Lauke dislokuojama daugialypė biojutimo sistema, skirta aptikti cheminio ir biologinio karo veiksnius mikrosistemos ir nanoinžinerija

Lauke dislokuojama daugialypė biojutimo sistema, skirta aptikti cheminio ir biologinio karo veiksnius mikrosistemos ir nanoinžinerija

Anonim

Dalykai

  • Biojutikliai
  • Aplinkos, sveikatos ir saugos klausimai
  • Mikrofluidikai
  • Nanofotonika ir plazmonika

Anotacija

Biologinio ir cheminio teroro aktų grėsmė išlieka vis didėjanti problema visame pasaulyje. Todėl reikia sukurti tinkamą technologiją, skirtą aptikti cheminius ir biologinius karybos agentus, ankstyvą identifikavimą, skirtą naudoti pirmiesiems reagavimo priemonėms. Čia mes atskleidžiame sukurtą autonominę oro mėginių ėmimo ir aptikimo sistemą, skirtą įvertinti, ar nėra cheminių ir biologinių karo veiksnių, galinčių pakenkti gyventojams. Dabartiniame įrenginyje naudojama suprojektuota rūko generatoriaus oro surinkimo sistema (338 l min –1 ) ir biosensituojančių mikroschemų technologijos, tokios kaip elektrocheminis matavimas, Au nanodalelių pagrindu pagamintas lokalus paviršiaus plazmono rezonansas ir greitas mikrofluidinių mikroschemų PGR, kad būtų galima aptikti mažesnes minučių koncentracijas. nei nervų dujų (sarino ir VX), toksiškų baltymų (BTX / A / Hc ir ricino) ir patogenų (juodligės modelinis tirpalas) vidutinė mirtina dozė (LD 50 ). Surinkimui ir aptikimui reikalingas tik 5–15 min. mėginių paruošimas jau integruotas į sistemą be tiesioginio žmogaus įsikišimo. Be sistemos jautrumo ir lengvo naudojimo, jos perkeliamumas daro labai naudingą pirmosios pagalbos teikėjams, o tai galėtų padėti nedelsiant įvertinti riziką ir sušvelninti įvykius vietoje.

Įvadas

1995 m. Nervų dujų sarinas ( O- izopropilmetilfosfonofluoridatas) buvo naudojamas kaip cheminis ginklas teroristiniame išpuolyje Tokijo metro 1, 2 . 2001 ir 2004 m. JAV įvyko juodligės išpuolių ir incidentų dėl ricino. Pastaraisiais metais pranešimų apie sėkmingai įvykdytus biologinius ir cheminius teroro išpuolius trūkumas nereiškia absoliučios saugos garantijos. JAV valstybės departamentas (DOS) 2015 m. Pranešė, kad kai kurios šalys vis dar nesilaiko nusiginklavimo sutarties pagal Biologinių ginklų konvenciją arba Biologinių ir toksinių ginklų konvenciją ir toliau vykdo su ginklais susijusią biologinę veiklą 3 . Tai daro BC teroro išpuolių grėsmę realią ir iš tikrųjų auga. Atsižvelgiant į grėsmę ir į tai, ar šie BC ginklai yra prieinami, pigūs ir lengvai paruošiami, būtų labai svarbu sukurti greitą, patikimą ir labai jautrų BC karo agentų aptikimo sistemą, kurią vietoje galėtų naudoti pirmieji reaktoriai.

Tarp daugelio BC agentų, sarinas, VX ( S - [2- (diizopropilamino) etil] - O- metilfosfonotioatas), juodligė, botulino toksinas ir ricinas pasižymi stipriu ūmiu toksiškumu ir yra centrų priskiriami „A arba B kategorijai“. ligų kontrolės ir prevencijos (JAV) ir I sąrašo junginiams pagal Cheminio ginklo konvenciją. Todėl šiems BC karo agentams yra skiriamas didelis dėmesys rizikos valdymo ir kovos su terorizmu priemonių atžvilgiu.

BC karo agentams 4, 5, 6, 7 nustatyti buvo sukurta daugybė metodų. Nervų dujų, tokių kaip sarinas, tabunas, somanas ir VX, aptikimui, masių analizė, įskaitant GC-MS, LC-MS, IM-TOF-MS arba MALDI-TOF MS, acetilcholinesterazės (AChE) reaktyvacija, kolorimetrinis aptikimas, chromogeninis ir fluorescencinis. buvo pranešta apie zondavimą remiantis fluorescencinio rezonanso energijos perdavimu ir elektrocheminį aptikimą. Juodligės aptikimui buvo panaudota daugkartinė imuninė analizė 8, PGR, naudojant realaus laiko „TaqMan“ testus 9, ir nešiojamoji Raman sistema, pagrįsta paviršiaus padidintu Ramano išsklaidymu, naudojant AgFON substratą 10 . Biologinio karo veiksniams aptikti buvo plačiai naudojami imunocheminiai metodai 11 . Neseniai buvo sukurtas autonominis aerozolizuotų biologinių veiksnių aptikimas taikant daugybinį imuninį tyrimą su PGR, kurio metu Bacillus anthracis ir Yersinia pestis nustatomi aerozolių mėginių paėmimo seka, daugybinės imunoanalizės analizės, DNR ekstrahavimo ir patvirtinančiojo PGR 9 pagalba . Tačiau ši autonominė sistema nesuderinama su kitų cheminio karo agentų aptikimu. Be to, nurodytos įprastos technologijos turi trūkumų, susijusių su pirmojo reagavimo priemonės naudingumu, pavyzdžiui, nerimą kelia mažas jautrumas, didelis klaidingai teigiamų rodiklių dažnis, varginantis darbas ir daug laiko reikalaujantis apdorojimas. Pirmiausia pagalbos teikėjams, tokiems kaip policijos mobiliosios komandos ir ugniagesiai gelbėtojai, reikalingos mobilios ir tvirtos, lengvos sistemos, kurias būtų lengva transportuoti ir įdiegti, kad būtų galima aptikti vietoje, o tai yra būtina norint nedelsiant įvertinti riziką, ją sumažinti ir priimti sprendimus. Todėl labai norima sukurti autonominę sistemą, kuri galėtų tiksliai ir greitai aptikti BC karo agentus iš mėginių paėmimo įvykio vietoje pradiniam patikrinimui.

