstelės stabiliai ekspresuoja cyt. c- EGFP buvo transfekuotos arba shRNR prieš PUMA, arba kontroliniu vektoriu, po to apdorojant PAC-1. PUMA slopinimas citote. c -EGFP ekspresuojančios ląstelės sumažino abu cyt. c PAC-1 sukeltas išsiskyrimas ir ląstelių žūtis (4e – g paveikslai ir papildomas S3 pav.), patvirtinantys esminį PUMA vaidmenį tarpininkaujant ER nuo streso priklausomoms ląstelėms, kurias sukelia PAC-1.

Ero1 α tarpininkaujamas kalcio srautas iš ER į mitochondrijas per MAM

Iki šiol aprašyti rezultatai rodo ER streso ir nuo PUMA priklausomos mitochondrijų permeabilizacijos įtaką PAC-1 sukeltai ląstelių mirčiai. ER yra ne tik pagrindinė baltymų sulankstymo, brendimo ir stabilizavimo vieta, ji taip pat vaidina lemiamą vaidmenį kalcio homeostazėje. 26, 27 Todėl norint išskaidyti Ca 2+ vaidmenį PAC-1 sukeltoje ER įtampoje, HeLa ląstelės buvo stabiliai transfekuotos kalcio jutikliu D1ER kamelonu, kad aptiktų ER kalcio išsiskyrimą. 28 PAC-1 sukėlė reikšmingą ECFP / EYFP santykio pokytį, parodant PAC-1 kalcio išsiskyrimą iš ER (5a pav.). Buvo pranešta apie Bik ir Bim vaidmenį atliekant ER kalcio išsiskyrimą iš įvairių ER sukeltų streso sukeltų ląstelių mirties formų. 29, 30 Tačiau BIK ir Bim indukcija nebuvo reikšminga ir nuosekli PAC-1 apdorotose ląstelėse, atmetant jų vaidmenį tarpininkaujant ER kalcio išsiskyrimui. Naujausi tyrimai parodė CHOP ir Ero1 α vaidmenį reguliuojant ER kalcį. 31, 32 Kadangi šie du baltymai buvo labai sureguliuoti PAC-1 apdorotose ląstelėse, kaip aprašyta anksčiau, siekiant patvirtinti jų vaidmenį ER kalcio išsiskyrime, tiek Ero1a, tiek CHOP buvo nutildyti HeLa D1ER ląstelėse (5b – d pav.). Dėl Ero1 α nutildymo sumažėjo ER kalcio išsiskyrimas, kurį atspindi mažesnis FRET santykio pokytis (5c paveikslas) kartu su sumažėjusia ląstelių žūtimi (5d paveikslas), pastebėtais Ero1 α turinčiose ląstelėse, nei CHOP nutildytose ląstelėse.

Image

Ero1 α tarpininkauja kalcio srautui iš ER į mitochondrijas per MAM. a ) HeLa ląstelės, stabiliai ekspresuojančios ER nukreiptą ratiometrinį FRET zondą (D1ER chameleonas), buvo naudojamos stebint ER kalcio išsiskyrimą. CFP / YFP santykis buvo išmatuotas iš vaizdų ir parodytas grafiškai ( n = 3). Parodyti ląstelių santykio vaizdai prieš gydymą PAC-1 ir 2 valandas po gydymo PAC-1 kartu su santykio skale. ( b ) HeLa D1ER ląstelės buvo transfekuotos skramtoma siRNR arba siRNR prieš žmogaus Ero1α arba CHOP, kaip aprašyta. Ląstelės buvo apdorotos PAC-1 24 valandas, o ląstelių ekstraktas buvo naudojamas Western blot tyrimui, naudojant Ero1 α arba CHOP antikūnus. β- aktinas tarnavo kaip įkrovos kontrolė. ( c ) HeLa D1ER ląstelės praėjus 24 valandoms po transfekavimo siEro1 α arba siCHOP, buvo apdorotos PAC-1 ir pavaizduotos kalcio išsiskyrimui, kaip aprašyta. Vidutinis CFP / YFP santykis buvo išmatuotas iš vaizdų ir pavaizduotas grafiškai ( n = 3). ( d ) Ląstelės, transfekuotos siSC (subraižytos) arba siEro1 α arba siCHOP, buvo valomos PAC-1 24 valandas. Ląstelių žūtis buvo įvertinta, nudažius ląsteles, naudojant Hoechst, siekiant vizualizuoti chromatino kondensaciją. ( e ) HeLa, U2OS, SW480, p53 išmuštos HCT116 ląstelės ir MEF Bax / Bak DKO ląstelės nurodytais laikotarpiais buvo gydomos PAC-1. Visas ląstelių ekstraktas buvo paruoštas ir panaudotas Western blot analizei naudojant antikūnus prieš Ero1 α . Taip pat parodyta BEF indukcija, kurią demonstruoja MEF Bax / Bak DKO ląstelės. β- aktinas tarnavo kaip įkrovos kontrolė. ( f ) HeLa ląstelės, ekspresuojančios EGFP, nukreiptas į ER ir DsRed, nukreiptas į mitochondrijas, buvo gydomos PAC-1 12 valandų. Parodyti reprezentatyvūs gydytų ir neapdorotų ląstelių mitochondrijų ir ER vaizdai

