Fibulino-3 tarpininkavimas slopinant epitelio ir mezenchiminį perėjimą ir Aldh + plaučių vėžio kamieninių ląstelių savaiminis atsinaujinimas per Igf1r signalus | onkogenas

Fibulino-3 tarpininkavimas slopinant epitelio ir mezenchiminį perėjimą ir Aldh + plaučių vėžio kamieninių ląstelių savaiminis atsinaujinimas per Igf1r signalus | onkogenas

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių signalizavimas
  • Epitelinis – mezenchiminis perėjimas
  • Plaučių vėžys
  • Savęs atsinaujinimas

Anotacija

Neseniai nustatyta, kad fibulinai (FBLN), tarpląstelinių matricos baltymų šeima, veikia kaip naviko slopikliai ar aktyvatoriai sergant įvairiais vėžiais, o pagrindiniai jų veikimo vėžio srityje molekuliniai mechanizmai išlieka neaiškūs. Anksčiau parodėme, kad FBLN3 raišką slopina promotoriaus hipermetilinimas ir yra susijęs su invaziškumu agresyvaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio atvejais. Šiame tyrime mes įvertinome FBLN3 vaidmenį ir signalizacijos mechanizmą plaučių vėžio kamieninėse ląstelėse (CSC). Priverstinė FBLN3 ekspresija slopino plaučių adenokarcinomos ląstelių invaziją ir migraciją bei sumažino epitelio - mezenchiminio perėjimo (EMT) aktyvatorių, įskaitant N-kadheriną ir sraigę, ekspresiją. FBLN3 taip pat slopino plaučių adenokarcinomos ląstelių kamieninį aktyvumą - tai rodo sferoido susidarymo sumažėjimas ir kamieninių žymenų, tokių kaip Sox2 ir β-kateninas, lygio sumažėjimas. Šis FBLN3 poveikis buvo susijęs su glikogeno sintazės kinazės-3β, GSK3β / β-katenino keliu ir aukščiau esančiais GSK3β reguliatoriais, įskaitant fosfoinositido 3-kinazės (PI3K) / AKT ir į insuliną panašų augimo faktoriaus-1 receptorių (IGF1R)., buvo inaktyvuotos FBLN3. Be to, buvo įrodyta, kad IGF1R yra tiesioginis FBLN3, kuris konkurencingai slopina į insuliną panašų augimo faktorių (IGF), taikinys. Norėdami patvirtinti FBLN3 poveikį plaučių CSC, aldehido dehidrogenazės teigiamais (ALDH +) A549 plaučių CSC buvo surūšiuoti ir apdoroti rekombinantiniu FBLN3 baltymu. FBLN3 aiškiai slopino EMT, kamieno aktyvumą ir per daug suaktyvintą ALDH + CSC subpopuliacijos IGF1R / PI3K / AKT / GSK3β kelią. Be to, rekombinantinio FBLN3 baltymo injekcija aplink poodinius ksenografus, nustatytus ALDH + CSC, atletiškoms nuogoms pelėms reikšmingai slopino naviko augimą ir progresavimą. Apskritai, mūsų rezultatai rodo, kad FBLN3 slopina EMT ir savaiminį plaučių CSC atsinaujinimą moduliuodamas IGF1R / PI3K / AKT / GSK3β kelią, ir kad FBLN3 būtų naudingas kaip alternatyvi CSC terapija.

Įvadas

Plaučių vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių mirties nuo vėžio priežasčių visame pasaulyje. Nesmulkialąstelinis plaučių vėžys (NSCLC), kuris sudaro ∼ 80% visų plaučių vėžio atvejų, dėl jo agresyvumo yra susijęs su prastu 5 metų išgyvenimu (15%). 1 Pažangos, susijusios su ląstelių signalizacijos keliais, tokiais kaip epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR) kelias, kuris kontroliuoja naviko ląstelių išgyvenimą, supratimas, nustatė genetinius ir norminamuosius pokyčius, susijusius su naviko ląstelių augimu, ir pacientų atranką naudojant genetinius žymenis ir molekulinę terapiją. pagerėjo klinikiniai rezultatai. 2 Vis daugiau įrodymų rodo, kad daugelio rūšių vėžį, įskaitant plaučių vėžį, gali paskatinti vėžinės kamieninės ląstelės (CSC), kurios gali būti atsakingos už blogą plaučių vėžio baigtį. 3, 4 Todėl kaip dar viena perspektyvi vėžio gydymo strategija buvo pasiūlyta nukreipti signalinius kelius, kurie yra kritiški plaučių KSC. 5

CSC yra retas nediferencijuotų ląstelių rinkinys, kuris gali inicijuoti naviko susidarymą ir generuoti daugiapotencialius pirmtakus, gaminančius nevienalytę vėžio ląstelių populiaciją. Jie apibūdinami kaip ląstelės, sudarančios ląstelių sferas ir turinčios tumorigeninį poveikį in vivo ksenografų tyrimuose. Pirmiausia buvo pranešta apie CSC hipotezę pagrindžiančius eksperimentinius įrodymus atliekant leukemiją sukeliančius CSC. Dabar nustatyta 6 CSC daugeliui žmonių, 7, 8, įskaitant krūties, smegenų ir plaučių vėžį. CSC buvo pasiūlyta kaip naviko agresyvumo ir blogos prognozės priežastis, nes jie parodo vidinį atsparumą radiacijai ir chemoterapijai. 3 Be to, atradimas CSC populiacijoje, kuriai būdingas epitelio ir mezenchiminis perėjimas (EMT), sukeliantis metastazes, sustiprino CSC tyrimų svarbą kuriant vėžį. 4 CSC hipotezė turi esminę klinikinę reikšmę. Nors dabartinės gydymo strategijos gali paveikti didžiąją dalį navikinių ląstelių, jos palieka terapijai atsparius CSC, kurie yra rezervuaras ligos pasikartojimui ir metastazėms. 9 Taigi, norint nustatyti galimus terapinius taikinius, svarbu išaiškinti molekulinius kelius, kurie reguliuoja CSC savybes ir jų sąveiką su aplinka.