Mes ištyrėme ir sukūrėme įvairius biojutiklius, kurie tinka aptikti cheminio karo veiksnius, biologinius toksinus ir patogenus. Cheminiai karo vaistai, tokie kaip sarinas ir VX, slopina AChE, turinčio svarbų vaidmenį centrinėje nervų sistemoje, aktyvumą 12, 13 . AChE aktyvumas ir jo slopinimas gali būti matuojami analizės metodais, tokiais kaip spektrofotometriniai, fluorometriniai, pjezoelektriniai, potenciometriniai ir amperometriniai matavimai 14, 15, 16, 17, 18 . Elektrocheminis matavimas yra pageidautinas dėl jo labai jautraus aptikimo ir, dar svarbiau, galimų prietaisų perkeliamumo ir miniatiūros. Mes jau sukūrėme nešiojamą USB potencialą (BDTminiSTAT100) ir vienkartinį ekrano atspausdintą anglies elektrodą (SPCE), turintį pavyzdinį našumą 19, 20, 21 . Buvo parinkti optimalūs elektrocheminiai matavimai iš mūsų prietaisų ir panaudoti sukurtoje autonominėje sistemoje.

Lokalizuoto paviršiaus plazmoninio rezonanso (LSPR) technologija yra naudingas jutimo metodas atliekant biomolekulių sąveikos analizę. Šis metodas yra plačiai naudojamas atliekant imunocheminių reakcijų analizę ir klinikinę infekcinių ligų diagnozę. Dėl LSPR sistemos perkeliamumo ir paprastumo ji tampa pageidautina kaip neatsiejama sistemos dalis. Ankstesniame darbe mes pranešėme apie labai jautrų biologinių toksinų aptikimo metodą, naudojant LSPR jutimo metodą, pagrįstą glikano nanotechnologijomis 22 . Mes pademonstravome, kad LSPR sistema leido aptikti riciną 30 ng mL −1, Shiga toksiną 10 ng mL −1 ir choleros toksiną 20 ng mL −1 . Taigi tikimasi, kad ši sistema bus taikoma kitiems tiksliniams biologiniams toksinams.

Ptogeniniams sukėlėjams aptikti PGR yra labai patraukli dėl savo jautrumo ir specifiškumo, kurie leidžia amplifikuoti specifines DNR molekulių sekas. Jau pranešėme apie mikroschemoje esančią PGR technologiją, pagrįstą mikrofluidikų technologijomis. Mes sėkmingai pademonstravome Juodligės PA geną per 5 minutes ir gripo viruso geną per 10 minučių, tai yra greičiau nei įprastais metodais 19, 23 . Taigi mes pasirinkome šią PGR mikroschemų technologiją ir įtraukėme ją į autonominę sistemą, skirtą greitai nustatyti patogeninius agentus vietoje.

Be to, buvo sukurta mėginių rinkimo sistema, kuri yra būtina išankstiniam apdorojimui ir tikslo paruošimui. Biocapture650 (MesoSystems Technology, Inc., Kennewick, JAV) yra gerai žinomas kaip vietoje esantis oro mėginių ėmiklis; tačiau jį sunku susieti su kitais įrenginiais. Mūsų sukurtoje autonominėje sistemoje buvo sujungti aerozolių susidarymo ir mėginių ėmimo technologijos būdai, kurie palengvina mėginio pristatymą į aptikimo regionus. Mes sukūrėme unikalų oro mėginių ėmimo bloką, kurį galima sujungti su aukščiau aprašytais mūsų biojutikliais.

Apibendrinant, įgyvendindami savo koncepciją, kaip parodyta 1 paveiksle, mes integravome savo pranešimus apie biojutimo technologijas į vieną sistemą, skirtą įvairių tipų agentams. Mes atlikome elektrocheminį matavimą su fermento reakcija ir vienkartiniu elektrodu nervų dujoms, LSPR tyrimą su glikochipu iki nuodingų baltymų ir greitą genų aptikimą, naudodami mikroscheminę PGR, patogenams, kad aptiktume mažesnius nei vidutinės mirtinos dozės kiekius (LD 50 ). . Be to, mes sukūrėme ir pagaminome unikalų oro mėginių ėmimo įrenginį autonominiam surinkimui ir mėginių ėmimui. Ši technologija ne tik integruoja mūsų mikroscheminių ir nanodalelių mikroscheminių mikroschemų technologijas, bet ir sukuria visą automatizuotą sistemą nuo surinkimo iki aptikimo, kuri paprastai daroma atskirai kituose jutikliniuose įrenginiuose, rankiniu būdu naudojant reagentus. Taigi surinktas prietaisas nereikalauja labai techniškai tinkamo operatoriaus naudojimo. Be to, surinktas prietaisas yra skirtas lengvai valdyti ir transportuoti. Mes tikime, kad surinktas prietaisas būtų labai naudingas pirmiesiems pagalbos teikėjams ir padėtų nedelsiant įvertinti įvykių vietoje riziką. Čia pristatome integruotą ir automatizuotą sarino, VX, juodligės, botulino toksino ir ricino atpažinimo sistemą.