Visas dydis

Pirmiau pateikti tyrimai rodo, kad Ero1 α yra kritinis ER kalcio išsiskyrimo ir vėlesnių ląstelių mirties PAC-1 komponentas. Padidėjęs ląstelių mirties slopinimas, nustatytas Ero1 α turinčiose ląstelėse, nei CHOP nutildytose ląstelėse, rodo, kad PAC-1 apdorotose ląstelėse yra Ero1 α priklausomas dominuojančios ląstelės mirties signalas. Todėl pagrindinis Ero1 α vaidmuo PAC-1 sukeltoje ląstelių žūtyje buvo toliau analizuojamas vėžio ląstelių linijų grupėje. Kaip parodyta 5e paveiksle, ankstyva Ero1 α indukcija buvo akivaizdi visose ląstelėse, net p53 KO HCT116 ląstelėse ir Bax / Bak DKO MEF ląstelėse. Ero1 α yra pagrindinis ER – mitochondrijų membranos komponentas, svarbus ER – mitochondrijų kalcio signalizavimui. 33, 34, 35 Ero1 α reguliavimas gali leisti susidaryti su mitochondrijomis susietai ER membranai (MAM), dėl kurios gali atsirasti mitochondrijų kalcis, lemiantis mitochondrijų permeabilizaciją. Norėdami vizualizuoti PAM-1 formavimąsi MAM, sukūrėme ląsteles, ekspresuojančias EGFP, nukreiptas į ER ir DsRed fluorescencinius baltymus, nukreiptus į mitochondrijas. Tiek didelės skiriamosios gebos mikroskopiniai vaizdai, tiek konfokaliniai vaizdai atskleidė ER ir mitochondrijų struktūrinius pokyčius su kartais artimais asociacijos taškais PAC-1 apdorotose ląstelėse, palyginti su negydytomis ląstelėmis (5f paveikslas ir papildomas S4 paveikslas). Kaip matyti iš mikroskopinių vaizdų, PAC-1 apdorotos ląstelės parodė daugiau rutulinių ER, palyginti su neapdorotų ląstelių tinklo struktūromis, parodydamos, kad gilūs morfologiniai pokyčiai gali padėti MAM susidaryti PAC-1 apdorotose ląstelėse. Apskritai, aukščiau aprašyti rezultatai tvirtai rodo, kad PAC-1 sukeltas Ero1 α reguliavimas kulminacija yra ER kalcio nutekėjimas būtent į mitochondrijas per MAM įsitraukimą.

