Įrodymai, kad pseudomonas aeruginosa kvorumo jutimo reguliatorius tiesiogiai kontroliuoja virulentiškumą ir gynybines genų grandines, mvfr | mokslinės ataskaitos

Įrodymai, kad pseudomonas aeruginosa kvorumo jutimo reguliatorius tiesiogiai kontroliuoja virulentiškumą ir gynybines genų grandines, mvfr | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Mikrobiologija
  • Molekulinė biologija

Anotacija

Pseudomonas aeruginosa nepanaikina antibiotikų likvidavimo ir dėl daugybės virulentiškumo veiksnių yra atsakingas už ūmines ir lėtines žmonių infekcijas. Šiuo metu manoma, kad MvfR (PqsR) kontroliuoja daugelio šių veiksnių ekspresiją netiesiogiai per pqs ir phnAB operonus. Pateikiame tvirtų įrodymų, kad MvfR taip pat gali surišti ir tiesiogiai reguliuoti papildomų 35 lokų ekspresiją per P. aeruginosa genomą, įskaitant pagrindinius reguliatorius ir virulentiškumo faktorius, tokius kaip kvorumo jutimo (QS) reguliatoriai lasR ir rhlR bei genai, dalyvaujantys baltymų sekrecija, transliacija ir atsakas į oksidacinį stresą. Mes parodome, kad šios antioksidantų sistemos, AhpC-F, AhpB-TrxB2 ir Dps, yra labai svarbios P. aeruginosa išgyvenimui reaktyvioms deguonies rūšims ir tolerancijai antibiotikams. Atsižvelgiant į tai, kad MvfR reguliuojami junginiai sukuria reaktyviąsias deguonies rūšis, tai rodo griežtai reguliuojamą QS savigynos nuo apsinuodijimo sistemą. Šios išvados taip pat meta iššūkį dabartiniam P. aeruginosa QS sistemų hierarchiniam reguliavimo modeliui, atskleisdamos naujas jų sąsajas, kurios rodo žiedinį modelį. Be to, jie atskleidžia naują „MvfR“ vaidmenį savigynoje, skatinantį toleranciją antibiotikams ir ląstelių išgyvenimą, toliau parodantį „MvfR“ kaip labai pageidaujamą kovos su virulentiškumu taikinį.

Įvadas

Pseudomonas aeruginosa yra pagrindinis nosokomijos patogenas, keliantis kritinę grėsmę žmonių sveikatai 1, 2, nes yra tolerantiškas ir greitai vystosi atsparumas beveik visoms dabartinėms antimikrobinėms terapijoms 3, 4, 5, 6, 7 . P. aeruginosa ūmines ir lėtines infekcijas palengvina daugybė virulencijos veiksnių, įskaitant toksinus, mažas molekules ir antrinius metabolitus, taip pat gynybinės sistemos nuo šeimininkų imuniteto ir bakterijų konkurentai. P. aeruginosa sąveika su konkurentų šeimininkais ir bakterijomis sukuria aplinką, kurioje yra daug reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, kurias P. aeruginosa išgyvena dėl savo daugybinių antioksidantų sistemų 16., 17 .

Dauguma P. aeruginosa virulentiškumo faktorių yra kontroliuojami trimis pagrindinėmis ląstelių tankio priklausomybės nuo kvorumo jutimo sistemomis: LasR 18, RhlR 19, 20 ir MvfR (taip pat žinomas kaip PqsR) 21, 22, 23, 24. Dabartinis vaizdas yra tas, kad šios trys sistemos yra hierarchiškai susijusios su LasR, esančiu šios hierarchijos viršuje 25, 26, 27 . LasR ir RhlR tiesiogiai kontroliuoja atitinkamų aktyvinančių induktorių, acil-homoserino laktonų (HSL) 3-okso-C12-HSL ir C4-HSL, koduojamų atitinkamai per lasinte sintetazes lasI ir rhlI, gamybą 18, 28, 29, 30 . LasR jungiasi prie 34 papildomų locus P. aeruginosa genome, įskaitant mvfR ir rhlR , ir tiesiogiai reguliuoja kelių genų, įskaitant transkripcijos reguliatorius, ekspresiją, kuris galiausiai lemia netiesioginį daugiau nei 300 genų moduliavimą visame genome 31 . RhlR tiesiogiai kontroliuoja rhlAB ir rhlC, atsakingų už ramnolipidinių paviršiaus aktyviųjų medžiagų 32, 33 biosintezę, ekspresiją ir netiesiogiai kontroliuoja kelių genų ekspresiją 34 . MvfR taip pat kontroliuoja savo veiklą, rišdamas ir teigiamai reguliuodamas pqsABCDE ir phnAB operonų, kurie katalizuoja MvfR induktorių ir ~ 60 skirtingų mažos molekulinės masės junginių 21, 22, 23, 35, 36, ekspresiją, įskaitant hidroksichinolonus (HAQ), biosintezę. ) 37 ir ne HAQ molekulė 2-AA 38, 39, 40 . Du gausiausi HAQ (4-hidroksi-2-heptilchinolinas [HHQ] ir 3, 4-dihidroksi-2-heptilchinolinas [Pseudomonas chinolono signalas-PQS]) jungiasi ir aktyvuoja MvfR, sukeldami daugybę virulentiškumo faktorių, kurie skatinti infekciją 23, 35, 41, 42, 43 . MvfR aktyvumas koreliuoja su HHQ sinteze. Taigi svarbus MvfR regulono aktyvavimo MvfR etapas yra MvfR baltymo prisijungimas prie pqsABCDE ir phnAB operonų 23, 35 . Iki šiol tai buvo vieninteliai du operonai, prie kurių buvo žinoma, kad MvfR jungiasi 22, 35, 44, o faktas, kad MvfR reguliuoja 18% P. aeruginosa genomo 45 raišką, buvo priskiriamas netiesioginiam poveikiui.

Atrodo, kad trys QS sistemos yra sujungtos įvairiais ir sudėtingais būdais. RhlR ir LasR QS sistemos viena kitą suaktyvina 46 . RhlR tiesiogiai slopina pqsA ir mvfR raišką, jungdamasis prie atitinkamų jų promotorių 35, 44, ir atrodo, kad MvfR regulonas yra sujungtas su RhlR per pqsE , paskutinį pqs operono geną, kontroliuojamą MvfR 47 . Kita vertus, LasR teigiamai reguliuoja MvfR, nes jis jungiasi ir indukuoja mvfR ekspresiją eksponentinės 27, 35 fazės metu, o vėlesniuose augimo etapuose MvfR ilgainiui tampa nepriklausomas nuo LasR 35 . Kitas LasR ir MvfR sistemų sujungimas yra tas, kad MvfR per pqs operoną kontroliuoja PQS pirmtakų ir užprogramuoto ląstelių mirties signalo 2-n-heptil-4-hidroksichinolino-N-oksido (HQNO) 13 sintezę 13, tuo tarpu LasR kontroliuoja fermentinį jų pirmtakų virsmą šiomis molekulėmis kontroliuodamas atitinkamai pqsH ir pqsL genų ekspresiją - 26, 37, 48 .

Čia mūsų viso genomo analizė pateikia tvirtų įrodymų, kad be tiesioginės pqsABCDE , phnAB ir mvfR genų kontrolės, MvfR taip pat gali prisijungti prie 34 papildomų lokusų per visą P. aeruginosa genomą ir tiksliai suderinti susijusių genų ekspresiją. . Šiame darbe pateikiamos naujos įžvalgos apie P. aeruginosa kvorumo nustatymo grandines, kurios yra labai svarbios tiek patogenezei, tiek ląstelių išgyvenimui kenksmingoje aplinkoje, jos ryšį su kitomis P. aeruginosa QS sistemomis, taip pat jo vaidmenį savigynos reakcijoje, kuris skatina antibiotikų toleravimą.

Rezultatai

MvfR jungiasi ir reguliuoja daugybinių virulentiškumu susijusių lokusų ekspresiją P. aeruginosa genome

Ankstesni tyrimai pranešė, kad didėjant ląstelių tankiui, MvfR reguliuoja daugiau genų, pradėjus stacionarią 45 fazę, pasiekti 18% P. aeruginosa genomo. Norėdami išsiaiškinti MvfR veikimo būdą QS kontroliuojamų genų ekspresijai, mes panaudojome viso genomo metodą ir atlikome chromatino imuninio nusodinimo seką (ChIPseq) kartu su RNR seka (RNAseq). Norėdami visiškai suvokti MvfR prisijungimo dinamiką, mes atlikome šią analizę keturiais laiko taškais, atitinkančiais skirtingas bakterijų augimo stadijas. Mes panaudojome ląsteles nuo ankstyvosios (OD 600nm 1.0), vidurinės (OD 600nm 2.0) ir vėlyvosios (OD 600nm 3.0) eksponentinės fazės, taip pat nuo nejudančios fazės (OD 600nm 4.0) augimo. MvfR sąveikaujanti DNR buvo nusodinta imuniniu būdu ir identifikuota pagal Illumina seką. 1 lentelė ir 1a pav. Rodo, kad MvfR jungiasi su 37 lokusais per PA14 genomą. Tarp šių 37 lokusų radome laukiamus pqsA , phnA ir mvfR promotorius, taip patvirtindami mūsų požiūrį. MvfR surišimą taip pat patvirtino in vivo (bakterijų kultūros) ChIPqPCR kai kuriuose iš šių raktų (papildomas paveikslas S1).

Pilno dydžio lentelė

Image

a ) MvfR rišamųjų vietų lokalizavimas PA14 genome. Pirmasis išorinis juodas apskritimas žymi PA14 žiedinį genomą. Genai, užkoduoti teigiamoje (antrame apskritime) arba neigiamame (trečiame apskritime), rodomi mėlynai. Paveikslėlis sukurtas naudojant IGV programinę įrangą 102 . MvfR surišimo vietas vaizduoja raudoni stačiakampiai (ketvirtasis apskritimas). ( b ) genų, susietų su MvfR surišimo vietomis, klasifikavimas. Teigiamą reguliavimą rodo raudona rodyklė, o neigiamą - žalia plokščia juosta.

Visas dydis

Norint koreliuoti MvfR jungtį su tikslinės genų ekspresija, RNAseq tyrimai buvo atlikti naudojant tėvystės padermę PA14 ir izogeninį mvfR mutantą. „RNAseq“ tyrimų genų ekspresijos analizė rodo, kad MvfR reguliuoja 95% genų, susijusių su jo surišimo vietomis, 64% yra sukeltas ir 31% represuotas. MvfR poveikis dviejų likusių vietų reguliavimui yra neaiškus (1b pav., 1 lentelė ir papildoma S1 lentelė).

MvfR jungiasi su 37 lokusais arba promotoriaus regione (22%), tęsiasi per kelis genus (57%), genuose (16%) arba genų gale (5%) (2a pav.). Įdomu tai, kad genuose esančiose MvfR surišimo vietose yra 72% GC, o tai yra žymiai daugiau nei visos kitos MvfR surišimo vietos (2b pav.). Šie duomenys rodo, kad MvfR gali parodyti skirtingus surišimo modelius ir potencialiai atpažinti skirtingus DNR surišimo motyvus, atitinkančius LysR tipo transkripcijos reguliatorių (LTTR) gebėjimą surišti skirtinguose geno regionuose 49 . Silicio analizė naudojant MEME suite 50 iš tikrųjų rodo, kad numatomi sutarimo motyvai skiriasi atsižvelgiant į MvfR surišimo vietą (2c – e pav.).

Image

a ) MvfR surišimo vietų dažnis atsižvelgiant į vietą. ( b ) GC kiekio procentinė dalis MvfR rišančių vietų DNR sekoje pagal vietos vietą - promotoriaus srityje (mėlyna), geno viduje (raudona) arba kelių genų sutapimas (žalia). Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant vienpusį ANOVA + Dunnett post-testą. ( c – e ) MvfR surišimo motyvas, atpažintas naudojant MEME rinkinį 50, atsižvelgiant į vietos vietą, promotoriaus regione ( d ), geno viduje ( e ) arba persidengiančius kelis genus ( f ).

Visas dydis

Funkcinis genų, susietų su 37 lokusais, prie kurių prisijungia MvfR, suskirstymas rodo, kad jie daugiausia atlieka su virulentiškumu susijusias funkcijas, įskaitant baltymų sekreciją, kvorumo nustatymą, ramnolipidų biosintezę ir geležies įgijimą, bet taip pat funkcijas, susijusias su ląstelių metabolizmu, mažų molekulių transportavimu, vertimas ir atsakas į oksidacinį stresą (1 lentelė ir 1b pav.). Tolesniuose skyriuose aptariamas MvfR surišimas ir genų ekspresija kai kuriose iš šių pagrindinių virulencijos funkcijų.

MvfR prisideda prie tiek RhlR, tiek LasR QS sistemų indukcijos

RhlR ir LasR yra dvi kitos P. aeruginosa pagrindinės QS sistemos, tiesiogiai ir netiesiogiai kontroliuojančios kelis virulentiškumo genus, įskaitant MvfR QS sistemą. 3a ir S1 paveikslai rodo, kad MvfR jungiasi su rhlR - rhlI lokusu, esant OD 600nm 2.0. Atitinkamai, rhlR raiška žymiai sumažėja mvfR mutante esant OD 600nm 2.0 (3b pav., C), kas rodo kitą RhlR QS sistemos reguliavimo lygį, išskyrus tai, kas anksčiau buvo aprašyta per PqsE 24, 51, 52 . Iš tikrųjų, kaip parodyta 3d pav., RhlA išraiška - tiesiogiai reguliuojama RhlR - yra žymiai mažesnė mvfR mutante nei pqsE mutante (p <0, 01), ir tai patvirtina papildomą MvfR reguliavimo vaidmenį RhlR QS nuo PqsE nepriklausoma sistema.

Image

( a ) ChIPseq analizė atskleidžia, kad MvfR jungiasi su rhlR-rhlI regionu. Juodoji juosta virš rišimo intensyvumo diagramos rodo smailę, identifikuotą naudojant SPP skambintoją. ( b ) RNAseq analizė rodo, kad MvfR indukuoja rhlR raišką . Šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2, tamsiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 3. ( c ) qRTPCR analizė patvirtina, kad MvfR indukuoja rhlR raišką . Šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2. Duomenys rodo trijų nepriklausomų pakartojimų vidutinį +/− SEM. ( d ) MvfR turi papildomą rhlA ekspresijos kontrolės sluoksnį, be PqsE, nes rhlA promotoriaus aktyvumas mvfR mutante yra žymiai mažesnis nei pqsE mutanto (p <0, 01, neporuotas T testas). Duomenys rodo mažiausiai 3 nepriklausomų pakartojimų vidutinį +/− SEM.

Visas dydis

„ChIPseq“ analizė taip pat parodo MvfR surišimą regione, kuriame yra lasR ir rsaL genai (4a ir S1 pav.). Nuosekliai mLfR mutante sumažėja lasI , rsaL ir lasR raiška, tai rodo, kad MvfR veikia kaip šios srities aktyvatorius (4b, c pav.). MvfR jungiasi prie šių genų anksti (OD 600nm 1.0) (4a pav.), O tai koreliuoja su ankstyvu poveikiu šių genų transkripcijai (4c pav.).

Image

(a ) ChIPseq analizė atskleidžia, kad MvfR jungiasi su rsaL-lasR regionu. Juodoji juosta virš rišimo intensyvumo brėžinių parodo smailę, nustatytą naudojant SPP skambintojo piką. ( b ) RNAseq analizė rodo, kad MvfR indukuoja lasR , lasI ir rsaL išraišką . Šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2, tamsiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 3. ( c ) qRTPCR analizė patvirtina, kad MvfR indukuoja lasR raišką . Silpnai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 1, šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2. Duomenys rodo 3 nepriklausomų replikų vidutinį +/− SEM. Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant vienpusį ANOVA + Dunnett post-testą.

Visas dydis

Visi šie duomenys rodo tiesioginę MvfR kontrolę RhlR ir LasR QS sistemose ankstyvojoje ir vidutinės eksponentinės fazės metu. Ši išvada yra įdomi alternatyva mūsų dabartiniam QS sistemų hierarchinio reguliavimo požiūriui, nes ji palaiko žiedinį, sujungtą trijų sistemų reguliavimą.

MvfR skatina teigiamą grįžtamąjį ryšį, indukuodamas mažą phrS RNR

phrS yra maža RNR, žinoma, kad ji teigiamai reguliuoja MvfR post-transkripcijos lygyje, dėl ko padidėja PQS ir piocianino gamyba, galiausiai skatinant P. aeruginosa virulentiškumą 53 . Kaip parodyta 5a ir S1 paveiksluose, MvfR jungiasi prie phrS geno srities. Atitinkamai, mrfR mutanto , phrS geno ekspresija žymiai sumažėja, palyginti su PA14 (5b, c pav.). Remiantis MvfR jungimosi su phrS genu modeliu (5a pav. Ir 1 lentelė), phrS ekspresija sumažėja esant OD 600nm 2, 0, bet ne OD 600nm 3, 0 (5b pav.). Šie duomenys rodo, kad MvfR skatina teigiamą grįžtamąjį ryšį per tiesioginę mažos phrS RNR indukciją.

Image

( a ) ChIPseq analizė rodo, kad MvfR jungiasi su phrS sritimi. Juodoji juosta virš rišimo intensyvumo brėžinių parodo smailę, nustatytą naudojant SPP skambintojo piką. ( b ) RNAseq analizė rodo, kad MvfR indukuoja phrS raišką . Šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2, tamsiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 3. ( c ) qRTPCR analizė patvirtina, kad MvfR indukuoja phrS raišką . Silpnai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 1, šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2. Duomenys rodo 3 nepriklausomų replikų vidutinį +/− SEM. Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant vienpusį ANOVA + Dunnett post-testą.

Visas dydis

MvfR indukuoja II ir VI tipo baltymų sekrecijos sistemas

P. aeruginosa per II tipo sekrecijos sistemą (T2SS) išskiria svarbius toksinus (ty elastazę, egzotoksinus, fosfolipazes) į tarpląstelinę aplinką 54 . VI tipo sekrecijos sistema (T6SS) dažniausiai veikia antagonistinę sąveiką su konkurentais iš bakterijų 55 . Anksčiau parodėme, kad MvfR daro įtaką T6SS 42 ir T2SS transkripcijai ir T2SS išskiriamų eksoproduktų lygiui 22, 45 . „MvfR“ teigiamai reguliavo T6SS HSI-II genų transkripciją, nors stebėtinai buvo pranešta, kad jie nepakito 42 pqsE mutante , o tai rodo, kad MvfR yra pagrindinis šio reguliavimo veiksnys. Šią mintį patvirtina faktas, kad MvfR jungiasi per T6SS HSI-II hsiA2 ir hcpD (6a ir S1 pav.). Genų ekspresijos tyrimai su mvfR mutantu atskleidžia, kad MvfR sukelia daugumos T6S HSI-II genų ekspresiją esant OD 600nm 2.0, bet ne esant OD 600nm 3.0 (6b pav., C). Iš esmės jie atitinka MvfR jungimosi įtaką ankstyvoje eksponentinėje fazėje ir MvfR jungimosi nebuvimą vėliau (6a pav. Ir 1 lentelė) ir reiškia tiesioginį MvfR vaidmenį išreiškiant šį lokusą ankstyvajame ir viduryje. -eksponentinis augimo etapas.

Image

( a, d ) ChIPseq analizė atskleidžia, kad MvfR jungiasi su hsiA2-hcpD (T6SS HSI-II) ir xcpQ-xcpP-xcpR (T2SS) regionais. Juodoji juosta virš rišimo intensyvumo brėžinių parodo smailę, nustatytą naudojant SPP skambintojo piką. ( b, e ) RNAseq analizė rodo, kad MvfR indukuoja daugumos T6SS ir T2SS genų ekspresiją. Šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2, tamsiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 3. ( c, f ) qRTPCR analizė patvirtina, kad MvfR skatina T6SS ir T2SS genų ekspresiją. Silpnai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 1, šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2. Duomenys rodo 3 nepriklausomų replikų vidutinį +/− SEM. Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant vienpusį ANOVA + Dunnett post-testą.

Visas dydis

6d ir S1 pav. Parodyta, kad MvfR taip pat jungiasi su T2SS genais xcpQ , xcpP ir xcpR - pagrindiniais genais, suteikiančiais šios sistemos funkcionalumą keleto virulentiškumo egzoproduktų sekrecijai . Atitinkamai, daugumos T2SS genų ekspresija yra sumažinta mvfR mutantuose esant OD 600nm 2, 0, tačiau nemažėjant šių genų ekspresijai, kai OD 600nm = 3, tai reiškia, kad šiuose vėlesniuose OD nėra aptinkamo MvfR jungimosi (6 pav., F). ir 1 lentelė). Visi šie duomenys rodo, kad MvfR tiesiogiai prisideda prie pagrindinių T6SS HSI-II ir T2SS genų reguliavimo ankstyvosiose P. aeruginosa augimo stadijose.

MvfR jungiasi prie penkių su vertimu susijusių lokusų ir neigiamai veikia P. aeruginosa vertimą

Anksčiau pranešėme, kad MvfR neigiamai moduliuoja P. aeruginosa baltymo transliacijos genų 6 raišką. Tačiau neaiškus yra šios neigiamos reguliavimo molekulinis mechanizmas. 7 paveikslas parodo, kad MvfR jungiasi ir kontroliuoja penkių su vertimu susijusių lokusų ekspresiją. MvfR surišimas tęsiasi visame regione, kurį sudaro genai, koduojantys 5S, 16S, 23S rRNR ir dvi tRNR. MvfR jungimasis yra OD 600nm 1, 0–3, 0 metu visuose keturiuose šio regiono pakartojimuose per visą PA14 genomą (7a – d pav.). Be to, MvfR jungiasi prie transliacijos inicijavimo faktoriaus IF-3 koduojančio geno infC , kuris yra antrasis operono genas, taip pat koduojantis su vertimu susijusius genus, thrS , rpmL ir rplT (7f pav.). Išplečiant tai, apie ką mes anksčiau pranešėme 6, čia parodome, kad mvfR mutante padidėja 16S, 23S ir 5S rRNR raiška (7e pav.). Be to, žymiai padidėja ir thrS , infC bei rpmI genų ekspresija (7g pav.), Kas rodo, kad MvfR veikia kaip neigiamas šio su vertimu susijusių genų rinkinio reguliatorius. Nuosekliai P. aeruginosa transliacinis aktyvumas, matuojamas įtraukiant L-azidohomoalaniną į 57 baltymus, mvfR mutante žymiai padidėja, palyginti su PA14 (7h pav.), Patvirtinantis MvfR vaidmenį slopinant vertimą. Apskritai šie radiniai reiškia tiesioginį neigiamą QS koreguojantį poveikį P. aeruginosa transliacijos mechanizmams per MvfR jungimąsi su rRNR genais ir infC operonu .

Image

( a – d, f ) ChIPseq analizė atskleidžia, kad MvfR jungiasi su 4 rRNR sritimis - rRNR Nr. 1 ( a ), rRNR Nr. 2 ( b ), rRNR # 3 ( c ) ir rRNR # 4 ( d ) - taip pat infC operonas ( f ). Juodoji juosta virš rišimo intensyvumo brėžinių parodo smailę, nustatytą naudojant SPP skambintojo piką. ( e, g ) qRTPCR analizė rodo, kad MvfR slopina 16S, 23S ir 5S rRNR, taip pat thrS , infC ir rpmI raišką . Silpnai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 1, šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2. Duomenys rodo 3 nepriklausomų replikų vidutinį +/− SEM. Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant nesuporuotą rRNR genų T testą ir vienpusį ANOVA + Dunnett post-testą infC operono genams. ( h ) MvfR slopina P. aeruginosa transliacijos aktyvumą, kurį atspindi naujai susintetintų baltymų matavimas, naudojant paženklintą aminorūgšties alaniną AHA (L-azidohomoalaniną). Kontrolės būdu buvo naudojamas transliacijos inhibitorius chloramfenikolis (15 mg / L). Duomenys rodo trijų nepriklausomų pakartojimų vidutinį +/− SEM. Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant vienpusį ANOVA + Dunnett post-testą.

Visas dydis

MvfR antioksidantų genų indukcija prisideda prie antibiotikų toleravimo

Ko gero, vienas įdomiausių MvfR surišimo lokusų rinkinių yra susijęs su oksidaciniu streso atsaku. Kaip parodyta 8a, d, g ir S1 paveiksluose, MvfR jungiasi prie ahpC - ahpF , trxB2 - ahpB ir dps regionų. Atitinkamai, mvfR mutante žymiai sumažėja visų šių genų ekspresija (8b pav., C, e – h). Tai patvirtina, kad ankstesni mūsų mikrorajono ekspresijos tyrimai taip pat parodė, kad šių genų ekspresija yra sumažinta, esant MvfR QS sistemos inhibitoriams 42 . Alkil-hidroksiperoksidazės AhpC, AhpF ir AhpB, taip pat treonino reduktazė TrxB2 ir Dps baltymai dalyvauja detoksikuojant vandenilio peroksidą ir organinius peroksidus 17, 58, 59, 60 bei geležies oksidaciją ir sekvestraciją. Šie baltymai galiausiai užkerta kelią mirtinų Fentono reakcijos metu susidarančių hidroksilo radikalų 61, 62 susidarymui. Nuosekliai stebėjome, kad AhpC, AhpF, TrxB2, AhpB ir Dps leidžia toleruoti vandenilio peroksidą, atsižvelgiant į tai, kad tų genų mutantai yra nuo 1, 4 iki 17 kartų jautresni H 2 O 2 nei PA14 (8i pav.). „ MvfR“ mutantas taip pat yra žymiai jautresnis H 2 O 2 nei PA14 (8i pav.), Tokiu būdu palaikydamas MvfR svarbą reaguojant į oksidacinį stresą.

Image

( a, d, g ) ChIPseq analizė rodo, kad MvfR jungiasi prie ahpC-ahpF, trxB2-ahpB ir dps regionų . Juodoji juosta virš rišimo intensyvumo brėžinių parodo smailę, nustatytą naudojant SPP skambintojo piką. ( b, e, h ) RNAseq analizė rodo, kad MvfR indukuoja ahpC , ahpF, trxB2, ahpB ir dps raišką . Šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2, tamsiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 3. ( c, f, g ) qRTPCR analizė patvirtina, kad MvfR indukuoja ahpC , ahpF , trxB2 , ahpB ir dps raišką . Silpnai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 1, šviesiai mėlyna juosta = mvfR mutantas esant OD 600nm 2. Duomenys rodo 3 nepriklausomų replikų vidutinį +/− SEM. Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant vienpusį ANOVA + Dunnett post-testą. ( i, j ) mvfR mutantas (raudonas), taip pat ahpC ir ahpF mutantai (purpurinė), trxB2 ir ahpB mutantai (žalia) ir dps mutantas (pilka spalva) yra jautresni nei PA14 vandenilio peroksidui ( i ) arba β- laktamo antibiotikas Meropenemas ( j ). PA14 kontrolės išgyvenamumo dalis po gydymo H 2 O 2 arba Meropenemu yra atitinkamai 6, 8 × 10 −4 arba 7, 1 × 10 −6 . Duomenys rodo mažiausiai 3 nepriklausomų pakartojimų vidutinį +/− SEM. Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant vienpusį ANOVA + Dunnett post-testą.

Visas dydis

Svarbu tai, kad antioksidantų gynybinės savybės apsaugo nuo antibiotikų, nes jų ROS slopina 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 . Anksčiau aprašėme MvfR svarbą tolerancijai antibiotikams 6, 43, 70 ir čia paklausėme, ar AhpC, AhpF, TrxB2, AhpB ir Dps detoksikacijos gebėjimai gali prisidėti prie šio reiškinio. Kaip parodyta 8j paveiksle, ahpC, ahpF, trxB2, ahpB ir dps mutantai yra nuo 2, 7 iki 7, 7 kartų jautresni β-laktamo antibiotikui Meropenem nei tėvų PA14 padermei, o tai rodo, kad tiesioginė MvfR kontrolė yra AhpC-F, TrxB2-AhpB. ir Dps prisideda prie antibiotikų toleravimo.

Diskusija

Šis tyrimas suteikia naujų įžvalgų apie MvfR vaidmens supratimą apie sudėtinį QS reguliavimą ir P. aeruginosa patogenezę. Iš tiesų, mūsų duomenys tvirtai rodo, kad MvfR veikia kaip tiesioginis pagrindinių P. aeruginosa virulencijos sistemų moduliatorius už biosintetinių operonų pqsABCDE ir phnAB ribų , laikydamasis savo pirminės nomenklatūros, kaip daugialypio Virulencijos faktoriaus reguliatoriaus (MvfR) 22 . Be to, šis darbas leidžia mums geriau suprasti QS reguliavimą ir meta iššūkį dabartinei hierarchinei nuomonei, kad LasR yra prieš MvfR ir kad MvfR kontroliuoja QS virulentiją tik netiesiogiai, transkripcijos būdu kontroliuodamas pqsABCDE operoną 24, 51, 52 .

Ankstesni tyrimai parodė didelį MvfR poveikį transkripciniam reguliavimui iki 18% P. aeruginosa genų 45 . Tačiau kai kurių iš šių genų tiesioginio MvfR reguliavimo galimybę nustelbė HAQs ir PqsE vaidmuo virulentiškume 26, 47, 51, 52, 71, 72 . Pažymėtina, kad PQS yra nepakeičiamas virulentiškumui, nes pqsH mutacija nesumažina virulencijos pelėms 23 . Siūlomas tiesioginis MvfR transkripcijos reguliavimas čia aprašytuose P. aeruginosa genuose galėtų atspindėti jau nustatytą netiesioginį reguliavimą, veikiantį per PqsE ir HHQ / PQS 26, 47, 51, 52, 71, 72 . Nors nustatyti 34 lokusai atspindi tik dalį MvfR reguliuojamų genų, jie vis dėlto yra svarbūs, nes juose yra specifinių virulentiškumo faktorių, taip pat pasaulinių virulentiškumo reguliatorių, įskaitant du kitus pagrindinius QS reguliatorius LasR ir RhlR. Padidėjęs genų, reguliuojamų MvfR, skaičius vėlyvose eksponentinėse ir nejudančiose augimo fazėse, greičiausiai, kyla dėl tiesioginių MvfR pagrindinių ląstelių, metabolinių ir QS reguliavimo funkcijų reguliavimo ankstesniuose augimo etapuose.

Pastebėjome, kad MvfR turi skirtingus surišimo modelius ir atpažįsta skirtingus DNR surišimo motyvus. Prognozuojami MvfR sutarimo jungimosi motyvai tiek promotoriaus regionuose, tiek regionuose, persidengiančiuose keliuose genuose, turi klasikinę LTTR TN x A palindromo struktūrą 49 . „Tomtom“ analizė 73 rodo, kad numatomas vietų, esančių genų viduje, sutarimo motyvas primena RutR, E. coli transkripcijos reguliatoriaus, žinomo kaip specifiškai surišančio su genais 74, DNR surišimo motyvą, kuris atitinka šią MvfR surišimo vietų grupę. Toks intrageninis surišimas ir MvfR gebėjimas veikti kaip neigiamas ir teigiamas reguliatorius anksčiau aprašytas su kitais LTTR šeimos nariais 49, 75 . Svarbu pažymėti, kad kryžminio sujungimo žingsnis, būdingas visoms ChIP procedūroms, gali užfiksuoti baltymų ir baltymų sąveiką ir gali sukelti klaidingai teigiamų jungčių vietas. Ateities nuodugnūs mechanistiniai tyrimai, sutelkiant dėmesį į MvfR surišimo modelius, leis mums įtikinamai parodyti MvfR tiesioginį nustatytų lokusų reguliavimą ir geriau suprasti, kaip ir kodėl MvfR sąveikauja su DNR tokiu būdu.

Išilginis MvfR surišimo tyrimas, vykstant P. aeruginosa augimui, palaiko sujungtą trijų pagrindinių QS sistemų reguliavimo kelią, nes MvfR greičiausiai susijęs su tiesioginiu abiejų LasR ir RhlR QS sistemų moduliavimu, kurios abi anksčiau buvo parodytos kaip reguliuojančios MvfR QS. sistema 27, 35, 44 . Čia pateikti duomenys užginčija P. aeruginosa QS sistemų hierarchinį reguliavimo modelį ir pateikia apskrito reguliavimo modelį (žr. Siūlomą modelį 9 pav.). Įdomu tai, kad MvfR prisijungimas prie lasR ir rhlR ir jų moduliavimas vyksta ankstyvojoje ir vidutinėje eksponentinėje fazėje (OD 600nm 1.0 ir 2.0), todėl kyla klausimas, kodėl šis laikas yra svarbus. Vėlyvoje eksponentinėje ir stacionarioje fazėje rhlR išraiška ir C4-HSL lygiai neviršija 45, 46, o RhlR jungiasi su mvfR ir pqsA promotoriais, veikiančiais kaip tiesioginį MvfR QS sistemos 35, 44 represorių, skatinant griežtą neigiamą autoreguliavimo kilpą. Priešingai, MvfR prisijungimas prie lasR greičiausiai grįžta į MvfR QS grandinę, sukeldamas mvfR išraišką 27, 35, o PqsH tarpininkaujama HHQ pavertimas PQS padidina MvfR aktyvumą 43, 48 . Dar dvi siūlomos teigiamo grįžtamojo ryšio kilpos, atsirandančios ankstesniuose augimo tarpsniuose, atsiranda dėl MvfR prisijungimo prie savęs ir phrS mažos RNR, kuri anksčiau buvo apibūdinta kaip MvfR 53 po transkripcijos aktyvatorius. Iki šiol buvo pranešta, kad phrS indukcija vyksta nejudančiame augimo etape, nes ją kontroliuoja transkripcijos reguliatorius ANR hipoksinėmis sąlygomis 53 . Mūsų duomenys rodo, kad MvfR galėjo tiesiogiai sukelti phrS ekspresiją ankstyvoje ir vidutinės eksponentinės fazės metu, prieš pradedant ANR ir hipoksiją. Šios dvi siūlomos teigiamų atsiliepimų kilpos gali būti naudingos MvfR QS sistemai, nes greitai padidėja MvfR lygis ir sukuriamas funkcinis tarpląstelinis MvfR ligandų lygis prieš pasiekiant kvorumo lygį pasaulinėje ląstelių populiacijoje.

Image

Šis siūlomas pavyzdinis paveikslas sutelktas į tiesioginį „MvfR“ reguliavimą ir sistemas, kurios apie tai atsiliepia teigiamai (rodyklė) arba neigiamai (juosta). Tamsiai mėlynos rodyklės / juostos atspindi jungtis, anksčiau aprašytas literatūroje, tuo tarpu šviesiai mėlynos rodyklės / juostos rodo naujas jungtis, pagrįstas šiuo tyrimu.

Visas dydis

Kitas įdomus reguliavimas, nustatytas šiame tyrime, yra susijęs su geležies įsisavinimu ir homeostaze. Iš tiesų, mes pastebime, kad MvfR jungiasi ir indukuoja du sideroforus, pyochelin ir pyoverdin, ir numanomus geležies pernešėjus PA14_28970-28980 ir PA14_46810-46820 (1 lentelė ir papildoma S1 lentelė). Geležis yra būtinas daugelio ląstelinių procesų faktorius, tačiau dėl mitybinio imuniteto jis yra ypač menkas infekcijos metu šeimininkui 76, 77, 78 . Tačiau per didelis geležies kiekis gali sukelti ląstelių pažeidimą ir galiausiai ląstelių žūtį, nes geležis katalizuoja ROS susidarymą per Fentono reakciją 62, 79 . Todėl geležinė homeostazė yra kritinė. Kai viduląstelinio geležies lygis yra aukštas, absorbcijos sistemas ir jų reguliatorius, įskaitant MvfR, slopina kailių transkripcijos reguliatorius 80 . Ši neigiama grįžtamojo ryšio kilpa taip pat atmeta visų kitų ROS sukeliančių sistemų, kontroliuojamų MvfR, gamybą (ty Pyocyanin, HQNO) 8, 13 .

Nors geležies įsisavinimas ir ROS gaminančios sistemos gali pakenkti P. aeruginosa , vis dėlto jos yra labai svarbios išgyvenimui, kolonizavimui ir konkurencijai su kitomis bakterijų rūšimis. 8, 9, 10, 81, 82 . Todėl P. aeruginosa galimybė išgyventi, kai šios sistemos yra aktyvios, suteikia svarbų atrankinį pranašumą. Čia parodome, kad MvfR sustiprina apsaugą nuo ROS, kurią gali sukurti šios sistemos, prisijungdamos prie antioksidantų gynybos sistemų AhpC-F, AhpB-TrxB2 ir Dps ir sukeldamos jų ekspresiją. Šie antioksidantų baltymai, kaip žinoma, riboja ROS susidarymą, nes sumažina vandenilio peroksido ir geležies, kurios yra Fentono reakcijos substratai, kiekį 59, 61, 62, 83 . Taigi šių antioksidantų genų MvfR moduliacija gali leisti ląstelėms išgyventi gaminant oksidacinius toksinus (žr. Siūlomą modelį 9 pav.). Ši apsauginė „toksinų / anti-toksinų“ sistema primena antibiotikus gaminančias bakterijas, kurioms reikalingas savigydos mechanizmas, kad būtų išvengta savižudybės 84, 85 . Apsauga nuo apsinuodijimo savimi nėra vienintelis šių antioksidantų vaidmuo, nes mes čia parodome, kad jie prisideda prie antibiotikų toleravimo. MvfR gebėjimas sukelti jų ekspresiją paaiškina anksčiau nežinomą MvfR tarpininkaujamo antibiotikų tolerancijos molekulinį mechanizmą. Be to, kad indukuojame antioksidantų sistemas, mes taip pat parodome, kad MvfR jungiasi su vertimu susijusiais lokusais ir slopina vertimą. Kadangi žinoma, kad antibiotikams toleruojančios ląstelės sumažina baltymų sintezę ir metabolizuoja 4, 5, 86, 87, MvfR poveikis transliacijai taip pat gali prisidėti prie antibiotikų toleravimo (žr. Pasiūlytą modelį 9 pav.).

Apskritai, mūsų duomenys rodo, kad MvfR tiesiogiai kontroliuoja daugybinių virulentiškumo faktorių raišką ir vaidina pagrindinį vaidmenį P. aeruginosa QS sąveikoje bei tolerancijai antibiotikams, reguliuodamas daugelį antioksidantų sistemų. Tai pabrėžia MvfR, kaip kritinį virulentiškumą lemiančio veiksnio, svarbą ir sustiprina jo, kaip labai pageidaujamo narkotiko, kandidato galimybes 42, 43, 88, 89, 90, 91 .

Metodai

Bakterijų padermės, plazmidės, augimo sąlygos

UCBPP-PA14 (PA14) yra P. aeruginosa klinikinis žmogaus izoliatas 92 . Visos mutantinės padermės, įskaitant mvfR- 22, pqsA- 21 ir pqsE- 47, yra izogeniškos UCBPP-PA14. pECP60 plazmidė, turinti rhlA-lacZ reporterių sistemą, anksčiau buvo aprašyta 45, 93 . Jei nenurodyta kitaip, visos bakterijų padermės buvo auginamos 5 ml LB Lenox terpėje (Fisher Scientific) 37 ° C temperatūroje, esant 200 aps./min. Orbitos kratymui, naudojant stiklinius vamzdelius (VWR). Norėdami sugeneruoti pJN-mvfR-FLAG plazmidę, išreiškiančią C-terminalai-FLAG pažymėtą MvfR, 657 bp aukštupio sritis ir mvfR koduojanti sritis su C-galo FLAG buvo amplifikuota PGR, tada klonuota į pJN105, apdorotą EcoR1 ir Xho1, kaip aprašyta 94 punkte. . Gauta plazmidė buvo transformuota į mvfR- ląsteles. MvfR-štamas, turintis pJN-mvfR-FLAG, buvo auginamas esant 15 μg / ml Gentamicino.

„ChIPseq“

5 ml kultūros buvo pasėjamos esant OD 600 nm 0, 1 ir buvo auginamos esant 37 ° C 200 aps./min. LB Lenox + 15 μg / ml gentamicinui. Esant OD 600 nm 1, 2, 3 ir 4, ląstelės buvo plaunamos šviežiu LB Lenox, po to granuliuotos ir laikomos –80 ° C temperatūroje. ChIP eksperimentas buvo atliktas, kaip aprašyta 43, 95 punkte, naudojant anti-FLAG M2 magnetinius rutulius (Sigma). Bibliotekos konstravimas ir Iliuminos DNR sekos nustatymas buvo atliktas htSEQ (Sietlas, WA). Sekų derintojas BWA 96 buvo naudojamas sekos sudarymo schemoms susieti su UCBPP-PA14 fasta etaloninio genomo rinkmena (RefSeq, 2010 m. Gegužės 24 d.). Mėginių smailės esant OD 600nm 1, 2, 3 ir 4 buvo identifikuotos naudojant „ChipSeq“ piko skambutį SPP 97, o OD3_input kaip atskaitos įvestį. Smailės buvo filtruojamos esant Z_score = 9, siekiant apriboti klaidingų teigiamų tikimybių tikimybę. Pastebėtina, kad augimo metu laikui bėgant keičiantis pH gali paveikti geležies biologinį prieinamumą, be to, tai gali paskatinti mikrobų fiziologinius pokyčius, kurie gali turėti įtakos jungimuisi.

CHIP qPCR

Mes patvirtinome „ChIPseq“ duomenis per „ChIP qPCR“, o ne atlikdami EMSA tyrimus, nes šis metodas leidžia mums ištirti MvfR jungimąsi gyvose ląstelėse, kuriose yra visi biologiškai svarbūs komponentai, taip pat įveikti žinomus sunkumus nuosekliai išvalyti viso ilgio MvfR baltymą 88, 98 . Mėginiai buvo paruošti, kaip aprašyta aukščiau esančiame „ChIPseq“ skyriuje. Po to qPCR buvo atliktas naudojant pradmenis, skirtus būti MvfR rišamųjų vietų viduryje, naudojant „Primer 3“ įrankį (//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Kiekvienos vietos pradmenų sekos yra išvardytos papildomoje S2 lentelėje. Kiekybinis PGR buvo atliktas naudojant „Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix“ (Stratagene), kaip aprašyta 43, 47 punkte, naudojant „Mx3005P qPCR“ aparatą (Stratagene). Duomenys buvo analizuojami naudojant procentinį įvesties metodą ir naudojant rpoD kaip neigiamą kontrolę, kaip ir ref. 43.

RNAseq

PA14 ir mvfR ląstelės buvo auginamos LB Lenox, esant 37 ° C 200 aps./min., Kol OD 600nm 2 arba OD 600 nm 3. Kiekvienos kultūros dubliavimai buvo perdirbti RNR ekstrakcijai naudojant „RNeasy“ rinkinį (QIAGEN), o apdorojimas DNR atliktas TURBO DNR. nemokamas rinkinys („Thermo-Fisher“). Tada RNR mėginiai buvo sunaikinti rRNR naudojant RiboZero (Epicenter), o po to buvo sukonstruotos naujos kartos sekos sudarymo bibliotekos, naudojant NEBNext Ultra-Directional RNA Library Prep Kit (New England Biolabs). Šios bibliotekos buvo surikiuotos naudojant „Illumina HiSeq 2500“ instrumentą, vidutiniškai sukuriant maždaug 8, 8 mln. Po suderinimo naudojant BWA 96, HTSEQ 99 pagrindu, remiantis UCBPP-PA14 transkripto anotacija (NC_002516), buvo gauti atskirų nuorašų skaitymai. Išraiškos verčių įvertinimas ir diferenciškai išreikštų nuorašų aptikimas buvo atlikti naudojant EdgeR 100 . Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant klaidingą atradimų procentą.

qRT-PGR

RNR mėginiai buvo paruošti, kaip aprašyta aukščiau RNAseq. cDNR buvo generuota RT-PGR naudojant „Superscript III First-Strand kit“ (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. Specifiniai gruntai buvo sukurti naudojant „Primer3“. Naudojami pradmenys aprašyti S2 papildomoje lentelėje. RpoD ekspresija buvo naudojama kaip pamatinis genas, kaip aprašyta 47 101 punkte . Kiekybinis PGR buvo atliktas naudojant „Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix“ (Stratagene), kaip aprašyta 43, 47 punkte, naudojant „Mx3005P qPCR“ aparatą (Stratagene).

Vertimo veiklos tyrimas

Transliacijos aktyvumas buvo nustatytas naudojant Click chemiją, kaip aprašyta 57 skyriuje, su modifikacijomis. PA14 ir mvfR ląstelės buvo auginamos LB Lenox 37 ° C 200 aps / min per naktį iš užšaldyto elemento, po to išplautos ir pakartotinai suspenduotos M9 terpėje iki OD 600 nm 0, 1. Ląstelės buvo auginamos 5 valandas 37 ° C temperatūroje 200 aps./min., Tada 15 μg / ml chloramfenikolio (arba 10% etanolio nešiklio) kartu su 1 μM Click-iT AHA L-azidohomoalaninu (Life Technologies) buvo dedama 45 minutes į augančias kultūras. Tada ląstelės buvo granuliuotos ir 1 valandą fiksuotos 4% PFA, po to plaunamos PBS. Tada ląstelės lizuojamos ultragarsu, naudojant 1% SDS 50 mM Tris-HCl pH8. Ženklinti ištirpinti baltymai buvo reaguojami su „Click-iT“ baltymų reakcijos buferio rinkiniu („Life Technologies“), kuriame yra 4 mM tetrametilrodamino (TAMRA) alkino („Life Technologies“) pagal gamintojo instrukcijas. Tada baltymai ekstrahuojami metanolio-chloroformo metodu ir du kartus plaunami metanoliu, kaip aprašyta nuorodoje. 57. 2 μL kiekvieno ekstrahuoto baltymo mėginio buvo galutinai pažymėta tašku ant nitroceliuliozės membranos ir pavaizduota naudojant 534 nm sužadinimo (žalią) / 607 nm spinduliuotės (oranžinį) filtrą „FluorChem M“ vaizdavimo įrenginyje („Protein Simple“). Po to signalas buvo apdorotas naudojant „ImageJ“ programinę įrangą, kad būtų galima kiekybiškai įvertinti AHA žymėtus baltymus, atspindinčius besiformuojančią baltymų sintezę.

β-galaktozidazės geno reporterio tyrimas

Palaikant plazmidę, PA14 ir mvfR ląstelės, turinčios pECP60 plazmidę, buvo auginamos esant 300 μg / ml karbenicilino. Esant 600 Nm 2 OD, 20 µL ląstelių buvo surinktos ir inkubuotos su 80 µl permeabilizacijos tirpalo (100 mM Na 2 HPO 4, 20 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0, 8 mg / ml CTAB, 0, 4 mg / ml natrio deoksicholato ir 5, 4). μL / ml β-merkaptoetanolio) 30 minučių 37 ° C temperatūroje. Tada pridėta 600 μL substrato tirpalo (60 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, 1 mg / ml ONPG ir 2, 7 μL / ml β-merkaptoetanolio) ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje, kol bus nustatyta geltona spalva. Galiausiai buvo įpilta 700 μl Stop tirpalo (1 M Na2C03), kad užblokuotų reakciją, ir buvo išmatuotas OD 420 nm . Millerio vienetai buvo apskaičiuoti taip: 1000 x OD 420 nm / (OD 600 nm x 0, 02 ml x reakcijos laikas). Daugiau informacijos apie šį protokolą galite rasti apsilankę (//openwetware.org/wiki/Beta-Galactosidase_Assay_%28A_better_Miller%29).

Tolerancija H 2 O 2 arba Meropenemui

PA14 , mvfR- , aphC- , ahpF- , trxB2- , ahpB- ir dps- ląstelės buvo auginamos 37 ° C 200 aps./min. LB Lenox terpėje iki eksponentinės fazės vidurio (OD 600nm 2), po to veikiamos 300 mM vandenilio peroksido ( H 2 O 2 ) 1 valandą tomis pačiomis inkubavimo sąlygomis. Prieš pridedant (t = 0) ir po (t = 1 valandos) H 2 O 2, kiekvienos kultūros 100 μl mėginys buvo surinktas, praskiedžiamas ir dedamas į LB agaro lėkšteles, kad būtų nustatytas bendras bakterijų skaičius (t = 0) ir išgyvenusios bakterijos (t = 1 h). Kolonijas sudarantys vienetai (CFU) buvo suskaičiuoti po 24 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje. Tolerancija Meropenemui buvo vertinama taip pat, išskyrus, kai ląstelės buvo auginamos 1% TSB terpėje, o žudymas buvo atliekamas 24 valandas, esant 10 μg / ml Meropenemo (Sandoz, JAV).

Statistinė analizė

Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant nesuporuotą T testą arba „One Way ANOVA + Dunnett“ post-testą daugybinių palyginimų atveju, kaip tinkama ir parodyta paveikslo legendose.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Maura, D. et al. „ Pseudomonas aeruginosa Quorum Sensor Regulator“, MvfR, tiesioginės Virulencijos ir gynybinių genų grandinių kontrolės įrodymai. Mokslas. Rep. 6, 34083; „doi“: 10.1038 / srep34083 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.