Image

a ) Vietos įtaisų sistemos, skirtos greitai ir su dideliu jautrumu įvertinti cheminių ir biologinių karo veiksnių buvimą, koncepcijos schema. Ši sistema veikia autonomiškai nuo oro mėginių ėmimo iki aptikimo, integruodama oro mėginių ėmimo įrenginį, pagrįstą ciklono technologijomis, ir aptikimo sistemos vienetus, kuriuose naudojami biosensorinių lustų įrenginių technologijos, tokios kaip elektrocheminiai matavimai, LSPR ir lusto PCR. Be to, sistema yra lengva ir kompaktiška, kad ją būtų galima perkelti. b ) Sistemos sudėtis. Iš pradžių ore esančios cheminės ir biologinės kovos medžiagos surenkamos į aerozolių mėginių ėmimo skyrių. Surinktas mėginio tirpalas paskirstomas į atskirtus biosensorinius lustus ir išmatuojamas. Visus įrenginius valdo valdymo blokas. Atminkite, kad baltos spalvos dėžutėse nurodytos dalys yra vienkartinės. ATCh, acetiltiocholinas; AChE, acetilcholinesterazė; LSPR, lokalizuotas paviršiaus plazmono rezonansas; TCh, tiokolinas.

Visas dydis

Rezultatai ir DISKUSIJA

Aerozolių mėginių ėmimo bloko konstrukcija

Įrenginyje yra trijų tipų biosensoriai, skirti įvairių tipų reagentams aptikti. Šie biojutikliai reikalauja, kad tiriamasis reagentas būtų ištirpinamas vandenyje, nes jame yra fermentų ir angliavandenių grandinių, kurios reaguoja ar jungiasi tirpale aptikimui. Biocapture650 yra gerai žinomas kaip tipiškas aerozolių mėginių ėmimo įrangos pavyzdys. Tačiau sudėtinga valdyti mūsų biojutiklius su komerciškai prieinamu mėginių ėmikliu, nes surinkimo kasetėje iš anksto yra ploviklio, o tai riboja trijų biologinio jutimo technologijų naudingumą. Norėdamas, kad būtų kompaktiškas nešiojamas aptikimo vietoje objektas ir turintis galimybę siurbti orą dideliam oro kiekiui surinkti ir mėginio agentams ištirpinti į padidinto jautrumo tirpalą, buvo suprojektuotas ir išplėtotas mėginių ėmimo įrenginys. 2d ir e paveiksluose parodytas visas oro mėginių ėmimo įrenginio prototipas.

Aerozolis buvo suformuotas susidarius sterilių mikrohidrolakelių, susidariusių dėl rūko generatoriaus (2b pav.), Rūkui, kuri liečiasi su aplinkos oru. Didelis lašelių paviršiaus ploto ir tūrio santykis skatina lengvą dalelių surinkimą ir efektyvų tirpimą ore. Mėginio paruošimo rinkinį sudaro keturi rūko generatoriai ir vienas centrinis surinkimo piltuvas (2f pav.). Perėjęs per centrinį kanalą, mišinys supilamas į keturis surinkimo mėgintuvėlius, kur tiriamasis tirpalas lieka atskyrus dujas ir skysčius dėl ciklono efekto cilindrinėje tuščiavidurėje geometrijoje 25 (2a paveikslas). Ciklono efektas skatina didesnių lašelių susidarymą surinkimo vamzdžių viduje ir veikia išcentrinę jėgą, kad lašeliai priliptų prie vidinės sienos. Tada lašeliai, kuriuose yra tikslinis mėginys, lašėja į surinkimo cilindro dugną ir yra perduodami į biojutiklius. Oro perteklius teka per centrinį vamzdį surinkimo cilindre (2c paveikslas). Palyginti su „Biocapture650“, kurios surinkimo greitis yra 200 l min – 1, išvystytas oro ėminių ėmimo įtaisas išmatuotas srauto greitis buvo 338 l min – 1, tai yra 1, 7 karto didesnis.

Be palyginamo sukurto įrenginio veikimo, komponentai veikia tik su 24 V akumuliatoriaus maitinimo šaltiniu. Turėdami elektrinių dalių, veikiančių tik iš nuolatinės srovės šaltinio, buvo nesunku realizuoti kompaktišką ir nešiojamą įrenginį.

