Virškinimo trakto stromos naviko progresavimas dėl fascin-1 perviršio ir mir-133b sumažėjęs reguliavimas | šiuolaikinė patologija

Virškinimo trakto stromos naviko progresavimas dėl fascin-1 perviršio ir mir-133b sumažėjęs reguliavimas | šiuolaikinė patologija

Anonim

Dalykai

  • Virškinimo trakto vėžys
  • miRNR
  • Naviko biomarkeriai

Anotacija

MikroRNR (miRNR) yra mažos, nekoduojančios RNR, kurios yra padidintos arba sumažintos reguliuojant kelių rūšių vėžį ir turinčios svarbų vaidmenį navikogenezėje ir progresavime. Norėdami geriau suprasti aberrantiškai išreikštų miRNR ir jų taikinių genų, turinčių įtakos virškinimo trakto stromos naviko (GIST) biologijai, vaidmenį, atlikome miRNR matricą 19 GIST atvejų ir nustatėme, kad kelios miRNR, įskaitant miR-133b , buvo sumažintos klasės GIST. Vėliau kiekybinė realaus laiko atvirkštinė transkripcija-PGR atskleidė, kad fascin-1 mRNR buvo sureguliuota pagal miR-133b žemąjį reguliavimą aukšto lygio GIST; šis rezultatas atitiko ankstesnę ataskaitą, rodančią, kad fascin-1 gali būti tiesioginis miR-133b taikinys . Tuomet mes ištyrėme fascin-1 baltymo raišką imunohistocheminiu dažymu 147 GIST atvejais ir nustatėme, kad fascin-1 per didelis ekspresija buvo reikšmingai koreliuojama su trumpesniu išgyvenamumo be ligos laiku ir keliais agresyviais patologiniais veiksniais, įskaitant naviko dydį, mitozinį skaičių, rizikos laipsnį., kraujagyslių invazija ir gleivinės išopėjimas. Mūsų rezultatai rodo, kad miR-133b sureguliavimas ir per didelis fascin-1 ekspresija gali atlikti svarbų vaidmenį progresuojant GIST, o fascin-1 gali būti naudingas biomarkeris numatant agresyvų elgesį.

Pagrindinis

Virškinimo trakto stromos navikas (GIST) yra labiausiai paplitęs virškinimo trakto mezenchiminis navikas. 1, 2 KIT arba PDGFRA geno funkcinės mutacijos yra pagrindinis molekulinis įvykis GIST vystymuisi, o tirozino kinazės inhibitoriai, nukreipti į KIT ir PDGFRA onkoproteinus, yra kliniškai naudojami pažengusiems navikams. 3, 4, 5, 6 GIST rodo platų biologinio elgesio spektrą, nuo gerybinio iki piktybinio, o histologinis laipsnis, apibrėžtas naviko dydžio ir mitozinių skaičių deriniu, yra kliniškai naudingas paciento prognozei numatyti. 1, 2, 7, 8 Be to, kraujagyslių invazija 9 ir gleivinės išopėjimas 7 taip pat yra susiję su GIST agresyvumu. Tačiau molekulinis GIST progresavimo mechanizmas nėra iki galo išaiškintas.

MikroRNR (miRNR) yra maža (21–25 nukleotidų) nekoduojanti RNR, atliekanti svarbų reguliavimo vaidmenį ląstelių dauginimosi, diferenciacijos ir mirties procesuose. 10, 11 miRNR jungiasi per dalinę sekos homologiją į 3 ′ neperkeltą tikslinių pasiuntinių RNR (mRNR) regioną ir slopina tikslinius genus, slopindami vertimą arba skatindami mRNR skilimą. Buvo pranešta apie nevienodas miRNR ekspresijas sergant kelių rūšių vėžiu; vėžyje sureguliuotos miRNR gali veikti kaip onkogenai, nes neigiamai reguliuoja naviką slopinančius genus, tuo tarpu kai kai kurių miRNR vėžio sumažėjimas gali sukelti onkogenų padidėjimą. 12, 13 Daugėja įrodymų, kad unikalūs miRNR raiškos profiliai kiekvienam vėžio tipui būtų naudingi biomarkeriai diagnozuojant ir prognozuojant vėžį. 12, 14 Kalbant apie GIST, miRNR raiškos tyrimai atskleidė, kad nenormali miRNR išraiška yra susijusi su 14q trynimu, dažnu GIST chromosomų anomalija. 15, 16 Visai neseniai atliktas tyrimas pranešė, kad miR-199a padidėjimas buvo susijęs su didelės rizikos laipsnio ir blogesnėmis prognozėmis pacientams, sergantiems GIST. 17 Tačiau norint išsiaiškinti miRNR vaidmenį kuriant ir progresuojant GIST, reikalinga papildoma analizė.