ER hiperoksidacija lemia mitochondrijų kalcio įsisavinimą ir mitochondrijų ROS susidarymą

Nuo MAM priklausomas kalcio išsiskyrimas iš ER pirmiausia leidžia selektyviai absorbuoti kalcį mitochondrijose. Todėl, naudodamiesi mitochondrijų kalcio indikatoriaus dažais Rhod-2, mitozondrinio kalcio pasisavinimą tiek HeLa, tiek MEF Bax / Bak DKO ląstelėse mes analizavome srauto citometrija, kuris parodė PAC-1 stimuliuojamą padidėjusį mitochondrijų kalcio įsisavinimą (6a pav.). Atsižvelgiant į tai, išankstinis ląstelių gydymas mitochondrijų kalcio pasisavinimo inhibitoriumi Ru360 arba BAPTA-AM užkerta kelią PAC-1 sukeltai ląstelių žūčiai ir HeLa, ir MEF Bax / Bak DKO ląstelėse (6b paveikslas). Galimas mitochondrijų kalcio perkrovos priklausomas mitochondrijų permeabilizacijos mechanizmas yra mitochondrijų ROS susidarymas. Norint ištirti PAC-1 mitochondrijų ROS generaciją, HeLa ląstelės buvo stabiliai ekspresuojamos redoksui jautriu žaliu fluorescenciniu baltymu (GFP), nukreiptu į mitochondrijas, roGFP-Mito. 36 Žadinimo santykio pokytis esant 405 ir 488 nm bangos ilgiui atspindi oksiduotą arba redukuotą zondo būklę mitochondrijose. Vaizdo santykio tyrimas mikroskopu parodė 405/488 nm santykio padidėjimą daugiau nei 32% ląstelių po 12 h apdorojimo PAC-1, nurodant zondo oksidaciją (6c paveikslas). Kaip parodyta papildomame S5 paveiksle, 46% ląstelių padidėjo 405/488 nm santykis po apdorojimo PAC-1, pagrindžiant roGFP-Mito oksidaciją kaip akivaizdžią iš srauto citometrijos. DTT visiškai sumažino mitochondrijų zondą, sumažindamas 405/488 nm santykį, palyginti su negydytomis ląstelėmis, ir tai rodo jutiklio funkcionalumą. Kadangi Ero1 α gali oksiduoti ER liumeną, kurio kulminacija yra ER kalcio išsiskyrimas, mes įtarėme, kad PAC-1 gali hiperoksiduoti ER liumeną, kuris inicijuoja ER kalcio išsiskyrimą. Norėdami gauti įrodymų apie hiperoksidacinį PAC-1 ER oksidaciją, HeLa ląstelės buvo transfekuotos redoksui jautriu GFP, nukreiptu į ER, roGFP2-iL-KDEL, kaip aprašyta neseniai. 37 Santykio vaizdavimas ir srauto citometrijos analizė parodė roGFP oksidaciją, nukreiptą į ER, parodant, kad ER luminalinę oksidaciją iš tikrųjų sukelia PAC-1, galbūt per Ero1 α (6d pav. Ir 5 papildomas paveikslas).

Image

ER hiperoksidacija, mitochondrijų kalcio įsisavinimas ir mitochondrijų ROS susidarymas prisideda prie ląstelių mirties PAC-1. ( a ) HeLa ir MEF DKO ląstelės 24 valandas buvo veikiamos 50 arba 100 μM PAC-1. Ląstelės buvo nudažytos mitochondrijų kalcio indikatoriumi Rhod-2, kaip aprašyta. RAC-2 fluorescencija, analizuota FACS, parodyta kaip histogramos. ( b ) HeLa ir MEF DKO ląstelės buvo iš anksto apdorotos 0, 05% DMSO arba mitochondrijų kalcio pasisavinimo inhibitoriumi, Ru360 (25 μM ) arba ląstelėms pralaidžiu kalcio chelatoriumi, BAPTA-AM (50 μM ), po to atlikus PAC-1 gydymą 24 h. Ląstelių mirtis buvo kiekybiškai įvertinta chromatino kondensacijos tyrimu, kaip aprašyta ( n = 3, vidurkis ± SD). ( c ) HeLa ląstelės, stabiliai ekspresuojančios į mitochondrijas nukreiptą roGFP, buvo sukurtos taip, kaip aprašyta. Mikroskopinis zondo mitochondrijų lokalizacijos vaizdas parodytas padidinant x 100. Išmetimas esant 535/30 nm bangos ilgiui buvo surinktas esant dvigubam sužadinimui 405/20 X ir 490/20 X, naudojant x 60 objektyvą tiek neapdorotoms, tiek neapdorotoms (PAC-1 12 h) stabilioms ląstelėms. Vaizdų santykis buvo generuojamas padalijant 405 nm kanalą iš 490 nm kanalo į pikselius. Taip pat parodyta santykio skalė. ( d ) HeLa ląstelės, stabiliai ekspresuojančios į ER nukreiptą roGFP, roGFP2-iL-KDEL, buvo sukurtos taip, kaip aprašyta. Į ER nukreipto zondo mikroskopinis vaizdas rodomas padidinant x 100. Santykio vaizdas buvo atliktas kaip ir anksčiau, naudojant × 100 objektyvų. Vaizdų santykis buvo generuojamas padalijant 405 nm kanalą iš 490 nm kanalo į pikselius. Taip pat parodyta santykio skalė