Fibulinai (FBLN) yra išskiriamų glikoproteinų grupė, kuriai būdingi epidermio augimo faktoriaus (EGF) tipo domenų pakartojimai. Jie yra plačiai ekspresuojami tarpląstelinės matricos (ECM) baltymai ir dalyvauja ląstelių tarpusavio ryšyje ir stabilizuoja ECM struktūrą, funkcijas, svarbias normaliai organogenezei ir embriono vystymuisi. FBLN taip pat yra susijęs su kietų navikų, tokių kaip krūties ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys, išsivystymu 11, tačiau sunku apibrėžti jų vaidmenį pradedant vėžį ir progresuojant. FBLN yra ekspresuojami navikuose ir slopina arba skatina ląstelių augimą, atsižvelgiant į ląstelių kontekstą. Naujausi tyrimai parodė, kad per didelis FBLN5 ekspresija susijęs su storosios žarnos vėžio 11 augliogeniškumu ir auglių augimo bei invazinio elgesio slopinimu sergant plaučių vėžiu. 12 FBLN3, FBLN5 homologo, vaidmuo tumorigeniškumui taip pat skiriasi įvairiose ląstelių linijose, 13, 14, o jo funkcijos sergant vėžiu vis dar nežinomos.

Mes parodėme, kad FBLN3 slopina invazinį A549 NSCLC ląstelių elgesį per transkripcinį matricos metaloproteinazės (MMP) -7 ir MMP-2 slopinimą. 15 Invaziškumas yra būdinga EMT ir CSC savybė. Be to, žinoma, kad A549 ląstelės apima kamieninių ląstelių populiaciją, sudarančią ∼ 24% visos ląstelių populiacijos. 16 Remdamiesi šiais duomenimis, mes ištyrėme, ar FBLN3 gali reguliuoti plaučių CSC. Buvo išanalizuotas FBLN3 per daug ekspresuojančių A549 ląstelių EMT ir kamienai, taip pat išanalizuotas FBLN3 baltymo poveikis plaučių CSC, surūšiuotam iš A549 NSCLC ląstelių populiacijos.

Rezultatai

FBLN3 slopina EMT plaučių adenokarcinomos ląstelėse

Anksčiau parodėme, kad per didelis FBLN3 ekspresija, kurios raiška sumažėja žmogaus plaučių adenokarcinomos audinyje (1 papildomas paveikslas), sumažino A549 ląstelių invaziją slopindama MMP raišką. 15 Priverstinė FBLN3 ekspresija A549 NSCLC ląstelėse taip pat žymiai sumažino ląstelių migraciją ir pakito ląstelių morfologija - nuo verpstės formos į akmenimis panašias ląsteles (1a paveikslas, kairysis skydelis). Priešingai, FBLN3 ekspresijos slopinimas H460 ląstelėse padidino ląstelių invaziją / migraciją ir sukėlė verpstės formos ląstelių morfologinius pokyčius (1a paveikslas, dešinė panelė). Tokie morfologiniai pokyčiai ir padidėjęs ląstelių migracija / invaziškumas yra tipiškos EMT savybės. FBLN3 ekspresija NSCLC ląstelėse pakeitė mezenchiminių ląstelių savybes į epitelio ląstelių savybes. Remdamiesi šiomis išvadomis, mes iškėlėme hipotezę, kad FBLN3 yra neigiamas EMT reguliatorius NSCLC ląstelėse.

Image

FBLN3 slopino plaučių adenokarcinomos EMT. a ) FBLN3 poveikis invazijai ir migracijai į FBLN3 per daug ekspresuojančias A549 ląsteles ( FBLN3 ) arba FBLN3 slopinamas H460 plaučių vėžio ląsteles ( si-FBLN3 ). Invazijos / migracijos kameros, padengtos Matrigel, buvo naudojamos taip, kaip aprašyta Metodose. Ląstelės buvo nufotografuotos atliekant fazinio kontrasto mikroskopiją ir kiekybiškai įvertintos, tada rezultatai buvo nubraižyti. ( b ) Western blot analizė EMT žymeklių FBLN3-ekspresiją sukeliančiose A549 arba FBLN3 slopintose H460 ląstelėse. c ) FBLN3 per daug ekspresuojančių A549 ląstelių EMT žymenų imunofluorescencinė analizė. Tikslinės molekulės buvo tiriamos naudojant specifinius antikūnus ir atitinkamus antrinius antikūnus, konjuguotus su fluoresceino izotiocianatu (FITC). Branduoliai buvo nudažyti 4, 6-diamidino-2-fenilindoliu (DAPI). Kaip kontrolė buvo naudojamos pcDNA3.1 perkeltos ( VC ) arba kontrolinės mažos trukdančios RNR (siRNR) perkeltos ( si-Ctl ) ląstelės.