Šiame tyrime mes nustatėme keletą miRNR, kurios buvo žymiai sumažintos aukšto lygio GIST. Tarp tokių miRNR pranešta, kad miR-133b yra sureguliuotas kai kurių rūšių vėžiui, įskaitant stemplės plokščiųjų ląstelių karcinomą, o miR-133b gali tiesiogiai reguliuoti fascin-1 raišką ( fascininis homolog-1, FSCN1 , dar vadinamas fascinu )., onkogeninis aktiną surišantis baltymas stemplės plokščiųjų ląstelių karcinomos atveju. 18 Šie atradimai paskatino išsiaiškinti galimą fascin-1 ekspresijos GIST klinikopatologinę reikšmę.

medžiagos ir metodai

Bylos medžiaga

Iš viso 147 pirminės GIST atvejai buvo gauti iš Kyushu universiteto, Fukuoka, Japonija, Anatominės patologijos katedros bylų. Nė vienas iš atvejų prieš pradinę chirurginę operaciją nebuvo gydomas imatinibu. Kiekvienas GIST buvo įvertintas atsižvelgiant į klinikopatologinius ir histologinius požymius, įskaitant naviko dydį, mitozinį skaičių, kraujagyslių invaziją ir gleivinės opą. Mitozės buvo suskaičiuotos ir susumuotos iš 50 didelės galios laukų (HPF). Kraujagyslių invazija buvo įvertinta pagal mūsų ankstesnį tyrimą. 9 Kiekvieno naviko laipsnis buvo nustatytas derinant naviko dydį ir mitozinį skaičių, remiantis dviem klasifikavimo sistemomis: sistema, kurią pasiūlė Fletcher et al 1 Nacionalinių sveikatos institutų (NIH) konsensuso posėdyje, ir sistema, kurią pasiūlė Miettinen et al 2. ginkluotosios jėgos patologijos institute (AFIP). Imunohistocheminis dažymas buvo atliktas 147 atvejais, o prognostiniai duomenys, turintys ilgą stebėjimo laiką, buvo gauti 105 atvejais.

Tarp 147 atvejų 19 atvejų taip pat buvo gauti identiški greitai užšaldyti mėginiai, palaikantys pakankamą RNR kokybę mikrotraumos tyrimui.

Šį tyrimą patvirtino Kyushu universiteto Priežiūros komitetas (Nr. 24–24).

KIT ir PDGFRA genų mutacijų analizė

Genominė DNR buvo išgauta iš greitai užšaldytų mėginių, naudojant standartinį proteinazės K skaidymą ir fenolio / chloroformo ekstrahavimą. Kaip buvo pranešta anksčiau, 19 GIST atvejų ištirtos KIT geno 9, 11, 13 ir 17 egzonų bei PDGFRA geno 12 ir 18 egzonų mutacijos. 6 Toliau suskirstėme KIT genotipą į agresyvųjį genotipą (KIT exon 11 delecijos arba KIT exon 9 dubliavimosi) ir indolent genotipą (KIT exon 11 missense mutacija, KIT exon 11 vidinis tandemo dubliavimasis arba KIT wild), nes GIST su KIT exon 11 delecija arba KIT 9 egzono dubliavimasis turi agresyvesnį biologinį elgesį nei kiti genotipai (apžvelgti Lasota ir Miettinen 3 nuorodose).

RNR ekstrahavimas ir miRNR ekspresijos profiliavimas

Visa RNR, įskaitant mažas RNR, buvo išgaunama iš greitai užšaldytų audinių naudojant miRNeasy mini rinkinį (QIAGEN, Valensija, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Prieš atliekant mikrotraumos analizę, RNR kokybei patikrinti buvo atlikta RNR elektroforezė. Buvo laikoma, kad devyniolika GIST mėginių, kuriuose aiškiai nustatyta 18sRRNR ir 28srRNR smailės, turi pakankamos kokybės RNR, kad būtų galima atlikti mikrotraumos tyrimą. Ištraukta visa RNR buvo pažymėta Hy5, naudojant „miRCURY LNA Array miR“ ženklinimo rinkinį („Exiqon“, Vedbaek, Danija). Ženklintos RNR buvo hibridizuotos ant 3D-Gene žmogaus miRNR Oligo mikroschemų, turinčių 904 žmogaus miRNR ir 107 virusinių miRNR antisensinių zondų dublikatus (Toray, Kamakura, Japonija). Zondų anotacijos ir oligonukleotidų sekos buvo patvirtintos naudojant miRBase miRNR duomenų bazę (//microrna.sanger.ac.uk/sequences/). Po griežtų plovimų, fluorescenciniai signalai buvo nuskaityti „ScanArray Express Scanner“ (PerkinElmer, Waltham, MA, JAV) ir išanalizuoti naudojant „GenePix Pro 5.0“ versiją (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, JAV). Neapdoroti kiekvienos dėmės duomenys buvo normalizuoti pakeičiant foninio signalo vidutiniu intensyvumu, nustatomu pagal visų tuščių taškų signalo intensyvumą, esant 95% pasikliautiniems intervalams. Buvo laikomi galiojantys abiejų pasikartojančių taškų, kurių signalo intensyvumas buvo> 2 sd, foninio signalo intensyvumas. Santykinis duotos miRNR išraiškos lygis buvo apskaičiuotas palyginus galiojančių taškų vidurkio signalo intensyvumą su jų vidutine verte per mikrotraumos eksperimentus po normalizavimo jų mediana, pakoreguota lygiaverčiai. miRNR, diferencijuotai priklausomai nuo patologinių parametrų, buvo statistiškai identifikuojami naudojant t- testą. Neapdorotus mikrotraumos analizės duomenis galima rasti „Gene Expression Omnibus“ tinklalapyje (registracijos Nr. GSE36087, //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

„ MiR-133b“ kiekybinis realaus laiko RT-PGR

Mes ištyrėme miR-133b ekspresijos lygį kiekybiniu realaus laiko atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-PGR) būdu, kad patvirtintume mikrotraumos rezultatus. Trumpai tariant, visa RNR buvo ekstrahuota, kaip minėta aukščiau, ir cDNR buvo pagaminta atvirkštinės transkripcijos būdu naudojant „miScript“ atvirkštinės transkripcijos rinkinį (QIAGEN) pagal gamintojo instrukcijas. Naudodami „ABI 7500“ realaus laiko PGR sistemą („Applied Biosystems“, Foster City, CA, JAV), mes atlikome kiekybinę PGR miR-133b ir SCARNA17 ; pastaroji buvo endogeninė kontrolė. Kiekviename mėginyje esančiame PGR reagente buvo 50 ng cDNR, 25 μl QuantiTect SYBR žaliojo PGR pagrindinio mišinio, 5 μl miScript Universal Primer kaip atvirkštinio grunto ir 5 μl miScript Primer Testo, skirto kiekvienam miR-133b (MS00031430). arba SCARNA17 (MS00014014) kaip priekinis gruntas. Ciklo sąlygas galima pamatyti gamintojo instrukcijose (//www.qiagen.com/). Standartinės kreivės buvo sudarytos naudojant virškinimo trakto sienelės naviko audinio cDNR mėginių nuoseklų praskiedimą. MiRNR kiekis kiekviename GIST mėginyje buvo įvertintas palyginus su standartinėmis kreivėmis, o miR-133b ir SCARNA17 kiekio santykis buvo naudojamas kaip santykinis miR-133b ekspresijos lygio matas kiekviename GIST mėginyje.

Kiekybinis realaus laiko RT-PGR, skirtas Fascin-1 mRNR

Iškėlę hipotezę, kad fascin-1 gali būti kandidatas į miR-133b taikymą GIST, kaip ir stemplės plokščiųjų ląstelių karcinomos atveju (žr. Rezultato skyrių), mes ištyrėme fascin-1 mRNR lygį kiekybiniu realaus laiko RT-PGR ir palyginome. su miR-133b ekspresijos lygiu 19 GIST atvejų. Trumpai tariant, kiekvieno mėginio PGR reagente buvo 50 ng cDNR, sukurto taip, kaip aprašyta aukščiau, 25 μl „QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix“ ir 5 μl „QuantiTect“ pradmenų testo, kuriame yra ir priekiniai, ir atvirkštiniai pradmenys, skirti kiekvienam fascin-1 (QT00019747 ; QIAGEN) arba β-aktinas (QT01680476; QIAGEN); pastaroji buvo naudojama kaip endogeninė kontrolė. Kiekvienos GIST mėginio santykinis mRNR ekspresijos lygis buvo apskaičiuotas pagal fascin-1 kiekio santykį su β-aktino kiekiu.

Fascin-1 imunohistochemija

Imunohistocheminis dažymas buvo atliekamas su formalinu fiksuotuose ir parafinu įterptuose mėginiuose su pirminiais antikūnais prieš fascin-1 (pelės monokloniniai, klonas: 55K-2; skiedimas: 1/50; Dako Cytomation, Carpinteria, CA, JAV). Įvertinta citoplazminio imunoreaktyvumo dalis naviko ląstelėse. Proporcija buvo įvertinta pagal fascino-imunoreaktyvių naviko ląstelių procentą taip: neigiama (0%), 0; židinio (1–50%), 1; ir difuzinis (> 50%), 2. Intensyvumas įvertintas kaip neigiamas, 0; silpnas, 1; ir stiprus, 2. Kiekvienoje plokštelėje endotelio ląstelės rodė fascin-1 citoplazminę ekspresiją, o imunoreaktyvumas, lygus ar stipresnis nei endotelio ląstelėse, buvo laikomas stipriu pozityvumu. Bendras balas 0 (neigiama išraiška) arba 2 (židinio ir silpnoji išraiška) buvo paskirtas kaip „žemoji išraiška“, o balas 3 (židinio ir stipri išraiška arba difuzinė ir silpna išraiška) arba 4 (difuzinė ir stipri išraiška) buvo paskirta kaip „aukšta išraiška“.

Statistinė analizė

Koreliacija tarp miR-133b arba fascin-1 mRNR raiškos lygio ir klinikopatologinių parametrų buvo analizuota Pearsono koreliacijos testu arba Manno – Whitney U- testu. Koreliacija tarp fascin-1 baltymo lygio ir klinikopatologinių veiksnių buvo išanalizuota atliekant test 2 testą. Atliekant išgyvenamumą be ligos ir daugiamatę analizę, mes panaudojome Kaplan – Meier metodą atitinkamai pagal log-rank testą ir Cox proporcingo pavojaus modelį. Statistiškai reikšminga buvo P vertė <0, 05.

Rezultatai

KIT ir PDGFRA genų klinikinės patologinės išvados ir mutacijos

Klinikopatologiniai atradimai ir mutacijų analizės rezultatai 19 atvejų buvo apibendrinti 1 lentelėje. Pagal NIH rizikos laipsnį 4 atvejai buvo klasifikuojami kaip žemo laipsnio, 4 - kaip vidutinio lygio ir 11 - kaip aukšto lygio. Genų mutacijos buvo rasta KIT exon 9 atvejais 1 ir KIT exon 11 atvejų (delecija, 8 atvejai; missense mutacija 1 atvejis; vidinis tandemo dubliavimasis, 1 atvejis), tuo tarpu nei KIT, nei PDGFRA mutacijų nebuvo. 8 atvejai. Pirminės vietos buvo skrandis, plonoji ir storosios žarnos atitinkamai 10, 7 ir 2 atvejais.

Pilno dydžio lentelė

Skirtingai išreikštos miRNR priklausomai nuo klinikopatologinių veiksnių: prižiūrima analizė

Atlikdami prižiūrimą analizę, mes nustatėme, kad maždaug 10–70 miRNR buvo skirtingai ekspresuojami atsižvelgiant į individualius klinikopatologinius parametrus, tokius kaip pirminė vieta, naviko dydis, mitozinis skaičius, naviko laipsnis ir KIT genotipas (duomenys nepateikti). 2 lentelėje parodyta 24 miRNR, kurių reguliavimas buvo aukšto laipsnio NIH GIST, palyginti su žemo ar vidutinio laipsnio GIST ( P <0, 05, buvusio mediana / pastarojo mediana <0, 8). Norėdami susiaurinti miRNR kandidatus, susijusius su naviko progresavimu, mes palyginome savo duomenis su ankstesnio Choi ir kt. Tyrimo duomenimis . 15 Mes nustatėme, kad miR-133b buvo vienintelė miRNR, kuri buvo smarkiai sumažinta NIH aukšto lygio GIST abiejose kohortose (Choi ir kt. 15 papildoma 4 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

„ MiR-133b“ ir „ Fascin -1“ kiekybinis realaus laiko RT-PGR

Mes ištyrėme miR-133b išraiškos lygį kiekybiniu realaus laiko RT-PGR, kad patvirtintume mikrotraumos rezultatą 19 GIST atvejų ir patvirtinome, kad miR-133b išraiška buvo mažesnė NIH aukšto lygio GIST nei vidutiniškai iki - žemos kokybės GIST ( P = 0, 0575, 1a pav.). Be to, miR-133b ekspresijos lygis buvo atvirkščiai koreliuojamas su mitoziniu skaičiumi ( P = 0, 0275). Pirminė vieta, naviko dydis, AFIP laipsnis ir KIT genotipas nebuvo koreliuojami su miR-133b lygiu (atitinkamai P = 0, 5676, P = 0, 4829, P = 0, 1416 ir P = 0, 3218).

Image

„ MiR-133b“ ir „ fascin-1 mRNR“ ekspresijos lygiai nustatomi realaus laiko RT-PGR. ( a ) miR-133b išraiška paprastai buvo mažesnė aukšto lygio GIST nei vidutinio ar žemo laipsnio GIST ( P = 0, 0575). ( b ) „ miR-133b“ ekspresijos lygis buvo atvirkščiai koreliuojamas su fascin-1 mRNR ( r = –0, 47, P = 0, 0453). ( c ) fascin-1 mRNR lygis buvo reikšmingai koreliuojamas su fascin-1 baltymo lygiu, nustatytu imunohistocheminiu dažymu ( P = 0, 0003). ( d ) Fascin-1 mRNR buvo reikšmingai padidinta NIH aukštos rizikos GIST, palyginti su vidutinio ir žemo laipsnio GIST, lygiu ( P = 0, 0064).

Visas dydis

Tada mes patikrinome numatomą miR-133b mRNR taikinį naudodami „TargetScan“ (//www.targetscan.org/) ir nustatėme 648 numatomus taikinius, įskaitant FSCN1 ( fascin-1 ), MCL1 ( mieloidinių ląstelių leukemijos seka 1 ) ir FLT1 ( kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptoriai ). Kadangi ankstesnis stemplės plokščiųjų ląstelių karcinomos tyrimas atskleidė, kad fascin-1 raišką iš tikrųjų reguliuoja miR-133b , 18 nusprendėme ištirti koreliaciją tarp miR-133b ir fascin-1 raiškos lygių bei fascin-1 klinikopatologinę reikšmę ESME. Naudojant kiekybinį realaus laiko RT-PGR, 19 GIST atvejų miR-133b ekspresijos lygis buvo atvirkščiai koreliuojamas su fascin-1 mRNR ( r = −0, 47, P = 0, 0453) ekspresijos lygiu (1b paveikslas). Fascin-1 mRNR raiškos lygis buvo reikšmingai koreliuojamas su fascin-1 baltymo lygiu, nustatytu imunohistocheminiu dažymu ( P = 0, 0003; 1c paveikslas). Be to, didesnė fascin-1 mRNR raiška taip pat reikšmingai koreliavo su NIH aukštos rizikos laipsniu ( P = 0, 0064; 1d pav.), AFIP didelės rizikos laipsniu ( P = 0, 0275) ir didesniu mitoziniu skaičiumi (> 5/50 HPF, P = 0, 0114), bet ne su pagrindine vieta (skrandis ir žarnynas, P = 0, 3272) ar naviko dydžiu (> 5 vs ≤5 cm, P = 0, 1414). Fascin-1 mRNR raiškos lygis buvo žymiai didesnis GIST, turinčių agresyvų KIT genotipą (KIT egzono 11 delecija arba KIT egzono 9 dubliavimasis), nei tų, kurių indolent KIT genotipas (KIT exon 11 missense mutacija, KIT exon 11 vidinio tandemo dubliavimas ar KIT laukinis; P = 0, 0455). Tačiau tai nebuvo koreliuojama su KIT mutacijos buvimu ar nebuvimu (bet kokios rūšies mutacija prieš laukinę, P = 0, 1167).

Fascin-1 baltymo ekspresija ir jo klinopatologinė reikšmė

Imunohistocheminį ir klinikopatologinį tyrimą išplėtėme iki 147 chirurginės rezekcijos GIST atvejų. 147 pacientai sudarė 74 vyrai ir 73 moterys, kurių amžius nuo 20 iki 93 metų (mediana, 64 metai). Navikas buvo nuo 1, 2 iki 27 cm dydžio (vidutinis, 5, 8 cm). Mitozinis skaičius svyravo nuo 0 iki 121 per 50 HPF (mediana, 3/50 HPF). Pagal NIH rizikos laipsnį 4 atvejai buvo klasifikuojami kaip labai žemi, 36 - kaip žemi, 55 - kaip vidutiniai ir 52 - kaip aukšti. Pagal AFIP rizikos laipsnį 35 atvejai buvo klasifikuojami kaip labai žemi, 35 - kaip žemi, 34 - kaip vidutiniai ir 43 - kaip aukšti. Pirminės vietos buvo skrandis ir žarnynas atitinkamai 106 ir 41 atvejais. Kraujagyslių invazija ir gleivinės išopėjimas buvo atitinkamai 29 ir 50 atvejų (2a ir b paveikslai). Fascin-1 baltymo ekspresija buvo klasifikuojama kaip neigiama (bendras balas 0; n = 77), silpnas židinys (bendras balas 2; n = 30), židinio stiprumas (bendras balas 3; n = 2), difuzinis silpnas (bendras balas 3; n = 14) ir difuzinis stiprus (bendras balas 4; n = 24; 2c ir d paveikslai). Todėl 77, 30, 16 ir 24 atvejai buvo vertinami atitinkamai kaip 0, 2, 3 ir 4, o tai atitiko žemą (visi balai 0, 2) ir aukštą (bendras balas 3, 4) išraiškas 107 (73%). ir 40 (27 proc.) atvejų. 3 lentelėje apibendrinta koreliacija tarp fascin-1 baltymo ekspresijos lygio (žemo ir aukšto) ir klinikopatologinių parametrų. Aukšta fascin-1 ekspresija reikšmingai koreliavo su didesniu naviko dydžiu ( P = 0, 0243), didesniu mitoziniu skaičiumi ( P <0, 0001), aukšto laipsnio NIH ( P <0, 0001), AFIP aukšto laipsnio ( P <0, 0001) ir kraujagyslių buvimu. invazija ( P <0, 0001) ir gleivinės išopėjimas ( P <0, 0001), bet ne su pirminės naviko vieta ( P = 0, 4156).