Visas dydis

Diskusija

Junginiai, galintys apeiti anti-apoptotinę Bcl-2 / Bcl-xL funkciją ir sukelti mitochondrijų cititą. c išsiskyrimas nepriklausomai nuo Bax / Bak gali būti terapinis tikslas nuo vaistų atsparioms vėžims. 3 Taikant šį požiūrį, tiesioginis vykdytojų kaspazių aktyvinimas išlieka kaip perspektyvi strategija, nes aktyvuotos kaspazės gali greitai sunaikinti ląsteles, nepriklausomai nuo garsių anti-apoptotinių baltymų ekspresijos. 6, 7. Pirmasis identifikuotas tiesioginis procaspazės-3 aktyvatorius (PAC-1), nors ir nesugebėjęs tiesiogiai suaktyvinti kaspazių ląstelėse, parodė sugebėjimą sunaikinti vaistams atsparias Bax / Bak deficito ląsteles, taip pat Bcl-2, per daug ekspresuojančias vėžines ląsteles. kaip buvo atspindėta mūsų ankstesnėje ataskaitoje. 8, 11 Be to, perspektyvus biologinis prieinamumas ir in vivo priešnavikinis aktyvumas nustato PAC-1 kaip galimą priešvėžinį vaistą. 10 Šiame tyrime mes pranešame, kad PAC-1 sukelia ER streso signalizaciją po Ero1 α priklausomos ER luminalinės hiperoksidacijos, sukeliančios kalcio nutekėjimą, tuo pat metu sukeldamos autofagiją ir mitochondrijų sukeltą apoptozę. Neseniai atlikta ribota mikrotraumos analizė taip pat suponavo galimą ER streso signalizavimą PAC-1 sukeltų ląstelių žūtimi. 38

The accumulation of unfolded proteins in ER represents a cellular stress induced by multiple stimuli as well as pathological conditions, which triggers evolutionarily conserved adaptive response termed UPR and leads to cell death if it is severe or protracted. 15 PAC-1 induced UPR in multiple cancer cell lines irrespective of caspase-3 status as indicated by early upregulation of ER-chaperons such as GRP78 and GRP94. When unfolded proteins accumulate in the ER, ER transmembrane sensors detect them to initiate three distinct UPR branches mediated by protein molecules such as PERK, IRE1 α and transcription factor ATF6 to deal with accumulated unfolded proteins. 15 Phosphorylation of eIF2 α and upregulation of CHOP was noticed in both MCF7 and MCF7C3 cells upon PAC-1 treatment, suggestive of the activation of PERK and ATF4/ATF6 branches of UPR signaling. IRE1 α is the most fundamental of ER stress sensors, which is conserved in all eukaryotic cells and activation of which elicits endoribonuclease activity that specifically cleaves mRNA encoding transcriptional factor XBP1. 15, 22 Consistent with this, unconventional splicing of XBP1 was observed in several cancer cell lines upon PAC-1 treatment. Moreover, PAC-1 induced GRP78 upregulation and XBP1 splicing in Bax/Bak DKO and Apaf-1 KO cells. Interestingly, the absence of Apaf-1 inhibited PAC-1-mediated cell death but not UPR response, proving that PAC-1-mediated ER stress induction precedes the initiation of mitochondrial death signaling. Translational inhibitor cycloheximide and overexpression of ER-targeted Bcl-2 significantly reduced caspase activation and consequent cell death, indicating that PAC-1-induced ER stress transduces death signal from the ER to mitochondria that causes cyt. c release and subsequent caspase activation. Although PAC-1 induced autophagy, inhibition of autophagy enhanced cell death, suggesting it as an initial survival signaling in PAC-1-treated cells. UPR is tailored essentially to re-establish ER homeostasis also through adaptive mechanisms involving stimulation of autophagy. 39, 40

