Dažnas sfrp1 ekspresijos praradimas daugybiniuose žmogaus solidiniuose navikuose: ryšys su nenormaliu promotoriaus metilinimu inkstų ląstelių karcinomos atvejais | onkogenas

Dažnas sfrp1 ekspresijos praradimas daugybiniuose žmogaus solidiniuose navikuose: ryšys su nenormaliu promotoriaus metilinimu inkstų ląstelių karcinomos atvejais | onkogenas

Anonim

Anotacija

Onkogeninis, su sparnais nesusijęs pieno pieno naviko viruso (Wnt) signalas, kurį sukelia epigenetinis specifinių kelio reguliatorių, pvz., Tariamo naviko slopintuvo, išskiriamo sušalusio baltymo 1 (SFRP1), inaktyvavimas, gali sukelti daugelio kietų žmogaus navikų, įskaitant krūtį, kancerogenezę., storosios žarnos ir inkstų vėžys. Norėdami įvertinti SFRP1 trūkumo pasireiškimą žmogaus navikuose, atlikome didelės apimties SFRP1 ekspresijos analizę, naudodamiesi imunohistochemija, visapusiškame audinių mikroraide (TMA), apimančiame 3448 navikus iš 36 organų. Šiame TMA buvo 132 skirtingi naviko potipiai ir 26 skirtingi normalūs audiniai. Nors naviko pirmtakų, pavyzdžiui, inkstų, storosios žarnos, endometriumo ar antinksčių, stadijos vis dar pasireiškė vidutiniškai arba gausiai SFRP1 ekspresija, ši ekspresija dažnai buvo prarasta atitinkamuose tikruose navikuose. Mes apibrėžėme devynis naujus naviko vienetus, kurių akivaizdus SFRP1 ekspresijos praradimas yra inkstų, skrandžio, plonosios žarnos, kasos, prieskydinių liaukų, antinksčių, tulžies pūslės, endometriumo ir sėklidžių vėžys. Inkstų ląstelių karcinoma (RCC) parodė didžiausią SFRP1 praradimo dažnį (89% mRNR lygyje; 75% baltymų lygyje) ir buvo parinkta tolesnei analizei ištirti SFRP1 praradimo žmogaus navikuose priežastis. Mes atlikome ekspresijos, mutacijos ir metilinimo analizę RCC ir jų atitikimo normaliuose inkstų audiniuose. SFRP1 promotoriaus metilinimas dažnai buvo nustatomas RCC (68%, n = 38) ir buvo koreliuojamas su SFRP1 mRNR ekspresijos praradimu ( p <0, 05). Nors heterozigotiškumas buvo prarastas 16% RCC, SFRP1 geno kodavimo ar promotoriaus srityje struktūrinių mutacijų nepastebėta. Mūsų rezultatai rodo, kad SFRP1 ekspresijos praradimas yra labai dažnas įvykis sergant žmogaus vėžiu, teigdamas apie esminį aberacinio Wnt signalo vaidmenį kuriant solidinius navikus. RCC atveju promotoriaus hipermetilinimas, atrodo, yra pagrindinis SFRP1 geno nutildymo mechanizmas ir gali prisidėti prie šios ligos pradžios ir progresavimo.

Įvadas

Žmogaus vėžio ląstelės turi skirtingus dereguliuotų genų raiškos modelius. Tikimasi, kad šis reguliavimo panaikinimas paveiks 1–3% transkripto (Zhang ir kt., 1997), įskaitant įvairius navikų slopintuvus genus, kurių ekspresija vyrauja vėžio ląstelėse. CpG turtingų promotorių regionų DNR metilinimas dabar yra žinomas kaip vienas iš pagrindinių naviko slopinančių genų inaktyvavimo vėžio ląstelėse mechanizmų (Esteller, 2005). Jau buvo pranešta, kad kai kuriems naviko vienetams genas, koduojantis tirpių, su sparnais nesusijusių, pieno pelių naviko viruso (Wnt) antagonistą ir spėjamą naviko slopintuvą, išskiriamą su raukšlėmis susijusį 1 baltymą ( SFRP1 ), dažnai inaktyvuojamas promotoriaus metilinant kietą medžiagą. navikai, įskaitant storosios žarnos vėžį (Caldwell ir kt., 2004; Suzuki ir kt., 2004), kiaušidžių vėžį (Takada ir kt., 2004), šlapimo pūslės vėžį (Stoehr ir kt., 2004; Marsit ir kt., 2005), mezoteliomą (Lee ir kt., 2004), prostatos vėžį (Lodygin ir kt., 2005), plaučių vėžį (Fukui ir kt., 2005) ir krūties vėžį (Veeck et al., 2006).

Novatoriški Suzuki et al tyrimai. (2004) sugebėjo atskleisti tiesioginį ryšį tarp epigenetinio SFRP1 naviko slopintuvo geno inaktyvacijos ir konstitucinio Wnt signalo perdavimo gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžyje . Wnt ligandų surišimas su atitinkamais Frizzled transmembraniniais receptoriais inicijuoja sudėtingą signalizacijos kaskadą, kuri stabilizuoja citozolinį β- kateniną. Po translokacijos į branduolį β- kateninas sąveikauja su T ląstelių faktoriaus (TCF) / limfoidą didinančio faktoriaus (LEF) transkripcijos veiksniais, sukeliančiais pasroviui taikomų genų aktyvaciją kaip tiesioginę pasekmę (Behrens et al., 1996). Tai, kad keli onkogenai, tokie kaip c-myc , ciklinas D1 ir c-jun (He ir kt., 1998; Mann ir kt., 1999; Tetsu ir McCormick, 1999), yra reaguojantys į Wnt genus, rodo konstitucinio Wnt signalo dalyvavimą vėžio išsivystymas praradus SFRP1 ekspresiją. Dabar yra vis daugiau įrodymų, kad onkogeninis Wnt signalizavimas taip pat gali būti susijęs su inkstų ląstelių karcinomos (RCC) vystymusi (Togashi ir kt., 2005).