Cheminio karo veiksnių aptikimas

AChE slopinimas yra labiausiai žinomas nervų dujų agentų veikimo būdas. Slopinimo mechanizmas yra gerai ištirtas; organiniai fosfatai negrįžtamai jungiasi prie AChE katalizinės vietos 4 . Kai kurie organiniai fosfato pesticidai, tokie kaip Diazinono oksonas (DZO, dietil-2-izopropil-6-metil-4-pirimidinilfosfatas), taip pat gali panašiu mechanizmu slopinti AChE aktyvumą. Kaip vienas iš analizės metodų buvo plačiai papasakoti elektrocheminiai AChE slopinimo matavimai. Mūsų tyrimų grupė taip pat pranešė apie kolorimetrinį jutiklį, skirtą aptikti DZO, remiantis AChE 28 slopinimu. Be to, mes sukūrėme nešiojamąjį elektrocheminio aptikimo metodą, naudojantį USB maitinamą potenciostatą ir vienkartinį SPCE 19, 20, 21 . Su jais mes integravome savo elektrocheminį biojutimo įtaisą, skirtą aptikti cheminius agentus dėl jo perkeliamumo ir mobilumo. Pradiniam elektrocheminių sąlygų optimizavimui DZO buvo naudojamas kaip modelinis tirpalas, siekiant sumažinti apsinuodijimo riziką, nes DZO toksiškumas yra maždaug 100 kartų mažesnis nei 29- ojo sarino. ATCh buvo naudojamas kaip substratas matuojant AChE aktyvumą 30, 31 . Tiokolinas (TCh) buvo fermentiniu būdu gaminamas ir matuojamas elektrocheminiais oksidacijos signalais, gautais naudojant DPV metodą (3a paveikslas).

Image

Cheminio karo veiksnių aptikimas elektrocheminiu metodu. a ) AChE slopinamojo aktyvumo elektrocheminio matavimo schema. b ) USB maitinamas potenciostatas ir atspausdintas anglies elektrodas. c ) DPV voltamogramos mišinyje su 0–2, 0 E – 5 g mL –1 DZO. d ) Didžiausias oksidacijos srovės aukštis lemia pradinę korekcijos liniją. e ) AChE slopinimo ir cheminio karo agento koncentracijos santykis kaip standartinė kreivė, gauta nubrėžus didžiausią DPV matavimą. f ) mūsų sistemos autonominio matavimo įvertinimas renkant ore esančius cheminio karo agentus, kad būtų galima atlikti elektrocheminį AChE slopinimo matavimą.

Visas dydis

20 μL 4 U mL −1 AChE (PBST, pH 7, 4) tūris ir 50 μL skirtingų koncentracijų DZO (praskiestas ypač grynu vandeniu) buvo sumaišomi 1, 5 ml tūbelėje 50 s, kad būtų slopinamas AChE. veikla. Po AChE aktyvumo slopinimo į mišinį buvo įpilama 20 μL 100 mM ATCh (ypač gryname vandenyje), kad tiokolinas susidarytų 2 min. Iš reakcijos mišinio tūrio 20 μL tūrio buvo nedelsiant užpilama SPCE, o AChE aktyvumas buvo matuojamas naudojant USB maitinamo potenciometro DPV režimą (3b paveikslas). 3c paveiksle pavaizduotos mišinio su įvairiomis DZO koncentracijomis DPV voltamogramos. Tiokolino oksidacijos DPV atsaką buvo galima pastebėti esant maždaug 0, 5 V smailės potencialui be DZO slopinimo. Oksidacijos srovės vertės smarkiai sumažėjo, atsižvelgiant į DZO koncentracijos padidėjimą iki 2 × 10 –5 g ml – 1 . Esant 5 × 10 –5 g ml – 1 DZO, DPV atsakymo vargu ar buvo galima pastebėti. Taigi buvo nustatytas didžiausias oksidacijos srovės aukštis. Tiesine linija tarp dviejų signalo smailės galų buvo nubrėžta pradinė linija ir apskaičiuotas smailės aukštis (3d paveikslas). Norint parodyti AChE aktyvumo slopinimo laipsnį, didžiausio srovės stiprio sumažėjimas, sukeliant AChE slopinimą cheminiais agentais, buvo palygintas su didžiausio srovės stiprio aukščiu be AChE slopinimo ir parodytas kaip santykinis slopinimo laipsnis (%). Įvertinta AChE slopinimo priklausomybė nuo DZO koncentracijos, o standartinė kreivė pateikta 3e paveiksle. 10 ng mL –1 DZO koncentracija parodė 5, 8 ± 5, 6% silpno santykinio slopinimo. Padidėjus DZO koncentracijai, 50 μg ml −1 santykinis slopinimas buvo 97, 9%.

AChE aktyvumo slopinimas VX ir sarinu taip pat buvo matuojamas tuo pačiu metodu. Jei AChE slopina sariną, esant 100 ng mL −1 didelei koncentracijai, santykinis slopinimas siekė 94, 7%. Buvo patikimai nustatyta 0, 3 ng mL −1 sarino koncentracija esant 8, 5% santykiniam slopinimui, kuris yra mažesnis už aptiktą mažiausią DZO koncentraciją. Tai labai susiję su sarino toksiškumu, kuris yra 100 kartų didesnis nei pesticidų organinio fosfato DZO 29 toksiškumas.

VX atveju santykinis slopinimas buvo 96, 1% esant 30 ng mL −1 ir 12, 9% esant 0, 3 ng mL −1 . Standartinė VX slopinimo kreivė beveik sutapo su sarino slopinimo kreive. VX ir sarino molekuliniai svoriai yra atitinkamai 267, 4 ir 140, 1. VX turėjo tą patį slopinimą maždaug per pusę molekulių skaičiaus, palyginti su sarinu. Šis rezultatas paprasčiausiai reiškia, kad VX slopinimas buvo jautriau aptinkamas. Be to, VX yra 240 kartų toksiškesnis nei DZO ir 2, 4 karto toksiškesnis nei sarinas. Iš šių rezultatų mes patvirtinome, kad mūsų elektrocheminį prietaisą galima naudoti norint gauti atsaką priklausomai nuo slopinimo aktyvumo ir koncentracijos.