The physical contact point between ER and mitochondria, which acts as a signaling hub, called MAM, is enriched with several proteins that allow integration of signaling between these two organelles. Ero1 α induction by PAC-1 may allow formation of microdomains of calcium channels, leading to selective uptake of calcium into mitochondria through mitochondrial Ca 2+ uniporter (MUC). This chronic leakage of calcium to mitochondria culminates in mitochondrial calcium overload as well as ER luminal calcium deficiency. Previous studies have shown that ER stress contributes to CHOP-dependent induction of Ero1 α . 31 We have observed prolonged induction of Ero1 α by PAC-1 in multiple cell types including p53 KO cells. We also observed CHOP induction in treated cells; however, silencing of Ero1 α was more effective in reducing cell death and ER calcium release, pointing that induction of Ero1 α by PAC-1 contributes to ER stress. Prolonged induction of Ero1 α is able to oxidize ER lumen that may in turn enhance IP3-induced calcium release by disrupting the interaction between ERp44 and IP3R1. 41 Consistent with this, a recent study revealed that overexpression of hyper-active, mutant Ero1 α leads to hyper-oxidation of ER oxidoreductase ERp57, leading to UPR without the induction of antioxidant response. 42 Our study also identified PUMA as a p53-independent regulator of mitochondrial permeabilization subsequent to Ero1 α -mediated ER calcium release. BH3-only proteins such as Bim, Bik, Bid and PUMA have pivotal role in controlling apoptosis at the mitochondrial level by neutralizing anti-apoptotic Bcl-2 family proteins and activating pro-apoptotic Bax/Bak proteins. 43 Overexpression of transcriptional activator CHOP during ER stress leads to p53-independent upregulation of PUMA. 44 Therefore, it is likely that upregulation of both Ero1 α at ER and PUMA at the mitochondria contributes to calcium leakage through MAM and both act as regulators of calcium leakage from ER to mitochondria. In accordance with this, we have noticed significant colocalization of Ero-1 α and PUMA in PAC-1-treated cells (data not shown). Supporting the essential role of PUMA, silencing of PUMA reduced cyt. c release as well as apoptosis induced by PAC-1 in MCF7 cells. The ability of PAC-1 to induce MAM-dependent ER calcium leakage into the mitochondria, generating a calcium and ROS overload at the mitochondria, could drive PUMA-dependant mitochondrial permeabilization independent of Bax/Bak. In agreement with this model, mitochondrial calcium uptake inhibitor significantly reduced cell death in Bax/Bak DKO cells.

Even though experiments described here identified Ero1 α as the key player of PAC-1-induced ER stress and subsequent cell death, further studies are required to understand how PAC-1 targets Ero1 α . One of the potential functional targets identified for PAC-1 is its ability to chelate zinc, a metal necessary for the stability of diverse enzymes in ER lumen such as protein disulfide isomerase (PDI). 45 Ero1 α oxidizes active-site cysteines of PDI, an enzyme critical for adding disulfide bonds into newly synthesized proteins. Because of its ability to maintain increased oxidizing equivalents, Ero1 α activity must be regulated to prevent excessive build up of ROS as well as hyper-oxidizing conditions in ER. Chelation of zinc by PAC-1 appears to affect the activity of Ero1 α -PDI axis, leading to hyper-oxidation of ER, calcium release and build up of misfolded proteins at the ER. Ero1 α , being an integral partner of MAM may further allow immediate calcium uptake by mitochondria leading to mitochondrial permeabilization. Overall, the results described revealed critical signaling involving Ero1 α -dependent ER luminal hyper-oxidation and ER calcium leakage into the mitochondria through engagement of MAM, in PAC-1-induced cell death. Further studies may reveal whether Ero1 α -dependent ER luminal hyper-oxidation and mitochondrial calcium overload can be utilized as a possible target against cancer drug-resistance.

Medžiagos ir metodai

Cell lines and maintenance

MCF7, HeLa, SiHa, HCT116, SKOV3, U2OS, ADR-RES, T47D, MDAMB231, SW480 and HEK293 cells were maintained in DMEM containing 10% FBS in a humidified CO 2 chamber at 37 °C. SV40-immoratalized MEF WT and its variants were maintained in DMEM containing 10% FBS and antibiotics.

Chemikalai ir reagentai

PAC-1 was purchased from Calbiochem (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). The other drugs such as MG132, thapsigargin, cisplatin, 3-methyladenine and cycloheximide were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). The antibodies against GRP78 (E-4), GRP94 (H-212), Bak (G-23), Hsp90 (H-114), p53 (FL-393) were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antibodies against caspase-3, cleaved caspase-3, caspase-7 caspase-2, CHOP (L63F7), LC3B, XIAP, GFP, Bcl-2, p-eIF2 α (Ser51), eIF2 α , IRE1 α (14C10), Ero1-L α and PUMA were obtained from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Calnexin, Cyt. c 6H2.B4 and H2AX antibodies were purchased from BD Pharmingen (San Diego, CA, USA).

Expression vectors and generation of stable cell lines

pcDNA3 caspase-3 was transfected in MCF7 using lipofectamine-LTX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and maintained in 800 μ g/ml of G418 (Invitrogen). Single clones were selected for getting cell population with homogenous expression of caspase-3. Expression vectors for calcium sensor ratiometric FRET probe D1ER cameleon and Bcl-2 targeted at ER with cytochrome b5-targeting sequence (pcDNA3 Bcl-2Cb5-EGFP) were transfected into respective cells using lipofectamine. Cells expressing fluorophore were sorted out using FACS Aria II (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Cells expressing EGFP-LC3, cyt. c -EGFP and caspase-specific FRET probe CFP-DEVD-YFP were generated as reported previously. 11, 46 PUMA shRNA vector (NM_014417, Sigma-Aldrich) was transfected by means of lipofectamine-LTX and stable clones were selected by maintaining in 3 μ g/ml of puromycin (Invitrogen). HeLa cells were stably transfected with expression vector for redox sensitive GFP targeted at mitochondria (roGFP-Mito) as described. 36

Transfection of siRNA

HeLa and MCF7 cells were transfected with GRP78 siRNA, Ero1 α siRNA, CHOP siRNA or scrambled siRNA (Santa Cruz Biotechnology) according to manufacturer's protocol with recommended transfection reagent. The cells were replenished with fresh complete medium (DMEM containing 20% FBS) after 8 h.

Cell death and functional assays

Western blot, clonogenicity assay and flow cytometry analyses for annexin binding, cell cycle status and caspase activation in FRET probe-expressing cells were carried out as explained previously. 11, 47, 48 For analysis of oxidation status of redox sensitive GFP, HeLa cells stably expressing the probe were treated with PAC-1 at 50 μ M. After 12 h, cells were trypsinized and analyzed by FACS at 405 and 488 nm laser lines, using 535/40 emission filter in ratio mode. DTT was used as a reducing agent to validate the functionality of the probe as described. 36

Analysis of XBP1 mRNA splicing by RT-PCR

RNA was isolated from cells using Trizol (Invitrogen) and 2 μ g each of RNA was used for cDNA synthesis using MMLV-reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA). Expression analysis of XBP1 mRNA splicing was performed after normalizing with endogenous control, β -actin. The amplicons were resolved using 3% agarose gel. Primer sequences are mentioned in Supplementary Information.