Visas dydis

EMT yra procesas, kurio metu suskaidomi daugiausia nuo E-kadherino priklausomi ląstelių kontaktai tarp gretimų epitelio ląstelių. 17 EMT metu E-kadherinas yra sumažintas, o N-kadherinas - padidintas, atitinkamai, transkripcijos faktoriais „Twist“ ir „Snail“. 18, 19 taip pat padidėja ZEB1 ekspresija, slopinanti E-kadherino geno ekspresiją. Tarpinis siūlinis baltymo vimentinas, būtinas mezenchiminių ląstelių migracijos reguliatorius, yra dar vienas svarbus EMT žymeklis, kuris reguliuoja EMT indukciją per šliužą ir onkogeninį H-Ras. 21 A549 ląstelė išreiškė labai žemą E-kadherino kiekį, tačiau N-kadherino ir vimentino buvo žymiai dideliu lygiu (1b pav.). Taip pat buvo aptinkami su EMT susiję transkripcijos veiksniai, įskaitant Twist, Snail ir ZEB1. Šliužų ekspresija A549 ląstelėse buvo labai maža; nors žinoma, kad jis yra tipiškas plaučių vėžio EMT reguliatorius. Šie A549 ląstelių mezenchiminiai fenotipai virsta epitelio ląstelėmis per daug ekspresuojant FBLN3. FBLN3 per didelis ekspresas A549 ląstelėse reikšmingai sumažino N-kadherino, vimentino, „Twist“, ZEB1 ir sraigės ekspresiją ir padidino E-kadherino ekspresiją (1b paveikslas, kairysis skydelis). Priešingai, FBLN3 slopinimas H460 ląstelėse sumažino E-kadherino kiekį ir padidino vimentino, „Twist“, ZEB1, sraigės ir šliužo kiekį (1b paveikslas, dešinė panelė). A549 ląstelių dažymas imunofluorescenciniu būdu E-kadherinui, N-kadherinui ir vimentinui patvirtino šiuos rezultatus (1c paveikslas). Šie molekuliniai įvykiai, lydintys 1a paveiksle pavaizduotus ląstelių pokyčius, patvirtina FBLN3 kaip neigiamo EMT reguliatoriaus vaidmenį plaučių adenokarcinomos atveju.

FBLN3 taip pat neigiamai reguliuoja plaučių adenokarcinomos ląstelių kamienus

EMT, kaip invazijos ir metastazių varomosios jėgos svarba vis labiau pripažįstama. Naujausi duomenys parodė ryšį tarp EMT ir CSC, kurie inicijuoja ir palaiko navikus. 22 Taigi mes apibūdinome mezenchiminių A549 ląstelių, susijusių su kamienu, savybes ir ištyrėme FBLN3 poveikį šioms savybėms.

CSC gali būti kultivuojami suspensijoje terpėje, kurioje nėra serumo, kurioje yra augimo faktorių, kad susidarytų plūduriuojantys rutuliniai kūneliai. Sferos formavimo tyrimas yra plačiai naudojamas kamieninėms ląstelėms atpažinti retrospektyviai, remiantis tyrimo naudingumu vertinant savarankišką atsinaujinimą ir diferenciaciją vienos ląstelės lygiu in vitro. 24 A549 ląstelių kultūrose rutulio formavimas buvo pastebėtas per 10 dienų (2a pav.), Tai rodo, kad A549 ląstelės turi didelę dalį į vėžines kamienines ląsteles. Šiose ląstelėse reikšmingi kiekiai buvo išreikšti stiebo žymenimis, tokiais kaip β-kateninas, Notch2 ir su kamienu susiję transkripcijos faktoriai (Sox2 ir Oct3 / 4) 25 (2b paveikslas). Tačiau FBLN3 per didelis ekspresija A549 ląstelėse slopino sferosidų susidarymą (2a pav.) Ir slopino kamieninių žymeklių raišką (2b paveikslas), tai reiškia, kad FBLN3 slopino CSC subpopuliacijos A549 ląstelėse atsinaujinimo aktyvumą. Kaip parodė kolonijų formavimo tyrimas, FBLN3 per didelis ekspresas slopino A549 ląstelių augimą (2c pav.). Kitų plaučių vėžio ląstelių linijų augimą panašiai slopino egzogeninis FBLN3, tiekiamas iš FBLN3 praturtintų kondicionuotų terpių (papildomi 2a ir b paveikslai). Gydymas FBLN3 praturtintomis kondicionuotomis terpėmis taip pat sumažino kamienų ir EMT žymenų išraišką plaučių vėžio ląstelėse (2d paveikslas), o šių reakcijų blokavimas FBLN3 antikūnu (papildomas 2c paveikslas) patvirtino, kad tarpląstelinis FBLN3 yra neigiamas kamienų reguliatorius. ir EMT NSCLC ląstelėse.

Image

FBLN3 neigiamai reguliuoja plaučių adenokarcinomos ląstelių kamieną. a ) Sferos susidarymas, kai FBLN3 per daug ekspresuoja A549 ląstelės ( FBLN3 ) apibrėžtoje kamieninių ląstelių terpėje, kurioje nėra serumo. Ląstelės buvo fotografuojamos atliekant fazinio kontrasto mikroskopiją ir nurodytas sferidų skaičius. b ) kamieninių žymeklių Western blot analizė FBLN3 viršijančiose A549 ląstelėse. c ) FBLN3 per daug ekspresuojančių A549 ląstelių kolonijų susidarymo tyrimas. Ląstelės buvo fotografuojamos atliekant fazinio kontrasto mikroskopiją ir kiekybiškai įvertintos. Kaip kontrolė buvo naudojamos pcDNA3.1 perkeltos ( VC ) A549 ląstelės. d ) kamieninių žymeklių Western blot analizė plaučių karcinomos ląstelėse (A549, H1299 ir H460), apdorotose FBLN3 praturtintomis kondicionuotomis terpėmis (A / F / M). 15