Optimizavę elektrocheminius parametrus, įvertinome elektrocheminį prietaisą kartu su oro mėginių ėmimo įtaisu, remdamiesi surinktų cheminių ginklų agentų AChE slopinimu gaudymo cilindre. Darbo eiga buvo tokia: vandeninis cheminio kovos agento tirpalas buvo purškiamas ore, naudojant purkštuvą nuo 1 ng iki 1 μg 1 min. Dar 1 min., Generatoriaus rūkas sąveikauja su atmosfera ir patenka į surinkimo piltuvą. AChE iš anksto buvo įdėta į surinkimo cilindrą. Tirpalas maišomas cilindre oro ciklono judesio metu, oro ėmimo metu. Po to substrato tirpalas buvo išpiltas į surinkimo cilindrą iš paskirstymo talpyklos po 50 s. Fermento reakcija buvo palaikoma 2 minutes, o tada mišinys buvo nusiųstas į SPCE elektrocheminiam matavimui. Atominis purškiklis, skirtas purkšti chemines kovines medžiagas, ir prietaisas buvo dedami į pagal užsakymą pagamintą narvą, uždengtą vinilo lakštu, ir visi eksperimentai buvo atlikti šioje kontroliuojamoje aplinkoje. Informacija apie tirpalų pasiskirstymo valdymą po oro mėginių paėmimo aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai“ ir iliustruojami papildomuose paveiksluose S1 – S3. Atminkite, kad visi veiksmai atliekami automatiškai.

Rezultatai (3f pav.) Rodo, kad sariną buvo galima labai tiksliai aptikti mažiausiai 30, 0 ng, esant santykiniam slopinimui 23, 5 ± 2, 8% (CV 11, 7%). Esant daugiau kaip 1, 17 ± 0, 06 μg, santykinis slopinimas buvo 93, 7 ± 2, 44% (CV 2, 6%). VX atveju santykinis slopinimas buvo 47, 2 ± 5, 3% (CV 11, 2%) mažam 86, 6 ± 0, 24 ng kiekiui. Buvo galima aptikti mažesnį 36, 2 ng VX kiekį; tačiau matavimas buvo atliktas tik vieną kartą. Atsistatymo greitis buvo apibrėžtas kaip purškiamo cheminio karo agento kiekio santykis su į cilindrą surintu kiekiu. Surinkto cheminio karo agento kiekis buvo apskaičiuotas pagal standartinę santykinio slopinimo kreivę, kuri iš anksto buvo įvertinta pagal jutiklio galimybes (3e pav.). Skaičiavimai rodo, kad purškto 1, 2 ± 0, 05 μg sarino ir 1, 2 μg VX regeneravimo greičiai buvo atitinkamai 13, 1 ± 6, 9 ir 3, 24%. Šis skirtumas susijęs su reagentų tirpumu vandenyje; Sarinas tirpsta 100% esant 25 ° C, o VX tirpsta tik 3% 32 . Nors susigrąžinimo lygis yra žemas, elektrocheminio aptikimo jautrumas yra pakankamas, kad kompensuotų šią įgimtą problemą. Sarino ir VX LD50 (50% mirtinos dozės) yra atitinkamai 150 ir 40 mg m- 3 (kvėpavimo minutės tūris žmonėms) 7 . Kai atmosferoje buvo purškiama 30 ng VX, buvo tikimasi, kad tankis atmosferoje bus 90 ng m- 3, o tai yra visiškai žemiau LD 50, bet aptinkama prietaisu. Mūsų sukurta sistema galėtų greitai pasiekti automatinį aptikimą, pereinant nuo oro mėginių paėmimo iki elektrocheminio jutimo per 5 minutes. Balione surinkti tirpalai taip pat buvo analizuojami atliekant didelio tūrio GC-MS injekciją, kuri patvirtino cheminių veiksnių buvimą (duomenys nepateikti). Be to, norint pamatyti prietaiso specifiką ir tai, kad lauke esantys teršalai netrukdytų matavimams, atmosfera universiteto stovėjimo aikštelėje buvo patikrinta ir išmatuota jutikliu. Gautais matavimais įtakos nebuvo (papildoma informacija).

Remiantis paskelbtais rezultatais, mūsų sukurtos sistemos aptikimo riba (LOD) buvo palyginta su kitais mobiliaisiais nervų sukėlėjų matavimo metodais 7 . „Draeger“ dujų aptikimo vamzdelis rodė 0, 1 mg m – 3 LOD, jonų judrumo spektrometras turi 0, 2 mg m 3 LOD, o liepsnos fotometrinis detektorius taip pat turi 0, 1 mg m 3 LOD. Mūsų sukurtos sistemos jautrumas buvo aptiktas nanogramų tvarka ir buvo daug mažesnis, palyginti su esamais mobiliaisiais įrenginiais.

Toksinų sukėlėjų aptikimas

Biologiniams toksinams aptikti buvo sukurti komerciškai prieinami aptikimo rinkiniai ir sistemos, ir daugeliu atvejų jiems paprastai reikia maždaug. Tiriant įtariamas medžiagas, nuo mėginio paruošimo galima nustatyti 15–30 min. Šie metodai reikalauja, kad pirmieji reagentai mėginį paruoštų rankiniu būdu įvykio vietoje, dėvėdami sunkius biologinio pavojaus kostiumus, kuriuos sunku valdyti, todėl operacija dažnai būna varginanti ir atima daug laiko. Be to, turimi rinkiniai ir sistemos yra tinkami tik milteliams ar skystam mėginiui, o ne aerozoliams. Tarp daugelio numatytų teroro scenų įkvėpimas gali padaryti didelę žalą gyventojams. Todėl įtariamus ore esančius biologinius debesis, kuriuose gali būti toksinų ar grėsmės sukėlėjų, reikėtų patogiai ir greitai įvertinti, ruošiant mėginį arba nenaudojant jo rankiniu būdu.

