Folio rūgštis apsaugo nuo arseno sukelto embriono toksiškumo, reguliuodama dvr1 ekspresiją | mokslinės ataskaitos

Folio rūgštis apsaugo nuo arseno sukelto embriono toksiškumo, reguliuodama dvr1 ekspresiją | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biochemija
  • Molekulinė biologija

Anotacija

Kaip maistinis faktorius, folio rūgštis gali užkirsti kelią širdies ir nervų defektams embriono vystymosi metu. Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad arsenas neigiamai veikia embriono vystymąsi, nes sumažina Dvr1 / GDF1 ekspresiją zebrafish. Čia mes ištyrėme, ar folio rūgštis gali apsaugoti nuo embrionų sukelto toksiškumo arsenu. Mes nustatėme, kad papildant folio rūgštimi padidėja perinimas ir išgyvenamumas, sumažėja apsigimimų dažnis ir pagerėja nenormalus zebrafish embrionų, paveiktų arsenito, širdies ir nervų vystymasis. Tiek realaus laiko PGR analizė, tiek visos sumontuotosios hibridizacijos metu nustatyta, kad folio rūgštis reikšmingai išgelbėjo Dvr1 ekspresijos sumažėjimą, kurį sukėlė arsenitas. Vėliau mūsų duomenys parodė, kad arsenitas žymiai sumažino ląstelių gyvybingumą ir GDF1 mRNR bei baltymų kiekį HEK293ET ląstelėse, o folio rūgštis panaikino šį poveikį. Folio rūgštis susilpnino tarpląstelinių reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) lygio padidėjimą ir oksidacinio adapterio p66Shc baltymo ekspresiją, lygiagrečiai su GDF1 ekspresijos ir ląstelių gyvybingumo pokyčiais. P66Shc numušimas smarkiai slopino ROS gamybą ir arsenito sukeltą GDF1 slopinimą. Mūsų duomenys parodė, kad folio rūgšties papildai apsaugojo nuo arseno sukelto embriono toksiškumo, reguliuodami Dvr1 / GDF1 ekspresiją, o folio rūgštis padidino GDF1 ekspresiją mažindama p66Shc ekspresiją ir tarpląstelinius ROS lygius.

Įvadas

Geriamojo vandens užteršimas neorganiniu arsenu kelia didelę grėsmę visuomenės sveikatai daugelyje šalių. Lėtinis arseno poveikis padidina vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų, vystymosi ir reprodukcinių problemų riziką ir paplitimą 1, 2 . Buvo pranešta, kad arseno poveikis gimdoje gali sukelti įgimtą širdies ligą palikuonims, kurių motina nėštumo metu vartojo užterštą vandenį 3 . Geriamas vanduo, kuriame yra didelis arseno kiekis, yra naujagimių deformacijos, įskaitant nervų sistemos deformacijas, galūnių deformacijas ir įgimtas širdies ligas, rizikos veiksnys Kinijos populiacijose 4 . Tyrimai su gyvūnais parodė, kad arsenas sukelia preimplantacinį vystymosi sulėtėjimą, taip pat augimo sulėtėjimą po gimdymo ir deformaciją 5, 6 .

Oksidacinis stresas buvo nustatytas kaip svarbus arseno toksiškumo mechanizmas 7 . Arseno sukelta ROS sukelta apoptozė buvo gerai dokumentuota daugelyje ląstelių linijų 8, 9 . Naujausi tyrimai pranešė, kad arsenitas stimuliuoja nikotinamido adenino dinukleotido fosfato (NADPH) oksidazę, esančią kraujagyslių endotelio ląstelių ir kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelių membranoje, kad padidėtų reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS), tokių kaip superoksidai ir vandenilio peroksidas 10, 11, generacija . P66Shc dalyvauja mitochondrijų ROS gamyboje, veikdamas kaip redokso fermentas, oksiduojantis citochromą c, tokiu būdu sukurdamas proapoptotinį H 2 O 2, reaguodamas į specifinius streso signalus 12 . Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad arsenitas sukelia stiprų redokso disbalansą mažindamas glutationo lygį ir didindamas ROS lygį per p66Shc, kuris sukelia apoptozę, suaktyvindamas citochromo c-kaspazės kelią 13 . Tiek p66shc numušimas, tiek antioksidantas N-acetilcisteinas (NAC) pagerina arsenito paveiktų embrionų kompetenciją in vitro , padidindami atsparumą oksidaciniam stresui 13, 14 . Trinei ir kt. pranešė, kad p66Shc veikia kaip naviko slopintuvo p53 pasroviui taikinys ir yra būtinas norint, kad stresas suaktyvintas p53 galėtų sukelti tarpląstelinių oksidantų padidėjimą, citochromo c išsiskyrimą ir apoptozę 15 .

Folio rūgštis, vandenyje tirpus vitaminas B, negali būti sintetinamas in vivo, o absorbuojamas iš žalių lapinių daržovių ir citrusinių vaisių 16 . Gerai žinoma, kad maisto papildai su folio rūgštimi sumažina naujagimių mirtingumą dėl nervų vamzdelių sutrikimų 17 . Keli tyrimai parodė, kad perikoncepciniai multivitaminai, kurių sudėtyje yra FA, gali sumažinti įgimtų širdies ydų riziką 18, 19. Dietinis maisto papildas, užkertantis kelią pelių etanolio sukeltiems širdies apsigimimams, išvengė 20 . Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad folio rūgštis apsaugo nuo selenito sukelto embriono toksiškumo, įskaitant širdies ir nervų defektus, zebrafish 21 . Han et al. pranešė, kad folio rūgštis dalyvavo kanoniniame Wnt kelyje, kad išgelbėtų ličio sukeltas stuburinių širdies anomalijas 22 . Folio rūgštis pastaruoju metu sulaukia daug dėmesio kaip mitybos veiksnys, turintis įtakos arseno sukeltam toksiškumui. Xu ir kt. pranešė, kad folio rūgšties papildai silpnina arseno sukeltą toksiškumą ir apoptozę hepatocituose 23 . Gydymas folio rūgštimi galėtų apsaugoti SWV / Fnn pelių fibroblastus nuo natrio arsenito citotoksiškumo 24 . Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad embriono arseno toksiškumas zebrafish vystymosi metu yra būdingas perikardo edema, kraujotakos nepakankamumas, kilpos nepakankamumas ir neurodevelopmental painiava 25 . Tolesnė analizė parodė, kad zebrafish Dvr1 (dekapentapleginis ir susijęs su Vg-1), žinduolių GDF1 homologas (augimo diferenciacijos faktorius 1), susijęs su kairiosios ir dešinės ašies formavimu, buvo susijęs su arseno sukeltu embriono toksiškumu 26 . Vis dėlto nežinoma, ar folio rūgštis gali padėti išvengti arseno toksiškumo zebrafish embrionams.

