Friedelino sintazė iš maytenus ilicifolia: leucinas 482 vaidina svarbų vaidmenį gaminant labiausiai pertvarkytą pentaciklinį triterpeną | mokslinės ataskaitos

Friedelino sintazė iš maytenus ilicifolia: leucinas 482 vaidina svarbų vaidmenį gaminant labiausiai pertvarkytą pentaciklinį triterpeną | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Skaičiavimo modeliai
  • Antrinė medžiagų apykaita

Anotacija

Tarp biologiškai aktyvių triterpenų labiausiai pasikeitė friedelino struktūra, kurią sukuria oksidoskalileno ciklazės, ir jis vienintelis turi citoninę grupę. Šiame tyrime mes klonavome ir funkciškai apibūdinome friedelino sintazę ir vieną cikloartenolio sintazę iš Maytenus ilicifolia (Celastraceae). Ištisos šių 2 genų kodavimo sekos buvo klonuojamos iš lapų mRNR, o jų funkcijos buvo apibūdintos heterologine raiška mielėse. Cikloartenolio sintazės seka yra labai panaši į kitus žinomus šio tipo OSC (maždaug 80% tapatumo), nors M. ilicifolia friedelin sintazės aminorūgščių seka yra labiau susijusi su β-amirino sintazėmis (tapatumas 65–74%), kuri yra panaši. į friedelino sintazę, klonuotą iš Kalanchoe daigremontiana . Kelių sekų suderinimai parodė leucino liekanos buvimą dviejose vietose prieš friedelino sintazės Asp-Cys-Thr-Ala-Glu (DCTAE) aktyviosios vietos motyvą, tuo tarpu didžioji dauguma iki šiol nustatytų OSC turi valino arba izoleucino liekaną. ta pati pozicija. Leucino liekanos pakeitimas valinu, treoninu ar izoleucinu M. ilicifolia friedelin sintazėje trukdė substrato atpažinimui ir paskatino skirtingų pentaciklinių triterpenų susidarymą. Taigi, mūsų duomenys rodo leucino liekanos svarbiausią vaidmenį šios oksidosqualene ciklazės struktūroje ir veikime.

Įvadas

Terpenai yra ypatinga antrinių metabolitų grupė. Jų biosintetiniai keliai prasideda nuo izoprenilo vienetų, izopentenilo difosfato (IPP) ir jo izomero dimetilalildifosfato (DMAPP), kurie sudaro terpenų, turinčių cheminių griaučių nuo 10 iki 40 anglies, blokų. Šie junginiai yra pirminiame prokariotų ir eukariotų metabolizme, nors jie yra ir antriniame eukariotų metabolizme 1 .

Tarp terpenų triterpenai yra tiesiogiai gaunami fermentuojant 30 anglies skvaleno ciklizavimą bakterijose arba iš gauto 2, 3-oksidoskalvalo ciklizacijos eukariotuose ir katalizuojami oksidoskalileno ciklazių (OSC). OSC yra specifiniai konkrečiam produktui ir konkuruoja dėl oksidoskvalėno substrato, kad gautų triterpenus. Oksidokvalleno ciklizaciją inicijuoja karbocationas, kuris keletą kartų pertvarkomas, ir susidaro įvairūs 2 junginiai (1 pav.). Tarp augalų pentaciklinių triterpenų germanikolis yra mažiausiai pertvarkymų turinčių molekulių, o friedelinas 1 turi didžiausią skaičių 2, 3, 4 .

Image

Oleanilo katijonas yra įprasta šaka formuojant friedeliną 1 ir β-amiriną ​​2.

Visas dydis

Triterpenai gali turėti įtakos membranų struktūrinėms ir hormoninėms funkcijoms, yra steroidų pirmtakai (bakterijų hopanoidai ir augalų cikloartenolis yra fitosterolių, grybelių ergosterolio, žinduolių cholesterolio ir steroidinių hormonų pirmtakai) arba gali pasižymėti gynybinėmis savybėmis. augalai kaip pentacikliniai triterpenai 5, 6, 7 .

Biologinis friedelino aktyvumas buvo išsamiai ištirtas. Pavyzdžiui, friedelino molekulė parodė antimikrobinį poveikį gramneigiamoms ir neigiamoms bakterijoms 8 Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis 9, Mycobacterium madagascariense ir Mycobacterium indicus pranii 10 bei gebėjimui paveikti augimo slopinimą Candida spp. 8, Trichophyton ir Aspergillus niger 11 . Be to, friedelinas taip pat parodė kraujagysles plečiančias, antihistaminines, priešuždegimines, analgezines ir karščiavimą mažinančias savybes 12 ; skrandžio apsaugą užtikrinanti 13, antioksidantų ir kepenų apsauginė veikla 14 ; ir gebėjimas slopinti kai kurias vėžio ląstelių linijas 15 .

Be savo paties biologinio aktyvumo, teigiama, kad friedelinas yra priešnavikinių chinono metidų triterpenoidų pirmtakas, įskaitant cetenraceae ir hipporateceacea šeimų mateniną ir pristimeriną 4, 16, 17 . Įrodyta, kad friedelinas yra sintetinamas po ciklidinimo oksidosqualene būdu Maytenus aquifolium ir Salacia campestris lapuose ir pernešamas į jų šaknis, kur oksidoreduktazės paverčia jas mayteninu ir pristimerinu 4 . Abi molekulės pripažintos turinčios priešuždegiminį 18, 19, 20 ir antimikrobinį poveikį 4, 21, 22, 23, 24 ir yra perspektyvios priešnavikinės medžiagos 25, 26, 27 .

Tarp oksidosqualene ciklazių (OSC), tetraciklinių triterpeno sintazių lanosterolio sintazės ir cikloartenolio sintazės yra labiausiai ištirtos ir jos turi keletą struktūrinių ypatybių, susijusių su jų produktų ciklizacijos pertvarkymo specifiškumu. 28, 29, 30, 31 . Nepaisant to, Homo sapiens 32 baltymų duomenų banke yra tik viena reprezentatyvi oksidosqualene ciklazės (OSC) struktūra ir viena Alicyclobacillus acidocaldarius 33 skvaleno ciklazė . Palyginti su tetraciklinio triterpeno sintazėmis, mažiau žinoma apie pentaciklinio triterpeno sintazių produkto specifiškumą, nors pranešta apie kai kuriuos tyrimus. Pvz., N-terminalas nurodomas kaip svarbiausias regionas, kuriame yra specifiškumas tarp lupeolio sintazės (iš Arabidopsis thaliana ) ir β-amirino sintazės (iš Panax ženšenio ) 34 . Triptofano ir leucino liekanos Met-Trp-Cys-Tyr-Cys-Arg (MWCYCR) motyve iš Panax ženšenio β-amirino sintazės ir Met-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg (MLCYCR) motyvas iš Olea europaea lupeol sintazės. buvo įvardytos kaip svarbios gaminiams diferencijuoti. Be to, buvo nustatyta, kad konservuota tirozino liekana tame pačiame motyve yra būtina norint stabilizuoti vieną iš katijonų tarpinių junginių, gaunančių pentaciklinius triterpenus. Priešingai, histidinas randamas analogiškoje padėtyje lanosterolio ir cikloartenolio sintazėse. Manoma, kad jis yra būtinas norint sudaryti tetraciklinius triterpenus 35 .

Kiek mums yra žinoma, friedelino sintazės genas buvo klonuotas tik iš vienos rūšies ( Kalanchoe daigremontiana ). Taigi nebuvo atsižvelgta į struktūrinius jos veiklos ypatumus 3 . Todėl, norėdami ištirti produkto specifiškumą pagrindžiančią struktūrinę bazę, sėkmingai klonavome ir išreiškėme OSC genus iš Maytenus ilicifolia . Mes nustatėme naują friedelino sintazės homologą ir apibūdinome jo fermentinį aktyvumą. Be to, mutagenezės tyrimai, atlikti leucinu 482 padėtyje (Leu482) ir molekulinis modeliavimas, rodo struktūrinius veiksnius, kurie gali būti susiję su produkto specifiškumu ir friedelino gamyba.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Pilno ilgio cDNR iš M. ilicifolia, koduojančio 2, 3-oksidoskalileno ciklazes, klonavimas

Friedelinas yra vienas iš pagrindinių triterpenų M. ilicifolia lapuose. Norėdami išskirti visą cDNR, koduojančią friedelino sintazę ir kitas šiuose audiniuose ekspresuojamas 2, 3-oksidoskalileno ciklazes, mes panaudojome homologija pagrįstą strategiją OSC šerdies fragmentams amplifikuoti, kurie vėliau buvo prailginti naudojant greitąją 5′- ir 3′-amplifikaciją. cDNR galų (RACE). Degeneravę pradmenys buvo sukurti remiantis konservuotomis augalų OSC sritimis, rastomis atliekant daugybę sekų suderinimų. Maždaug 750 bp dydžio OSC šerdies fragmentai buvo amplifikuoti iš bendro M. ilicifolia lapų cDNR, naudojant išsigimusius pradmenis. Fragmentai buvo padalijami į seką ir identifikuojami atlikus pagrindinio vietinio suderinimo paieškos įrankio (BLAST) analizę. Buvo identifikuotos dvi skirtingos OSC šerdies sekos, ir šie fragmentai RACE buvo pratęsta 5 'ir 3' kryptimis. Remiantis šia strategija, buvo nustatyti trys atviri skaitymo rėmai (ORF) 2, 3-oksidoskalalio ciklazėms iš M. ilicifolia lapų. Eilių palyginimas naudojant BLAST parodė didelį panašumą tarp įvairių kitų augalų rūšių M. ilicifolia OSC ir susijusių baltymų, tokių kaip β-amirino sintazės, lupeolio sintazės ir cikloartenolio sintazės (papildoma S1 lentelė).

M. ilicifolia 2, 3-oksidosqualene ciklazių funkcinis apibūdinimas

Norint apibūdinti M. ilicifolia OSC fermentinį aktyvumą, jų visiški ORF buvo klonuoti į mielių ekspresijos vektorių pYES2, kurį kontroliuoja galaktozės sukeliamas promotorius, ir paverčiami į S. cerevisiae štamą VZL 1303 (susidaro kaip aprašyta medžiagoje ir metodų skyrius). Gautos S. cerevisiae VZL 1303 + pYES2-OSCs ląstelės buvo indukuotos ekspresuoti M. ilicifolia OSC ir buvo naudojamos triterpeno produktų ekstraktui paruošti, kurie buvo analizuojami naudojant dujų chromatografiją ir masių spektrometriją (GC-MS). Chromatogramos parodė, kad kiekviename ekstrakte buvo vienas pentaciklinis triterpenas, kurio kontroliniame bandinyje nebuvo aptikta tuščiu vektoriu (2 pav.). GC-MS analizė patvirtino augalų triterpenų susidarymą S. cerevisiae palyginus su friedelino standartu. Aptiktų junginių masių spektrai pateikti papildomame S1 pav. Du OSC ORF buvo apibūdinami taip: (1) friedelino sintazė iš M. ilicifolia (Mi FRS – GenBank registracijos numeris KX147270) ir (2) cikloartenolio sintazė iš M. ilicifolia, Mi CAS1 (GenBank registracijos numeris KX147271). Protono branduolio magnetinio rezonanso (1H-BMR) analizė patvirtino, kad junginys, gautas ekspresuojant rekombinantinį Mi FRS, buvo friedelinas. Anglies-13 branduolinio magnetinio rezonanso (13C-NMR) spektroskopiniai duomenys patvirtino, kad yra friedelinas dėl šių būdingų signalų: (1) karbonilo grupė, kai δ ​​213 (C-3), ir (2) metilo grupė su gama apsaugos efektas esant 6, 8 (C-23) 36, 37 . Šie signalai buvo patvirtinti naudojant heteronuklearinius daugialypių ryšių koreliacijos (HMBC) spektrus, kurie parodė kryžmines viršūnes tarp C-3 (δ 213, 3) ir H-2 (δ 2, 38). 1 H poslinkiai ir 13 C charakteringi friedelino signalai yra pateikti S2 papildomoje lentelėje. Nors mielių, išreiškiančių Mi FRS ir Mi CAS1, chromatografinis profilis nėra tapatus tam, kuris gaunamas esant tuščiojo vektoriaus (pYES2) išraiškai, kitos nustatytos smailės neatitinka OSC produktų. Kita vertus, jie buvo identifikuoti kaip kiti ergosterolio kelio junginiai, tokie kaip 4, 4-dimetilzymosterol (30, 5 min.).

Image

Bendros ( a ) standartinių junginių, įskaitant friedeliną 1, β-friedelanolį 3, α-amirino acetatą 4, β-amirino acetatą 5, epitarakserolį 6 ir β-amiriną ​​2, jonų chromatogramos (TIC), naudojamos šioje analizėje ir S. cerevisiae VZL 1303 ekstraktai, turintys b ) tuščią vektorių pYES2; ( c ) vektorius, turintis friedelino sintazės kodavimo seką iš M. ilicifolia , pYES2- Mi FRS; ir ( d ) vektorius, turintis 1 cikloartenolio sintazės kodavimo seką iš M. ilicifolia , pYES2- Mi CAS1. Masės spektrai su friedelino 1 ir cikloartenolio 7 fragmentacijos modeliais parodyti 1 papildomame paveiksle.

Visas dydis

Friedelino sintazė yra labiausiai išreikšta OSC seka M. ilicifolia lapuose

Norėdami palyginti klonuotų OSC raišką su triterpenų buvimu lapuose, mes panaudojome realaus laiko kiekybinę atvirkštinės transkripcijos PGR (qPCR), kad nustatytume jų santykinį mRNR lygį per metus. Kaip parodyta 3 pav., Santykiniai Mi FRS mRNR lygiai buvo aukštesni nei kitų OSC per visus metus, nors nuo vasaros iki pavasario jų lygis žymiai sumažėjo. Įdomu tai, kad nepaisant palyginti žemo ekspresijos lygio, Mi CAS1 geno ekspresija padidėjo, kai Mi FRS geno ekspresija sumažėjo.

Image

( a ) Kiekvieno geno ekspresijos lygis buvo nustatytas iš RNR, ekstrahuoto iš lapų qPCR trimis egzemplioriais. Statistiškai reikšmingas skirtumas yra pažymėtas žvaigždute (*) juostos viršuje. Stulpeliai su ta pačia raide reiškia, kad atlikus Tukey testą (P <0, 05) nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp genų ekspresijos atitinkamu sezonu. Svarbu pastebėti, kad geno, koduojančio friedelino sintazę, ekspresijos lygis per metus statistiškai skiriasi ir taip pat yra statistiškai aukštesnis už geno, koduojančio Mi CAS1, ekspresijos lygį. b ) TIC už M. ilicifolia lapus . Pastaba dėl triterpeno friedelino 1 ir antrinio β-friedelanolio 3 paplitimo.

Visas dydis

Visus metus buvo tikimasi aukšto Mi FRS raiškos lygio (3a pav.), Nes friedelinas yra pagrindinis triterpenas, esantis M. ilicifolia lapuose (3b pav.) 38 . Cikloartenolio 7, fitosterolių pirmtako, chromatogramose nenustatyta, nes jis yra fitosterolio pirmtakas, nors cikloartenolio sintazės klonuota seka buvo išreikšta per metus. Fitosterolis, jau aprašytas M. ilicifolia, yra stigmasterolis 39, 40, kurio negalima pamatyti lapų chromatogramoje, nes mūsų naudojamos metodikos neleido vienu metu nustatyti stigmasterolio ir friedelino.

Triterpeno sintazės iš M. ilicifolia turi tipiškas OSC savybes

Palyginti su kitomis funkciškai apibūdintomis OSC sekomis, deponuotomis „GenBank“, šiame tyrime OSC klonuoti į šias dvi pagrindines grupes: (1) pentaciklinės triterpeno sintazės ir (2) cikloartenolio sintezės. Taikant kaimyninių jungčių metodą, analizė parodė, kad fermentas Mi FRS yra unikali seka ir nesusilieja su šiuo metu prieinama friedelino sintaze iš Kalanchoe daigremontiana (Kd FRS). Šis pastebėjimas paplitęs tarp OSC, turinčių tą pačią funkciją, bet iš skirtingų rūšių 41 (4 pav.). Kaip aprašyta anksčiau, friedelino, glutinolio ir lupeolio sintazės iš K. daigremontiana (Kd FRS, Kd GLS ir Kd LUS) sudaro vieną atšaką, o tos pačios rūšies tarakserolio sintazė ( Kd TAS) yra glaudžiai susijusi su Betula platyphylla beta-amirino sintazėmis. (BPY) ir iš „ Panax“ ženšenio (PNY1 ir PNY2) 3 . Nepaisant to, Mi CAS1 fermentas susilieja su cikloartenolio sintazių klade. Prognozuojamos bendrosios šiame tyrime klonuotų OSC baltymų savybės yra parodytos 1 papildomoje lentelėje. Po daugybės visuotinių suderinimų Mi FRS parodė aukštą tapatumą (65–74%) kelioms β-amirino sintazės sekoms. Mi CAS1 yra maždaug 80% identiškas kitoms cikloartenolio sintazėms.

Image

Nors fermentai „ Mi FRS“ ir „ Kd FRS“ pasižymi vienoda funkcine charakteristika, fermentai nebuvo glaudžiai sujungti. Šiai analizei naudojamų sekų „GenBank“ duomenys pateikti 4 papildomoje lentelėje.

Visas dydis

Daugybinių M. ilicifolia klonuotų ORF sekų palyginimo analizė nustatė konservuotus superšeimos domenus - skvaleno ciklazės domeno 1 pogrupį (SQCY_1) ir izopreno-C2 tipo reduktazę (ISOPREN_C2), esančius II klasės terpeno sintezėse, įskaitant OSC. Visos sekos parodė, kad yra Asp-Cys-Thr-Ala-Glu (DCTAE) motyvas, kuriame yra katalitinės asparto rūgšties liekana (oksidakoskalileno ciklizacijos ir substrato karbocacijos susidarymo iniciatorius) 42, 43 . Jie taip pat parodė keturis QW motyvus (konservuoti motyvai, turintys daug aromatinių aminorūgščių, pradedant Q-Gln ir baigiant W-Trp), kurie, kaip manoma, yra svarbūs palaikant fermentų struktūrą 3, 44 . Būdingų Gly-Tyr-Asn (GYN) liekanų ir konservuoto Met-Trp-Cys-His-Cys-Arg (MWCHCR) motyvas iš cikloartenolio sintazių, taip pat Ser-Phe (SF) liekanų ir konservuotų Met- Pentaciklinių triterpeno sintazių X-Cys-Y-Cys-Arg (MXCYCR) motyvas prognozuojamose vietose atitinka funkcinę Mi CAS1 ir Mi FRS klasifikaciją, atitinkamai 34, 35 (5 pav.).

Image

Pabrėžti keturi konservuoti QW motyvai ir katalitinės vietos DCTAE, nurodantys rūgštis, dalyvaujančias substrato karbocacijos susidaryme. Kiti konservuoti likučiai OSC yra MXCH / YCR, kuriuos riboja punktyrinė linija, ir liekanos GYN ir SF, išskiriančios tetraciklinę į pentaciklines sintazes, kurios yra dvigubai pabrauktos.

Visas dydis

Leucino liekana, esanti tiesiai prieš DCTAE motyvą, vaidina svarbų vaidmenį friedelino sintazės veikloje

Visuotinis Mi FRS suderinimas su Kd FRS parodė maždaug 65% tapatumą, kuris yra panašus į tapatumą, kurį pasidalija Mi MiS ir kitos triterpeno sintazės (1 papildoma lentelė). Nepaisant to, kai Mi FRS yra lyginamas su kitais OSC, tai rodo kai kurias ypatybes, kurių nėra kitose tirtose sekose. Verta paminėti, kad leucino liekana yra dviejose vietose prieš DCTAE motyvą Kd FRS (Leu483) ir Mi FRS (Leu482), tuo tarpu atitinkama padėtis yra pakeista valino liekana lanosterolio, β-amirino ir lupeolio sintazėse ir izoleucino liekana cikloartenolio sintezėse (papildomas S2 pav.). Įdomu tai, kad leucino liekana yra K. daigremontiana glutinolio sintazėje ( Kd GLS), kuri taip pat gamina friedeliną kaip antraeilį produktą 3, o šionono sintazėje - OSC, kuris gamina tetraciklinį triterpeną, kuriame taip pat yra citoninė grupė A- žiedas 45 .

Norėdami geriau suprasti Leu482 indėlį į Mi FRS friedelino sintazės aktyvumą, leucino liekaną pakeitėme valinu, treoninu arba izoleucinu ir įvertinome mielių išreikštą OSC mutantų biologinį aktyvumą. Iš modifikuotų fermentų gauti triterpenai buvo išgauti iš mielių ir įvertinti GC-MS. Kaip parodyta 6 pav., Leucino pakeitimas valinu (Leu482Val mutantas) ne tik panaikino friedelino gamybą, bet ir leido gaminti β-amiriną, kurio laukinio tipo Mi FRS nepastebėta. Tačiau pakeitus leuciną treoninu (Leu482Thr), atsirado tik β-amirinas. Galiausiai leucino pakeitimas izoleucinu (Leu482Ile) neturėjo įtakos friedelino gamybai. Todėl Leu482, esantis DCTAE motyve netoli katalizinio aspartato, čia apibūdinamas kaip svarbus gaminant friedeliną.

Image

a ) mielių ekstrakto, turinčio pYES2 - Mi FRS laukinio tipo, TIC, ( b ) pYES2 - Mi FRS Leu482Ile mutantas, ( c ) pYES2 - Mi FRS Leu482Thr mutantas ir ( d ) pYES2 - Mi FRS Leu482Val mutantas. Atkreipkite dėmesį, kad pYES2- Mi FRS Leu482Thr mutante nėra smailės, atitinkančios friedeliną . Pentaciklinių triterpeno junginių masių spektrų suskaidymas parodytas papildomame 1 pav.

Visas dydis

Konstrukcijų analizė

Norėdami išsiaiškinti baltymo struktūrines ypatybes, susijusias su friedelino sintazės aktyvumu, mutacijos buvo pažymėtos trimatėje Mi FRS struktūroje. Sukūrėme homologijos modelį, pagrįstą žmogaus lanosterolio sintaze (baltymų duomenų banko ID 1W6K) (papildomas S3 pav.). Mi FRS rutulinėje monomerinėje struktūroje yra 771 likučiai ir apskaičiuotas 0, 3 Å vidutinis kvadratinis nuokrypis (RMSD) su išlygintomis Cα koordinatėmis H. sapiens homologinei oksidoskalileno ciklazei 1W6K. Daugiausia alfa statinės Mi FRS topologija apima 21 alfa spiralę (išsami struktūrinė ir funkcinė anotacija genomo sekoms, CATH 1.50.10.20). Šiame modelyje taip pat yra skvaleno ciklazės 1 pogrupio domenas (SQCY liekanos 68–709).

Norėdami įvertinti kintančio Leu482 poveikį struktūrine perspektyva, šioje analizėje mes apsvarstėme anksčiau pasiūlytus karbocacijos pertvarkymus 2, kuriuose oleanilo katijonas, mažiau pertvarkytas rūšis, susidaręs po oksidosqualene ciklizacijos, yra artimiausias įprastas pirmtakas tiek β-amirinui, tiek friedelinui. (kaip parodyta 1 pav.). Dėl šios priežasties Leu482Thr mutantas sukeltų vandens molekulę į aktyviąją vietą (7a pav.) Dėl poliarinių ir mažesnių sterilių kliūčių, susijusių su leucino liekana laukinio tipo Mi FRS. Šioje vietoje vandens molekulė galėtų stabilizuoti katalizinį Asp174 likučius ir išstumti oleanilo katijoną, padėdami jo C žiedą arčiau Tyr259 (7a pav.). Struktūriniai pertvarkymai aktyviojoje vietoje gali sukelti karbokabilizacijos stabilizavimąsi, o tai galiausiai lemia nesočiųjų jungčių, esančių β-amirino žiede, susidarymą (7b pav.). Be to, „Leu482Thr“ sukeltas poslinkis A žiedą priartina prie hidrofobinių Trp417, Phe473 ir Trp534 šoninių grandinių, tokiu būdu blokuodamas metilo grupių pertvarkymą į struktūrą, stebimą friedelino A žiede (7c pav.).

Image

( a ) Modeliuotas oleanilo katijono (ciano), ( b ) β-amirino (oranžinis) ir ( c ) rišimosi būdas rodo „ Mi FRS Leu482Thr“ mutantų surišimo vietą: vandens molekulė žymima raudona rutuliu, o polinė sąveika tarp Tyr259 o oleanilo katijonas (rausvai raudonas) žymimas geltonomis punktyrinėmis linijomis. d ) Modeliuotas oleanilo katijonų (ciano), ( e ) friedelino (oranžinis) ir ( f ) rišimosi būdas rodo „ Mi FRS Leu482Val“ mutantų surišimo vietą: „Tyr259“ ir oleanilo katijono (magenta) polinė sąveika nurodoma geltonomis brūkšniais. .

Visas dydis

Priešingai, Leu482Val mutantas leistų didesnį oleanilo katijono mobilumą aktyviojoje vietoje, o tai rodo mažos energijos variacijos, apskaičiuotos skirtingoms pozicijoms, numatomoms jungiant doką. Didesnis mobilumas, kurį leidžia Leu482Val aktyviojoje vietoje, suteikia mažiau Tyr259 oleanilo katijono C žiedo stabilizaciją (7d pav.), Palyginti su Leu482Thr, todėl susidaro sistema, kuri gali paversti oleanilo katijonus į abu β-amirinus. ir friedelin (7e, f pav.) pagal siūlomus pertvarkymus (kaip parodyta 1 pav.).

Svarbu pažymėti, kad Leu482Ile mutantas friedelino gamybai įtakos neturėjo. Šį smūgio trūkumą galima paaiškinti panašiu tūriu ir hidrofobiškumu, išlaikomu tarp Leu ir Ile šoninių grandinių šioje padėtyje. Įdomu tai, kad daugumoje cikloartenolio sintazių šioje vietoje yra izoleucino liekana, tuo tarpu daugumoje triterpeno sintazių yra valino liekana.

Mutacijos tyrimas su Pisum sativum (PSX) cikloartenolio sintaze parodė, kad pakeitus vieną aminorūgštį (Tyr118Leu), beveik vien tik gaminamas kururbitadienolis, nors atvirkštinė mutacija Curkurbita pepo (CPQ) gurkšnio cikloartenolio sintazėje cikloartenolio susidarymo nepadėjo. bet parkeol 46 . Stebimos produkcijos modifikacijos spekuliatyvus paaiškinimas buvo pagrįstas dydžio pokyčiais ir katijonų π stabilizavimu aktyviojoje vietoje. Panašiai, mūsų modelis nurodė, kad β-amirinas susidaro dėl vieno friedelino sintazės mutanto (Leu482) specifiškai Val arba Thr dėl oleanilo katijono stabilizacijos aktyvios vietos ertmėje. Ryšys tarp stabilizacijos aktyviojoje vietoje ir triterpeno susidarymo pertvarkymų skaičiaus buvo patvirtintas kitu tyrimu, kuriame buvo analizuojama tetra ir pentaciklinių triterpenų susidarymo įvairovė β-amirino sintazės metu iš Panax ženšenio (EtAS), cikliškai veikiant skirtingiems oksidosqualene analogams. Tame tyrime nebuvo atlikti mutacijų vertinimai, tačiau buvo nustatyta, kad metil-30 grupė yra svarbi palaikant tinkamą sąveiką su fermentu, kad ji galėtų sudaryti pentaciklinius triterpenus 47 .

Neseniai atliktas kitas tyrimas, apibūdinantis Avena strigosa β-amirino sintazės SAD1 mutantus, nustatė, kad Cys563Tyr mutacija blokuoja ciklizacijos 48 pradžią . Tai yra trečia liekana, susijusi su ciklizacijos inicijavimu iki šiol, nes anksčiau buvo įrodyta, kad tiek katalizinė asparto rūgštis, tiek labai konservuotas DCTAE motyvo cisteinas yra būtini fermentiniam aktyvumui 49, 50 . Ši SAD1 cisteino 563 liekana (564 - Mi FRS) yra labai konservuota ir anksčiau buvo numatyta, kad atlikus žmogaus lanosterolio sintazės kristalų struktūros tyrimą, katalizinė asparto rūgšties funkcija gali būti naudinga dėl jų artimo padėties 32 . Be šio tyrimo, šis darbas parodė, kad Ser728Phe mutantas SAD1 β-amirino sintazėje iš Avena strigosa ir atitinkamas pakaitalas Thr729Phe AtUP LUP1 iš A. thaliana palankiai vertina tetraciklinių triterpenų, o ne β-amirino, pentaciklinio ir kt. pertvarkytas triterpenas. Naudojant baltymų modeliavimą ir doko analizę, kaip atlikta čia, šis darbas numatė, kad SAD1 β-amirino sintazės Ser728Phe mutante 728 padėtyje esanti didelė fenilalanino aromatinė šoninė grandinė kišasi į katalizinio centro Phe725, todėl nutrūksta. Dammarenilo katijono žiedo išsiplėtimas ir dėl to susidaro sutrumpinti tetracikliniai oksidoskalileno ciklizacijos produktai. Be to, SAD1-Ser728Phe ir AtLUP1-Thr729Phe mutantai dioksido skvaleną kaip substratą priima kaip mielę ir ciklizuoja jį epoksiddammarano dariniais, o tai rodo, kad Ser728 taip pat turi įtakos galimų OSC substratų galimybėms patekti į aktyviąją vietą 48 .

Triterpeno sintazių mutantų produktų ir substratų analizė ir specifinių aminorūgščių liekanų vaidmens prognozavimas atliekant homologinius modeliavimo ir jungiamuosius tyrimus yra galinga triterpeno įvairovės ištyrimo strategija, taip pat leidžianti gaminti naujus junginius kontroliuojant ciklizaciją. pertvarkymai ir skirtingų substratų priėmimas ESBO. Todėl mūsų mutacijos tyrimai apie friedelino sintazės aktyvumą, apibendrinti ankstesniais, yra įdomūs pavyzdžiai, kaip nustatomi skirtingi veiksniai ir motyvai, išskiriantys skirtingus OSC. Tolesnis struktūrinių veiksnių supratimas taip pat leis suprojektuoti padidinto specifiškumo ir produktyvumo OSC fermentus.

Medžiagos ir metodai

Augalinė medžiaga

Maytenus ilicifolia (Celastraceae) pavyzdys yra saugomas Farmacijos mokslų mokykloje, San Paulo valstybiniame universitete, Araraquara, Brazilija (registracijos numeris 00755, „Herbário do Departamento de Plantas Medicinais da Universidade de Ribeirão Preto“ (HPM-UNAERP)). Maytenus ilicifolia lapai buvo nuimti ir nedelsiant sudedami į skystą azotą malimui. Lapai buvo surinkti 2011 ir 2012 m.

OSC klonavimas

Visa RNR buvo išgauta iš M. ilicifolia lapų naudojant „RNeasy Plant Mini Kit“ (Qiagen, Hilden, Vokietija) ir buferiniu RLC (remiantis guanidino hidrochloridu). RNR kokybė buvo patikrinta elektroforezės būdu, naudojant 1, 2% agarozės gelį, su mėginiais, įdėtais į formamido buferį 51 . Absorbcijos santykis esant 260/280 ir 260/230 taip pat buvo nustatytas spektrofotometrijos būdu. CDNR buvo susintetinta naudojant didelės talpos cDNR atvirkštinės transkripcijos rinkinį (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, JAV) ir naudojama polimerazės grandininei reakcijai (PGR). Klonavimo strategija buvo vykdoma vadovaujantis metodais, aprašytais ankstesniuose 3, 52 tyrimuose, naudojant išsigimusius oligonukleotidinius pradmenis, suprojektuotus OSC konservuotuose regionuose (3 papildoma lentelė), ir genų specifinius pradmenis koduojančių sekų vidinių fragmentų amplifikacijai. Escherichia coli štamas DH10B buvo naudojamas klonavimui. 3'- ir 5'-sistemos greitam cDNR galų amplifikavimui (RACE, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, JAV) buvo naudojamos pagal gamintojo protokolus su genų specifiniais pradmenimis ORF galinių fragmentų amplifikavimui, kurie buvo maždaug 450 bp ir Atitinkamai 550 bp. PGR buvo atlikta Taq DNR polimeraze (Fermentas, Waltham, Masačusetsas, JAV), o PGR produktai buvo atskirti 0, 8% agarozės gelio elektroforeze ir ekstrahuoti naudojant QIAquick gelio ekstrahavimo rinkinį (Qiagen). Kiekvienos pakopos fragmentai buvo paruošti klonuoti į pTZ57R / T vektorių (Fermentas) ir buvo transformuoti į kompetentingas E. coli ląsteles. Plazmidės, turinčios DNR fragmentus, buvo išgrynintos iš transformuotų ląstelių naudojant QIAprep nugaros miniprep rinkinį (Qiagen), sekos sudarytos naudojant genetinį analizatorių 3130 su Big Dye Terminator v3.1 ciklo sekvenavimo rinkiniu ir išgrynintos naudojant Big Dye XTerminator gryninimo rinkinį (Applied Biosystems). . Skirtingos gautos sekos buvo identifikuotos kaip OSC, naudojant nukleotido BLAST įrankį (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ir sugrupuotos pagal jų tapatumą. Pilno ilgio ORF amplifikuoti naudojant šabloną M. ilicifolia cDNR ir 5 'bei 3' specifinius pradmenis (3 papildoma lentelė). PGR buvo atliekama naudojant Platinum Pfx DNR polimerazę (2, 5 V / μL; Invitrogen) tokiomis sąlygomis: (1) karštas užvedimas 2 minutes 94 ° C temperatūroje, (2) 30 ciklų 94 ° C 30 s, 55 ° C. 3 sekundes 45 s ir 68 ° C temperatūroje, ir (3) paskutinis pratęsimas 68 ° C temperatūroje 10 min. Gautas 2, 4 kb PGR produktas buvo klonuotas ir seka su M13 ir kitais pradmenimis (2 papildoma lentelė).

OSC funkcinė analizė

Šiame tyrime naudotas S. cerevisiae štamas VZL 1303 ( MAT a, Δura3, Δhis3, Δleu2, ERG7-kan r (DAmP, sumažėjo priklausomybė pagal mRNR pertraukimą)) buvo gautas mūsų laboratorijoje kertant CEN.PK2 ir ERG7 DAmP ( Thermo Scientific, Waltham, Masačusetsas, JAV) padermės. Pilno ilgio Maytenus ilicifolia OSC ORF buvo klonuoti į mielių ekspresijos vektorių pYES2 (Invitrogen), kurį kontroliuoja galaktozė ( GAL1 promotorius). PYES2- Mi FRS ir pYES2- Mi CAS1-plazmidės buvo transformuotos į VZL 1303, o gautos padermės buvo išaugintos 0, 5 litre sintetinės visos terpės be uracilo (SC-U). Heterologinį genų ekspresiją 10 val. Paskatino 2% galaktozė, o triterpeno susidarymas buvo atliekamas esant 0, 1 M kalio fosfatui, turinčiam 3% gliukozės, 24 h 30 ° C temperatūroje purtant. Tada ląstelės buvo surenkamos ir lipidai pašalinami muilinimo reakcijos būdu su 25% KOH 50% etanolio tirpale (50 ml) su grįžtamuoju šaldytuvu 5 minutes. Triterpenai ekstrahuojami skysčio ir skysčio padalijimu 3 kartus su 50 ml heksano 3, 53 ir išdžiovinami.

Heterologiškai pagamintų izoprenoidų cheminė analizė

Ekstraktas (90 mg) buvo suspenduotas 1 ml heksano, chromatografuotas kolonėlėje per silikagelį (500 mg) ir išplautas heksanu (4 ml) ir chloroformu (6 ml), gaunant šias 3 frakcijas: (1) Hex1 (8 mg), (2) Hex2 (14 mg) ir (3) CHCl3 (42 mg). Ši procedūra buvo atlikta trimis egzemplioriais, siekiant patikrinti proceso ir analizės patikimumą. Chloroformo frakcijos, kurios, kaip buvo įrodyta, praturtintos triterpenais, buvo analizuojamos dujų chromatografijos metodu, naudojant masės aptikimą (GC-MS), naudojant QP-2010 (Shimadzu, Kioto, Japonija), naudojant DB-5MS koloną (30 m × 0, 25 mm). × 0, 25 μm; „Agilent Technologies“, Santa Klara, Kalifornija, JAV). Dujų chromatografija buvo atlikta laikantis šių specifikacijų: (1) įleidimo temperatūra 250 ° C, (2) kaitinimo gradientas nuo 200 ° C iki 290 ° C (10 ° C / min), (3) gaudyklės temperatūra 250 ° C, (4) sąsajos temperatūra 290 ° C, (5) 1 μL įpurškimo tūris, (6) dalijimosi santykis 1:10, (7) dujų srautas esant 1, 03 ml / min., (8) EI 70eV jonizacija ir (9) ) aptikimo intervalas nuo 50 iki 500 m / z. Iš aptiktų smailių gautos struktūros buvo ieškomos pagal Nacionalinio standartų ir technologijos instituto (NIST) biblioteką ir palygintos su literatūra ir turimais standartais. Branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektrai buvo užregistruoti „de NMR Bruker Avance III 600“ (14, 1 T; Billerica, Masačusetsas, JAV) spektrometru su CDCl3 kaip tirpikliu ir tetrametilsilanu (TMS) kaip etaloniniu.

Triterpenų, esančių M. ilicifolia lapuose, cheminė analizė

Švieži M. ilicifolia (5 g) lapai buvo surinkti, iš karto sudedami į skystą azotą malimui ir ekstrahuojami heksanu: etilo acetatu (8: 2, tūris / tūris ). Ekstraktas išdžiovinamas, pakartotinai suspenduotas 1 ml chloroforme, filtruojamas ir analizuojamas dujų chromatografijos metodu tuo pačiu metodu, kaip aprašyta aukščiau.

Audinių išraiškos lygiai

Lapai buvo surinkti per keturis sezonus per vienerius metus, o visa RNR buvo ekstrahuota, kaip aprašyta aukščiau. Mėginiai buvo apdoroti DNaze I (1 U / μL, Sigma-Aldrich, Sent Luisas, Misūris, JAV) prieš cDNR sintezę didelės talpos cDNR atvirkštinės transkripcijos rinkiniu. Kiekybinis realaus laiko PGR (qPCR) buvo atliktas naudojant pagrindinį „Power SYBR Green PCR“ mišinį (Applied Biosystems). Genui būdingi pradmenys buvo suprojektuoti amplifikuoti maždaug 160 bp fragmentus, o 40S ribosomų baltymo genas („GenBank“ registracijos numeris KX147273) buvo naudojamas kaip endogeninė kontrolė (3 papildoma lentelė). Po pradinio patikrinimo ir reakcijos optimizavimo qPCR buvo atliktas tokiomis sąlygomis: (1) 50 ° C 2 minutes, (2) 95 ° C 10 minučių ir (3) 40 ciklų 95 ° C 10 s ir 60 ° C 1 min. Analizė buvo padaryta trimis egzemplioriais kiekvienam iš keturių lapų OSC nuorašų iš kiekvieno metų sezono, o rezultatai išreiškiami kaip vidutinė santykinė išraiška. Statistinis reikšmingumas buvo apskaičiuotas naudojant dispersijos analizę (ANOVA) ir Tukey testą. Mažesnės nei 0, 05 P vertės buvo laikomos reikšmingomis.

Filogenetinė analizė

Skirtingų augalų OSC sekos buvo išgautos iš NCBI naudojant „protein Blast“ įrankį (4 papildoma lentelė) ir buvo sulygiuotos su keturiomis sekomis, klonuotomis šiame tyrime naudojant „ClustalW“ (//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). . Kaimynų sujungimo medis buvo sukurtas naudojant „Mega 5“ programinės įrangos numatytuosius parametrus, pagrįstus 1000 įkrovos replikų.

Silicio baltymų analizė

Kiekvieno klonuoto OSC išverstos aminorūgščių sekos buvo gautos naudojant „ORF Finder“ programinę įrangą (//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html). Išvestų aminorūgščių palyginimai buvo atlikti naudojant „protein Blast“ įrankį. Siekiant užtikrinti, kad klonuotose sekose būtų identifikuojama OSC šeima, konservuoti domenai buvo analizuojami naudojant NCBI išsaugoto domeno paieškos įrankį (//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi), o pI ir molekulinis svoris (MW) buvo numatytas //web.expasy.org/compute_pi/. Trimatės struktūros buvo modeliuojamos naudojant modeliuotojo sąsają „ViTaMIn“ (//github.com/gustalima/vitamin-stable) ir kaip šabloną Homo sapiens lanosterolio sintazės (PDB ID 1W6K) kristalų struktūrą. Ligandą rišančių aminorūgščių liekanos Mi FRS buvo numatytos naudojant „Autodock Vina 54“ .

Friedelino sintazių mutagenezė

PYES2- Mi FRS plazmidė buvo naudojama kaip šablonas nukreipiant į vietą nukreiptą mutagenezę vieno pradmens amplifikacija 55 . Gruntai, naudojami kuriant pakaitinį mutantą leucine 482 ( Mi FRS), yra pateikti 3 papildomoje lentelėje. Pavienių pradmenų amplifikacija buvo atlikta naudojant Phusion High Fidelity DNR polimerazę (2000 U / ml; New England Biolabs) šiomis sąlygomis: ( 1) karštasis užvedimas 98 ° C temperatūroje 1 min., (2) 30 ciklų 98 ° C temperatūroje 10 s, 50 ° C 30 s ir 72 ° C 5 minutes, ir (3) galutinė polimerizacija 72 ° C temperatūroje 5 min. Viengrandiai amplifikacijos produktai buvo sumaišyti ir atkaitinti palaipsniui mažinant temperatūrą 10 ° C / min. Nuo 98 ° C iki 37 ° C. Po Dpn I (20 U / μL; New England Biolabs) apdorojimo plazmidės buvo transformuotos į kompetentingas E. coli ląsteles. Seka buvo naudojama norint patvirtinti norimų mutacijų buvimą. Galiausiai plazmidės buvo transformuotos į VZL 1303 ląsteles, o Mi FRS mutantų funkcijos buvo išanalizuotos, kaip aprašyta aukščiau.

Baltymų homologijos modeliavimas

771 aminorūgšties Mi FRS baltymų seka buvo perkelta iš jos DNR sekos, gautos iš „GenBank“ (KX147270). NCBI baltymas BLAST, naudojamas tinkamų šablonų paieškai, nustatė žmogaus homologo oksidoskalileno ciklazę (PDB 1W6K). Buvo sukurtas „ Mi FRS“ modelis, naudojantis pasitenkinimo erdviniu ribojimo algoritmu, įdiegtu modelyje MODELLER 9v14 56, 57, 58 . Geriausias modelis buvo išrinktas įvertinus „Ramachandran“ sklypus ir „MODELLER“ DOPE balą.

Oleanilo katijonų dokas

Oleanilo katijonas buvo dokuotas naudojant Lamarcko genetinį algoritmą (LGA), įdiegtą „Autodock 4.2“ ir „AutoDock Vina 54, 59“ . Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti mutacijų skatinamus struktūrinius pokyčius, kurie leistų pakeisti oleanilo katijonų protonų pertvarkymą, o tai dar labiau paskatino beta-amirino arba friedelino susidarymą. Šia prasme buvo ištirtos kelios oksidosqualene ciklazės, prieinamos kaip PDB struktūros (PDB ID 1W6J, 1W6K, 2SQC, 3SQC ir 1GSZ). Struktūrinė analizė atskleidė konservuotą vandenį aktyviojoje vietoje, ir tai rodo molekulinio atpažinimo vaidmenį. Todėl vandens molekulė buvo naudojama įvertinti ligando surišimo būdą, taip pat santykinę padėtį tarp oleanilo karbokacijos ir Tyr259. Paieškos tinklelis buvo apibrėžtas kaip kubas su 12 Å briauna, kurio centras yra Trp612. Likučiai 4 Å nuo dėžutės centro (Trp257, Tyr259, Val263, Val410, Trp417, Phe473, Leu482, Aps484, Cys485, Trp534, Met549, Leu552, Ile555, Phe728, Leu734 ir Tyr736) buvo nustatyti kaip lankstūs. Oleanilo molekulės 3D struktūra buvo sukurta naudojant standartinius geometrinius parametrus, prieinamus MarvinSketch (Marvin 16.2.22), 2016, ChemAxon (//www.chemaxon.com). Optimizuota ligandų konformacija buvo energingai sumažinta naudojant „MarvinSketch“ numatytuosius parametrus. Rezultatai buvo analizuojami naudojant PyMOL 1.7.2.

Papildoma informacija

Prisijungimo kodai: Mi FRS – „GenBank“ prisijungimo numeris KX147270; „Mi CAS1“ - „GenBank“ prisijungimo numeris KX147271.

Kaip pacituoti šį straipsnį : Souza-Moreira, TM et al . Friedelino sintazė iš Maytenus ilicifolia : Leucine 482 vaidina esminį vaidmenį pertvarkant penktaciklinį Triterpeną. Mokslas. Rep. 6, 36858; „doi“: 10.1038 / srep36858 (2016).

Leidėjo pastaba : „Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.