Šiame darbe yra nukreiptas į įtariamą debesį ar aerozolį, kuriame yra grėsmę keliančių biologinių kovos veiksnių, ir buvo sukurta visiškai automatizuota biologinio pavojaus aptikimo sistema, susidedanti iš mėginių paėmimo, aptikimo ir signalo rodymo, kurioje nėra paruošiamas mėginys, pavyzdžiui, tamponų rinkimas. ir reikalingas pirmojo atsakiklio apdorojimas.

Botulino toksinai (BTX) iš Clostridium botulinum yra ypač nuodingi baltymai, atsirandantys gamtoje. Ligos kontrolės ir prevencijos centrai (JAV) priskyrė BTX A kategorijai ir sulaukė didesnio dėmesio valdydami riziką ir imdamiesi kovos su bioterorizmu priemonių. Iš septynių skirtingų botulino toksinų serotipų (nuo A iki G) A tipo toksiškumas yra didžiausias: įkvėpus LD50 yra 0, 7–0, 9 μg žmogui. Savo tyrime pagrindiniu taikiniu pasirinkome A tipo toksiną, kuris turi du komponentus: lengvą grandinę (MW 50 kDa) ir sunkią grandinę (MW 100 kDa). Jie yra sujungti disulfidiniu (S – S) ryšiu. Lengvoji grandinė (Lc) turi proteazės aktyvumą, skaidydama SNAP-25 ir slopindama acetilcholino išsiskyrimą. Sunkioji grandinė (Hc) turi angliavandenių surišimo domeną ir specialiai pritvirtina glikolipidus, vadinamus GT1b gangliozidais, ant žmogaus nervų ląstelių.

Čia taikėme natūralų šio toksino atpažinimo ir surišimo procesą selektyviam ir greitam aptikimui. Kaip keitiklio aptikimo įtaisas buvo naudojamas LSPR biosensorius. Buvo sukurta ir sintetinta GT1b gangliozido mimika iš natūralaus GT1b gangliozido. Sintetinis GT1b darinys turi lipoinės rūgšties, skirtos pritvirtinti prie Au paviršiaus, o LSPR mikroschema, modifikuota naudojant GT1b, buvo surinkta pagal mūsų nustatytą metodiką 22 . Kaip parodyta 4a paveiksle, gautame GT1b LSPR luste buvo naudojamos 40 nm dydžio Au nanodalelės. Šiame tyrime vietoje neurotoksinų (BTX / A), sudarytų iš Hc ir Lc ir turinčių stiprų toksiškumą, buvo naudojamas sunkiosios grandinės surišimo domenas (BTX / A / Hc).

Image

LSPR lustų struktūros ( b ) botulino toksinui (BTX) ir ( b ) ricinui aptikti. BTX aptikimo lustams buvo imobilizuotos 40 nm Au nanodalelės, o ricino aptikimui buvo naudojamos 20 nm. Šios drožlės ir sintetiniai glikolipidai kaip toksino ligadai buvo paruošti remiantis ankstesniu mūsų dokumentu 22 . c ) BTX / A / Hc aptikimas LSPR naudojant GT1b modifikuotus LSPR lustus po to, kai mūsų prietaisas surinko BTX / A / Hc. (i) ca. 1/15 ekvivalento BTX LD 50 (2 μg), (ii) ca. 1/45 LD 50 ekvivalento (0, 83 μg). iii) galvijų serumo albuminas, kurio neigiama kontrolinė medžiaga yra maždaug 1/15 ekvivalento BTX LD 50 (2 μg). Čia buvo apskaičiuota, kad įkvepiant LD50 buvo įvertintas 70 kg sveriantis žmogus, kuris 15 minučių įkvepia BTX / A užterštą orą. Aptikimo lustas: GT1b funkcionalus lustas, Tikslinis toksinas: BTX / A / Hc, Srauto greitis: 138 ml min- 1, Bėgimo buferis: 10 mM HEPES (pH 7, 5) +150 mM NaCl. Kiekviena sistemoje surinktų BTX / A / Hc regeneravimo norma buvo apskaičiuota iš 151, 4 ml purškiamo tirpalo kiekių ir kiekviena toksino koncentracija buvo nustatyta pagal standartinę kalibravimo kreivę. Atgaunama 76% (i) ir 53% (ii). d ) (i) ricino LSPR sensorgrama esant maždaug 1/45 000 LD 50 (0, 23 μg) ir RCA 120 (ii), apytiksliai. 1/90 000 LD 50 (0, 12 μg), (iii) ca. 1/220 000 LD 50 (0, 06 μg), ir (iv) ca. 1/440 000 LD 50 (0, 03 μg). (D) įėjimo paveikslėlis yra santykinis dozės ir atsako grafikai tarp LSPR atsako ir atkurto RCA 120 kiekio . Čia buvo apskaičiuotas 70% žmogaus įkvėpto ricino LD50 LD50, kuris įkvėpė ricinu užteršto oro 15 minučių. Aptikimo lustas: Lac mikroschema, Tiksliniai toksinai: ricinas, Srauto greitis: 138 ml min- 1, Bėgimo buferis: 10 mM HEPES (pH 7, 5) +150 mM NaCl.

Visas dydis

Norėdami įvertinti LSPR biosensorinį vienetą, ištyrėme galimą biosensoriaus naudingumą, naudodami skirtingas RCA 120, ricino (RCA 60 ) ir BTX / A / Hc koncentracijas tirpale. Papildomas S5 paveikslas rodo tiesinį ryšį tarp LSPR reakcijų ir šių reagento koncentracijų. Kalibravimo kreivė rodo tiesiškumą nuo 0 iki 200 ng mL −1, tai rodo, kad esamas LSPR vienetas yra patikimas. Be to, ricino koncentracijai 1/3000, kai išmatuotas LSPR atsakas buvo 0, 000805 ± 0, 000196, CV vertė buvo 25% ( n = 3), o tai rodo matavimų patikimumą.

4c paveikslas rodo, kad integruotas nešiojamasis biosensorius surinko BTX / A / Hc su GT1b modifikuotu lustu po BTX / A / Hc iš aerozolio, pagaminto naudojant purkštuvą. Kad būtų lengviau nustatyti toksinus, srauto sistema buvo kontroliuojama tokiu būdu. Iš pradžių tekančio buferio tirpalas 200 s buvo pumpuojamas į srauto kanalą, kad būtų nustatyta pradinė linija, tada surinktas mėginys buvo pumpuojamas 600 s, o tada siurblys buvo perjungtas atgal į tekančią buferį (išsami informacija S1 papildomoje lentelėje ir papildomame S6 paveiksle). . Taigi LSPR jutiklių schemose buvo gauti aiškūs absorbcijos pokyčiai. Įkvėpus LD50 yra maždaug 700 ng, kai 70 kg sveriantis žmogus įkvepia oro, užteršto BTX / A 33 . Nes žmonės įkvepia maždaug 8 l oro per 1 min., Apskaičiuota, kad LD 50 yra maždaug 0, 7 μg / 8 l 1 min. 34, 35 . Buvo nustatyta ši 1 minutės įkvėpimo būsenos riba, kuri atitinka orą, užterštą maždaug toksinu. 87, 5 μg m −3 . Kadangi surinkimo įrenginys 1 minutę išsiurbia 338 l oro, sistema įkvepia apytiksliai. 30 μg BTX / A / Hc 1 min. Priešingai, ca. Iš atomizatoriaus buvo purškiama 2, 0 μg BTX / A / Hc rūko, užteršto toksinu, kuris įkvepiant atitinka LD50. Dėl to integruotas nešiojamasis biojutiklis galėjo surinkti ir užfiksuoti apytiksliai. 1, 6 μg BTX / A / Hc iš užteršto aerozolio. Surinktas oras, kuriame yra BTX / A / Hc, buvo sumaišytas su grynu vandeniu surinkimo cilindre, kad būtų atgautas tikslinis toksinas, o po to automatiškai tekėjo į GT1b modifikuotą lustą LSPR sistemoje, kad būtų galima aptikti toksinus. Šiuo atveju nustatyta, kad toksino atsistatymas yra 76% (skaičiavimo detalės pateiktos skyriuje „Medžiagos ir metodai“), remiantis LSPR kalibravimo kreive (papildomas S5b paveikslas), tai reiškia, kad sistema veiksmingai surinko toksiną. 4c paveiksle (i) LSPR atsakas buvo prisotintas maždaug po. 800 s (mėginys įšvirkštas 0 s), parodant, kad galima aptikti ekvivalentiškos BTX / A LD 50 įkvėpimo koncentraciją. Be to, dabartinė sistema galėtų aptikti mažesnę BTX / A LD50 ekvivalento 1/45 koncentraciją (4c paveikslas (ii)), todėl dabartinė sistema yra labai jautri.

Toliau mes ištyrėme ricino aptikimą. Ricinas yra klasifikuojamas kaip B kategorijos biologinis agentas ir yra mažiau pavojingas nei A kategorijoje. Ricinas turi du subvienetus: A subvienetas turi ribonukleinį aktyvumą, o B subvienetas turi du angliavandenius jungiančius domenus. B subvienetas jungiasi su β-d-galaktopiranozilo (β-d-Gal) liekana, kurią panaudojome šiam toksinui aptikti. LSPR mikroschema ricinui nustatyti yra parodyta 4b paveiksle, o laktozidas, turintis β-d-Gal liekanomis modifikuotą mikroschemą, buvo paruoštas, kaip buvo pranešta anksčiau 22 . Ricinui aptikti buvo naudojamos 20 nm Au nanodalelės (4b pav.). Įpurškiant 1/45 000 ekvivalento (maždaug 0, 23 μg ml −1 ) ricino LD 50 įkvėpus, integruota sistema surinko toksiną į vandenį, o tada ricinas buvo aiškiai aptiktas (4d paveikslas (i)). Rezultatas rodo, kad sistema gali nustatyti toksiną esant daug mažesnei įkvėpimo LD 50 koncentracijai; todėl dabartinė sistema bus naudinga kaip įrankis vietoje vienu metu aptikti cheminius ir biologinius veiksnius, net jei toksinas buvo praskiestas ore. Taigi, norint įvertinti dabartinės sistemos, kaip pirminio toksinų tyrimo, apribojimą, buvo atliktas tas pats priklausomybės nuo koncentracijos eksperimentas, naudojant ricino modelinį tirpalą RCA 120 . RCA 120 koncentracija, 0, 66 μg ml –1, kuri atitinka 1/90 000 ricino LD50, buvo purškiama ir 1 min. Buvo surinkta iš aerozolio naudojant mūsų aparatą. Apskaičiuota, kad išeiga 83%. Ši skaitinė reikšmė buvo daug didesnė nei kitų aptiktų signalų. Didelis atsistatymas yra susijęs su biologinio toksino tirpumu vandenyje, o jo molekulinis svoris yra didesnis nei cheminio karo agentų. Taip pat buvo įvertintos mažesnės RCA 120 koncentracijos (maždaug 1/220 000 ir maždaug 1/440 000 LD 50 ), o gautos išeigos išeiga buvo atitinkamai 80 ir 75%. As shown in Figure 4d, the plots of the recovery weights of RCA 120 and LSPR responses showed almost linear dose–response relationships; this indicated that our developed device exhibited good performance. In the LSPR sensorgram, 1/45 000 concentration of ricin of LD 50 in inhalation showed a response similar to that of 1/90 000 concentration of RCA 120 . This result is attributed to the fact that the molecular weight of ricin is half of that of RCA 120, and the number of sugar-binding sites of ricin is also half of that of RCA 120 .