Visas dydis

Gydymas FBLN3 sumažino β-katenino kiekį per IGF1R / PI3K / AKT / GSK3β kelią

Naujausiose ataskaitose buvo aprašytas signalo perdavimo kelių, susijusių su EMT, ir stiebo skerspjūvis. 4, 25 Smad kompleksas yra siūlomas kaip signalo konvergencijos taškas, susijęs su Wnt keliu 26, o EMT, 27 ir β-kateninas yra vienas iš svarbių Smad komplekso komponentų. Nors FBLN3 nurodytas signalizacijos kelias plaučių vėžiu nenustatytas, ankstesniame skyriuje aprašyti rezultatai rodo, kad FBLN3 reguliuoja β-katenino ekspresiją NSCLC ląstelėse. Β-katenino poveikis EMT ir su kamienu susijęs NSCLC ląstelių signalizavimas buvo vertinamas atliekant β-katenino numušimą. β-Catenin slopinimas A549 ląstelėse slopino kamienų ir EMT žymenų raišką (3a paveikslas) ir lydėjo sumažėjusią A549 ląstelių invaziją ir migraciją (3b paveikslas). Dėl β-katenino slopinimo taip pat pasikeitė ląstelių morfologija ir sumažėjo ląstelių augimas (3c pav.), Atsižvelgiant į poveikį FBLN3 per daug ekspresuojančioms A549 ląstelėms. Kita vertus, FBLN3 per didelis ekspresija slopino fosforilinimo sukeltą AKT, su tarpląsteliniu signalu susijusios kinazės ir branduolio faktoriaus-κB aktyvaciją, kaip mes parodėme anksčiau. 15 FBLN3 slopinantis AKT aktyvumą, kuris slopina navikinių ląstelių migraciją ir invaziją, taip pat buvo parodytas nosiaryklės karcinomos atveju. 28 AKT fosforilina daugybę molekulių, įskaitant glikogeno sintazės kinazės-3β (GSK3β), priešakyje esantį β-katenino reguliatorių. 29 AKK fosforilindamas GSK3β, inaktyvuoja GSK3β ir atitinkamai stabilizuoja β-kateniną. 30 Kaip parodyta 4a paveiksle, nedidelis trukdantis RNR sukeliamas AKT ekspresijos sumažėjimas A549 ląstelėse sumažino AKT ir GSK3β fosforilinimą, sukeldamas β-katenino skilimą. Sraigės baltymas, kurio stabilumą reguliuoja GSK3β, 31 taip pat buvo sumažėjęs, ir šie rezultatai atitiko FBLN3 per daug ekspresuojančių A549 ląstelių fenotipus. NSCLC ląstelėse buvo galima aptikti reikšmingą β-katenino ir sraigės ekspresiją, ir šią išraišką pakeitė FBLN3 ekspressija ir (arba) slopinimas (4b paveikslas). FBLN3 turėjo įtakos fosfo-GSK3β lygiui šiose ląstelėse, tai reiškia, kad FBLN3 reguliuoja plaučių vėžio ląstelių β-katenino ir sraigės reguliavimą per GSK3β fosforilinimą. AKBL fosforilinimas ir fosfoinositido 3-kinazė (PI3K), aukščiau esančio AKT reguliatoriaus, taip pat turėjo įtakos FBLN3 ekspresijai.

Image

A549 ląstelių EMT ir kamienų savybes slopino β-kateninas. a ) EMT ir kamieninių žymeklių Western blot analizė 5-katenino slopintose A549 ląstelėse ( si-β-kateninas ). b ) Invazijos ir migracijos tyrimas. c ) 5-katenino slopintų A549 ląstelių kolonijų susidarymo tyrimas. Ląstelės buvo fotografuojamos atliekant fazinio kontrasto mikroskopiją ir kiekybiškai įvertintos. Kaip kontrolė buvo naudojamos kontrolinės siRNR perkeltos (si-Ctl) A549 ląstelės.

Visas dydis

Image

FBLN3 sumažino p-GSK3β, slopindamas IGF1R / PI3K / AKT kelią. ( a ) AKT / GSK3β signalinių komponentų Western blot analizė AKT slopintose A549 ( si-AKT1 ) ląstelėse. b ) PI3K / AKT / GSK3β aktyvacijos IGF1R Western blot analizė ląstelėse, kuriose FBLN3 ekspresuoja A549 ( FBLN3 ) arba FBLN3 slopinamas H460 ( si-FBLN3 ). c ) EMT ir kamieno žymenų bei susijusių signalizacijos komponentų Western blot analizė A549 ląstelėse, apdorotose 24 valandas 10 μM AG1024, IGF1R inhibitoriumi.

Visas dydis

Yra žinoma, kad insulinas ir į insuliną panašus augimo faktorius (IGF) -1 stimuliuoja β-katenino kelią aktyvuodami IGF1R / PI3K / AKT kelią ir fosforilindami GSK3β hepatokarcinogenezėje. 30 Be to, į insuliną panašus augimo faktoriaus 1 receptoriaus (IGF1R) raiška yra susijusi su blogu chirurgiškai gydytų NSCLC pacientų išgyvenimu, 32 todėl tai yra patrauklus terapinis taikinys plaučių vėžiui gydyti. Atsižvelgdami į šias įrodymų linijas, manėme, kad IGF1R buvo pagrindinis PI3K / AKT / GSK3β signalo stimuliatorius NSCLC ląstelėse, o tai savo ruožtu sukelia GSK3β fosforilinimą ir β-katenino stabilizaciją. Mes ištyrėme FBLN3 poveikį IGF1R signalizacijos keliui. Priverstinė FBLN3 ekspresija sumažino IGF1R aktyvaciją dėl fosforilinimo. Priešingai, FBLN3 numušimas padidino IGF1R fosforilinimą (4b paveikslas). Be to, gydymas IGF1R inhibitoriumi AG1024, kuris imituoja slopinantį FBLN3 poveikį, aiškiai sumažino fosfo-GSK3β ir išeikvojo β-kateniną bei sraigę (4c paveikslas). Šie duomenys patvirtino, kad tarp IGF1R / PI3K / AKT / GSK3β signalizacijos kelio ir signalizacijos kelių, susijusių su EMT ir kamienu A549 plaučių vėžio ląstelėse, yra kliūčių ir kad FBLN3 neigiamai reguliuoja IGF1R signalizacijos kelią. EGFR, kito PI3K / AKT kelio virškinimo reguliatoriaus plaučių vėžio ląstelėse, fosforilinimą taip pat paveikė FBLN3 (4b paveikslas) ir AG1024 (4c paveikslas).

Norėdami tiksliau ištirti tarpląstelinio FBLN3 baltymo funkciją, paruošėme rekombinantinį FBLN3 baltymą ir išanalizavome jo poveikį bei sąveiką su ląsteliniais komponentais. Rekombinantinis FBLN3 su heksa-histidino (HIS) žymeniu C gale (FBLN3-HIS), išreikštas Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) -K1 ląstelėse, buvo išgrynintas naudojant nikelio granules (5a pav.). Egzogeninis gydymas rekombinantiniu FBLN3 slopino A549 ląstelių EMT arba kamieną. Β-katenino, Sox2 ir Oct3 / 4 lygis buvo sumažėjęs (5b paveikslas), patvirtinantis rekombinantinio FBLN3 aktyvumą. Sumažėjęs invazijos / migracijos ir sferosidų susidarymas, taip pat imunohistocheminė EMT žymenų analizė, gydant rekombinantiniu FBLN3, taip pat parodė (3 papildomas paveikslas), kad FBLN3 yra neigiamas EMT ir kamienų A549 ląstelių reguliatorius.

Image

IGF1R yra tiesioginis FBLN3 taikinys plaučių karcinomos ląstelėse. ( a ) Rekombinantinis FBLN3-HIS buvo ekspresuotas CHO-K1 ląstelėse, išgrynintas naudojant nikelio granules ir įvertintas Western blot metodu. b ) EMT ir kamieno žymenų Western blot analizė A549 ląstelėse, apdorotose FBLN3-HIS (3 μg / ml). c ) FBLN3 rišančių baltymų atitraukimo tyrimas, naudojant nikelio agarozės granules, prisotintas FBLN3-HIS, kaip aprašyta metoduose. Kompleksai buvo nusodinami ir analizuojami atliekant Western blot analizę, naudojant IGF1Rβ ir EGFR antikūnus. Taip pat buvo atlikti koponeninio nusodinimo tyrimai, naudojant IGF1R antikūną arba EGFR antikūną. d ) IGF-1 arba EGF sąveikos su jų specifiniais receptoriais konkurencinis slopinimas dėl egzogeninio FBLN3 baltymo. A549 ląstelės buvo badaujamos 24 valandas ir 30 min. Buvo apdorotos augimo faktoriais (IGF-1 arba EGF; 100 nM) ir FBLN3-HIS (3 μg / ml). Ląstelių lizatai buvo paruošti ir analizuojami atliekant Western blot analizę.

Visas dydis

Norėdami surinkti į FBLN3 nukreiptas molekules, buvo atlikti ištraukiamieji ir koimunoprecipitaciniai tyrimai, naudojant FBLN3-HIS ir A549 ląstelių lizatus, ir išanalizuoti Western blot metodu, naudojant antikūnus prieš IGF1R ir EGFR, kurie, kaip manoma, yra FBLN3 receptoriai. Kaip parodyta 5c paveiksle, tiek IGF1R, tiek EGFR buvo patvirtinti FBLN3 kompleksuose, užfiksuotuose nikelio granulėmis. Be to, FBLN3 taip pat buvo nustatytas imunoprecipifikuotame komplekse, naudojant IGF1R ir EGFR antikūnus. Ši sąveika taip pat buvo patvirtinta H460 ląstelėse, kurios ekspresuoja endogeninį FBLN3, ir FBLN3 per daug ekspresuojančiose A549 ląstelėse (papildomas 4 paveikslas). Be to, FBLN3 konkurencingai slopino IGF-1 arba EGF sąveiką su jų specifiniais receptoriais, todėl slopinamas receptorių fosforilinimas (5d pav.). IGF1R aktyvacijos slopinimas FBLN3 taip pat sumažino AKT fosforilinimą. EGFR aktyvaciją taip pat slopino FBLN3; EGF sukeltas fosfo-AKT sumažėjo apdorojant ląsteles rekombinantiniu FBLN3, tačiau tik iš dalies, tai patvirtina, kad EGFR kelias nėra pagrindinis signalo perdavimo būdas aktyvinant PI3K / AKT A549 ląstelėse. Apskritai šie duomenys rodo, kad FBLN3 sukeliamą neigiamą EMT reguliavimą plaučių vėžio ląstelėse lemia jo poveikis PI3K / AKT / GSK3β keliui. Be to, rezultatai parodė, kad PI3K / AKT / GSK3β kelio aukščiau esančių reguliatorių IGF1R ir EGFR yra tiesioginiai FBLN3 taikiniai.

FBLN3 slopina savaiminio atsinaujinimo ir su EMT susijusias ALDH + vėžio kamieninių ląstelių savybes ir mažina ksenografuotų navikų augimą

NSCLC chemoterapija ir radiacija nepašalina visų naviko ląstelių dėl ląstelių atsparumo ir metastazių. Naujausi tyrimai parodė, kad EMT ir navikinė CSC subpopuliacija vaidina svarbų vaidmenį sukeliant metastazes vėžyje, atsparumą vaistams ir blogą NSCLC prognozę. 35 Mūsų rezultatai parodė, kad gydymas FBLN3 gali reguliuoti plaučių vėžio ląstelių EMT ir kamieną, tai reiškia, kad FBLN3 gali būti naudingas pašalinant plaučių CSC.

Siekiant aiškiau nustatyti FBLN3 poveikį plaučių CSC, vėžinių kamienų tipo populiacija, išskirta iš A549 ląstelių, buvo gydoma FBLN3 baltymu išoriškai. Buvo pasiūlyta, kad aldehido dehidrogenazės (ALDH) aktyvumas yra naudingas žymeklis CSC, kurie pasižymi padidėjusia ALDH1 ekspresija. 36 Ląstelės, turinčios aukštą ALDH aktyvumą, gali būti rūšiuojamos ir išskirtos iš mišrių ląstelių populiacijos, naudojant ALDEFLUOR analizę, po kurios atliekamas fluorescencijos būdu aktyvuotų ląstelių rūšiavimas. 37 NSCLC, vėžinės ląstelės, turinčios stiprų ALDH1A1 aktyvumą, pasižymi CSC ypatybėmis ir padidėjusia CD133 ekspresija. 38 Mūsų tyrimo metu ALDH + ir ALDH-A549 ląstelės buvo rūšiuojamos naudojant ALDEFLUOR tyrimą (6a pav.). Norint įvertinti rūšiuotų ląstelių naviko atstatymo galimybes, atletinėms nuogoms pelėms buvo sušvirkštos ALDH + arba ALDH-populiacijos. Sušvirkštus ALDH + ląsteles (5x105), po 18 dienų po injekcijos buvo matomi navikai (6b paveikslas); tačiau ALDH-ląstelių (iki 1 × 107) injekcija nesukėlė naviko susidarymo praėjus 30 dienų po inokuliacijos. ALDH + pogrupiai buvo atsparesni γ spinduliuotei, palyginti su gautais iš nerūšiuotų ląstelių (6c paveikslas). ALDH + ląstelėse ALDH1A1 ir ALDH1A3 nuorašo ir EMT kamieno žymenų, įskaitant β-kateniną ir sraigę, baltymų lygis buvo didesnis, palyginti su ALDH ląstelėmis (6d, e pav.). CD133, CD40 ir CD90 kamieninių ląstelių žymekliai, kurie neseniai buvo paryškinti, taip pat buvo padidėję ALDH + subpopuliacijose, palyginti su ALDH – populiacijomis (papildomas 5 paveikslas). ALDH + ląstelėse taip pat buvo sureguliuoti fosforilinti (p) -IGF1R, p-AKT ir p-GSK3β. Svarbiausia, kad FBLN3 ekspresija nebuvo aptinkama ALDH + ląstelėse, bet aptinkama ALDH-ląstelėse.

Image

ALDH + plaučių vėžio kamieninių ląstelių, atskirtų nuo A549 ląstelių, savaiminio atsinaujinimo ir EMT savybės. a ) A549 ląstelės buvo dažytos naudojant Aldefluor substratą (atidaryti histogramą) pagal gamintojo instrukcijas. Kaip neigiama kontrolė, Aldefluor paveiktų ląstelių alikvota buvo nedelsiant užšaldyta specifiniu ALDH inhibitoriumi, dietilaminobenzaldehidu (DEAB) (užpildyta histograma). Ląstelių populiacijos, atskirtos nuo neigiamos kontrolės, buvo surinktos kaip ALDH + (AL +), kaip nurodyta histogramoje, ir surūšiuotos naudojant FACS Aria (BD Biosciences). Neapdorota Aldefluor ląstelių populiacija buvo įvertinta kaip ALDH− (AL−) ir rūšiuojama. b ) AL + ir AL – ląstelių naviko inicijavimo gebėjimas. Išrūšiuotos porūšės (5 × 105 ląstelių) buvo švirkščiamos į poodį pelėms, kurioms buvo nuogumas, ir auglio formavimasis buvo stebimas 33 dienas po naviko injekcijos. c ) A549, AL + ir AL-ląstelių kolonijų susidarymo tyrimas. Taip pat buvo išanalizuotos gama švitintų ląstelių kolonijų formacijos (veikiamos vienkartine 2 Gy doze, naudojant 60 Co-ray šaltinį; dozės greitis, 2 Gy / min). d ) ALDH izoformų ir FBLN3 atvirkštinės transkripcijos (RT-PGR) analizė A549, AL + ir AL – ląstelėse. e ) EMT ir kamieno žymenų AL + ir AL – ląstelėse Western blot analizė. Taip pat išanalizuoti IGF1R / AKT / GSK3β kelio komponentai.

Visas dydis

Kai šios kamieninės ALDH + populiacijos buvo gydomos egzogeniniu FBLN3 baltymu, ląstelių invazija ir migracija labai sumažėjo (7a pav.). FBLN3 taip pat smarkiai sumažino ALDH + linijos sugebėjimą formuoti sferoidinius kūnus (7b paveikslas), taip pat sumažėjo ląstelių augimas (7c paveikslas). ALDH + ląstelių gydymas FBLN3 stipriai sumažino kamieno ir EMT žymenis, įskaitant Sox2, sraigę ir β-kateniną (7d pav.). Gydant FBLN3, p-IGF1Rβ ir p-GSK3β lygis ALDH + populiacijose taip pat sumažėjo. Gydant IGF1R inhibitoriumi AG1024, taip pat įvyko molekuliniai įvykiai, panašūs į tuos, kuriuos sukėlė FBLN3, ALDH + populiacijose, dar kartą patvirtindami, kad egzogeninis FBLN3 slopina IGF1R aktyvaciją (7e pav.). Kai ALDH + ląstelės buvo apdorotos FBLN3 praturtintomis kondicionuotomis terpėmis, MMP-2 ir MMP-7 ekspresija sumažėjo (7f pav.), Kaip parodyta mūsų ankstesniame tyrime naudojant nerūšiuotas A549 ląsteles. 15 Invaziškumas ir migracijos galimybės sumažėjo, o p-AKT, p-GSK3β (papildomas 6 paveikslas) ir β-kateninas (7f paveikslas) ALDH + populiacijose taip pat sumažėjo, gydant FBLN3 praturtintomis kondicionuotomis terpėmis. Tačiau šie FBLN3 poveikiai buvo užblokuoti pridedant FBLN3 antikūnus į kondicionuojamą terpę, patvirtinantį specifinį FBLN3 poveikį ALDH + ląstelėms.

Image

FBLN3 slopina ALDH + plaučių vėžio kamieninių ląstelių savarankišką atsinaujinimą ir EMT savybes. a ) Rekombinantinio FBLN3 baltymo (3 μg / ml) gydymas slopino AL + CSC invaziją ir migraciją. Rekombinantinio FBLN3 baltymo gydymas taip pat slopino sferinės ( b ) ir kolonijos ( c ) susidarymą AL + CSC. d ) AL + CSC, apdorotų rekombinantiniu FBLN3 baltymu, Western blot analizė. e ) sraigės, β-katenino ir IGF1R / AKT / GSK3β kelio komponentų Western blot analizė AL + CSC, apdorotiems 10 μM AG1024, 24 valandas. f ) AL + CSC, apdorotų 48 valandas kondicionuotomis terpėmis, praturtintomis FBLN3 (H / M ir A / F / M), Western blot analizė, kaip aprašyta anksčiau. 15 Norėdami patvirtinti FBLN3 poveikį, FBLN3 antikūnas (0, 4 μg / ml) buvo inkubuotas kondicionuotomis terpėmis, praturtintomis FBLN3, ir pridėtas prie AL + CSC. ( g ) FBLN3 poveikis ksenografinių navikų augimui AL + CSC. Rekombinantinis FBLN3 baltymas (5 μg / 18 g kūno svorio pelėms) buvo įšvirkštas į naviko implantacijos vietą tris kartus po to, kai buvo išaugintos naviko ląstelės (18, 21 ir 24 dienos po naviko implantacijos), ir išmatuotas naviko tūris, kaip aprašyta Metodai.

Visas dydis

Galiausiai mes ištyrėme FBLN3 poveikį plaučių CSC, naudojant poodinius ALDH + ląstelių ksenografus atletiškoms nuogas pelėms. Kai ALDH + ląstelės buvo švirkščiamos po oda, naviko našta buvo išmatuojama ∼ 18 dienų po inokuliacijos (6b paveikslas). Nuogytos pelės, sušvirkštusios ALDH + ląsteles, buvo suskirstytos į dvi grupes ( n = 5 kiekvienoje grupėje): grupę, kurioje FBLN3-HIS buvo suleista peritumoraliai 18, 21 ir 24 dienas po naviko injekcijos; ir kontrolinė grupė, į kurią buvo įšvirkštas nešiklis (fosfato buferinis tirpalas). Gydymas FBLN3 smarkiai sumažino ksenografuotų navikų augimą, palyginti su kontrolinės grupės navikais (7g paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad FBLN3 gali būti naudojamas gydant plaučių CSC.

Remdamiesi savo in vitro ir in vivo duomenimis, padarėme išvadą, kad FBLN3 ekspresijos slopinimas yra glaudžiai susijęs su EMT procesu ir vėžio ląstelių kamiene NSCLC ir kad egzogeninis gydymas FBLN3, nukreiptas į PI3K / AKT / GSK3β kelią, gali būti efektyvi plaučių CSC terapija.

Diskusija

Pradeda aiškėti keliai, kurie reguliuoja savęs atsinaujinimą ir ląstelių likimą CSC sistemose. Įvairių vystymosi signalų kaskadų (Wnt / β-katenino, Sonic Hedgehog ir Notch) reaktyvinimas kartu su padidintu DNR remontu ir ATP surišančių kasečių pernešamų vaistų ištekėjimais CSC gali būti atsakingi už jų atsparumą įprastam gydymui. 39 Be to, CSC vietinės mikroaplinkos pokyčiai taip pat gali turėti įtakos jų elgesiui. Pvz., Žinoma, kad labai tumorigeninės ir metastazinės plaučių CSC savybės yra susijusios su efektyviu citokinų tinklo baltymų gaminimu ir specifiniais signalizacijos keliais, susijusiais su kamieninių ląstelių faktoriumi ir jo receptoriaus c rinkiniu (CD117). Taigi, siekiant pagerinti dabartinių priešvėžinių strategijų veiksmingumą, reikia iš įvairių aspektų atsižvelgti į molekulinį nukreipimą į labai tumorigeninius ir metastazinius CSC. Šiuo metu perspektyvūs terapiniai metodai apima tam tikrų signalo perdavimo takų (pvz., RAC, WNT, PI3K ir PML) taikymą mažų molekulių inhibitoriais arba nukreipimą į konkrečias ląstelių paviršiaus molekules (pavyzdžiui, CD44) su veiksmingais citotoksiniais antikūnais. 41 Kai kurie iš šių vaistų yra ikiklinikiniame ar ankstyvajame klinikiniame vystymosi etape, ir belieka tik pamatyti, kiek jų iš tikrųjų pereis prie klinikinio taikymo. 42

FBLN yra tarpląsteliniai glikoproteinai, siejami su ECM, ir nemažai tyrimų buvo sutelkta į jų struktūrinius vaidmenis ECM. Tačiau naujausios išvados apie jų įsitraukimą į naviko augimą ir agresyvumą bei kaip naviko mikroaplinkos sudedamąją dalį paskatino atidžiau išnagrinėti jo veiksmus, be to, buvo keletas pranešimų apie FBLN vėžinių ląstelių signalizacijos reguliavimą, pvz., Notch signalizaciją. kelias 43 gliomoje ir EGF-AKT kelias kasos karcinomos ląstelėse. 44

Suaugusiesiems FBLN3 yra plačiai paplitęs įvairiuose audiniuose, įskaitant plaučius. Normalus plaučių audinys išreiškia nemažą FBLN3 kiekį. Tačiau FBLN3 ekspresija invazinėje plaučių adenokarcinomoje yra labai maža, 15, 45, išvadą patvirtino plaučių adenokarcinomos audinio imunohistocheminis dažymas (papildomas 1 paveikslas). Plaučių adenokarcinomos metu FBLN3 ekspresija yra inaktyvuota metilinant promotorių. 15 Visų pirma, plaučių CSC, surūšiuoti pagal ALDH aktyvumą, parodė mažesnę FBLN3 ekspresiją nei ne tumorigeninės vėžio ląstelės, turinčios mažą ALDH aktyvumą (6e pav.). Remdamiesi šiais duomenimis, mes ištyrėme, ar FBLN3 yra neigiamas plaučių CSC reguliatorius. Priverstinė FBLN3 ekspresija arba egzogeninis gydymas FBLN3 NSCLC kamieninėse ląstelėse veiksmingai slopino jų kamienines ir su EMT susijusias savybes. FBLN3 daro šį poveikį slopindamas PI3K / AKT / GSK3β kelią per IGF1R.

IGF-IR yra daugiafunkcė tirozino kinazės receptorė, dalyvaujanti keliuose biologiniuose procesuose, įskaitant ląstelių dauginimąsi, diferenciaciją, DNR atkūrimą ir ląstelių išgyvenimą. Tai buvo svarbu palaikant piktybinius fenotipus, o IGF-1R signalizacijos nutraukimas slopino vėžio ląstelių augimą ir judrumą in vitro ir in vivo modeliuose. Todėl IGF1R buvo nustatytas kaip galimas molekulinis taikinys keliems vėžio tipams, įskaitant krūties vėžį, gimdos kaklelio vėžį, piktybinę melanomą ir NSCLC. Be to, IGF-1R ir jo pasroviuose esančių medžiagų aktyvinimas turi lemiamą reikšmę normaliam daugelio audinių vystymuisi ir, manoma, kad tai yra svarbu palaikant suaugusių kamieninių ląstelių, gyvenančių audiniuose. 48 IGF-1R tarpininkavimas taip pat reikalingas embrioninių kamieninių ląstelių atsinaujinimui. 49 Tai rodo svarbų IGF-1R vaidmenį kamieninių ląstelių biologijoje. Todėl IGF1R funkcijos CSC buvo naujausių tyrimų, susijusių su keliais vėžiais, įskaitant krūties vėžį ir kepenų ląstelių karcinomą, dėmesio centre. 50, 51 Šiame tyrime mes parodėme, kad IGF1R signalizacijos aktyvavimas yra svarbus palaikant plaučių CSC. Dar svarbiau, kad mūsų duomenys patvirtina FBLN3, kaip IGF1R signalizacijos inhibitoriaus, vaidmenį, o ksenografo modelio rezultatai patvirtina galimą FBLN3 taikymą plaučių CSC terapijoje. Mes tikimės, kad FBLN3 papildymas plaučių vėžio ląstelėse iki tokio lygio, koks yra normaliose ląstelėse, slopins plaučių CSC augimą.

Taip pat nustatyta, kad EGFR - tirozinkinazės receptoriaus kinazė, turinti bendrus paskesnius komponentus su IGF-1R, - FBLN3 taikinio molekulė CSC, gautose iš A549 ląstelių. FBLN3 varžėsi su EGF, kad surištų EGFR ir slopindavo fosforilinimo sukeltą EGFR aktyvaciją. Tačiau atrodo, kad IGF1R slopinimas FBLN3 yra didesnis nei FBLN3 tarpininkaujamas EGFR slopinimas CSC kamienams slopinti, atsižvelgiant į tai, kad A549 ląstelių atsparumą EGFR inhibitoriams, tokiems kaip gefitiniibas, sukelia EGFR heterodimerizacija naudojant IGF1R. Neseniai buvo pasiūlyta, kad efektyvesnė vėžio terapija yra tikslinis EGFR ir IGF-IR, o gydymas IGF1R antikūnais kartu su EGFR inhibitoriais eksperimentiniuose modeliuose sukelia sinergetinį arba supra papildomą priešnavikinį poveikį. 53 Atsižvelgiant į šiuos duomenis, FBLN3 yra gerai pritaikytas tirozinkinazės receptorių / PI3K / AKT signalų reguliatorius, tuo pat metu blokuodamas EGFR ir IGF1R signalus plaučių CSC, o FBLN3 gydymas greičiausiai yra labai efektyvi CSC reguliavimo strategija.

Apibendrinant, mūsų duomenys parodė, kad FBLN3 yra neigiamas plaučių CSC kamienų reguliatorius, kuris daro poveikį per IGF1R signalizaciją ir rodo, kad FBLN3 gali būti pritaikytas kaip alternatyvi vėžio terapija agresyviai plaučių adenokarcinomai gydyti.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

  3. 3.

    3 papildomas paveikslas

  4. 4.

    Papildomas 4 paveikslas

  5. 5.

    5 papildomas paveikslas

  6. 6.

    Papildomas 6 paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Prie šio dokumento pridedama papildoma informacija „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)