Image

Histologiniai radiniai ( a, b ) ir imunohistocheminis dažymas fascin-1 ( c, d ) GIST. a ) Kraujagyslių invazija. Naviko trombą venoje rodo rodyklė, o arteriją - rodyklė. b ) gleivinės opa. Naviko ląstelės įsiveržia į gleivinę, o gleivinės epitelis išnyksta ties opa. c ) silpna fascin-1 ekspresija. Imunoreaktyvumas fascin-1 naviko ląstelėse yra silpnesnis nei endotelio ląstelėse. d ) stipri fascin-1 ekspresija. Naviko ląstelės rodo nuolatinį fascin-1 imunoreaktyvumą.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Tolesnė informacija buvo prieinama 105 atvejais. Visais 105 atvejais gydymas imatinibu nebuvo atliekamas nei prieš, nei po pirmosios operacijos, kol nepasikartojo ir (arba) nebuvo metastazių. Prognostinė analizė nebuvo įtraukta į kepenų ir (arba) pilvaplėvės metastazių atvejus pirminės operacijos metu. Vietinis pasikartojimas arba pilvaplėvės metastazės įvyko 7 atvejais, o tolimos metastazės, kurios dažniausiai buvo kepenų metastazės, 15 atvejų buvo po pirminės operacijos. Iš viso 17 atvejų (16%) pirminės lokalizuotos GIST po operacijos pasikartojo ir (arba) atsirado metastazių. Buvo išanalizuotos fascin-1 raiškos lygio prognostinės vertės ir kiti klinikopatologiniai išgyvenamumo be ligų parametrai. Didelė fascin-1 ekspresija (3 ir 4 balai) reikšmingai koreliavo su trumpesniu išgyvenamumo be ligos laiku, palyginti su žemu ekspresijos lygiu (0 ir 2 balai, P <0, 0001; 4 lentelė, 3a pav.). Be to, didesnis naviko dydis (> 5 cm, P = 0, 023), didesnis mitozinis skaičius (> 5/50 HPF, P <0, 0001), aukšto laipsnio NIH ( P <0, 0001), AFIP aukšto lygio ( P <0, 0001) ir buvimas kraujagyslių invazijos ( P <0, 0001) ir gleivinės išopėjimo ( P <0, 0001) kiekviena koreliacija buvo susijusi su blogesne vienmatės analizės prognoze (4 lentelė, 3b – d paveikslai). Pirminė vieta (skrandis ir žarnynas) neturėjo įtakos išgyvenamumo be ligos skirtumui. Atliekant daugiamatę analizę, auglio dydis, mitozinis skaičius ir kraujagyslių invazija buvo nustatyti kaip nepriklausomi blogesni prognoziniai išgyvenamumo be ligos prognostiniai veiksniai (atitinkamai P = 0, 0455, P = 0, 0055 ir P = 0, 0077; 4 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Image

Kaplan – Meier analizė atlikta 105 pacientams, kuriems nustatyta pirminė lokalizuota GIST. Didelė fascin-1 baltymo ( a ) išraiška, aukšto laipsnio NIH ( b ), kraujagyslių invazija ( c ) ir gleivinės išopėjimas ( d ) yra reikšmingai koreliuojami su trumpesniu išgyvenamumo be ligos periodu (kiekvienas P <0, 0001).