RCC atsiranda dėl inkstų epitelio ir sudaro maždaug 85% visų inkstų navikų. Remiantis Amerikos vėžio draugijos duomenimis, 2006 m. Jungtinėse Valstijose prognozuojama 38 890 naujų inkstų vėžio atvejų (2006 m. Statistika; //www.cancer.org). Nepaisant pastaruoju metu patobulintų RCC diagnostikos, ketvirtadaliui pacientų diagnozuota pažengusi liga, kurios vidutinis išgyvenimo laikas yra maždaug vieneri metai. Todėl manoma, kad 2006 m. Dėl RCC mirė 12 840 asmenų JAV, pabrėždami geresnių diagnostinių ir terapinių strategijų poreikį.

Neseniai buvo pranešta, kad hipoksijos sukeliamas 2- asis genas ( HIG2 ) yra gausiai ekspresuojamas RCC (Togashi ir kt., 2005). Šie autoriai nustatė, kad negimdinė HIG2 ekspresija suteikia RCC ląstelių linijoms augimo pranašumą. Manoma, kad HIG2 turės savo poveikį prisijungdamas prie Wnt receptoriaus „Frizzled-10“ ir vėliau inicijuodamas β- katenino perkėlimą į branduolį. Kadangi pačiame HIG2 promotoriuje yra keletas numanomų TCF jungimosi motyvų, buvo pasiūlyta, kad onkogeninis Wnt signalizavimas RCC ląstelėse yra stimuliuojamas per teigiamo grįžtamojo ryšio sistemą (Togashi et al., 2005). Papildomi tyrimai numanė galimą ryšį tarp RCC ir onkogeninio Wnt signalizacijos: Janssens et al. (2004) aptiko gausią Frizzled-5 ekspresiją RCC ir glaudžią koreliaciją su ciklino D1 kaupimu branduolyje. Taigi akivaizdu, kad svarbu išanalizuoti kitų Wnt genų ir jų neigiamų reguliatorių, įskaitant SFRP1, raišką RCC.

Šiame tyrime nagrinėjome du pagrindinius klausimus, norėdami dar labiau paaiškinti SFRP1 vaidmenį kancerogenezėje. Pirmasis tikslas buvo išsami SFRP1 ekspresijos analizė imunohistochemijos (IHC) metodu, naudojant daugiatomį audinių mikrotraumą (TMA), kuriame yra 3448 žmogaus navikai, gauti iš 132 navikų potipių ir 26 skirtingi normalūs audiniai. Ši analizė apibrėžė žmogaus navikų spektrą, parodantį SFRP1 ekspresijos praradimą. Antra, mes pasirinkome RCC kaip naviko darinį, kurio SFRP1 praradimo dažnis yra tolimesnis molekulinei analizei. Mes ištyrėme, ar spėjamas naviko slopintuvo genas SFRP1 yra inaktyvuotas mutacija ar nuo metilinimo priklausomu nutildymu RCC. Nustatyta, kad skatintojas metilinimas yra pagrindinis SFRP1 inaktyvacijos mechanizmas sergant krūties ir storosios žarnos vėžiu (Suzuki ir kt., 2004; Veeck ir kt., 2006). Šiuo tikslu mes išanalizavome SFRP1 geno mutaciją, ekspresiją ir promotoriaus metilinimą RCC ir koreliavome gautus duomenis iš DNR, RNR ir baltymų lygio.

Rezultatai

Gausus SFRP1 baltymo ekspresijos praradimas daugelyje tipų žmogaus navikų

Iš 3703 žmogaus naviko ir normalių audinių mėginių TMA buvo sėkmingai išanalizuoti 2616 (70, 6%). Neinformatyvūs rezultatai atsirado dėl audinių šerdžių praradimo eksperimentinio proceso metu arba dėl trūkstamų naviko ląstelių specifinėse TMA šerdyse. Iš viso buvo analizuota SFRP1 ekspresija 132 navikų potipiuose, gautuose iš 36 organų ir 26 normaliuose audiniuose (1 papildoma lentelė). Statistinei analizei SFRP1 ekspresijos praradimas buvo analizuojamas tik tuose navikų potipiuose su penkiais ar daugiau analizuotų atvejų ir tais atvejais, kai mažiausiai 75% analizuotų atvejų atitinkami normalūs ar gerybiniai audiniai turėjo vidutinio sunkumo ar gausų SFRP1 ekspresiją. Šį kriterijų įvykdė 17 vėžio potipių (pažymėti žvaigždute 1 papildomoje lentelėje), apimantys pagrindinius naviko darinius, apie kuriuos jau žinoma, kad jie praranda SFRP1 ekspresiją, pavyzdžiui, gaubtinės žarnos adenokarcinoma (nuostoliai 37%) ir krūties latakų karcinoma (44%). nuostoliai). Iš viso 14 (82%) iš šių 17 vėžio potipių pastebimas aiškus SFRP1 ekspresijos praradimas, palyginti su gerybiniais ar normaliais audiniais (ribos: mažiausiai 10% atvejų perėjo iš modernios / stiprios ekspresijos į ne arba silpną ekspresiją). Kalbant apie organo lygį, mes apibrėžėme devynis naujus navikinius darinius, kur SFRP1 ekspresijos praradimas nebuvo aprašytas anksčiau (1 lentelė). Šiems subjektams priskiriami inkstų, sėklidės, kasos, antinksčių, prieskydinių liaukų, endometriumo, plonosios žarnos, skrandžio ir tulžies pūslės navikai. Reprezentatyvūs šių vienetų SFRP1 IHC dažymo pavyzdžiai parodyti 1 paveiksle (kasos, plonosios žarnos, skrandžio ir sėklidės atveju) ir 2 paveiksle (inkstų ląstelių karcinomos atveju). Sėklidės ir kasos adenokarcinomų seminomos parodė neigiamą arba silpną SFRP1 raišką atitinkamai 59 ir 49% tirtų navikų (1 lentelė). Sergant skrandžio vėžiu, SFRP1 netekimas žymiai skyrėsi tarp žarnyno adenokarcinomų (48 proc. Neigiamo ar silpno dažymo) ir difuzinių adenokarcinomų (27 proc. Neigiamo ar silpno dažymo) (žr. 1 papildomą lentelę). RCC tyrime radome gausiausią SFRP1 ekspresijos praradimą aiškių ląstelių karcinomos atveju (51% silpnas arba neigiamas dažymas), tuo tarpu papiliariniame RCC buvo mažesnė SFRP1 nuostolių dalis (32% silpnas arba neigiamas dažymas). Priešingai, gerybinė inksto onkocitoma išlaikė SFRP1 ekspresiją kiekviename analizuotame mėginyje (1 lentelė). Panašios tendencijos buvo stebimos gaubtinės žarnos ir antinksčių vėžio pirmtakų stadijose. Nors storosios žarnos adenomos įvairaus laipsnio displazija ir antinksčių adenomos išlaikė SFRP1 baltymo ekspresiją, ši išraiška dažnai buvo prarasta atitinkamuose tikruose navikuose.