Analysis of ER Ca 2+ release by fluorescent microscopic time-lapse imaging

Time-lapse imaging was carried out in a live-cell incubation chamber (Tokai Hit, Fujinomiya-shi Shizuoka-ken, Japan) that maintains optimum CO 2, temperature and humidity, using motorized inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse TE2000-E (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA) equipped with a CARV II Confocal-imager (BD Biosciences). Images were captured using EMCCD camera Andor iXON 885 (Andor Technology Plc., Belfast, BT12 7AL, UK) and IPLab software (BD Biosciences) at regular intervals. To minimize photo-bleaching, the intensity of light was reduced to 1–4% by intensity control. Mean intensity of fluorescent cell was measured after ROI selection and background subtraction using IPLab software. For cameleon ratio-imaging, cells expressing the probes were maintained in chambered cover glass and imaged for 30 min after addition of drugs at an interval of 200 ms. CFP was excited with 438±12 nm band-pass filter and dual emission was collected at 480±15 nm and 542±27 nm band-pass filter in ratio mode. Analysis of FRET-ratio was done by NIS-Elements software (Nikon Instruments Inc.).

Analysis of MAM by fluorescent microscopy and confocal imaging

Ląstelės, stabiliai išreiškiančios DsRed, nukreiptos į mitochondrijas (Mito DsRed), ir EGFP, nukreiptos į ER (ER-EGFP) (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, JAV), buvo naudojamos MAM vizualizacijai atliekant didelio padidinimo vaizdą. Norėdami atvaizduoti fluorescencine mikroskopija, ląstelės buvo auginamos ant stiklinio dugno apvalkalo stiklo ir vaizdai buvo atlikti naudojant „Nikon Eclipse TiE“ mikroskopą (Nikon Instruments Inc.), panaudojant × 60 1, 4 NA objektyvą. Konfokaliniam vaizdavimui ląstelės buvo pasėtos ant stiklinių dugno plokštelių ir atvaizduotos naudojant × 63 1, 4 NA objektyvą. Konfokalinis vaizdas buvo atliktas naudojant A1R lazerinio skenavimo mikroskopą („Nikon Instruments Inc.“).

Redoksui jautrus GFP vaizdas

Norėdami pavaizduoti redoksui jautrų GFP, ląstelės buvo laikomos apvaliajame dangtelio stikle ir buvo pavaizduotos epifluorescenciniu mikroskopu, naudojant ksenoną kaip sužadinimo šviesos šaltinį (Lamda XL; Sutter Instrument Company, Novato, CA, JAV). Emisijos bangos ilgis 535/30 nm buvo surinktas esant dvigubam sužadinimui, naudojant filtrų rinkinį 405/20 X ir 490/20 X nuosekliu režimu. Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant CCD kamerą („Cool Snap HQ“; „Photometrics“, Tucson, AZ, JAV). Paveikslėlių santykis buvo generuojamas padalijant 405 nm kanalą iš 490 nm kanalo į vaizdo tašką iš taškų, naudojant NIS elemento programinę įrangą.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

  2. 2.

    Papildomas S2 paveikslas

  3. 3.

    Papildomas S3 paveikslas

  4. 4.

    Papildomas S4 paveikslas

  5. 5.

    Papildomas S5 paveikslas

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas vaizdo įrašas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Žodynas

UPR

išsiskleidęs baltymų atsakas

Cyt. c

citochromas c

ΨΨ m

mitochondrijų membranos potencialas

DKO

dvigubas nokautas

ER

endoplazminis Tinklelis

Ero1 α

endoplazminis retikulinis oksidoreduktinas-1 alfa

PASAKOS

fluorescencinio rezonanso energijos perdavimas

GFP

žali fluorescenciniai baltymai

PAC-1

prokapazę aktyvinantis junginys-1

PI

propidium jodidas

PUMA

p53 reguliuojamas apoptozės moduliatorius

KO

nokautas

MAM

mitochondrijomis susijusi ER membrana

ROS

reaktyviosios deguonies rūšys

WT

laukinio tipo

Papildoma informacija pridedama prie šio pranešimo ląstelių mirties ir ligų svetainėje (//www.nature.com/cddis)