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes ištyrėme miRNR raiškos profilį GIST ir nustatėme, kad miR-133b buvo sureguliuotas aukšto lygio navikuose, palyginti su žemesnio laipsnio navikais, o tai atitiko ankstesnę ataskaitą. 15 Naujausi tyrimai pranešė, kad miR-133b , pavaizduota 6p12.2 chromosomoje, buvo sumažintas šlapimo pūslės, storosios žarnos, plaučių ir stemplės karcinomų reguliavimas. 18, 19, 20, 21 Jeigu miR-133b nereguliuotas vėžio ląstelėse, atrodo, kad padidėja tikslinė mRNR, taigi, per daug ekspresuojama arba suaktyvinama onkoproteinas. Sergant plaučių vėžiu, miR-133b sumažėjęs reguliavimas yra susijęs su MCL-1 ir BCL2L2 padidėjimu , kas rodo antiapoptozinį vaidmenį. 21 Kano ir kt. 18 pranešė, kad miR-133b yra sumažintas stemplės plokščiųjų ląstelių karcinomos klinikinių mėginių reguliavimas, palyginti su normaliu epiteliu. Be to, jie nustatė, kad miR-133b indukcija slopino fascin-1 ekspresiją plokščiųjų ląstelių karcinomos ląstelių linijose, o nutildžius fascin-1 funkciją siRNR, buvo užkirstas kelias plačiakampių ląstelių karcinomos ląstelių proliferacijai ir invazijai, kas rodo, kad miR-133b gali būti naviką slopinančią miRNR ir tiesiogiai kontroliuoja onkogeninį fascin-1 geną. Todėl hipotezėme, kad miR-133b nuvertinimas gali būti susijęs su fascin-1 padidėjimu progresuojant ir GIST.

Fascinai yra aktiną surišantys baltymai ir yra svarbūs palaikant ir stabiliai siūlinio aktino pluošto pluoštus įvairiose ląstelėse. 22, 23 fascino gebėjimas surišti ir surišti aktiną turi pagrindinį vaidmenį reguliuojant ląstelių adheziją ir migraciją. Žmogaus audinyje yra trys fascinų potipiai: fascin-1, fascin-2 ir fascin-3. Fascin-1 yra plačiai ekspresuojamas mezenchiminiame audinyje ir nervų sistemoje, tuo tarpu fascin-2 ir fascin-3 yra būdingi atitinkamai tinklainės fotoreceptorių ląstelėms ir sėklidėms. Nors fascin-1 raiškos normaliame epitelyje nėra arba jo yra labai mažai, jis reguliuojamas kelių rūšių karcinomų, įskaitant plaučių, stemplės, skrandžio, storosios žarnos, kasos ir šlapimo pūslės, atvejais. 24, 25, 26, 27, 28, 29 Taip pat padidėjęs fascin-1 ekspresija yra susijęs su blogesne kelių rūšių karcinomų prognozėmis ir metastazėmis. 25, 26, 27. Fascin-1 vaidmuo karcinomose taip pat buvo išbandytas ląstelių linijose ir pelių modeliuose. 28, 30, 31, 32, 33 Bendrai šie atradimai rodo, kad fascin-1 funkciškai prisideda prie naviko progresavimo, ypač kalbant apie invaziją ir metastazes.

Nebuvo iki galo išaiškinti fascin-1 transkripcijos reguliavimo molekuliniai mechanizmai; tačiau cAMP atsaką į elementą surišantis baltymas ir arilo angliavandenilių receptoriai yra teigiami kandidatai, kurie sustiprina fascin-1 promotoriaus aktyvumą. 23, 34. Priešingai, manoma, kad kelios miRNR, tokios kaip miR-133a, 133b, 143 ir 145 , neigiamai reguliuoja fascin-1 nuorašą kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse 35 ir karcinomos ląstelėse, įskaitant urotelinės karcinomos ir plokščialąstelinių ląstelių karcinomos ląsteles. 18, 36 Šios miRNR turi konservuotas sekas 3 'netransliuojamoje fascin-1 srityje . Šiame tyrime miR-133b raiškos lygis buvo atvirkščiai koreliuojamas su fascin-1 mRNR raiška mūsų GIST klinikinių mėginių serijoje. Tačiau negalime pereiti prie išvados, kad miR-133b yra pagrindinis fascin-1 geno reguliatorius GIST ląstelėse, nes mes neatlikome funkcinio tyrimo, naudodami GIST ląstelių linijas. Be to, fascin-1 raišką taip pat gali reguliuoti aukščiau nurodytas molekulinis mechanizmas, įskaitant miRNR, išskyrus miR-133b .

Nepaisant to, mes nustatėme, kad padidėjusi fascin-1 baltymo išraiška buvo maždaug ketvirtadalyje GIST ir tai reikšmingai koreliavo su trumpesniu išgyvenamumo be ligos periodu, didesniu kepenų metastazių dažniu ir keliais agresyviais patologiniais veiksniais, įskaitant naviko dydį., mitozinis skaičius, rizikos laipsnis, kraujagyslių invazija ir gleivinės išopėjimas. Mūsų rezultatas atitinka fascin-1, kaip onkoproteino, funkciją ir rodo, kad fascin-1 gali turėti svarbų vaidmenį progresuojant GIST. Tai yra pirmoji ataskaita, kurioje parodytas fascin-1 raiškos paplitimas ir klinikinė patologija didelėje GIST serijoje. Ankstesniame tyrime, kuriame buvo tiriamos kelios sarkomų rūšys, folikulų dendritinių ląstelių auglyje dažnai buvo stebimas fascin-1 per didelis išsiskyrimas, tuo tarpu jis pasireiškė tik 1 iš 13 (8%) GIST atvejų. 37

Ankstesniame mūsų tyrime kraujagyslių invazija buvo reikšmingai koreliuojama su dideliu kepenų metastazių dažniu GIST. Dėl per didelio fascin-1 ekspresijos GIST ląstelėse gali padidėti naviko ląstelių invaziškumas ir padėti joms įsiskverbti į kraujagysles. Keleto kepenų ląstelių karcinoma sergančių pacientų venų invazijos ir intrahepatinės metastazės buvo labiau paplitusios fascin-1 teigiamų atvejų atvejais. 38

Panašiai gleivinės opų buvimas buvo susijęs ir su blogesne prognoze, ir su fascin-1 perdėta ekspresija dabartinėje GIST serijoje. Ankstesnis Miettinen et al 7 atliktas tyrimas taip pat pranešė, kad opos yra agresyvus skrandžio GIST elgesys. Šie duomenys rodo, kad fascin-1 per didelis ekspresas gali prisidėti prie GIST ląstelių invazijos į gretimą audinį ir sukelti opų susidarymą gleivinėje.

Nors fascin-1 per didelis ekspresija buvo koreliuojamas su blogesne vienfaktorių analizės prognoze, tai nebuvo savarankiškas prognostinis faktorius daugiamatėje analizėje (4 lentelė). Vienas iš galimų šio neatitikimo paaiškinimų yra tas, kad kiti prognostiniai veiksniai gali painioti kintamuosius daugiamatėje analizėje, nes fascin-1 raiška buvo stipriai koreliuojama su kitais prognostiniais veiksniais, tokiais kaip naviko dydis, mitozė, rizikos laipsnis, kraujagyslių invazija ir gleivinės išopėjimas (3 lentelė). ).

Gerai žinoma, kad GIST su KIT exon 11 delecija arba KIT exon 9 dubliavimu turi agresyvesnį biologinį elgesį nei tie, kurie turi kitus genotipus. 3, 39 Šiame tyrime KIT genotipą suskirstėme į agresyvųjį genotipą (KIT exon 11 delecija arba KIT exon 9 dubliavimasis) ir indolent genotipą (KIT exon 11 missense mutacija, KIT exon 11 vidinė tandemo dubliacija arba KIT wild). Įdomu tai, kad fascin-1 mRNR lygis buvo žymiai didesnis GIST, turinčių agresyvų KIT genotipą, nei tiriamųjų, turinčių indolentinį KIT genotipą ( P = 0, 0455), nors buvo ištirtas ribotas atvejų skaičius. Rezultatas atitinka faktą, kad fascin-1 per didelis išraiška yra susijęs su agresyviu GIST elgesiu. Norint išsiaiškinti galimą KIT genotipo, fascin-1 perraiškos ir biologinio elgesio ryšį didesnėse GIST serijose, reikalingas papildomas tyrimas.

Neseniai buvo įrodyta, kad migrastatinas blokuoja naviko metastazes, jungdamasis su fascin-1 ir slopindamas fascino / aktino ryšį eksperimentiniame krūties karcinomos modelyje. Nors imatinibas iš pradžių yra veiksmingas pacientams, sergantiems metastazavusia GIST, antrinis atsparumas yra didelė klinikinė problema. Todėl būtina sukurti naują terapinį būdą. Norint ištirti fascin-1 kaip galimą terapinį taikinį ir migrastatino veiksmingumą pacientams, sergantiems metastazavusiu GIST, reikės atlikti papildomus tyrimus.

Apibendrinant, mes nustatėme, kad miR-133b yra galima kandidatė miRNR, kuri buvo sumažinta kartu su GIST progresu. Per didelis fascin-1, galimo miR-133b taikinys , ekspresija buvo koreliuojama su keliais agresyviais patologiniais veiksniais ir blogesne prognoze, leidžiančiais manyti, kad fascin-1 gali prisidėti prie GIST progreso, o fascin-1 gali būti naudingas biomarkeris numatant. agresyvus elgesys GIST.

Prisijungimai

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • GSE36087