Šiame tyrime įvertinome folio rūgšties poveikį arseno sukeltam embrioniniam toksiškumui zebrafish ir nustatėme, kad folio rūgštis gali apsaugoti širdies ir kraujagyslių bei nervų sistemas nuo arseno toksiškumo. Folio rūgštis sumažino oksidacinį stresą ir padidino Dvr1 / GDF1 raišką slopindama oksidacinio streso adapterio p66Shc ekspresiją. Šis tyrimas parodė, kad folio rūgštis gali būti veiksminga apsauga nuo toksiškumo arsenui, reguliuojant Dvr1 aktyvumą.

Rezultatai

Folio rūgštis padidina perinti ir išgyventi bei sumažina embrionų, veiktų arsenito, apsigimimą

Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad arsenitas atitolina perėjimą ir sukelia nenormalią morfologiją bei mirtingumą 25 . Norėdami įvertinti, ar folio rūgštis galėtų išgelbėti nuo to, kad embrionai paveikė arseną, mes gydėme zebrafish embrionus 2 mM arsenito, skirtingomis folio rūgšties dozėmis ir jų deriniu esant 4 AG / s greičiui. Perinti, išgyventi ir apsigimimai buvo stebimi skirtingais laiko momentais. Kaip parodyta 1A pav., Kontrolinės ir folio rūgštimi apdorotos (100 μM) grupės perėjimo tempai buvo daugiau kaip 50% esant 48 AG. Tik 10% embrionų išperėjo 48 AG galingumo grupėse, apdorotose arsenitu. Grupės, apdorotos arsenitu ir 100 μM folio rūgštimi, perėjimo greitis šiek tiek padidėjo. Esant 72 ir 96 AG greičiui, perinimo greitis buvo maždaug 98% kontrolinėje ir folio rūgštimi gydytų grupių, bet tik 30% grupėje, apdoroto arsenitu. Bendras gydymas 50 arba 100 μM folio rūgštimi žymiai palengvino arsenito sukelto perėjimo greičio sumažėjimą. Be to, perėjimo greitis grupėje, kuri buvo apdorota arsenitu ir 100 μM folio rūgštimi, buvo maždaug toks pat kaip kontrolinėje grupėje.

Image

( A ) Histograma rodo embrionų, išgelbėtų folio rūgštimi, perinti po valandos po apvaisinimo (hpf). Statistiškai reikšmingi skirtumai nuo gydytų arsenitu grupės yra pažymėti žvaigždutėmis. ** p <0, 01, *** p <0, 001, palyginti su arsenito grupe, ANOVA. ( B ) Išgyvenamumo procentai yra nubraižomi pagal valandą po apvaisinimo (hpf). C ) Pažeistų embrionų procentinė dalis nubraižoma pagal valandą po apvaisinimo (hpf). Vertė pateikiama kaip vidurkis ± SE Ctrl, kontrolė; FA, folio rūgštis; As, arsenitas. (Kiekvienas gydymas buvo pakartotas tris kartus; n = 50 kiekvienam gydymui).

Visas dydis

Kaip parodyta 1B pav., Reikšmingo skirtumo tarp embrionų išgyvenamumo visose grupėse nebuvo prieš 24 AG. Arsenito paveiktoje grupėje išgyvenamumas smarkiai sumažėjo nuo 48 iki 120 AG. Bendras gydymas 50 arba 100 μM folio rūgštimi akivaizdžiai padidino arsenitu apdorotos grupės išgyvenamumą nuo 48 iki 96 AG. Be to, išgyvenamumas po folio rūgšties papildymo 100 μM buvo didesnis nei 50 μM folio rūgšties. Tačiau apsauginis folio rūgšties poveikis sumažėjo nuo 48 iki 120 AG. Išgyvenamumas po folio rūgšties papildymo 50 μM grupėje sumažėjo iki panašaus lygio kaip ir arsenito paveiktoje grupėje esant 120 AG. Pažymėtina, kad papildymas 100 μM folio rūgšties gana gerai išgelbėjo embrionų, veiktų arsenito, išgyvenamumą esant 120 AG / h.

1C pav., Gydymas arsenitu, sąlygojo akivaizdų apsigimimo laipsnio padidėjimą nuo 48 iki 120 AG, palyginti su kontroline grupe. Embrionų gydymas arsenitu ir 100 μM folio rūgštimi šiais laikais palaikė normalų embriono vystymąsi, tai beveik atitiko kontrolinę grupę. Bendras gydymas 50 μM folio rūgštimi iš dalies išgelbėjo nenormalius embrionus, kuriuos sukėlė gydymas arsenitu, nuo 48 iki 96 AG. Šie duomenys parodė, kad folio rūgštis tam tikru mastu sumažino arsenito toksiškumą embrionams zebrafish.

Folio rūgštis apsaugo nuo arsenitą sukeliančių širdies defektų

Embrionai, apdoroti arsenitu, turėjo įvairių vystymosi anomalijų, įskaitant perikardo edemą, kilpos nepakankamumą, nugaros kreivumą ir plokščią galvą. Dėl arsenito paveiktų embrionų pažeidimų buvo išgelbėta papildant folio rūgštimi. Rezultatai buvo panašūs į kontrolinės ir folio rūgšties paveiktų grupių rezultatus (2A pav.). Vėliau, naudodami Tg (cmlc2: GFP) transgeninius zebrafish embrionus, mes patikrinome kamerų ir širdies kilpos išsivystymą. Embrionai, apdoroti arsenitu, parodė vamzdinę širdį su mažesniu skilveliu ir tarp dviejų kamerų susidarė nepakankama kilpa. Embrionai, paveikti arsenito ir folio rūgšties, parodė didesnį skilvelių vystymąsi ir širdies kilpos padidėjimą, palyginti su tais, kurie buvo gydyti arsenitu (2B pav.). Norėdami toliau ištirti folio rūgšties poveikį embriono hemoglobino gamybai, mes nustatėme eritropoezę dažydami o-dianisidinu. Eritroidinės ląstelės buvo matomos kontrolinėse ir folio rūgštimi paveiktose grupėse, esant 48 AG / h, tačiau jos išnyko širdies ir kraujagyslių sistemoje ir atskirai agreguotos ICM (tarpinė ląstelių masė) embrionuose, apdorotuose arsenitu. Tačiau gydymas kartu su arsenu ir folio rūgštimi atstatė sumažintą arseno sukeltą eritropoezę, palyginti su gydymu vien arsenu (2 pav. C). Be to, embrionų, kuriems nustatyta normali eritropoezė, procentas arsenitu gydytoje grupėje buvo sumažintas iki 63, 5%. Embrionų, kuriems būdinga normali eritropoezė, procentas bendro gydymo arseno ir folio rūgštimis grupėje buvo žymiai padidėjęs iki 85% (2 pav. D).