Detection of pathogen agents

We also evaluated our device for the detection of pathogen agents from the air sample using the installed rapid on-chip PCR device. BS spores were used as a simulant. The performance of our rapid on-chip PCR technology was previously reported 23 . A small volume of PCR solution was injected in the microchannel and formed the segment-flow through the perfused air and vapor pressures. When 2.5×10 6 cfu of the BS spore simulant solution was collected by the generated mist and became concentrated in the reservoir, the estimated amount of the collected BS spores was 1.6×10 5 cfu. The calculated concentration was approximately equivalent to 800 cfu μL −1 . Figure 5 shows the results of the amplified fluorescence intensity after the segment-flow PCRs with the various concentrations of BS spores. The flow rate of the PCR solution was adjusted to detect low concentrations of positive control. The flow rate was fixed at 24 μL min −1, and the total reaction time was 12.5 min for 40 cycles of the segment-flow PCR. Orange-colored bars indicate the fluorescence intensities after the segment-flow PCRs in cases of direct injection of 1000 cfu μL −1 of BS spore solution and no template control (NTC) solution without the aerosol sampler: positive and negative controls, respectively. Blue bars indicate the results of the segment-flow PCRs using the aerosol sampler. These fluorescence intensities after the segment-flow PCRs do not only relate to the amount of the sprayed BS spores; these were also reasonable values between the results of both controls. While the BS spore solution was diluted 100 times (equal to 8 cfu μL −1 ), the fluorescence was successfully increased compared with the NTC. Here, chemical agents should be used with the assumption that the lethal dose in air is for 1 min of inhalation since the toxicity effect will appear immediately. Alternately, a pathogen agent should have the assumption that the lethal dose in air for 1 h of inhalation, because the infection of a bacterium pathogen or virus takes propagation time and has the greater possibility of treatment. The infection dose of anthrax spores is 8000–50 000 spores 34, 35 . If a human inhales approximately 8 l min −1, the lethal dose of anthrax is calculated to be 16 000 spore m −3 . If it is assumed that the infection can be medically treated with the administration of antibiotics after early discovery of the agent exposure, the safety margin of the lethal dose is increased by 10 times 35 . Thus, 54 000 spores should be collected and detected, as required for anthrax sensitivity, when air is collected for 338 l min −1 by our sampling device. A concentration of 8 cfu μL −1, which was successfully detected by our device, has 25 000 spores and covered the required sensitivity for anthrax detection. Therefore, it is expected that the sensitivity of the developed system would be enough for detecting biological warfare similar to anthrax spores. In addition, for 800 cfu mL −1, the observed fluorescence intensity was 8.38±1.05 with a CV value of 12.5% ( n =3) that demonstrate the reliability of the measurement.

Image

Estimation of our device to detect pathogen simulant from the air sampling to on-chip PCR detection.

Visas dydis

Išvada

First responders, such as the police and fire fighters, greatly need a multibiosensing mobile system with minimum manipulation for on-site detection for rapid risk assessment and analysis of the possible presence of BC agents in the event site. In this report, we have developed an autonomous air sampling and detection system, which integrates aerosol sampling and biosensing technologies. The designed collection system (338 l min −1 ) was able to collect the target BC agents. More importantly, concentrations lower than the mean lethal dose (LD 50 ) were successfully detected for nerve gases (sarin and VX) by electrochemical measurement, toxic proteins (BTX/A/Hc and ricin) by LSPR measurement, and pathogens (anthrax simulant) by chip PCR. An operation time of only 5–15 min is needed for the collection and detection. The detection of each BC was done separately, but it is envisioned that the device is capable of simultaneous detection. Due to technical limitations in preparing a model gas containing all the BC targets, this was not demonstrated. More importantly, neither cross-contamination nor false signals was found for BC targets present in unintended sensing device (Supplementary Figure S7 and Supplementary Table S2), which promotes the reliability of the obtained measurements. Finally, to realize our system concept, we produced a compact and battery-operated device having all of the units integrated into one system (Figure 6). However, it should be noted that the device is intended for first responders' utility, and it is expected that the findings will be validated again in testing labs after the necessary actions are made based on the risk assessment of on-site events. Still, with the features of the developed device, it is greatly expected to contribute to maintaining a safe and healthy society.

Image

Prototype of the integrated automated portable device. All parts of the device are assembled in a compact 300 mm×300 mm×300 mm and 12.8 kg container. The device runs with a 24-V battery power source and is connected to a tablet screen.

Visas dydis

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija