Mers-cov evoliucijos dinamika: potenciali rekombinacija, teigiama atranka ir perdavimas mokslinės ataskaitos

Mers-cov evoliucijos dinamika: potenciali rekombinacija, teigiama atranka ir perdavimas mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Evoliucinė genetika
  • Molekulinė evoliucija
  • Virusinė genetika

Anotacija

Artimųjų Rytų kvėpavimo sindromo koronavirusas (MERS-CoV) priklauso koronaviruso beta grupei ir pirmą kartą buvo atrastas 2012 m. MERS-CoV gali užkrėsti kelias šeimininko rūšis ir sukelti sunkias žmonių ligas. Mes atlikome filogenetinių ir bioinformatinių analizių ciklą, norėdami ištirti MERS-CoV evoliucijos dinamiką tarp skirtingų rūšių šeimininkų, turinčių genomo duomenis. Mūsų analizė rodo: 1) buvo aptiktos 28 potencialios rekombinantinės sekos ir jas galima suskirstyti į septynis potencialius rekombinantinius tipus; 2) MERS-CoV smaigalio (S) baltymas buvo stipriai parinktas, kai MERS-CoV pernešė iš savo natūralaus šeimininko į žmogų; 3) Šešios iš devynių teigiamo atrankos vietų, aptiktų spike (S) baltyme, yra jo receptorius rišančiame domene, kuris tiesiogiai liečiasi su šeimininko ląstelėmis; 4) MERS-CoV dažnai perduodamas pirmyn ir atgal tarp žmogaus ir kupranugario, po to, kai jis įgijo žmogaus kupranugario infekcijos galimybę. Visi šie rezultatai rodo, kad potencialūs rekombinacijos įvykiai galėjo įvykti dažnai per MERS-CoV evoliucijos istoriją, o teigiamos MERS-CoV S baltymo atrankos vietos gali leisti jam užkrėsti žmogų.

Įvadas

Artimųjų Rytų kvėpavimo sindromo koronavirusas (MERS-CoV) yra naujas beta koronavirusas, pasižymintis dideliu patogeniškumu, kuris kelia rimtą grėsmę žmonių sveikatai 1 . Reikšmingi įrodymai parodė, kad MERS-CoV egzistavo Centrinėje ir Rytų Afrikoje dešimtmečius 2, 3 ir turi daug natūralių šeimininkų, įskaitant dvi šikšnosparnių rūšis (Neoromicia capensis ir Vespertilio superans ), drominį kupranugarį ( Camelus dromedarius ) ir europinį ežį ( Erinaceus europaeus ) 4, 5, 6, 7 . Vis dėlto atrodė, kad žmogaus MERS-CoV pirmiausia išsiskyrė Saudo Arabijoje 2012 m., O paskui pasklido tarp žmonių visame pasaulyje 8 . Žmogaus MERS-CoV prototipo tyrimai taip pat rodo, kad žmogaus MERS-CoV tMRCA (naujausio bendro protėvio laikas) gali būti aptinkamas maždaug 2011 m. 9 . Kadangi šikšnosparnio MERS-CoV genomo seka yra labai identiška žmogaus MERS-CoV, nurodoma, kad žmogaus MERS-CoV šikšnosparnių kilmė gali būti 10, o taip pat yra tam tikrų įrodymų apie MERS-kupranugario žmogaus kilmę. CoV perdavimas 11, 12 . Kartu šie tyrimai parodė, kad zoonozinis įvykis gali turėti neesminę reikšmę MERS-CoV evoliucijai ir perdavimui.

Ankstesni tyrimai parodė, kad rekombinacija buvo įprasta tarp beta koronaviruso 13, 14 narių . Prisijungęs prie anksčiau nesusietos DNR, rekombinacijos įvykis gali sukurti naujas viruso padermes, kurios gali užkrėsti naujus šeimininkus ir išvengti šeimininkų imuninių reakcijų. Filogenetinė analizė parodė, kad egzistuoja du pagrindiniai MERS-CoV kladai - A ir B ir B klotas gali būti dar padalytas į penkias filogenetines grupes 15 . Yra duomenų, kad rekombinacija įvyko tarp III ir V grupių. Vis dėlto neaišku, ar įvyko galimas rekombinacijos atvejis tarp kitų grupių, ar tarp kelių filogenetinių grupių.

MERS-CoV genomas yra daugiau nei 30 000 nukleotidų (nt), kurį sudaro septyni numatomi atvirojo skaitymo rėmai (ORF) ir keturi struktūriniai genai - smaigalys (S), apvalkalas (E), membrana (M) ir nukleokapsidas (N). ) 16 (papildomas 1c pav.). Betakoronavirusų paviršiaus smaigalys (S) baltymas yra vienas iš pagrindinių veiksnių, lemiančių jų kryžminimą tarp rūšių, nes jis tarpininkauja viruso receptoriaus atpažinimui ir taip suaktyvina virusinės infekcijos procesą 17 . Be to, S baltymo N-gale esantis receptorių surišimo domenas (RBD) yra pagrindinis beta koronaviruso, patenkančio į šeimininko ląsteles, elementas, o mutacijos koronaviruso UBD turi įtakos jo infekcijai ir kryžminių rūšių gebėjimui 18, 19 . Pvz., Atlikus sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso (SARS-CoV), kuris yra didelis patogeniškumas, baltymo smaigalį tyrimą, nustatyta, kad S baltymų receptorių jungimosi srityje yra keturi aminorūgščių pakaitai kartu su šeimininku iš civeto į žmogų 20 . Be to, du aminorūgščių pakaitai HKU4 S baltymo C-terminale, šikšnosparnio beta koronavirusas, leidžia patekti į žmogaus ląsteles, o tie patys aminorūgščių pakaitai taip pat randami MARS-CoV 21 . Be to, heptado pasikartojantys regionai MERS-CoV C-terminale ir susiję koronavirusai taip pat vaidina svarbų vaidmenį adaptuojant virusą 22 . Apibendrinant galima pasakyti, kad šie aukščiau aprašyti tyrimai rodo, kad S baltymas vaidina gyvybiškai svarbų MERS-CoV skirtingų rūšių pernešamumą. Vis dėlto reikia ištirti evoliucinį mechanizmą, kaip MERS-CoV S ir kiti baltymai palengvino MERS-CoV perdavimą tarp rūšių.

Čia mes atlikome filogenetinių ir bioinformatinių MERS-CoV analizių serijas. Mes sistemingai tyrėme MERS-CoV rekombinacijos įvykius, galimą MERS-CoV transmisijos kelią penkiose skirtingose ​​šeimininkų rūšyse ir kiekvieno MERS-CoV baltymo evoliucinį slėgį, kai perduodamos rūšys. Mūsų tyrimas gali suteikti tam tikros įžvalgos paaiškinant galimą MERS-CoV adaptacinės evoliucijos mechanizmą.

Rezultatai

MERS-CoV epidemijos aprašymas ir filogenetinė analizė

Iki šiol didžiausias MERS-CoV protrūkis yra Saudo Arabijoje ir beveik visi žmonių atvejai turi tiesioginį ar netiesioginį ryšį su Arabijos pusiasaliu. Šiame tyrime mes surinkome 74 žmogaus MERS-CoV viso genomo sekas iš 9 šalių (papildoma 1 lentelė). Šių mėginių geografinis pasiskirstymas parodytas papildomame 1a pav. Didžioji jų dalis yra iš Arabijos pusiasalio šalių (78, 4%, 58/74), o daugiau nei pusė - iš Saudo Arabijos (64, 9%, 48/74) (papildomas 1a pav.). Didžiausias MERS sezonas yra nuo balandžio (26, 5%) ir gali (25, 0%) (papildomas 1b pav.).

Remdamiesi surinktų sekų viso genomo suderinimu (1 papildoma lentelė), atlikome šių sekų filogenetinę analizę dviem SRAS-CoV, tarnaujančiais kaip pogrupis. Mūsų filogenetinis medis rodo, kad visi kupranugariai ir žmogaus MERS-CoV yra susitelkę. Šikšnosparnis ir ežiukas MERS-CoVs sudarė pagrindinę parafiletinę grupę visiems kupranugarių ir žmogaus MERS-CoV klodams (1a pav.). Vienas kupranugaris MERS-CoV, išskirtas Egipte (GI: 589588051), sudaro vieną bazinį apvalkalą žmogui, o kitas kupranugario MERS-CoV (1b pav.). Kaip anksčiau buvo pranešta, žmogaus ir kupranugario MERS-CoV klasterį galima dar padalyti į du klodus - A ir B klotus. A klade yra keturios žmonių padermės, išskirtos Jordanijoje ir Saudo Arabijoje, o 70 žmonių ir 17 kupranugarių MERS-CoV yra sumaišytos B klėtyje. B kloteje yra penkios grupės ir mes jas pavadinome I grupe V grupei kaip ankstesnį tyrimą 15 . I grupėje atitinkamai V yra 25, 17, 14, 2 ir 29 MERS-CoV sekos (1b pav.).

Image

a ) Filogenetinė MERS-CoV analizė. Medis buvo pastatytas maksimalios tikimybės metodu. SARS-CoVs yra juodos spalvos ir naudojami kaip šaknis medžiui šaknis. Žalia, violetinė, mėlyna ir raudona spalvos rodo ežiuko MERS-CoV grupę, šikšnosparnio Vespertilio superans MERS-CoV grupę, šikšnosparnio Neoromicia capensis MERS-CoV grupę, žmogaus ir kupranugario MERS-CoV grupę. b ) Žmogaus kupranugario MERS-CoV filogenetinė analizė. Medis buvo pastatytas maksimalios tikimybės metodu. Egipte išskirtas kupranugaris MERS-CoV (GI: 589588051) yra pagrindinis A ir B klotui ir naudojamas kaip šaknis medžiui šaknis. Skirtingos šešėlinės spalvos reiškia skirtingus galimus rekombinantinius tipus. c ) potencialaus rekombinantinio tipo procentinė dalis visose rekombinacijos padermėse. d ) galimi rekombinantiniai tipai. Raudona, violetinė, mėlyna, žalia ir geltona spalvos reiškia atitinkamai I – V filogenetinės grupės sutarimo sekas.

Visas dydis

MERS-CoV rekombinacija

Mes atlikome surinktų pilno ilgio MERS-CoV sekų rekombinacijos analizę. Mes nustatėme, kad 28 iš jų yra galimi rekombinacijos atvejai (30, 4%, 28/92), įskaitant tris kupranugarių MERS-CoV ir 25 žmogaus MERS-CoV (papildoma 1 lentelė). Mes suskirstėme 28 galimas rekombinantines sekas į septynis skirtingus tipus ir pavadinome jas 1-uoju 7-uoju (1b – d pav., 1 papildoma lentelė). 1 tipas reiškia rekombinaciją, įvykusią tarp II ir V grupių, kuri apima 3 sekas ir sudaro apie 11% visos rekombinantinės sekos. 2 tipas reiškia rekombinaciją tarp III ir V grupių, kuri apima 6 sekas (22%). Įdomu tai, kad 2015 m. Pietų Korėjoje ir Kinijoje naujai rasti MERS-CoV yra 2 tipo rekombinantai 15, 23 . 3 tipas reiškia rekombinaciją tarp I ir III grupių, kuri apima 2 sekas (7%). 4, 5 ir 6 tipai yra rekombinacija, įvykusi tarp skirtingų IV ir V grupės genominių sričių, apimančių atitinkamai 7, 4 ir 4 sekas (25%, 14% ir 14%). 7 tipas yra rekombinacija, įvykusi tarp trijų grupių (I, IV ir V grupės), kuri apima 2 sekas (7%). Mūsų atlikta filogenetinė analizė parodė, kad 1 tipas priklauso II filogenetinei grupei, o 2 ir 3 tipai priklauso III filogenetinei grupei, o 4–7 tipai priklauso filogenetinei V grupei. I ir IV grupių filogenetinėms medžiagoms rekombinacijos nerasta (1b pav.) . Taip pat rekonstravome filogenetinį medį naudodami tik ne rekombinantines sekas ir nustatėme, kad jo topologija atitinka medį, pagrįstą visomis sekomis (papildomas 2 pav.). Mes taip pat atlikome kiekvieno rekombinantinio tipo SNP (vieno nukleotido polimorfizmų) analizę ir nustatėme, kad 2, 4, 6, 7 tipo dideli rekombinacijos segmentai yra pastebimi, tačiau 1, 3, 5 tipai yra neaiškūs (papildomas 3 pav.).

MERS-CoV baltymų adaptyvioji atrankos analizė

Norėdami ištirti MERS-CoV baltymų atrankos spaudimą, kai jie perduodami iš gyvūnų šeimininko į žmogų, atlikome adaptacinius visų MERS-CoV baltymų evoliucijos tyrimus, jei nebuvo rekombinantinių padermių. Pirmiausia mes nustatėme kupranugarių ir žmogaus MERS-CoV kaip pagrindinę šaką, o šikšnosparnių ir ežys MERS-CoV - kaip foninę šaką, kad atliktume atšakos bandymą CAMEML programoje PAML (žr. 1a pav.). Stiprus teigiamas selekcija aptinkamas smaigalio (S) glikoproteinuose tarp šių dviejų atšakų (p <0, 001), tuo tarpu reikšmingo teigiamo atrankos kituose MERS-CoV genuose nėra (1 lentelė). MERS-CoV smaigalio (S) glikoproteinuose randame devynias teigiamas atrankos vietas ir aštuonios iš jų yra statistiškai reikšmingos (1 lentelė). Šešios reikšmingos teigiamo atrankos vietos yra S baltymo receptorių surišimo srityje (2a pav.). Mes panaudojome paskelbtą kristalų struktūrą (PDB ID 4L72 RCSB baltymų duomenų banke), MERS-CoV smaigalyje esančio glikoproteino, sujungto su žmogaus receptoriaus dipeptidilpeptidaze 4 (DDP4), receptorių surišimo sritimi (RBD, aa 367–606, 2b pav.)., parodyti jų vietas 3D aplinkoje (2b pav.). MERS-CoV S baltymo receptorių surišimo domenas gali būti dar padalytas į receptorius surišantį subdomeną ir pagrindinį subdomeną. Dvi reikšmingos teigiamo atrankos vietos, K511R ir G521N, yra receptorių surišimo subdomene, o K511R tiesiogiai liečiasi su žmogaus DDP4 receptoriais. Q419S, G436N, D472S ir R479L yra pagrindiniame subdomene. Be to, mes aptikome teigiamą selekcijos vietą S baltymo c-terminale L775S. Antra, mes apžiūrėjome pozityvaus atrankos vietas tarp žmogaus kupranugario MERS-CoV (2 lentelė). ORF 8b, M baltyme, N baltyme ir S baltyme rasta penkios reikšmingos teigiamos selekcijos vietos (2 lentelė). Du iš jų yra N baltymuose, o vienas iš jų yra atitinkamai M, S arba 8b (ORF8b) skaitymo rėme.

Pilno dydžio lentelė

Image

a ) Aptiktos teigiamos selekcijos vietos S baltymo receptorių surišimo srityje ir juos atitinkantys kodonai. ( b ) Žmogaus receptorių dipeptidilpeptidazė 4 yra žalios spalvos, o S baltymo receptorių surišimo sritis - mėlynos spalvos. Aptiktos teigiamos atrankos vietos pažymėtos raudona spalva ir juodais skaičiais.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

MERS-CoV baltymų pakaitų greičio analizė

MERS-CoV genomą sudaro 11 atvirų skaitymo rėmų (papildomas 1c pav.). Buvo įvertintas kiekvieno kupranugario ir žmogaus MERS-CoV nukleotidų pakeitimo greitis kiekviename atvirojo skaitymo rėme ir viso genomo seka (3 lentelė). Genomo masto vidutinis kupranugarių ir žmogaus MERS-CoV nukleotidų pakeitimo dažnis per metus buvo 4, 81 × 10 –4 . 3 atvirojo skaitymo rėmelio (ORF3) pakeitimo sparta yra greičiausia, o ORF5 - mažiausia. ORF4b, nukleokapsido (N) glikoproteino ir smaigaus (S) glikoproteino pakaitalai yra panašūs, greičiau nei viso genomo pakaitalai.

Pilno dydžio lentelė

MERS-CoV perdavimo analizė

Norint ištirti MERS-CoV perdavimo laikinį ir erdvinį modelį, buvo sukurtas maksimalaus klade patikimumo (MCC) medis, naudojant MERS-CoV viso genomo sekas be rekombinantinių padermių (3c pav.). Buvo įvertinta kiekvieno medžio mazgo protėvių pagrindinė būsena su laiko nuoroda ir pažymėta skirtingomis spalvomis. Mes įvardijome šešis svarbius MERS-CoV divergencijos MCC medžio mazguose nuo A iki F mazgus (3c pav.). Galimas kiekvieno mazgo perdavimo laikas ir jo 95% didžiausias užpakalinis tankis (HPD) parodytas 3b pav. Mes nustatėme, kad žmogaus kupranugario MERS-CoV kilmės laikas yra gana vėlu (mazgas D). Be to, B brėžinio tMRCA yra ~ 2012 m. (3b pav., Mazgas F), o klodas A ir clade B skiriasi 2011 m. (3b pav., Mazgas E). Įdomu tai, kad MKC medis rodo, kad B klūde yra šeši įvairių rūšių perdavimo atvejai, turintys didelę užpakalinę tikimybę. Penki iš jų yra perdavimo tarp žmogaus iki kupranugario įvykiai, o vienas iš jų yra perdavimo nuo kupranugario tarp žmonių įvykiai (3c pav. ). Be to, kartu su žmogaus / kupranugario ir šikšnosparnio / ežio MERS-CoV kartu mes padarėme išvadą, kad senovės MERS-CoV egzistuoja dešimtmečius (3b, c pav.). „MERS-CoVs“ tMRCA, nustatant Vespertilio superans, Neoromicia capensis arba Erinaceus europaeus, galima atsekti atitinkamai 2006 m. (Mazgas C), 2003 m. (Mazgas B) ir 1996 m. (Mazgas A). Prieš atsirandant žmogaus kupranugario MERS-CoV, visų MERS-CoV apskaičiuota tMRCA pasirodė maždaug 1996 m. (2c pav., Mazgas A). Mes taip pat atlikome analizę nuo šaknų iki galo, naudodami nuoseklų duomenų rinkinį (3a pav.). Rezultatas rodo, kad tMRCA atsiradimo laikas yra ~ 1995 m., Kai yra aukšti statistiniai palaikymai (R2 = 0, 874, p vertė <0, 001). Visi šie rezultatai rodo, kad senovės MERS-CoV turėjo egzistuoti dešimtmečius gyvūnų šeimininkui ir pastaruoju metu turėjo galimybę užkrėsti žmones ar kupranugarius.

Image

( a ) Šaknies iki galo analizė rodo, kad x-pertrauka (tMRCA) yra ~ 1995, kai R2 yra 0, 874. b ) Pradinis laikas ir 95% HPD mazgui A – F. c ) perdavimo analizė, pagrįsta MCC metodu. Mėlyna, raudona, geltona, žalia ir žalsvai mėlyna spalva vaizduoja kupranugarį MERS-CoV, žmogaus MERS-CoV, ežį MERS-CoV, šikšnosparnį Neoromicia capensis ir MERS-CoV bei šikšnosparnį Vespertilio superans MERS-CoV. Mazgas nuo A iki F yra pažymėtas juodu užpildytu apskritimu. Žalia rodyklė nurodo pernešimą iš kupranugario į žmogų, o raudonos rodyklės nurodo pernešimą tarp žmogaus iki kupranugario B kloteje.

Visas dydis

Diskusija

MERS-CoV priklauso koronavirusui, beta-koronavirusui, C linijai. Nuo tada, kai jis buvo atrastas 2012 m., MERS-CoV sulaukė didžiulio dėmesio dėl savo galimybės užsikrėsti tarp žmonių ir aukštu mirtingumu. Rekombinacijos atvejai buvo patvirtinti žmogaus MERS-CoV 23 . Tai, kad MERS-CoV galima rasti keliose rūšyse, rodo jo pernešamumą tarp rūšių 4, 5, 6, 7, 11 . Iki šiol evoliucijos detalės, kaip MERS-CoV perduodamas žmonėms, vis dar nežinomos. Remdamiesi išsamiausia MERS-CoV genomo sekų kolekcija, mes bandėme išsiaiškinti MERS-CoV evoliuciją ir plitimą tarp skirtingų rūšių.

Buvo pranešta apie MERS-CoV penkių rūšių, įskaitant europinį ežį, dviejų rūšių šikšnosparnius, drominį kupranugarį ir žmogų, rūšis. Mes panaudojome ML metodą, norėdami rekonstruoti iš šių rūšių išskirto MERS-CoV viso genomo filogenetinį medį. Iš ML medžio matyti, kad ežys MERS-CoV yra pagrindinės visų kitų MERS-CoV, o dvi šikšnosparnių MERS-CoV yra pagrindinės kupranugario ir žmogaus MERS-CoV. Šis rezultatas leidžia manyti, kad kupranugarių ir žmogaus MERS-CoV protėviai gali būti iš kitų gyvūnų šeimininkų, tokių kaip ežiukas ar šikšnosparnis. Taip pat rekonstravome filogenetinį MERS-CoV medį, naudodami NJ metodą arba remdamiesi kiekvienu MERS-CoV baltymu. Šie medžiai rodo nuoseklią topologiją, kuri leidžia manyti, kad mūsų tyrime įvertintas filogenetinis ryšys yra patikimas (papildomas 5 pav.).

B kladą padalijome į penkias grupes kaip aiškų tyrimą, norėdami nustatyti MERS-CoV 15 rekombinaciją. Kadangi evoliuciniai atstumai tarp MERS-CoV yra artimi (3 lentelė), tarp jų nebuvo galima aptikti didelio segmento rekombinacijos. Taigi pagal nepertraukiamus rekombinacijos segmentus mes apibrėžėme potencialius rekombinacijos įvykius MERS-CoV. Šis metodas buvo naudojamas ankstesniame tyrime norint pažymėti galimą rekombinacijos įvykį 24 . Mūsų tyrime mes nustatėme 28 padermes, sudarančias septynis rekombinantinius tipus, kurie užėmė daugiau nei 30% visų išskirtų MERS-CoV žmonių ir kupranugarių. Tarp jų, tarp dviejų filogenetinių grupių, tarp dviejų filogenetinių grupių, mes radome 26 padermes iš šešių rekombinantinių tipų (nuo 1 iki 6 tipo) ir po du kamienus iš vieno tipo (7 tipas). Kol kas MERS-CoV rekombinacija buvo patvirtinta ankstesniame tyrime, tačiau nėra pranešimo apie rekombinaciją tarp daugiau nei dviejų MERS-CoV grupių. Įdomu tai, kad dauguma rekombinantinių tipų (1, 2, 4, 5, 6 ir 7 tipai) yra susiję su V grupe ir sudaro 92, 9% visų rekombinantinių padermių (26/28). Rezultatas rodo, kad rekombinacijos gali atsitikti dažnai, o rekombinantiniai tipai, apimantys V grupę, gali įvykti plačiai. Be to, keli rekombinacijos įvykiai rodo, kad dviguba ir superinfekcija greičiausiai egzistavo per MERS-CoV perdavimo istoriją. Nepavyko aptikti galimų didelių 1, 3 ir 5 tipo rekombinacijos segmentų. Palyginę pamatinių sekų SNP (vieno nukleotido polimorfizmus) su rekombinantinėmis sekomis, mes manėme, kad specifinės nukleotidų mutacijos gali turėti įtakos rekombinacijos analizės rezultatams. Šią problemą galima išspręsti atradus daugiau MERS-CoV sekų arba ateityje sukūrus išsamesnę MERS-CoV genotipų klasifikaciją. Mes taip pat atlikome filogenetinę potencialaus rekombinantinio regiono analizę ir gavome panašius rezultatus (papildomas 3 pav.).

Įdomu tai, kad Rytų Azijos MERS-CoV padermės (Kinija ir Pietų Korėja) priklauso 2 tipo rekombinantams, o ankstesnis tyrimas rodo, kad jų tMRCA gali būti potencialios rekombinacijos įvykis 23, o tai rodo, kad rekombinantiniai padermės buvo perduotos plačiai. Be to, viena rekombinantinė MERS-CoV linija sukėlė plataus masto kupranugario ir žmogaus protrūkį 26 . Siūloma, kad rekombinantiniai MERS-CoV būtų patyrę įvairių rūšių infekciją. Be to, mūsų tyrimas atskleidė, kad rekombinantinių padermių yra daug, o galimų rekombinantinių rūšių yra gausu. Visi šie duomenys pabrėžia, kad turėtume daugiau dėmesio skirti rekombinantiniam MERS-CoV perdavimui.

Nors vis dar nežinoma, kaip MERS-CoV perduodamas iš natūralaus šeimininko į žmogų, MERS-CoV buvo rasta daugelyje gyvūnų šeimininkų, tokių kaip šikšnosparniai ir ežiukai. Norėdami ištirti kiekvieno MERS-CoV baltymo evoliucinį slėgį per jo galimą kryžminimą tarp rūšių, mes atlikome išsamų MERS-CoV baltymų teigiamų atrankos vietų nuskaitymą. Į šią analizę nebuvo įtraukti rekombinantiniai padermės. Mes nustatėme kupranugario žmogaus MERS-CoV kaip pagrindinę šaką, o ežys šikšnosparnis MERS-CoV kaip foninę šaką ir įvertinome santykinį evoliucinį slėgį priekinio plano šakoje, palyginti su fonine šaka. Mes tik nustatėme, kad MERS-CoV S baltyme buvo atlikta stipri teigiama atranka ir yra devynios reikšmingos teigiamos S baltymo atrankos vietos. Tai rodo, kad S baltymas buvo stipriai evoliucinis spaudimas, kai jis buvo pernešamas iš natūralaus šeimininko į žmogų. Tarp reikšmingų teigiamų atrankos vietų šešios iš jų yra S baltymo receptorių surišimo srityje (RBD). LBD yra labai svarbus virusui patekti į šeimininko ląsteles ir jį sudaro viena surišimo sritis ir viena šerdies sritis. Remdamiesi UBR 3D modeliu, mes pastebime, kad dvi vietos yra RBD rišamojoje srityje, o tai rodo, kad šie aminorūgščių pakaitalai gali pakeisti MERS-CoV rišimosi gebėjimą šeimininko ląstelėse ir taip palengvinti jos perdavimą tarp rūšių. Kitos keturios vietos yra pagrindiniame UBR regione. Šie aminorūgščių pakaitalai gali pakeisti branduolio regiono struktūrą ir netiesiogiai paveikti MERS-CoV kryžminių rūšių galimybes. Siekdami pašalinti mėginio paklaidą tarp žmogaus / kupranugarių grupės ir šikšnosparnio / ežiuko grupės, mes taip pat atsitiktinai paėmėme 68 nerekombinantinių žmogaus ir kupranugarių sekų pavyzdžius. Mes bandėme atitinkamai 10, 20 ir 50 atsitiktinių imčių. Naudodami atsitiktinių imčių sekas, kartu su šikšnosparnių ir ežiukų MERS-CoV sekomis, atlikome šakų analizę ir gavome tuos pačius rezultatus, kaip ir mūsų aukščiau paminėti (duomenys neparodyti).

Taip pat įvertinome kupranugario žmogaus MERS-CoV nukleotidų pakeitimo laipsnius, kad ištirtume jo evoliucijos dinamiką po to, kai jis užkrėtė kupranugarį ir žmogų. Mūsų apskaičiuotas viso MERS-CoV genomo nukleotidų pakeitimo greitis yra 4, 81 × 10 −4, tai yra lėčiau nei ankstesnis įvertinimas 9 . Vienas šio reiškinio paaiškinimas yra tas, kad mes naudojome didesnį duomenų rinkinį nei ankstesniame tyrime, į kurį įtrauktos visos turimos MERS-CoV viso genomo sekos. Mūsų apskaičiuotas MERS-CoV genomo pakaitų lygio patikimumo intervalas iš esmės sutampa su kito tyrimo rezultatu 16 . Apskaičiuotas nukleotidų pakeitimo laipsnis rodo, kad pagreitintą evoliuciją patyrė keturi baltymai.

Atlikdami evoliucinę slėgio analizę, mes nustatėme, kad keturiuose kupranugario žmogaus MERS-CoV baltymuose buvo atlikta teigiama atranka ir aptiktos penkios reikšmingos teigiamo atrankos vietos. Vienas iš jų yra M baltymuose. Yra įrodymų, kad M baltymai yra galingas interferono antagonistas 26, todėl teigiama, kad evoliucinis slėgis M baltymams kyla iš šeimininko imuninės sistemos. Dvi iš penkių reikšmingų vietų randamos N baltyme, kuris yra pagrindinis MERS-CoV savaiminio surinkimo pagrindas. Koronaviruso N baltymas gali jungtis su skirtingais ląstelės-šeimininkės baltymais ir įrodytas, kad turi įvairias funkcijas, iš kurių viena taip pat yra neutralizuojanti interferoną-šeimininką, kaip parodyta SARS-CoV 27, 28, 29, 30 . Pagrįsta manyti, kad MERS-CoV N baltymas intensyviai atrenkamas, nes jo funkcijos buvo panašios į SARS-CoV N baltymo funkcijas. Aukščiau pateikti rezultatai leidžia manyti, kad rankos varžybos tarp MERS-CoV baltymų ir šeimininko imuninės sistemos gali būti pagrindinė MERS-CoV adaptacinės evoliucijos varomoji jėga, kai ji pradėjo užkrėsti kupranugarį ir žmogų. MERS-CoV smaigalio (S) glikoproteinas vystosi šiek tiek greičiau, nei vidutinis viso genomo rodiklis, o tai rodo, kad MERS-CoV S baltymo nukleotidų pakeitimo greitis išlieka greitas net ir peržengus rūšies ribą. Teigiamos atrankos vieta, kurią nustatėme MERS-CoV S baltyme su specifinės vietos tyrimu, yra identiška ankstesnio tyrimo rezultatui 3 . Ši svetainė yra heptado kartojimuose 1, kuris yra pagrindinis membranų sintezės architektūros komponentas ir reikalingas MERS-CoV patekti į šeimininko ląsteles 31 .

Nesant rekombinantinių padermių, mes atlikome MCC analizę, naudodami MERS-CoV viso genomo sekas, norėdami nustatyti laiką ir šaltinį, kai MERS-CoV peržengė rūšių ribą. MCC medžio topologija labai panaši į viso genomo filogenetinio medžio topologiją. Mes apibrėžėme šešis mazgus (A – F), kad paaiškintume perdavimą. Atliekant MCC analizę, užpakalinė tikimybė protėvių A, B ar C mazgams nėra labai didelė, o šių trijų mazgų 95% didžiausias užpakalinis tankis (HPD) yra gana ilgas. Taigi šie rezultatai yra silpni norint parodyti tikslų MERS-CoV kilmės laiką arba protėvio būseną. Tačiau šie vertinimai vis tiek pateikė įrodymų, kad protėvis MERS-CoV dešimtmečius turėjo užkrėsti daugybę gyvūnų šeimininkų, tokių kaip šikšnosparnis ar ežiukas (papildomas 4 pav.). X-pertraukimas (tMRCA) „nuo šaknies iki galo“ yra ~ 1995 su dideliais statistiniais palaikymais, o tai artima apskaičiuotam tMRCA laikui atliekant MCC analizę. Ši hipotezė atitinka serologinių tyrimų rezultatus 2, 3 . Žmogaus kupranugario MERS-CoV bendras protėvis atsirado 2010 m., O A ir B klotų tMRCA atsirado 2011 m., Tai yra visiškai tas pats, kas ankstesnėje ataskaitoje 16 . B kloteje mes aptikome penkis galimus perdavimo tarp žmogaus ir kupranugario atvejus ir vieną perdavimo nuo kupranugario tarp žmonių įvykį. Tai rodo, kad MERS-CoV dažnai perduodavo pirmyn ir atgal tarp žmogaus ir kupranugario, po to, kai įgijo galimybę užkrėsti abu šeimininkus. Tiesą sakant, yra bent vienas patvirtintas MERS-CoV perdavimo iš kupranugario į žmogų atvejis 32 .

Išvada

Apibendrinant mes nustatėme, kad potencialūs rekombinacijos įvykiai yra dažni MERS-CoV evoliucijos istorijoje, o galimus rekombinantinius MERS-CoV galima suskirstyti į septynis tipus. MERS-CoV S baltymo teigiamos atrankos aminorūgščių vietos, ypač esančios jo receptorių surišimo srityje, galėjo palengvinti jo perdavimą tarp rūšių gyvūnų iš gyvūno šeimininko į žmogų. Mes aptikome stiprų teigiamą keturių kupranugarių žmogaus MERS-CoV baltymų teigiamą atranką, o tai rodo, kad jie greičiausiai patyrė stiprų adaptacinį evoliucinį spaudimą iš šeimininkų imuninės sistemos. Be to, mes taip pat nustatėme šešis galimus kryžminių rūšių perdavimo atvejus tarp žmogaus ir kupranugario. Mūsų tyrimas ištyrė MERS-CoV evoliucinę dinamiką, kuri sudarys pagrindą MERS-CoV kontrolei ir gydymui.

Medžiagos ir metodai

Sekos duomenys

Iš NCBI nukleotidų duomenų bazės buvo atsisiųstos visos 91 MERS-CoV ir dviejų SARS-CoV genomo nukleotidų sekos. Tarp 91 MERS-CoV genomo sekų 68 iš jų yra iš žmogaus, 18 iš jų atkeliavo iš dromedaro, du iš dviejų rūšių šikšnosparnių Neoromicia capensis ir Vespertilio superans , trys iš jų yra iš Europos ežero Erinaceus europaeus . Dvi SARS-CoV genomo sekos yra atitinkamai iš žmogaus ir šikšnosparnio Rhinolophus ferrumequinum . Mes panaudojome sekas 453061240 kaip nuorodas, kad ištrauktume atvirus skaitymo rėmus iš kiekvieno MERS-CoV genomo šiame tyrime.

Genomo sekų suderinimas ir filogenetinė analizė

Iš viso 93 surinktos genomo sekos buvo sulygintos naudojant „MUSCLE“ programinę įrangą su numatytaisiais parametrais 33 . „ClustalW“ ir „MAFFT“ naudojami patvirtinti „MUSCLE“ rezultatą 34, 35 . Sulyginimai buvo patikslinti rankiniu būdu „Bioedit“ (//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html). Vėlesnėms filogenetinėms analizėms (papildomos bylos) buvo naudojamos tik nedviprasmiškai suderintos padėtys. Mes panaudojome „JmodelTest 3.1“, kad įvertintume geriausią 36 suderinimo nukleotidų pakeitimo modelį, kuris yra GTR + I + G. Mes panaudojome PHYML 3.1, kad atliktume 93 surinktų genomo sekų filogenetinę analizę, remiantis jų genomo sekų suderinimu 37 . Šakų palaikymo vertės buvo apskaičiuotos naudojant „Shimodaira-Hasegawa“ testą, integruotą į PHYML.

Rekombinacijos analizė

B kloteje mes įvertinome kiekvienos filogenetinės grupės sutarimo sekas, naudodamos trūkumų įrankį EMBOSS explorer (//bioinfo.nhri.org.tw/cgi-bin/emboss/cons). Buvo nustatytos penkios sutarimo sekos kaip atskaitos taškai, o kiekviena seka B kloteje buvo naudojama kaip užklausa, norint aptikti galimą rekombinaciją naudojant „Simplot“ programinę įrangą 25 . Langas yra nustatytas 200 bp, o žingsnis - 20 bp.

Teigiamos atrankos analizė

Mes ekstrahuodavome kiekvieno MERS-CoV baltymo kodavimo sritį, naudodami MERS-CoV 453061240 štamą kaip pamatinį šabloną. CODEML programa, įgyvendinta PAML 4.7 pakete, buvo naudojama aptikti teigiamą kiekvieno MERS-CoV baltymų rinkinio 38 kodono suderinimo pasirinkimą. Filialo vietos modelyje buvo nustatyta, kad žmogaus-kupranugario MERS-CoV grupė yra pagrindinė, šikšnosparnio ežio MERS-CoV grupė buvo fonas, o A modelis su apskaičiuota ω verte buvo lyginamas su nuliniu modeliu (modelis A ') su fiksuota ω verte. Norėdami sumažinti šališkumą nuo imties dydžio, atsitiktine atranka atrinkome 68 žmogaus ir kupranugario MERS-CoV (A ir B klonai), kurie visi yra ne rekombinantinės sekos. Mes panaudojome 10, 20 ir 50 kaip atsitiktinį imties dydį su pakeitimais ir be jų. Atsitiktinių imčių sekos kartu su šikšnosparniu ir ežiu MERS-CoV buvo naudojamos kuriant duomenų rinkinius filialo vietos modelio analizei, kaip minėtas metodas (scenarijų žr. Papildomus failus). Be to, kiekvienam atsitiktiniam imties dydžiui pakartotinai atkreipėme penkis kartus, kad rezultatai būtų tvirti.

Mes taip pat panaudojome konkrečiai vietai skirtą modelį, kad aptiktume teigiamą selekciją žmogaus ir kupranugario skraiste. Konkrečiai vietai skirtas modelis buvo atliktas palyginus atitinkamai M2a (teigiamas pasirinkimas) ir M8 (beta ir ω) modelius, palyginti su nuliniais M1a (beveik neutralus) ir M7 (beta) modeliais. Kiekvieno baltymo evoliucinis atstumas buvo įvertintas naudojant MEGA 6 39 .

3D struktūros rodymas

MERS-CoV smaigalio (S) glikoproteino, jungiančio su žmogaus receptoriaus dipeptidilpeptidaze 4 (DDP4), receptorių rišančiojo domeno (RBD) kristalinė struktūra buvo parodyta naudojant Jmol (Jmol: atviro kodo „Java“ žiūriklis, skirtas 3D cheminėms struktūroms. . //www.jmol.org/).

Transmisijos analizė

Rekonstravome maksimalaus klade patikimumo (MCC) medį, naudodami MCMC (Markov Chain Monte Carlo) metodą, įdiegtą BEAST v1.8.2 pakete 40 . Mes įvertinome MERS-CoV plitimą tarp skirtingų šeimininkų ar geografinių vietovių. Analizėje taip pat buvo naudojamas mėginių ėmimo laikas ir kiekvienos sekos priimančioji / geografinė vieta. Nukleotidų pakeitimo laipsnis ir naujausio bendro protėvio (MRCA) atsiradimo laikas įvairiuose MCC medžio mazguose taip pat buvo įvertinti naudojant BEAST paketą. Bajeso koalescencijos analizėje buvo naudojamas atsipalaidavęs molekulinis laikrodis su nekoreliuotu log-normaliu pasiskirstymu ir pastovaus populiacijos dydžio modelis. Remiantis JmodelTest3.1 rezultatais, MCC analizėje buvo naudojamas GTR + Gamma + I nukleotidų pakeitimo modelis. Statistinį parametrų įverčių neapibrėžtį atspindėjo didžiausios 95% užpakalinio tankio (HPD) vertės. MCMC analizė buvo atlikta 500/100 mln. Kartų, skirtų šeimininkams / geografinis perdavimas, imant mėginius kas 50 000/10 000 kartų, kad būtų pasiektas parametrų konvergencija ir tinkamas efektyvus imties dydis (ESS> 200). Medžius apibendrinome naudodami „TreeAnnotator“, įgyvendintą BEAST v1.8.2 pakete. Pradiniai 25% mėginiai buvo išmesti kaip perdegimas, paliekant 75% medžių viename bandymo etape, kad būtų pasiektas sutarimo medis. „Root-to-tip“ analizė buvo atlikta naudojant „Path-O-Gen“ programinę įrangą (1.4 versija, //tree.bio.ed.ac.uk/software/pathogen/).

Papildoma informacija

Kaip cituoti šį straipsnį : Zhang, Z. et al . MERS-CoV evoliucinė dinamika: potenciali rekombinacija, teigiamas pasirinkimas ir perdavimas. Mokslas. Atstovas 6, 25049; „doi“: 10.1038 / srep25049 (2016).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.