Image

( A ) Embrionai, paveikti arseno, sukėlė nenormalų vystymąsi, ypač perikardo edemą, tačiau juos išgelbėjo folio rūgšties papildas, pasiekiantis 72 AG. ( B ) Širdies kilpų ir kamerų fenotipai buvo stebimi naudojant Tg (cmlc2: gfp) transgeninius embrionus. Reprezentatyvūs šoninio ir ventralinio vaizdo fluorescenciniai mikrografai, vaizduojantys skilvelio (V) ir prieširdžio (A) rodmenis, esant 48 AG greičiui. Dažymas ( C ) ir ( D ) O-dianisidinu buvo naudojamas eritroidų ląstelių pasiskirstymui ir skaičiui kontroliniuose ir apdorotuose embrionuose aptikti esant 48 AG. Eritrocito ląstelės buvo rastos ant trynio maišelio ir tarpdančių ląstelių masę (ICM). Rodyklės galvutė yra pastatyta taip, kad pažymėtų ICM. Grafikai parodo embrionų, turinčių normalią eritropoezę, procentinę dalį kontrolinių ir apdorotų grupių embrionuose, esant 48 AG. * p <0, 05, *** p <0, 001, palyginti su kontroline grupe; ## p <0, 01, palyginti su arsenito grupe. Duomenys rodo vidurkį ± SE Ctrl, kontrolę; FA, folio rūgštis; As, arsenitas. (Kiekvienas gydymas buvo pakartotas tris kartus; n = 50 kiekvienam gydymui).

Visas dydis

Folio rūgštis apsaugo aksonų pastolius ir CNS nuo toksiškumo arsenui

Norėdami patikrinti folio rūgšties sugebėjimą išgelbėti embrionų nervinį vystymąsi po paveikimo arsenitu, mes nustatėme acetilinį α-tubuliną, pan-aksoninį žymeklį, imuniniu dažymu esant 24 ir 48 AG greičiui. Esant 24 AG greičiui, embrionai, esantys arsenito paveiktoje grupėje, sumažino šiuos signalus smegenų srityje, palyginti su kontroline grupe, folio rūgštimi apdorota grupe ir arsenito bei folio rūgšties bendrojo gydymo grupe (3 pav. A). Esant 48 AG greičiui, gydymas arsenitu lėmė chaotišką aksonų pastolių išdėstymą ir netaisyklingą motorinių neuronų aksonų pasiskirstymą tarp segmentų (3B-c pav.), Priešingai nei kontrolinėje grupėje (3B pav. - a) ir folio rūgšties- apdorota grupė (3B-b pav.). Panašiai, arsenitu apdorotų zebrafish embrionų nervų modeliavimas užpakalinių smegenų srityje buvo neaiškus (3C-C pav.), Palyginti su kontroline grupe (3C-a pav.) Ir folio rūgštimi apdorota grupe (3C-b pav.)., kurios modeliai buvo normalūs. Papildymas folio rūgštimi išgelbėjo žalingą arsenito poveikį nervų vystymuisi (3B pav., Dd, Cd). Bendrojo gydymo grupės embrionų aksonai padidėjo visose smegenų srityse, o aksonų traktacija kaukolės srityje neatrodė paveikta. Šie duomenys parodė, kad folio rūgštis galėjo apsaugoti aksonų pastolius ir CNS nuo toksiškumo, kurį sukelia arsenitas.

Image

Nervų sistemos vystymąsi rodo imuninis α-AT (žaliosios fluorescencijos) dažymas. ( A ) 24 AG greičio šoninis vaizdas kontroliuojamoje grupėje (a) ir grupėse, apdorotose atitinkamai FA (b), As (c) ir jų deriniu (d). ( B ) Šoninis 48 AG greičio vaizdas kontrolinėje (a) ir grupėse, apdorotose atitinkamai FA (b), As (c) ir jų deriniu (d). Kiekvienos grupės dėžutės plotas buvo padidintas kaip (a-1), (a-2), (b-1), (b-2), (c-1), (c-2), (d-1)., ir (d-2), atitinkamai, kad būtų aiškesnis vaizdas apie nervų augimą smegenyse ir bagažinėje. Raudoni žvaigždutės žymi nervo šakas, esančias tektumoje ir tektaliniame skilvelyje; Geltonos žvaigždės rodo nervo šakas telencephalone; Baltos rodyklių galvutės yra išdėstytos taip, kad pažymėtų nervo šakas, esančias ausies pūslelinėje; Geltonos rodyklės rodo variklio neurono vystymąsi bagažinėje. ( C ) Kontrolinis (a) ir grupių, apdorotų FA (b), As (c), ir jų derinys (d), žiūrint iš 48 AG, šoninis vaizdas. Kiekvienos grupės dėžutės sritis buvo padidinta atitinkamai (a-1), (b-1), (c-1) ir (d-1), kad būtų aiškesnis vaizdas apie nervų augimą smegenyse. Vaizdai ( B ) yra šoniniai, iš priekio į kairę; vaizdai ( C ) yra nugariniai, iš priekio į kairę. Kiekvienas gydymas buvo pakartotas tris kartus. bn, smegenys; hb, užpakalinis smegenys; hbv, užpakalinio smegenų skilvelis; sp, nugaros smegenys; tel, telencephalonas; tct, tektumas ir tektalinis skilvelis. „Ctrl“, valdymas; FA, folio rūgštis; As, arsenitas.

Visas dydis

Folio rūgštis apsaugo nuo arseno sukeliamų vystymosi defektų, kontroliuodama Dvr1 / GDF1 ekspresiją

Ankstesni mūsų tyrimai parodė, kad arsenas silpnina embriono vystymąsi, sumažindamas Dvr1 (žinduolių GDF1 homologą) ekspresiją zebrafish 26 . Norint ištirti galimą folio rūgšties apsaugos nuo arsenito sukelto toksiškumo mechanizmą, Dvr1 buvo ištirtas zebrafish embrionuose, apdorotuose arsenitu, folio rūgštimi ir jų deriniu esant 4 AG / s (sferos stadija). Realaus laiko PGR analizė parodė, kad arsenu apdorotų embrionų Dvr1 lygis buvo žymiai mažesnis, palyginti su kontrolinėmis grupėmis, esant 6 AG (skydo stadija), ir tai atitinka mūsų ankstesnius rezultatus. Tačiau gydymas kartu su folio rūgštimi ir arsenitu žymiai padidino Dvr1 mRNR lygį, palyginti su gydymu tik arsenitu; lygiai buvo maždaug tokie patys kaip kontrolinėje grupėje (4A pav.). Šį rezultatą dar labiau patvirtino viso montavimo in situ hibridizacijos rezultatai (4 pav. B). Šie duomenys rodo, kad folio rūgštis apsaugo nuo arseno sukeliamų vystymosi defektų, reguliuodama Dvr1 ekspresiją.

Image

( A ) Dvr1 mRNR lygis kontroliuojamų ir apdorotų grupių embrionuose, esant 6 AG / ff, buvo išmatuotas kiekybiniu realaus laiko PGR. * p <0, 05, palyginti su kontroline grupe; # p <0, 05 vs arseno grupė. Duomenys parodo vidutinį ± SE ( B ) Dvr1 išraiškos modelį kontroliniuose ir apdorotuose grupių embrionuose, esant 6hpf, hibridizuojant visą sumontuotą in situ . „Ctrl“, valdymas; FA, folio rūgštis; As, arsenitas.

Visas dydis

Folio rūgštis reguliuoja ląstelių gyvybingumą ir GDF1 ekspresiją arsenito paveiktose HEK293ET ląstelėse

Norint dar labiau patvirtinti folio rūgšties apsauginį poveikį nuo arseno toksiškumo, HEK293ET ląstelėse buvo tiriamas ląstelių gyvybingumas ir GDF1 ekspresija. Ląstelių gyvybingumas sumažėjo reaguojant į arsenitą esant skirtingoms koncentracijoms (0, 1, 2 ir 5 μM) priklausomai nuo dozės. Ląstelių inkubacija su 2 arba 5 μM arsenitu žymiai sumažino ląstelių gyvybingumą, palyginti su kontroliniu gydymu (5A pav.). Gydymas folio rūgštimi, atvirkščiai, slopino šį sumažėjimą priklausomai nuo dozės (5 pav. B). Kai ląstelės buvo gydomos 5 μM arsenitu ir 20 μM folio rūgštimi, ląstelių gyvybingumas žymiai padidėjo, palyginti su grupe, kuri buvo gydoma vien arsenitu. Be to, kai ląstelės buvo apdorotos 100 μM folio rūgštimi, ląstelių gyvybingumas buvo beveik visiškai atkurtas (5 pav. B). GDF1 mRNR ir baltymų ekspresija buvo sumažinta priklausomai nuo dozės arsenito paveiktose ląstelėse (5 pav., C). Tačiau folio rūgšties papildai labai slopino GDF1 mRNR ir baltymų lygio sumažėjimą (5E pav., F).

Image

( A ) Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas atliekant CCK-8 proliferacijos testus HEK293ET ląstelėse, apdorotose skirtingomis arsenito koncentracijomis. ( B ) Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas atliekant CCK-8 proliferacijos testus HEK293ET ląstelėse, apdorotose arsenitu, folio rūgštimi ir jų deriniu. ( C ) ir ( D ) GDF1 ekspresija buvo įvertinta kiekybiniu realaus laiko PGR (C) ir Western blot (D) HEK293ET ląstelėse, apdorotose skirtingomis arsenito koncentracijomis. GDF1 ekspresijos kiekybinis įvertinimas densitometrijos būdu. ( E ) ir ( F ) GDF1 ekspresija buvo įvertinta kiekybiniu realaus laiko PGR (E) ir Western blot (F) HEK293ET ląstelėse, apdorotose arsenitu, folio rūgštimi ir jų deriniu. GDF1 ekspresijos kiekybinis įvertinimas densitometrijos būdu. * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001 vs kontrolinė grupė, # p <0, 05, ## p <0, 01 vs arseno grupė. Duomenys rodo vidurkį ± SE Ctrl, kontrolę; FA, folio rūgštis; As, arsenitas.

Visas dydis

Folio rūgštis sumažina ROS lygį ir p66Shc ekspresiją arsenito paveiktose HEK293ET ląstelėse

Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad su p66Shc susijęs redokso disbalansas sąlygojo arsenito sukeltą embriono sulėtėjimą 13, 14 . Mes ištyrėme, ar folio rūgštis keičia redokso balansą arsenito paveiktose HEK293ET ląstelėse. Kaip parodyta 6A pav., B, po ląstelių ROS lygis po 24 val. Buvo žymiai padidėjęs, palyginti su kontroliniu gydymu, o folio rūgšties papildai žymiai sumažino ROS susidarymą arsenito paveiktose ląstelėse. Kaip parodyta 6C pav., P66Shc raiška žymiai padidėjo reaguojant į gydymą įvairiomis arsenito dozėmis (0, 1, 2 ir 5 μM). Tačiau folio rūgšties papildai pastebimai slopino p66Shc baltymų ekspresijos padidėjimą (6 pav. D). Šie rezultatai parodė, kad folio rūgštis gali atlikti apsauginį poveikį arseno sukeltam ląstelių toksiškumui slopindama p66Shc ekspresiją ir tarpląstelinį oksidacinį stresą.

Image

( A ) ir ( B ) ROS lygis buvo įvertintas fluorescenciniu mikroskopu ( A ) ir mikrotinklių skaitytuvu ( B ) HEK293ET ląstelėse, apdorotose arsenitu, folio rūgštimi ir jų deriniu. ( C ) p66Shc ekspresija buvo įvertinta naudojant Western blot analizę HEK293ET ląstelėse, apdorotose skirtingomis arsenito koncentracijomis. P66Shc ekspresijos kiekybinis įvertinimas densitometrijos būdu. ( D ) p66Shc ekspresija buvo įvertinta atliekant Western blot analizę HEK293ET ląstelėse, apdorotose arsenitu, folio rūgštimi ir jų deriniu. P66Shc ekspresijos kiekybinis įvertinimas densitometrijos būdu. * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001 vs kontrolinė grupė; # p <0, 05 vs arseno grupė. Duomenys rodo vidurkį ± SE Ctrl, kontrolę; FA, folio rūgštis; As, arsenitas.

Visas dydis

P66Shc numušimas sumažina ROS lygį ir padidina GDF1 ekspresiją arsenito paveiktose HEK293ET ląstelėse.

Toliau įvertinome GDF1 ekspresiją ir ROS lygius p66Shc numušimo ląstelėse, esant arsenitui. HEK293ET ląstelės buvo transfekuotos kontroline arba p66Shc-siRNR, inkubuojamos 24 val., Po to dar 24 val. Apdorotos arsenitu. Kaip parodyta 7A pav., Numušimo efektyvumą patvirtino Western blot. P66Shc numušimas susilpnino arsenito sukeltą GDF1 slopinimą HEK293ET ląstelėse. Atitinkamai, p66Shc numušimo ląstelėse subcellular ROS lygis buvo žymiai sumažėjęs, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (7 pav. B). Šie rezultatai parodė, kad p66Shc sunaikinimas slopino arsenito sukeltą GDF1 ekspresijos slopinimą ir ROS lygio padidėjimą.

Image

( A ) p66Shc ir GDF1 ekspresija HEK293ET ląstelėse, transfekuotose kontroline arba p66Shc siRNR, esant arsenitui, buvo įvertinta Western blot metodu. P66Shc ir GDF1 ekspresijos kiekybinis įvertinimas densitometrijos metodu. ( B ) ROS lygis HEK293ET ląstelėse, transfekuotose kontroline arba p66Shc siRNR, esant arsenitui, buvo įvertintas fluorescenciniu mikroskopu. ** p <0, 01, ## p <0, 01, palyginti su kontroline siRNR grupe. Duomenys rodo vidurkį ± SE As, arsenitas; si-Ctrl, kontrolinė siRNR; si-p66Shc, p66Shc siRNR.

Visas dydis

Diskusija

Epidemiologiniai tyrimai patvirtino, kad arseno ir jo junginių poveikis gali turėti neigiamos įtakos žmonių sveikatai, nes gali sukelti daugybę vėžio formų, širdies ir kraujagyslių bei neurologinių ligų27. Naujausi tyrimai pranešė, kad folio rūgštis išgelbėjo ličio, homocisteino ir Wnt3A sukeltas stuburo širdies anomalijas 22 ir užkirto kelią sudėtiniams širdies defektams po etanolio ekspozicijos, kai buvo atliekama atskira kardiogeninė reakcija zebrafish 28 . Yra duomenų, kad folio rūgštis daro įtaką arseno apykaitai. FA gydymas apsaugojo SWV / Fnn pelių embrionų fibroblastus nuo natrio arsenito citotoksiškumo 24 . Šio tyrimo tikslas buvo ištirti folio rūgšties prevencinį poveikį nuo arseno sukelto embriono vystymosi toksiškumo. Mes pastebėjome, kad folio rūgšties (50 μM) poveikis iš dalies sumažino embrionų išgyvenamumą arba akivaizdžius apsigimimus, kuriuos sukėlė arseno poveikis embriono stadijose (48–96 AG). Priešingai, papildant didesnėmis folio rūgšties koncentracijomis (100 μM) labai padidėjo išgyvenamumas ir sušvelnėjo arseno sukelti embriono vystymosi pokyčiai, įskaitant atidėtą perėjimą, sumažėjusį augimą ir nervų bei širdies sistemų pažeidimus. Pastebėjome, kad apsauginis folio rūgšties poveikis sumažėjo nuo 48 iki 120 AG. Tai gali būti siejama su arseno kaupimu zebrafish 29, 30 . Alternatyviai, folio rūgštis gali nepajėgti atkurti kai kurių signalinių kelių, kuriuos ankstyvoje stadijoje pakeitė arsenas, o tai vėliau sukėlė vėlyvąsias zebrafish vystymosi anomalijas. Šie duomenys praturtino mūsų žinias apie folio rūgšties įtaką arseno sukeltam toksiškumui embriono vystymuisi.

GDF1 signalizacijos kelias yra būtinas formuojant kairiąją ir dešinę pelėms 31 . Fenotipai, stebimi su GDF1 funkcijų praradimo mutacijomis pelėms, atitinka sutrikusio kairiojo ir dešiniojo modelio modelį, kai heterotaksijoje matomi nepilni kairės pusės apsigimimai, įskaitant širdies defektus, tokius kaip nenormalus prieširdis ir skilvelis 32 . Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad Dvr1 ekspresija sumažėjo arsenitu apdorotuose embrionuose ir kad per didelė GDF1 ekspresija išgelbėjo širdies ir nervų vystymosi defektus, kuriuos sukėlė morfolinas arba arsenas zebrafish embrionuose 26 . Šiame tyrime mūsų duomenys parodė, kad folio rūgštis išgelbėjo arseno sukeltus embriono vystymosi defektus. Tiek realaus laiko PGR, tiek in situ hibridizacija parodė, kad folio rūgštis palengvino Dvr1 ekspresijos sumažėjimą, kurį sukėlė gydymas arsenitu zebrafish embrionuose. Šie duomenys parodė, kad folio rūgštis gali antagonizuoti arseno sukeliamus vystymosi defektus, reguliuodama Dvr1 / GDF1 ekspresiją. Signalizavimas Wnt / β-kateninu susijęs su širdies kairės-dešinės modeliavimu ir kardiogenezės metu vaidina skirtingą ir vystymosi stadijai būdingą vaidmenį 33 . Linask ir kt. parodė, kad alkoholio, ličio ar homocisteino indukcija ir širdies defektų apsauga nuo folio rūgšties buvo susijusi su Wnt / β-katenino signalo perdavimo intymiąja kontrole lemiamu metu prieš ankstyvą širdies organogenezę ir jos metu 20, 22, 34 . Tai leido manyti, kad Dvr1 / GDF1 gali būti naujas aplinkos poveikio kardiogenezei ir neurogenezei taikinys. Buvo pripažinta, kad kailis skysčio srautas į kairę organą vystymosi metu lemia kairiosios ir dešinėsios asimetrinių žymėjimų į kairę kūno pusę atsiradimą, kuris tada inicijuoja Nodal kaskadą kairiosios šoninės plokštelės mezodermoje, kad kontroliuotų kairę. plėtra 35 . Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad Wnt / β-katenino signalizacija reguliuoja stuburo embrionų kairės ir dešinės asimetrinį vystymąsi, reguliuodama skilvelinių organų formavimąsi ir funkcijas 36 . Petersonas ir kt. pranešė, kad „Dvr1“ yra atsakingas už kairiojo ir dešiniojo signalo perkėlimą iš Kupfferio pūslelės (zebražuvio sulenktas organas) į šoninę plokštelės mezodermą 37 . Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad embrionuose, apdorotuose arsenitu, skrandžio metu, o GDF1 per daug ekspresuojant, Dvr1 ir kitų su širdies raida susijusių signalinių molekulių poveikis buvo sureguliuotas, ir tai iš dalies išgelbėjo arseno sąlygotus vystymosi defektus 26 . Po 38, 39 arseno poveikio buvo pranešta apie pakitusį Wnt / β-katenino signalą. Kyla galimybė, kad Wnt / β-katenino signalizacija taip pat gali būti naudojama arseno indukcijai ir folio rūgšties apsaugai nuo zebrafish vystymosi defektų. Arseno ir folio rūgšties moduliuotas molekulinis tinklas turi būti toliau tiriamas.

Oksidacinis stresas vaidina svarbų vaidmenį sukeliant arseno toksiškumą. Toksiškas arseno poveikis labai priklauso nuo organizmo gynybos mechanizmų, ty nuo B grupės vitaminų ir antioksidantų būklės ir suvartojimo 40 . In vitro ir in vivo stebėtos tiesioginės folio rūgšties antioksidantinės savybės 23, 41 . Mūsų duomenys parodė, kad arsenitas paskatino ROS padidėjimą HEK293ET ląstelėse, o folio rūgštis reikšmingai sumažino ROS lygį. Atitinkamai, GDF1 ekspresija buvo sumažinta reaguojant į arsenitą, bet padidėjo, vartojant kartu su arsenitu ir folio rūgštimi. Šie duomenys suponavo, kad GDF1 ekspresija reaguoja į oksidacinį stresą, o tai atitinka ankstesnį rezultatą, kad GDF1 ekspresiją žemai reguliuoja vandenilio peroksidas 42 . P66Shc buvo pagrindinis ROS gamybos ir tarpląstelinio oksidacinio streso reakcijų reguliatorius. Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad arsenitas padidino p66Shc ekspresiją embrionuose prieš implantavimą, tuo tarpu antioksidantas NAC slopino šį poveikį 13 . Šiame tyrime mes nustatėme, kad p66Shc numušimas slopino tarpląstelinio ROS lygio padidėjimą ir arsenito sukeltą GDF1 sumažėjusį reguliavimą. Folio rūgštis slopino p66Shc baltymų lygio padidėjimą ir GDF1 ekspresijos sumažėjimą HEK293 ląstelėse, kurį sukėlė gydymas arsenitu. Šie radiniai parodė, kad folio rūgštis padidino GDF1 ekspresiją mažindama p66Shc ekspresiją ir tarpląstelinius ROS lygius. III klasės histono deacetilazė SIRT1 neigiamai reguliuoja p66Shc ekspresiją modifikuodama epigenetinį chromatiną 43 . Garcia ir kt. pranešė, kad folatų ir kitų metilo donorų trūkumas padidina apsigimimus ir sukelia kardiomiopatiją dėl pakitusio PGC-1 metilinimo ir acetilinimo bei sumažėjusios SIRT1 ekspresijos 44 . Tai reiškė, kad folio rūgštis sumažino p66Shc ekspresiją galbūt padidindama SIRT1 ekspresiją. Tiek sumažėjusi p66Shc ekspresija, tiek antioksidantinės folio rūgšties savybės prisideda prie tarpląstelinio ROS lygio sumažėjimo. Tačiau reikia toliau ištirti mechanizmą, pagal kurį oksidaciniai-redoksiniai signalai moduliuoja GDF1 išraišką.

Vienas iš nustatytų svarbių su arsenu susijusių sveikatos rizikos veiksnių yra biotransformacija, kuri apima redukcijos reakcijas (biologinis aktyvinimas) ir metilinimą (daugiausia detoksikaciją) 45 . Arsenas metilinamas iki monometilarsono rūgšties (MMA) ir dimetilarsino rūgšties (DMA) per vienos anglies metabolizmą - biocheminį kelią, kuris priklauso nuo folio rūgšties 46 . Augantys eksperimentiniai ir gyventojų skaičiaus įrodymai rodo, kad folio rūgšties papildai sustiprina metilinimą arsenu, o tai gali prisidėti prie apsauginio folio rūgšties poveikio nuo arseno sukelto embriono toksiškumo, stebėto šiame tyrime 40, 46 . Ankstyvos embriogenezės metu 47 yra svarbus visuotinės DNR metilinimo pokytis 47 . McGauqhey ir kt. pranešė, kad embrioniniai ir galiniai audiniai turi unikalius metilinimo parašus CpG salose ir pasikartojančias sekas zebrafish 48 . Arsenitas galėtų sukelti epigenetinius pakitimus, ypač pakeisdamas DNR metilinimo būdus 49 . Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad arsenu gydytuose embrionuose ankstyvame laike buvo nenormali hipometiliacija kamiene ir uodegoje, o vėliau - 25, po to visuotinis hipermetilinimas su morfogenetinėmis anomalijomis. Folio rūgštis yra vienas iš svarbiausių metilo grupių mitybos šaltinių ir vaidina lemiamą vaidmenį metilinant DNR ir reguliuojančius genų ekspresiją per S-adenozilmetioniną (SAM) 50 . Linask ir kt. pranešė, kad širdies defektai, kuriuos išgelbėjo folio rūgštis, greičiausiai susiję su vienos anglies metabolizmu ir epigenetiniais mechanizmais 34 . Lee ir kt. parodė, kad žmonės ir zebrafish naudoja panašius vienos anglies būdus, o nenormalus folio metabolizmas sukelia širdies defektus, tokius kaip linijiniai širdies vamzdeliai arba nepilna širdies kilpa zebrafish 51 . Du et al. pranešė, kad Setdb2, SET domeno turintis baltymas, turintis potencialų histono H3K9 metiltransferazės aktyvumą, kontroliuoja konvergenciją ir prailginimo judesius zebrafish skrandžio metu, transkripcijos būdu reguliuodamas Dvr1 52 . Tai reiškė, kad folio rūgšties poveikį arseno sukeltiems vystymosi defektams ir Dvr1 ekspresijai galima iš dalies paaiškinti jo įtaka embriono epigenomikai.

Pabaigoje mes nustatėme, kad folio rūgšties papildai išgelbėjo arsenito sukeltus vystymosi anomalijas, reguliuodami Dvr1 / GDF1 raišką. Arsenitas sukėlė p66Shc ekspresiją ir tarpląstelinių ROS susidarymą, kad sumažintų GDF1 ekspresiją, o folio rūgštis antagonizuodavo šį poveikį. Šis tyrimas pateikia įžvalgos apie arseno sukelto embriono toksiškumo rizikos vertinimą ir prevenciją. Šis darbas taip pat suteikia informacijos apie naują folio rūgšties apsaugos nuo arseno sukelto embriono toksiškumo mechanizmą.

Medžiaga ir metodai

Visi metodai buvo atlikti laikantis patvirtintų gairių.

Zebrafish priežiūra ir embrionų paruošimas.

Laukinio tipo AB padermė ir Tg (cmlc2: GFP) zebrafish ( Danio rerio ) buvo užauginti pagal anksčiau aprašytas zebrafish auginimo rekomendacijas 25 . Grupės poravimasis buvo reguliariai atliekamas per pirmąsias 30 min. Šviesos laikotarpio. Embrionai buvo surinkti per pirmąją šviesios: tamsios (L: D) ciklo 14:10 šviesos laikotarpio valandą ir inkubuojami kiaušinių vandenyje (distiliuotame dejonizuotame vandenyje, kuriame yra 60 μg / ml „Instant Ocean ®“ druskos) 28, 3 ° C temperatūroje. Visi zebrafish tyrimai buvo atlikti pagal protokolus, patvirtintus Pekino Nacionalinio šeimos planavimo tyrimų instituto gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto.

Embrionų gydymas ir morfologiniai vystymosi stebėjimai

Natrio arsenitas ir folio rūgštis buvo įsigyti iš „Sigma-Aldrich“, Sent Luise, MO, JAV. Tiek 1 M pradinis natrio arsenito tirpalas, tiek 100 μM folio rūgšties pradinis tirpalas buvo paruošti kiaušinių vandenyje, o alikvotinės dalys buvo išpilamos į Eppendorfo mėgintuvėlius laikyti –20 ° C. Prieš kiekvieną biologinį tyrimą pradiniai tirpalai buvo pašildomi iki kambario temperatūros (RT, 25 ° C) ir buvo naudojami ruošiant galutines bandymo koncentracijas kiaušinių vandenyje arba Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje su dideliu gliukozės kiekiu (DMEM, HyClone).

Remiantis anksčiau aprašytais embriono vystymosi etapais, paprastai besivystantys embrionai buvo parinkti stereomikroskopu (Zeiss Lumar, V12) blastulės stadijoje (4 val. Po apvaisinimo, hpf). Norint nustatyti efektyvią folio rūgšties koncentraciją vėlesniuose eksperimentuose, zebrafish embrionai buvo suskirstyti į eksperimentinio gydymo grupes, esant 4 AG / h (n = 50 asmenų / grupei), ir atsitiktine tvarka patekę į folijos rūgšties koncentraciją (50 ir 100 μM) su arba be 2 mM natrio arsenito, norint ištirti toksiškumą vystymuisi iki 120 AG. Kiekvienam poveikio bandymui buvo paskirta viena kontrolinė grupė (tik kiaušinių vanduo). Kiekvienas gydymas buvo pakartotas tris kartus skirtingomis dienomis / nerštais. Pigmento ekspresijai slopinti buvo pridėta 0, 003% (m / t) 1-fenil-2-tiokarbamido (PTU, Sigma), kad būtų atlikti histocheminiai arba imunocheminiai dėmių eksperimentai; nebuvo būtina pridėti PTU, kai stebėjome cheminio poveikio įtaką embrioniniam zebrafish vystymuisi, naudodamiesi šviesaus lauko stereomikroskopu 54 . Kiekviename inde kiaušinių vanduo buvo pakeistas šviežiu folio rūgšties tirpalu su arsenitu arba be jo. Buvo apskaičiuoti išgyvenamų, paveiktų ir perintų žuvų procentai ir nubraižyti pagal hpf.

Širdies ir kraujagyslių fenotipo įvertinimas

Apibūdinti embrionai buvo pašalinti iš inkubacijos, o širdies ir kraujagyslių fenotipas buvo stebimas stereomikroskopu (Zeiss Lumar, V12) ir CCD kamera (AxioCam MRc5) esant 72 AG greičiui. Naudojant Tg (cmlc2: GFP) transgeninius skilvelio ir prieširdžio embrionus, esant 48 AG greičiui, mikroskopu buvo stebimi nenormalūs širdies kilpos fenotipai. Hemoglobino dažymas o-dianisidinu buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau 55 . Sutrikusi kraujotaka buvo apibūdinta kaip sujungti eritrocitai ir mažas cirkuliuojančių eritrocitų skaičius. Visi fenotipai buvo įvertinti objektyviai, palyginti su įprastu fenotipu. Skaičiavimus kiekvienu laiko momentu atskirai sudarė du nepriklausomi stebėtojai ir buvo surašyti vidurkiai.

Visagimio imunochemija

Embriono nervų modeliavimas gali būti stebimas imuniniu dažymu acetilintu α-tubulinu (α-AT), kuris paprastai reaguoja su visais aksonų takais 56, naudojant standartinį metodą, kaip aprašyta anksčiau. Trumpai tariant, 48 AG sveriantys embrionai buvo dechorionuoti, fiksuoti 4% PFA kambario temperatūroje 1 valandą, plauti fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) su 0, 1% Tween-20 (Amresco) ir užblokuoti blokuojančiu buferiu, kuriame yra 10% normalaus ožkos serumo. (Zhongshan Biotech) ir 2 mg / ml galvijų serumo albumino (BSA, Sigma) 2 h kambario temperatūroje. Tada blokuojantis buferis buvo pašalintas, o embrionai buvo inkubuojami su pirminiu antikūnu (α-AT antikūnu, Sigma) per naktį 4 ° C temperatūroje. Tada jie buvo plaunami ir inkubuojami 2 valandas kambario temperatūroje su IgG-FITC (Zhongshan Biotech) triušio antivirusiniu antikūnu. Po to, kai embrionai buvo praplauti PBS, mikrografiniai vaizdai buvo paimti naudojant fluorescencinį stereomikroskopą (Zeiss Lumar, V12).

Viso kalno hibridizacija (WISH)

Antrąjį Dvr1 egzoną turinti plazmidė buvo gauta kaip dovana iš dr. Lehmann (Alberta universiteto, Kanada, oftalmologijos ir medicininės genetikos katedra) dovana. Dvr1 RNR zondas, kuris buvo sugeneruotas iš Dvr1 plazmidės po linearizacijos, buvo susintetintas ir paženklintas digoksigenino UTP-NTP mišiniu (Roche) T7 RNR polimerazės (Promega) pagalba. Embrionų hibridizacija in situ buvo sumontuota visą vietą in situ , kaip aprašyta anksčiau 57 . Trumpai tariant, in situ hibridizavimui naudojami embrionai buvo anestezuojami tricaine ir pritvirtinti 4% PFA. Dvr1 ekspresija zebrafish embrionuose buvo nustatyta naudojant šarmines fosfatazės konjuguotus antikūnus ir vizualizuota 4-nitro mėlynojo tetrazolio (Promega) ir 5-brom-4-chlor-3-indolil-fosfato (Promega) dažymu; tada embrionai buvo įtaisyti į glicerolį ir nufotografuoti dalelių mikroskopu (Zeiss Lumar, V12).

Ląstelių kultūros ir gyvybingumo analizė

HEK293ET ląstelės (žmogaus embrioninio inksto 293 ląstelės) buvo kultivuojamos aukštos gliukozės koncentracijos DMEM (HyClone), papildytame 10% galvijo vaisiaus serumu (FBS), 50 μg / ml penicilino ir 50 μg / ml streptomicinu, 37 ° C temperatūroje, esant 5 ° C drėgnai atmosferai. % CO 2 . Ląstelės (5 x 104 ląstelių kiekvienoje duobutėje) buvo pasėtos 96 šulinėlių plokštelėse; 75% santakoje, jie buvo subkultūruojami maždaug kas antrą dieną. Siekiant ištirti apsauginį folio rūgšties poveikį arsenito sukeltam citotoksiškumui, HEK293ET ląstelės buvo apdorotos natrio arsenito laipsniškomis koncentracijomis (1, 2 ir 5 μM) ir folio rūgšties laipsniškomis koncentracijomis (10, 20, 50 ir 100 μM) su arba be 5 μM natrio arsenito. Gyvų ląstelių masė buvo matuojama naudojant ląstelių skaičiavimo rinkinį-8 (CCK-8, Dojin Laboratories, Kumamoto), kad būtų galima suskaičiuoti gyvas ląsteles pagal WST-8. Po 24 valandų gydymo HEK293ET ląstelės buvo inkubuojamos 1 valandą 10 μM CCK-8, praskiesto ląstelių terpėje. Vėliau ląstelių gyvybingumas buvo išmatuotas naudojant mikroteklių skaitytuvą (BioTek), esant 450 nm bangos ilgiui, atėmus atitinkamas tuščias reikšmes.

RNR išskyrimas ir realiojo laiko kiekybinė RT-PGR analizė

Visa RNR buvo išgauta iš zebrafish embrionų esant 6 AG / h arba iš HEK293ET ląstelių, naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. Vienas mikrogramas visos RNR buvo atvirkščiai perrašytas į cDNR PGR (TAKARA). DNAMAN programinė įranga (7.0 versija, LynnonBiosoft) buvo naudojama kuriant specifinius pradinius ir atvirkštinius pradmenis. Pradmenų poros buvo suprojektuotos taip, kad apimtų intronus, kad būtų užkirstas kelias bet kokio užteršiančio genomo DNR amplifikacijai. Informacija apie šiuos fragmentus parodyta 1 lentelėje. Realiojo laiko PGR buvo atlikta naudojant ABI Prism 7500 sekos aptikimo sistemą (Applied Biosystems) su SYBR žaliosiomis fluorescencinėmis etiketėmis. Mėginiuose (galutinis tūris 20 μl) buvo: 1 × SYBR žaliojo pagrindinio mišinio (Applied Biosystems) ir 5 pmol kiekvieno grunto. Dviračių parametrai buvo šie: pradinis 3 min. Žingsnis 95 ° C temperatūroje, po to sekantys 40 15 s ciklų 95 ° C ir 1 min. 60 ° C temperatūroje. Kiekvienas kiekvienos grupės mėginys buvo matuojamas trimis egzemplioriais ir eksperimentai buvo pakartoti mažiausiai tris kartus. Kiekybinis įvertinimas buvo normalizuotas iki endogeninės kontrolės β-aktino. Visos reakcijos buvo atliktos trimis egzemplioriais. Santykinė išraiška buvo apskaičiuota naudojant gamintojo pateiktas Ct reikšmes.

Pilno dydžio lentelė

Mažas trukdantis RNR (siRNR) transfekcija

P66Shc siRNR ir neslopinančioji kontrolinė siRNR buvo nupirkta iš „Invitrogen“ ir pagal gamintojo instrukcijas buvo perkoduota naudojant „Lipofectamine TM 2000“ („Invitrogen“). „P66Shc“ siRNR sekos buvo 5'-AUGAGUCUCUGUCAUCGCUTT-3 ′ ir antisense 5′-AGCGAUGACAGAGACUCAUTC-3 ′ 58 sekos. HEK293ET ląstelės buvo pasėtos į 12 šulinėlių plokšteles ir per naktį išaugintos iki maždaug 60% santakos. Ląstelės buvo transfekuotos 50 pmol siRNR. At 24 h post-transfection, cells were exposed to arsenite for another 24 h, and proteins were extracted for Western blot analysis.

Western blot analizė

Cells were washed with PBS and lysed with a cell lysis buffer containing 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 10 mM NaF, 0.2 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF and a protease inhibitor cocktail (Roche). The protein concentration was measured using a Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad). Equal amounts of protein were loaded into each lane for separation by 12% SDS-PAGE. The resolved proteins were transferred to nitrocellulose membranes (Millipore), which were incubated with β-actin (Sigma), GDF1 (Epitomics) and p66Shc (Santa Cruz) antibodies, subsequently incubated with secondary goat anti-rabbit or goat anti-mouse IgG antibodies conjugated to horseradish peroxidase (Zhongshan Biotech), and then detected by enhanced chemiluminescence (ECL, Millipore). Visi eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais.

Measurement of ROS

To measure the quantity of ROS produced during treatment, the level of ROS in the HEK293ET cells was examined by DCFH-DA (Sigma) using a modified version of the described protocol 59 . After 24 h of arsenite exposure, HEK293ET cells were washed and incubated in serum-free medium containing 10 μM DCFH-DA. After a further 30 min of incubation at 37 °C, cells were washed with serum-free medium to remove residual dye and immediately imaged with an Inverted Fluorescence Microscope (Nikon TE-2000U) at 450–490 nm excitation and 515–565 nm emission. The ROS levels were also detected using a microplate reader at 488 nm excitation and 525 nm emission (BioTek). Four independent experiments were performed; the order in which the groups were processed was randomized each time.

Statistinė analizė

Statistical analysis was performed using SPSS software (version 18.0, SPSS Inc.) and Graph Pad Prism software (version 5, GraphPad software). All experiments were performed at least in triplicate, the measurements were recorded by observers who were blinded to the groups, and the results are expressed as the mean ± SE Differences between treatment groups were analysed by one-way analysis of variance (ANOVA) with post hoc analysis using Student's t test. For all analyses, differences were considered statistically significant when P < 0.05.

Papildoma informacija

How to cite this article : Ma, Y. et al. Folic acid protects against arsenic-mediated embryo toxicity by up-regulating the expression of Dvr1. Mokslas. Rep. 5, 16093; doi: 10.1038/srep16093 (2015).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.