Pilno dydžio lentelė

Image

Reprezentatyvūs SFRP1 IHC pavyzdžiai skirtinguose naviko dariniuose ir atitinkamuose normaliuose audiniuose. ( a ir b ) kasos audiniai. Normaliame kasos audinyje ( a ) yra stipri SFRP1 ekspresija, tuo tarpu kasos adenokarcinoma ( b ) dažniausiai yra neigiama. c ir d ) plonosios žarnos audinys. Normalus ileum audinys ( c ) pasižymi stipria SFRP1 ekspresija. Plonosios žarnos adenokarcinoma ( d ) rodo SFRP1 baltymo praradimą ar silpną ekspresiją. e ir f ) skrandžio audiniai. Normaliam audiniui, gautam iš geltonosios skrandžio srities, būdinga stipri SFPR1 ( e ) ekspresija, tuo tarpu skrandžio žarnyno adenokarcinomose ( f ) SFRP1 ekspresija beveik visiškai netenkama. g ir h ) sėklidės audinys. Normali sėklidė rodo stiprią SFRP1 ekspresiją Leidžo ląstelėse ( g ). Sėklidės Seminomas rodo akivaizdų SFRP1 ekspresijos praradimą ( h ). Didinimas ( a – h ): × 200.

Visas dydis

Image

Reprezentatyvūs SFRP1 IHC pavyzdžiai normaliame inkstų audinyje ir skirtinguose inkstų vėžio potipiuose. a ) Inkstai, normalus audinių teigiamas proksimalinių ir distalinių kanalėlių vaizdas. ( b ) Inkstų, aiški ląstelių karcinoma, SFRP1 ekspresijos neaptinkama. c ) Inkstai, aiški ląstelių karcinoma, silpnas SFRP1 pozityvumas. d ) inkstų, papiliarinė karcinoma, židinio SFRP1 teigiamumas. e ) inkstų, chromofobų karcinoma, vidutinė SFRP1 išraiška. f ) Inkstai, onkocitoma, gausus SFRP1 ekspresas. Didinimas ( a – f ): × 200.

Visas dydis

SFRP1 ekspresijos praradimo patikrinimas analizuojant vėžio profiliavimo matricą

Norėdami patikrinti IHC nustatytą SFRP1 baltymo ekspresijos praradimą, atlikome ekspresijos analizę SFRP1 mRNR lygiu. Papildomas DNR (cDNR) taškinis blot masyvas (Clontech vėžio profiliavimo masyvas), kuriame yra 494 cDNR, susintetinti iš 241 pirminio naviko ir 241 suderinto normalaus audinio, ir 12 cDNR iš metastazių, iš viso atstovaujančių 13 skirtingų organų, buvo hibridizuoti su SFRP1 specifiniu genų zondu ( 3 pav.). Gauti hibridizacijos signalai buvo kiekybiškai įvertinti densitometrijos būdu (2 lentelė). Ši analizė patvirtino ekspresijos praradimą, gautą naudojant IHC specifinius SFRP1 antikūnus, daugelyje navikų tipų. SFRP1 baltymo ekspresijos praradimas naujai aprašytuose skrandžio vėžiuose ir RCC gali būti patvirtintas RNR lygiu, parodant mažiausiai penkis kartus ekspresijos sumažėjimą 46% skrandžio vėžio ir 89% RCC. SFRP1-mRNR nebuvimą taip pat galima patvirtinti endometriume ir mažose navikų grupėse, gautose iš plonosios žarnos, prostatos ir kasos (žr. 3 paveikslą). Įdomu tai, kad nebuvo duomenų apie SFRP1 praradimą gimdos / endometriumo pirmtakų stadijose ir inkstų vėžį. Iš visų audinių, analizuotų mRNR lygiu, SFRP1 buvo aiškiausiai sumažintas RCC reguliavimas (3 paveikslas). Šie naviko mėginiai apėmė 17 pirminių RCC, vieną karcinoidinį naviką (3 paveikslas, D juosta), vieną pereinamojo laikotarpio ląstelių karcinomą (TCC) (3 paveikslas, F juosta) ir vieną onkocitomą (3 paveikslas, I juosta). Apibendrinant galima pasakyti , kad ši analizė parodė SFRP1 reguliavimo sumažėjimą 15 iš 17 RCC navikų ir vieno TCC bei karcinoidinio naviko reguliavimą, tačiau vienos gerybinės onkocitomos analizėje nuostolių nebuvo, palyginti su normaliu inkstų audiniu. Dėl tokio didelio SFRP1 praradimo RCC dažnio, mes vėliau sutelkėme savo jėgas į SFRP1 praradimo RCC mechanizmų vertinimą.

Image

SFRP1 mRNR ekspresijos praradimas žmogaus solidiniuose navikuose. Ekspresijos profiliai buvo nustatyti naudojant „Clontech“ vėžio profiliavimo matricą, kurioje yra cDNR poros, gautos iš vėžio audinių (T), neabsorbuojamų audinių (N) ir metastazavusių audinių (pažymėtų rodyklėmis ir žvaigždutėmis). Nebuvo pastebėta SFRP1 ekspresijos praradimo gerybiniuose navikuose, palyginti su normaliais audiniais (nurodytos poros).

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

SFRP1 promotoriaus metilinimas pirminės inkstų ląstelių karcinomos atvejais

Priežastinis metilinimas yra efektyvus SFRP1 inaktyvacijos mechanizmas krūties, storosios žarnos ir prostatos navikuose. Pagrindinis klausimas buvo, ar promotoriaus metilinimas taip pat yra RCC variklis , nukreipiantis į SFRP1 geno nutildymą. Kadangi buvo pranešta, kad normalus žmogaus audinys taip pat gali turėti tam tikro laipsnio su amžiumi susijusią genų metilinimą (Waki ir kt., 2003), išanalizavome naviko ir normalaus inksto audinio pavyzdžius atlikdami metilinimui būdingos polimerazės grandininės reakcijos (MSP) analizę . Buvo išanalizuota keturiasdešimt RCC, kurie visi atitiko normalų inkstų audinį. Reprezentatyvūs rezultatai parodyti 4 paveiksle. Aiškus PGR produktas gali būti amplifikuotas 38 RCC mėginiuose, naudojant metilinimui specifinius pradmenis, galinčius atskirti nemetilintus (TU, auglių nemetilintas; NU, normalus nemetilintus) ir metilintus (TM, navikas metilinamas; NM, normalios metilintos) sekos navikiniame ir normaliame inksto audiniuose. Atkreipkite dėmesį, kad naviko audinyje PGR produktas taip pat paprastai būna U reakcija, nes užteršti normalūs audiniai (stromos ląstelės, endotelio ląstelės), esantys naviko bandiniuose. Šis poveikis jau aprašytas Suzuki ir kt. (2004) gaubtinės žarnos karcinomos atvejais. Tačiau tik keli RCC (pvz., Nr. 17, Nr. 26 4 paveiksle) neparodė abejotino SFRP1 promotoriaus metilinimo MSP. Apskritai, 26/38 (68, 4%) RCC buvo nustatyta aiški SFRP1 promotoriaus metilinė. Dauguma tirtų navikų buvo aiški ląstelių karcinoma, nors buvo ištirti ir keli papiliariniai ir chromofobai (3 lentelė).

Image

SFRP1 promotoriaus metilinimas RCC. MSP buvo atlikta bisulfitais apdorota DNR iš RCC (T) ir atitinkančio normalų inkstų audinį (N). Parodyti aštuonių tipinių pacientų JSP rezultatai. DNR juostos juostose, pažymėtose U, rodo PGR produktus, amplifikuotus pradmenimis, atpažįstančius nemetilintą promotoriaus seką. DNR juostos juostose, pažymėtose M, žymi amplifikuotus produktus su metilinimui specifiniais pradmenimis. Žmogaus placenta (PLC) ir BT20, krūties vėžio ląstelių linija su metilintu promotoriaus regionu, buvo atitinkamai teigiamos U ir M reakcijos. Neigiamoje kontrolėje (NTC) vietoje šablono buvo naudojamas vanduo.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

SFRP1 ekspresijos ir metilinimo RCC koreliacijos analizė

Norint ištirti galimą koreliaciją tarp SFRP1 transkripcijos lygio ir metilinimo, SFRP1 mRNR raiška buvo nustatyta realaus laiko PGR toje pačioje RCC kohortoje, kuri anksčiau buvo naudojama metilinimo analizei. 5a paveikslas lygina SFRP1 mRNR ekspresiją RCC su tuo, kuris randamas atitinkančiuose normalius inkstų audinius, o tai rodo statistiškai reikšmingą sumažėjusį piktybinio audinio mėginių reguliavimą (mediana: 247 kartus; p <0, 001). Pakartotinis SFRP1 reguliavimo sumažėjimas, palyginti su normaliu audiniu, yra parodytas 5b paveiksle. Ryškus SFRP1 mRNR ekspresijos sumažėjimas daugiau nei 5 kartus buvo stebimas 34 iš 38 (90%) RCC naviko / normalių porų. Įvertinus statistinės koreliacijos duomenis, nustatyta reikšmingų skirtumų tarp SFRP1 promotoriaus metilinimo ir SFRP 1 mRNR žemiausio reguliavimo (Mann – Whitney U testas: p = 0, 048, 5c pav.). Šios grupės RCC ryšys tarp SFRP1 metilinimo ir turimų klinikopatologinių duomenų (amžiaus diagnozės metu, naviko stadijoje, histologinio laipsnio ir tipo) nerastas.

Image

SFRP1 mRNR raiška, kiekybiškai įvertinta realaus laiko PGR ir koreliacija su MSP duomenimis. ( a ) SFRP1 mRNR ekspresijos lygis kiekviename RCC ir normaliame inksto mėginyje buvo normalizuotas atsižvelgiant į SFRP1 ekspresiją, rastą komerciškai prieinamame normaliame inksto audinio mėginyje (Clontech). ( b ) SFRP1 mRNR raiška RCC normalizuota pagal jos raišką atitinkamame normaliame inksto mėginyje ir pateikiama kaip kartų keitimas (juodos juostos, mažesnis reguliavimas> 5 kartus, palyginti su normaliu; pilkos juostos, nediferencijuota išraiška). c ) Dėžutė, rodanti ryšį tarp SFRP1 promotoriaus metilinimo ir SFRP1 ekspresijos praradimo. Y ašyje parodytas SFRP1 mRNR sumažėjusio reguliavimo faktorius, palyginti su normaliu inkstu, (kartų keitimas N / T). Metilintas RCC parodė labai aiškų SFRP1 nuosmukį (mediana: 146 kartus), tuo tarpu nemetilintas RCC parodė mažesnį SFRP1 slopinimą (mediana: 16 kartų). Horizontalios linijos: grupės mediana; dėžutės: 25–75% kvartilių, diapazonas, smailė ir minimumas.

Visas dydis

Norėdami išanalizuoti, ar koreliacija tarp SFRP1 promotoriaus metilinimo ir SFRP1 mRNR praradimo taip pat atsispindi baltymų lygyje, atlikome nedidelę lygiagrečią SFRP1 DNR, RNR ir baltymo analizę keturiose naviko ir normalių audinių inkstų porose ir nustatėme atitikimą trijose. iš keturių mėginių. Visi naviko mėginiai parodė bent silpną SFRP1 promotoriaus srities metilinimą. Navikinis mėginys su silpniausiu signalu ir naviko mėginys, turintis stipriausią metilinimo signalą, buvo atrinkti reprezentatyviam duomenų rinkiniui, parodytam 6 paveiksle. RCC mėginys su silpnu SFRP1 metilinimo signalu (6a pav.) Parodė, kad jo SFRP1 yra 10 kartų mažesnis. mRNR (6b pav.) ir navikas vis tiek išlaikė tam tikrą SFRP1 baltymo ekspresiją (6d pav.). RCC mėginiuose, turinčiuose aiškius SFRP1 metilinimo signalus (6e pav.), SFRP1 mRNR sumažėjęs reguliavimas buvo daug akivaizdesnis (160 kartų) (6f pav.) Ir koreliavo su beveik visišku SFRP1 praradimu baltymų lygiu (6h pav.).

Image

SFRP1 promotoriaus metilinimo, SFRP1 RNR ekspresijos ir SFRP1 baltymo ekspresijos palyginimas reprezentatyviuose RCC ir atitinkamo normalaus audinio mėginiuose. ( a ir e ) promotoriaus metilinimo analizė. ( b ir f ) PGR analizė realiuoju laiku. ( c ir d ) ir ( g ir h ) normalių inkstų audinių ( c ir g ) SFRP1 imunohistochemija, taip pat atitinkami RCC ( d ir h ). Išsamesnės informacijos ieškokite tekste.

Visas dydis

SFRP1 geno heterozigotumo praradimas ir mutacijų analizė RCC

Aštuoniuose RCC mėginiuose buvo akivaizdus SFRP1 ekspresijos sumažėjimas (kartų pokytis> 5), nepaisant to, kad nebuvo SFRP1 promotoriaus metilinimo (duomenys nepateikti), rodantys tolesnius RCC inaktyvinimo mechanizmus, pavyzdžiui, genų praradimą ar somatines mutacijas. Todėl mes apžiūrėjome visą RCC mėginių seriją geros kokybės DNR ( n = 38), kad būtų nustatyti aleliniai nuostoliai dėl 8p chromosomos. Naviko DNR ir suderinta normali DNR buvo analizuojami naudojant mikrosatellitinius žymenis D8S255, D8S1817, D8S532, D8S268 ir D8S311 arti SFRP1 geno, žymenis D8S1469 ir D8S1145 prieš srovę atitinkamai 8p23.1 ir 8p22, ir žymeklį D8S5. (8q11.21) SFRP1 geno lokuso. Alelio netekimas dėl 8p chromosomos bent viename žymenyje buvo nustatytas 16% (šešių iš 38) inkstų navikų (tipiški pavyzdžiai parodyti 7 paveiksle). Įdomu tai, kad visi jie rodė heterozigotumo (LOH) praradimą 8p12 chromosomoje, arti SFRP1 geno. Trijuose navikuose buvo mažesnės delecijos su minimaliu delecijos regionu 8p12–11, 1 (D8S311) arba 8p12–11 (D8S255), tuo tarpu likusiems trims navikams LOH pasireiškė mažiausiai dviejuose žymenyse 8p chromosomoje. Šeši navikai, turintys LOH, buvo toliau analizuojami siekiant nustatyti SFRP1 mutacijas, atliekant tiesioginį genominį sekos nustatymą visiems SFRP1 egzonams ir susiuvimo vietoms, taip pat SFRP1 promotoriaus sričiai. Nebuvo nustatyta jokių inaktyvinančių mutacijų SFRP1 gene ir jokių SFRP1 promotoriaus srities pakitimų, tai rodo, kad SFRP1 geno mutacinis inaktyvavimas gali nedaryti pagrindinio vaidmens inkstų vėžyje .

Image

LOH analizė SFRP1 geno lokuse. N, normalus audinys; T, naviko audinys. Tipiniai ( a ) D8S311 ir ( b ) D8S255 pavyzdžiai. Trumpesnis ir ilgesnis alelis prarandamas atitinkamai navikuose (strėlės).

Visas dydis

Diskusija

Daugumai žmonių piktybinių navikų, ty storosios žarnos, krūties ir prostatos vėžiui, būdingas reikšmingas tariamo naviko slopintuvo geno SFRP1 ekspresijos praradimas. SFRP1 yra neigiamas Wnt signalizacijos kelio moduliatorius, nes jo praradimas storosios žarnos vėžyje buvo susijęs su nenormaliu Wnt signalizacijos kaskados aktyvavimu (Suzuki ir kt., 2004). Manoma, kad SFRP1 suriša Wnt ligandus ir užkerta kelią arba moduliuoja Wnt surišimą su savo giminingų Frizzled šeimos receptoriais (Finch et al. 1997; Melkonyan et al., 1997).

Šioje ataskaitoje mes išsamiai išanalizavome IHC SFRP1 raišką 26 skirtinguose žmogaus normaliuose audiniuose ir 132 skirtinguose žmogaus vėžio potipiuose. Mūsų ekspresijos duomenys rodo, kad SFRP1 ekspresijos praradimas yra labai paplitęs įvykis žmogaus navikuose. Apibendrinant galima pasakyti, kad 82% analizuotų vėžio potipių, palyginti su gerybiniais ar normaliais audiniais, buvo akivaizdus SFRP1 ekspresijos praradimas. Pvz., Krūties vėžyje nustatėme sumažintą SFRP1 ekspresiją 44% latakų ir 56% lobulinės karcinomos, tai patvirtina Klopocki et al duomenys. (2004), kuris nustatė, kad SFRP1 baltymo ekspresija netenkama 46% invazinių krūties navikų. SFRP1 promotoriaus hipermetilinimas ir SFRP1 mRNR ekspresijos praradimas pirminėse gaubtinės ir tiesiosios žarnos karcinomose buvo nustatyti atitinkamai 82 ir 76% atvejų (Suzuki ir kt., 2002, 2004). Tai tinka mūsų stebėtam SFRP1 sumažėjusio mRNR lygio reguliavimo dažniui atliekant vėžio profiliavimo masyvo analizę (50–77%).

Be anksčiau apibūdintų naviko subjektų, mes apibrėžėme devynis naujus naviko vienetus, turinčius akivaizdų SFRP1 ekspresijos praradimą, tai yra inkstų vėžį, skrandžio vėžį ir kasos vėžį, taip pat plonosios žarnos, prieskydinės liaukos, antinksčių, tulžies pūslės vėžį., endometriumas ir sėklidė. Jau buvo paskelbta, kad SFRP1 promotoriaus metilinimas yra svarbus skrandžio vėžio ląstelių linijose (Suzuki ir kt., 2002) ir gerai atitinka mūsų atradimus dėl sumažėjusios baltymų ekspresijos difuzinėje ir žarnyno skrandžio adenokarcinomoje. Watanabe ir kt. Įrodė, kad 85% ( n = 33) genominių DNR, gautų iš kasos vėžiu sergančių pacientų kasos sulčių, metilinimas SFRP1 promotoriu. (2006). Mūsų duomenys, rodantys SFRP1 ekspresijos sumažėjimą 49% kasos adenokarcinomų, patvirtina hipotezę, kad SFRP1 metilinimas kasos vėžyje yra pagrindinis SFRP1 geno nutildymo veiksnys šiame naviko darinyje .

Neseniai buvo tiriami sėklidžių navikai, skirti SFRP1 mRNR ekspresijai nedidelėje dešimties atvejų ir septynių kontrolinių grupių grupėje (Hoei-Hansen ir kt., 2004). Šie sėklidžių vėžiai atspindėjo vieną embriono karcinomą, vieną teratomą, tris seminomas ir penkias intratubulinių lytinių ląstelių neoplazijų karcinomą in situ (CIS). Gausus SFRP1 ekspresija buvo rastas visuose CIS mėginiuose ir teratomos mėginiuose, tuo tarpu seminomos ir normaliame audinyje nebuvo rasta arba buvo silpna SFRP1 mRNR ekspresija (Hoei-Hansen et al., 2004). Panašiai kaip ir šiame tyrime, 59% seminomų ( n = 46) nustatėme SFRP1 ekspresijos praradimą; tačiau atitinkamame normaliame sėklidės audinyje aptikome vidutinio sunkumo ar stiprų baltymų ekspresiją.

Neseniai Li ir Amar (2006) pranešė apie išskirtinį SFRP1 vaidmenį gydant žaizdas. SFRP1 netekimas sergant įvairiais odos navikais, ypač histiocitoma, kapiliarine hemangioma ir Kapoši sarkoma, taip pat gali reikšti, kad šiuose odos navikuose gali atsirasti nenormalus Wnt signalizavimas. Iki šiol nebuvo pranešta apie SFRP1 ekspresijos praradimo reikšmę skrandžio, endometriumo, plonosios žarnos ir prieskydinių liaukų kancerogenezėje. Tai yra mūsų laboratorijoje vykdomų tyrimų klausimas.

Wnt signalizacijos kelias taip pat vaidina svarbų vaidmenį embriono inkstų vystymesi (Vainio ir kt., 1999; Dressler, 2002), o jo reaktyvacija mutacijomis arba pakitusia atskirų komponentų ekspresija buvo laikoma lemiamu RCC vystymosi veiksniu. . Keli Wnt komponentai jau buvo ištirti: nepaisant adenomatozės polyposis coli (APC) ir tik retų β- katenino mutacijų (Bohm et al., 1997; Suzuki et al., 1997; Kim et al., 2000; Ueda et al.)., 2001), citoplazminė β- katenino kaupimasis buvo pakartotinai aprašytas (Kim ir kt., 2000; Janssens ir kt., 2004). Be to, buvo pranešta apie nenormalų Wnt signalizacijos kelio aktyvumą inkstų vėžiu gaunamose ląstelių linijose, susijusiose su aukštesniais Wnt5a ir Frizzled 5 mRNR ekspresijos lygiais ir (arba) padidėjusia β- katenino ekspresija (Zang et al., 2000). Be to, buvo pranešta, kad mRNR ir Wnt tikslinio ciklino D1 baltymų kiekiai daugiausia koreliuoja su padidėjusia Frizzled 5 ekspresija skaidraus ląstelių RCC (Janssens ir kt., 2004). Kaip jau minėta aukščiau, SFRP1 veikia kaip Wnt antagonistas, o jo praradimas buvo susijęs su Wnt signalizacijos kelio aktyvavimu. Tačiau SFRP1 vaidmuo RCC plėtroje dar nebuvo ištirtas. Taigi, patikrinę imunohistochemijos rezultatus RNR lygiu, naudodami vėžio profiliavimo matricos (CPA) hibridizaciją, mes sutelkėme dėmesį į pagrindinį SFRP1 ekspresijos praradimo mechanizmą inkstų vėžyje. Hipermetilinimas CpG salose genų promotorių regionuose buvo susijęs su transkripciniu nutildymu ir, be genetinių pakitimų, yra svarbus genų inaktyvacijos mechanizmas navikogenezėje. Mes nustatėme, kad SFRP1 promotoriaus hipermetilinimas 68% RCC ir koreliuojantis sumažėjęs SFRP1 mRNR ekspresijos reguliavimas, padidėjus 5 kartus 90% šių atvejų, sukelia sumažintą baltymo ekspresiją. Be to, mes atlikome 8p LOH analizę tais pačiais, daugiausia skaidriais ląstelių RCC mėginiais ir atitinkamais normaliais audiniais. Anksčiau buvo pranešta, kad LOH, esant 8 p skaidrių ląstelių RCC, atsiranda 15–32% atvejų, atsižvelgiant į taikytą aptikimo metodą (Reutzel ir kt., 2001; Presti ir kt., 2002). Daugiausia dėmesio skyrėme žymekliams, esantiems šalia SFRP1 lokuso 8p12.1, ir nustatėme LOH tik 16% atvejų, laikydamiesi aukščiau aprašytų duomenų. Be to, mes neradome mutacijų SFRP1 gene, pavyzdžiui, jos retai buvo rastos gaubtinės ir tiesiosios žarnos karcinomose (Caldwell et al., 2004), ir jokių pokyčių SFRP1 promotoriaus regione. Todėl darome išvadą, kad promotoriaus metilinimas, o ne mutacinė inaktyvacija yra pagrindinis SFRP1 geno nutildymo RCC mechanizmas. Tai atitinka ankstesnius atradimus, tokius kaip šlapimo pūslė (Stoehr ir kt., 2004), krūties (Veeck ir kt., 2006) ir prostatos vėžys (Lodygin ir kt., 2005). Pažymėtina, kad šie duomenys buvo gauti analizuojant daugiausia skaidrų ląstelių RCC (33/40). Šis vienetas parodė didžiausią SFRP1 baltymo praradimo dalį tarp inkstų navikų, analizuotų daugiataurėje TMA, ir tai yra dažniausiai pasitaikantis ir kliniškai agresyvus variantas. Manoma, kad, kaip ir papiliarinis RCC, šis subjektas išsivysto iš vamzdinio epitelio (Mancilla-Jimenez ir kt., 1976; Hughson ir kt., 1993). Manoma, kad chromofobų RCC, kurie 54% atvejų išlaikė SFRP1 baltymo ekspresiją, turi nusileisti nuo tarpdančių ląstelių surinkimo latako epitelio, todėl yra skirtingos kilmės (Storkel ir kt., 1989; Ortmann ir kt., 1991). .

Apibendrinant, mūsų tyrimas pateikia papildomų įžvalgų apie SFRP1 geno inaktyvacijos paplitimą, paplitimą ir priežastis bei galimą indėlį į neoplastinę žmogaus navikų progresavimą. Aiškus ląstelių RCC, abejotina citozino metilinimas atitinkamuose SFRP1 promotoriaus regionuose atrodo esminis mechanizmas, galintis sukelti negimdinį Wnt signalizacijos kelio aktyvavimą. Šis darbas yra būtina tolesnių funkcinių tyrimų sąlyga, išaiškinant Wnt signalizacijos kelio svarbą RCC ir kitų naviko darinių patogenezėje.

medžiagos ir metodai

Klinikinė medžiaga

Atitinkami naviko / normalūs inkstų vėžio pavyzdžių pavyzdžiai ( n = 40) buvo gauti iš pacientų, kuriems buvo atlikta pirminė RCC operacija Regensburgo universiteto ligoninės Urologijos skyriuje. Visi pacientai davė informuotą sutikimą dalyvauti tyrime. Dalis naviko medžiagos ir makroskopiškai normalus inkstas netrukus po operacijos buvo greitai užšaldyti skystu azotu arba įterpti į parafiną. Naviko ląstelių procentinei daliai įvertinti buvo paruoštos hematoksilinu ir eozinu dažytos užšaldytos dalys. Tik mėginiai, turintys daugiau kaip 50% navikinių ląstelių, buvo atrinkti analizei ir paruošti rankiniam mikrodalijimui. Visais atvejais du valdybos patvirtinti patologai (AH ir MW) sutarė dėl RCC diagnozės. Paciento charakteristikos ir histopatologiniai duomenys pateikti 3 lentelėje.

TMA statyba

Formalinu fiksuotų ir parafinu įterptų audinių mėginiai buvo paimti iš Universiteto ligoninės Patologijos instituto, Bazelio, Šveicarija, archyvų. Audinių ir klinikiniai duomenys buvo įvertinti pagal vietinės institucinės peržiūros tarybos nuostatus. Visi svarbūs paciento duomenys buvo anonimizuoti. Išsamus TMA buvo sukurtas perkeliant tipinius 0, 6 mm skersmens audinių cilindrus į septynis naujus parafino blokus, kaip aprašyta anksčiau (Bubendorf et al., 2001). Analizei buvo parinktos tipinės įvairių potipių tipinės sritys, kuriose dažniausiai pasitaikantys navikai ir atitinkami normalūs audiniai. Iš gauto TMA bloko 4 μm sekcijos buvo supjaustytos ir pritvirtintos prie klijais padengtos skaidrių sistemos („Instrumedics Inc.“, Hackensack, NJ, JAV). Daugiažydį TMA sudarė 3448 pirminiai navikai iš 132 skirtingų navikų potipių ir 26 skirtingi normalūs audiniai ir leido mums nustatyti SFRP1 ekspresijos paplitimą normaliuose audiniuose ir atitinkamus piktybinius navikus. Pagrindinius naviko audinius, įtrauktus į šią TMA, sudaro oda ( n = 330), smegenys ( n = 228), krūtinė ( n = 218), plaučiai ( n = 217), storosios žarnos ( n = 204), seilių liaukos ( n = 152). ), minkštųjų audinių ( n = 150), inkstų ( n = 144), kiaušidžių ( n = 140) ir sėklidžių ( n = 126). Išsamias naviko charakteristikas galima rasti 1 papildomoje lentelėje.

SFRP1 imunohistochemija

Section of 3 μ m were deparaffinized in xylene, rehydrated in a decreasing ethanol series and subsequently boiled for 30 min in citrate buffer (pH 6.0) for antigen retrieval. IHC was performed using an NEXES Immuno Stainer (Ventana, Tucson, AZ, USA) according to the manufacturer's specifications. Polyclonal anti-SFRP1 antibodies (Eurogentec, Seraing, Belgium) were verified for specificity as described previously (Klopocki et al., 2004) and used in a 1:200 dilution using the ChemMate Envision kit (Dako, Hamburg, Germany). Normal breast tissue sections in which SFRP1 expression has already been described by Klopocki et al. (2004) served as positive controls. Sections were counterstained with Mayer's hematoxylin and embedded in Entellan mounting medium (EMS Diatome, Fort Washington, PA, USA). The application of primary antibodies to tissue sections was omitted in negative controls. Immunohistochemical analysis was performed without the knowledge of histopathological data. Cytoplasmic staining was scored by a four-step scale from 0 (no expression) to 3+ (strong expression) for semiquantitative evaluation of the multiple tumour TMA by two pathologists (MW and AH).

Expression analysis using the CPA

The CPA (Clontech, Heidelberg, Germany) has been previously described in detail (Zafrakas et al., 2006). Histological type, patient age and a complete list of tissues can be found on the provider's website (//www.clontech.com/clontech/techinfo/manuals/PDF/pt7841-1.pdf). Hybridization using 25 ng of a gene-specific 32 P-labelled cDNA probe digested from Unigene cDNA clone (acc. no. W21306) was performed according to the manufacturer's recommendations. The tumour/normal intensity ratio was calculated using a STORM-860 phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) and normalized against the background.

DNA/RNA isolation from RCC

Frozen tissue samples were prepared for manual microdissection and dissolved in lysis buffer for subsequent DNA isolation using the blood and cell culture DNA kit (Qiagen, Hilden, Germany) or by RNA isolation using Trizol (Gibco-BRL, Glasgow, UK) according to the protocol supplied by the manufacturer.

Reverse transcription PCR

Of the total RNA, 1 μ g was reverse transcribed using the Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA). To improve transcription rate we mixed oligo-dT and pdN (6) -primers 1:2. For PCR, 1 μ l cDNA was amplified using SFRP1 (product size 599 bp) and glycerinaldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH ) (510 bp) primers given in Supplementary Table 2. Reactions were initiated as 'Hot Start' PCR at 95°C for 5 min and held at 80°C before the addition of 1 unit of Taq DNA polymerase (Roche, Mannheim, Germany). Cycle conditions applied for both genes were as follows: 95°C for 5 min, 35 cycles of 95°C for 1 min, 60°C for 1 min, 72°C for 1 min and a final extension at 72°C for 10 min. PCR analyses were carried out in a PTC-200 cycler (Bio-Rad, formerly MJ Research, Hercules, CA, USA). The amplification products were analysed on a 1% agarose gel containing ethidium bromide under UV light.

Semiquantitative real-time PCR

Semiquantitative PCR was performed using the LightCycler system together with the LightCycler DNA Master SYBR Green I Kit (Roche, Mannheim, Germany) as described previously (Veeck et al., 2006). Gene expression was quantified by the comparative C T method, normalizing C T -values to the housekeeping gene GAPDH and calculating relative expression values (Fink et al., 1998). Postamplification melting curve analyses were performed to assure product specificity.

Primer sequences for SFRP1 (product size 168 bp) and GAPDH (150 bp) are listed in Supplementary Table 2. The relative SFRP1 expression levels were standardized to the expression level of a normal kidney tissue sample that contained approximately 40% of epithelial (renal tubular) cells (tumours generally contained >50% of tumour cells). To ensure experiment accuracy, all reactions were performed in triplicate.

Bisulphite modification and MSP

Bisulphite modification and MSP were performed as described previously (Veeck et al., 2006). Of the genomic DNA, 1 μ g was bisulphite-treated using the DNA modification Kit (Chemicon, Ternecula, CA, USA) according to the manufacturer's specifications. For MSP, 1 μ l of modified DNA was amplified using MSP primers (see Supplementary Table 2) that specifically recognize the unmethylated (product size 135 bp) or methylated (126 bp) SFRP1 promoter sequence after bisulphite conversion. DNA derived from human placenta was bisulphite-treated to serve as a control for the unmethylated promoter sequence. DNA derived from human mamma carcinoma cell line BT20, recently described as hypermethylated in the SFRP1 promoter (Veeck et al., 2006), was used to generate a positive control for methylated alleles. Amplification products were visualized by UV illumination on a 3% low-range ultra agarose gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) containing ethidium bromide.

LOH analysis

The microsatellite markers used in this study and their localization (see Supplementary Table 2) were taken from the Genome Database (//www.gdb.org). All primers were obtained from Proligo (Hamburg, Germany). Matched normal/tumour DNA samples were amplified by PCR in a 25- μ l volume containing 0.2 m M dNTP, 0.18 μ M primers, 1.5 m M MgCl 2 and 0.25 units Taq -polymerase (Promega, Mannheim, Germany) using 3 μ l isolated DNA as template. The reaction mixture was subjected to 3 min of denaturing at 95°C and 35 cycles of 95°C for 1 min and specific annealing temperature for 1 min and 72°C for 1 min, followed by a final extension step at 72°C for 10 min. PCR conditions were optimized by gradient PCR and were carried out in a PTC-100 Thermocycler (Bio-Rad, formerly MJ Research, Hercules, CA, USA). Primer sequences and annealing temperatures are provided in Supplementary Table 2. The amplification products were visualized by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining as described (Schlegel et al., 1995). The silver-stained gels were assessed visually by two independent observers (CH and RSt) and informative cases were scored as allelic loss when intensity of the signal for the tumour allele was decreased to at least 50% relative to the matching normal allele. To avoid errors due to preferential amplification of one allele during the PCR, all LOH analyses were run in duplicates following independent PCRs.

SFRP1 genomic sequencing

Genomic DNA obtained from six LOH-positive clinical specimens, which contained >50% of tumour cells, were used as template for amplification of 500–1000 bp fragments containing the regions of interest. Oligonucleotide sequences are provided in Supplementary Table 2. Gel-purified PCR products were applied to the sequencing reaction containing Big Dye Terminator Mix and Big Dye Sequencing Buffer according to the BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit (ABI, Warrington, UK) and were sequenced in forward and reverse directions. The sequencing mixture was subjected to 1 min of denaturing at 96°C and 25 cycles of 96°C for 10 s and specific annealing temperature for 5 s and elongation at 60°C for 4 min, followed by a final extension step at 72°C for 10 min. Sequence detection was performed using an ABI Prism 310 Genetic Analyzer (ABI, Weiterstadt, Germany) and analysed using BioEdit Sequencing Alignment Editor v.7.0.5.3 (see: //www.mbio.ncsu.edu/BioEdit). The coding region of all three exons and the promoter region 1000 bp upstream from the transcription start site were analysed for base substitutions.

Statistical analysis of clinicopathologic patient data

Statistical analyses were completed using SPSS version 10.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Differences were considered statistically significant when p values were below 0.05. The non-parametric Mann–Whitney U test was used to compare the delta C T values of the real-time reverse transcriptase–PCR results between the RCC group and the normal kidney group and also to compare the different methylation groups.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

  2. 2.

    2 papildoma lentelė

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc).