Gliko inžinerijos būdu gauto monokloninio antikūno cetuksimabo funkcijos apibūdinimas in vitro | acta pharmaologica sinica

Gliko inžinerijos būdu gauto monokloninio antikūno cetuksimabo funkcijos apibūdinimas in vitro | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Įvertinti antihumaninio epidermio augimo faktoriaus receptoriaus monokloninio antikūno (EGFR mAb) cetuksimabo gliko inžinerijos formą ir aktyvumą in vitro .

Metodai:

Genai, koduojantys kinišką žiurkėną, skaidomą glikozilinimo fermentą (GnTIII), ir anti-žmogaus EGFR mAb, buvo klonuoti ir kartu ekspresuoti CHO DG44 ląstelėse. Šių ląstelių pagamintas pusiau skaldantis glikozilintas rekombinantinis EGFR mAb (bisec-EGFR mAb) buvo apibūdintas atsižvelgiant į jo glikano profilį, antiproliferacinį aktyvumą, Fc receptorių jungimosi afinitetą ir ląstelių lizės galimybes. Galaktozės-α-1, 3-galaktozės (α-Gal) kiekis bisec-EGFR mAb buvo išmatuotas naudojant HPAEC-PAD.

Rezultatai:

Bisec-EGFR mAb turėjo didesnį pusiau dalijančių N-acetilgliukozamino liekanų kiekį. Palyginti su laukinio tipo EGFR mAb, bisec-EGFR mAb parodė 3 kartus didesnį ląstelių lizės pajėgumą atliekant antikūnų priklausomą ląstelių citotoksiškumo testą ir 1, 36 karto didesnį antiproliferacinį aktyvumą žmogaus epidermoidinės karcinomos linijos A431 atžvilgiu. Be to, bisec-EGFR mAb turėjo didesnį surišimo afinitetą žmogaus FcyRa ir FcyRIIIa-158F atžvilgiu nei laukinio tipo EGFR mAb. Be to, bisec-EGFR mAb nenustatyta α-Gal, kuris buvo atsakingas už cetuksimabo sukeltas padidėjusio jautrumo reakcijas.

Išvada:

Gliko inžinerijos būdu pagamintas EGFR mAb su daugiau dalijančių modifikacijų ir mažesniu α-Gal kiekiu nei patvirtintas terapinis antikūnas Erbitux pasižymi patobulintu funkcionalumu in vitro ir reikalauja patvirtinimo in vivo .

Įvadas

Klinikiniuose žmogaus piktybinių navikų ir uždegimo gydymo klinikiniuose tyrimuose dalyvavo daugiau kaip 300 monokloninių antikūnų 1, 2 . Klinikinę šios vaistų klasės sėkmę rodo daugybė terapinių antikūnų, kurie buvo pateikti į rinką, ir augantis terapinių antikūnų skaičius. Vis dėlto tobulinti terapinių antikūnų efektyvumą ir mažinti jų šalutinį poveikį išlieka iššūkiais 1 .

Glikozilinimas yra viena iš svarbiausių baltymų po transliacijos modifikacijų ir turi esminį vaidmenį gydant antikūnus, įskaitant efektoriaus funkciją, imunogeniškumą, pusinės eliminacijos periodą serume ir kitus biologinio aktyvumo aspektus 3, 4 . Kai kurie žmogaus antikūnų glikoformos pasižymi stipresniu terapiniu poveikiu nei kitos glikoformos, o kai kurios glikoformos turi nepageidaujamų savybių. Pvz., De-fukosilintas Herceptin yra bent 50 kartų aktyvesnis atliekant Fcγ receptorių IIIa tarpininkaujantį antikūnų priklausomą ląstelių citotoksiškumą (ADCC), nei forma su alfa-1, 6-susietomis fukozės liekanomis 5 . Anti-CD20 antikūnas, turintis didesnį pusiau skaidomų acetilgliukozamino (GlcNAc) liekanų kiekį, turi 10–20 kartų didesnį ADCC nei jo laukinio tipo atitikmuo 6 .

Terapinis antižmoginis epidermio augimo faktoriaus receptorių monokloninis antikūnas (EGFR mAb) cetuksimabas (parduodamas pavadinimu Erbitux) yra ekspresuojamas pelių ląstelių linijoje Sp2 / 0 ir yra patvirtintas kolorektalinio vėžio gydymui. Šis terapinis antikūnas gali surišti EGFR ir sukelti EGFR autofosforilinimą, taip pat vėliau suaktyvinti signalo perdavimo takus, susijusius su ląstelių proliferacijos, diferenciacijos ir išgyvenimo reguliavimu 7 . Be to, šis terapinis EGFR mAb pasižymi ADCC prieš vėžio ląsteles 8 .

Kai kuriose JAV vietose buvo pranešta apie padidėjusį padidėjusio jautrumo reakcijas cetuksimabui 9 . Daugeliui tiriamųjų, kuriems pasireiškė padidėjusio jautrumo reakcija, prieš gydymą kraujyje buvo IgE antikūnų, atpažįstančių EGFR mAb. IgE antikūnai buvo specifiški galaktozės-α-1, 3-galaktozės (α-Gal), esančios EGFR mAb sunkiosios grandinės Fab dalyje. Pacientams, kurie prieš gydymą turi tokius IgE antikūnus, paprastai padidėja padidėjusio jautrumo reakcija, į veną suleidus monokloninių antikūnų, turinčių α-Gal.

Šiame tyrime pirmiausia mes sukūrėme stabilią kinų žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląstelių liniją, galinčią ekspresuoti laukinio tipo EGFR mAb, o vėliau šias ląsteles transfekavo cDNR, koduojančioje GnTIII (Golgi lokalizuotas fermentas, katalizuojantis pridedant pusiau skaldantį N- acetilgliukozamino liekana ant N-sujungtų oligosacharidų grandinių). Atlikus GnTIII ir laukinio tipo EGFR mAb ekspressiją šioje ląstelių linijoje, mes apibūdinome GnTIII modifikuoto EGFR mAb N-glikano profilį (bisec-EGFR mAb), naudodamiesi DNR sekvencerio palaikomais fluoro-foro pagrįstais kapiliarų elektroforeze (DSA-FACE). 10, 11 ir kiekybiškai įvertino α-Gal kiekį. In vitro buvo ištirtas EGFR mAb poveikis ląstelių augimui, ADCC ir FcyR jungimosi pajėgumui , siekiant įvertinti bisec-EGFR mAb funkcijas.

medžiagos ir metodai

Ląstelių linijos

A431 (ATCC CRL-1555) yra ląstelių linija, ekspresuojanti EGFR. Daudi (ATCC CCL-213 ) yra B limfoblastų ląstelių linija, išreiškianti slopinamąjį Fcy receptorių (FcγRIIb). HEK293 ląstelės, ekspresuojančios žmogaus FcyRa, FcyRIIa, FcyRIIIa-158V arba FcyRIIIa-158F, buvo generuojamos, kaip aprašyta anksčiau 12 .

Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb išraiška

GnTIII (-) CHO DG44 ląstelių linija buvo naudojama laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb ekspresijos tyrimuose. GnTIII ir EGFR mAb sunkioji ir lengvoji grandinės (cDNR, sintezuotos Invitrogen ir subklonuotos į ekspresijos vektorių mūsų laboratorijoje) buvo kartu ekspresuojamos CHO DG44 ląstelėse, naudojant OptiCHO antikūnų ekspresijos sistemą (Invitrogen). Ląstelių linija, stabiliai ekspresuojanti laukinio tipo EGFR mAb, buvo patikrinta 1 μmol / L MTX ir patvirtinta visos ląstelės ELISA (A431) 6 . Susintetintas Kinijos žiurkėno GnTIII genas (NM_001244074.1) buvo klonuotas į pCDNA 3.1 Hygro (-) vektorių, o laukinio tipo EGFR mAb ekspresuojanti ląstelių linija buvo transfekuota šiuo vektoriu. Bisec-EGFR mAb (stabiliai transfekuotas GnTIII genas) ląstelių linija buvo parinkta naudojant 500 μg / ml higromicino.

Laukinio tipo EGFR mAb, bisec-EGFR mAb ir atitinkamų Fab ir Fc fragmentų glikozilinimo analizė

Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb iš ląstelių supernatantų buvo užfiksuoti atitinkamai su baltymo G agarozė ir baltymo A agarozė. Atitinkami Fc ir Fab fragmentai buvo išskirti naudojant imobilizuotą papainą („Thermo Scientific“, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Suskaidytas supernatantas buvo perkeltas į A baltymo kolonėlę. Fab fragmentai buvo surinkti kaip pratekanti frakcija. Susieti Fc fragmentai išplaunami 0, 01 mol / l glicino, pH 3, 0. Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb bei atitinkamų Fab ir Fc fragmentų N-glikano profiliavimas buvo atliktas DSA-FACE.

Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb ADCC aktyvumo tyrimas

Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės (PBMC) buvo atskirtos nuo heparinizuoto šviežio sveiko žmogaus kraujo standartinėmis centrifugavimo procedūromis, naudojant Ficoll / Hypaque (Sigma). PBMC, naudojami kaip efektorinės ląstelės, buvo suaktyvinami RPMI su 10% FBS ir 10 U / ml interleukino-2 (Roche) per naktį. ADCC aktyvumo tyrimas buvo atliktas pagal gamintojo instrukcijas (CytoTox 96 ® neradioaktyviojo citotoksiškumo tyrimas, Promega, JAV). Trumpai tariant, A431 ląstelės buvo išaugintos iki prisijungimo fazės ir po skalbimo bandymo terpėje (DMEM) pakartotinai suspenduotos 4 x 105 ląstelių / ml. Tikslinės ląstelės (A431) buvo įpiltos po 50 μL / duobutėje į 96 šulinėlių plokščiadugnį ląstelių kultūros plokštelę. Antikūnai buvo nuosekliai praskiedžiami tyrimo terpėje ir po to įpilami po 50 μL / duobutėje, trijose plokštelėse. Plokštelės buvo inkubuojamos kambario temperatūroje 10 min., Prieš pridedant 100 µL nuosekliai praskiestų efektorinių ląstelių (PBMC) 6 . Ląstelių mišiniai su antikūnais buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje 4 valandas drėkintame CO 2 inkubatoriuje. Iš kiekvieno šulinio buvo pašalintas šimtas mikrolitrų supernatanto ir analizuotas matuojant laktato dehidrogenazės (LDH) aktyvumą, išsiskiriantį iš pažeistų tikslinių ląstelių, naudojant CytoTox 96 ® neradioaktyvaus citotoksiškumo testą (Promega, JAV). Efektorius ir (arba) tikslinės ląstelės taip pat buvo įtrauktos į kontrolę. Specifinė lizė buvo apskaičiuota, palyginti su bendra lizės kontrole, gauta inkubuojant tikslines ląsteles su 100 μL 2% Triton X-100.

Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb antiproliferacinis poveikis

A431 ląstelių linija buvo naudojama tiriant antikūnų Fab jungimosi sąlygotą antiproliferacinį aktyvumą. Trumpai tariant, A431 ląstelės buvo inkubuotos su laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb, praskiestu FBS neturinčioje terpėje 72 valandas 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2 . Įpylus MTS tirpalo (G5340, Promega), ląstelės buvo inkubuojamos dar 3 valandas. Kolorimetrinis įvertinimas buvo atliktas 492 nm bangomis, naudojant spektrofotometrą. Pranešama, kad proliferacijos slopinimas yra laukinio tipo EGFR mAb arba bisec-EGFR mAb sukeltas IC50, palyginti su teigiamos kontrolės (Erbitux) sukeltu IC50.

Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb FcR surišimo afinitetas

HEK293 ląstelės, ekspresuojančios žmogaus FcyRa, FcyRIIa, FcyRIIIa-158V arba FcyRIIIa-158F (1 × 106 ląstelių), buvo inkubuotos su laukinio tipo EGFR mAb, bisec-EGFR mAb arba Erbitux (10 μg / ml) arba 1% BSA PBS 1 valandą 4 ° C temperatūroje, tada nuplaunama ir dažoma FITC pažymėtu anti-žmogaus IgG (Sigma, JAV). Ląstelės buvo analizuojamos naudojant šviesos sklaidos parametrus MACS QUANT srauto citometru (Miltenyi Biotec, Vokietija). Buvo naudojami tušti kontroliniai bandymai, nustatant, kad ne daugiau kaip 0, 5% ląstelių būtų rišamos su FITC pažymėtu anti-žmogaus IgG.

Erbitux ir bisec-EGFR mAb α-Gal kiekybinis įvertinimas

Kalibravimo kreivės standartai buvo sukurti nuosekliai praskiedžiant 100 mmol / L D- galaktozės pradinį tirpalą (Sigma). Kiekvienas mėginys buvo sumaišytas su 2 μL (1-3, 4, 6) -galaktozidazės (prozimo) ir praskiedžiamas iki galutinės 1 mg / ml koncentracijos reakcijos buferyje ir inkubuojamas per naktį 37 ° C temperatūroje. Aukštos kokybės analitinis anijonų mainų chromatografinis atskyrimas buvo atliktas naudojant ICS-3000 chromatografijos sistemą (HPAEC, Dionex Corp). Tirpalas praskiedžiamas 2 kartus iki antikūnų koncentracijos 0, 5 mg / ml ir aptinkamas naudojant impulsinį amperometrinį detektorių (PAD), išplaunant per CarboPac PA1 kolonėlę.

Statistinė analizė

Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant SPSS 16.0, skirtą „Windows“ programinei įrangai (SPSS, Čikaga, IL, JAV). Kiekybiniai kintamieji buvo palyginti naudojant Studento t testą ir ANOVA. Visos praneštos P vertės buvo dvipusės, o mažesnės nei 0, 05 P vertės buvo laikomos statistiškai reikšmingomis.

Rezultatai

(Bisec) EGFR mAb ekspresija ir N-glikano analizė

EGFR mAb buvo paimtas iš ląstelių supernatanto, naudojant baltymą A. Visos ląstelės ELISA parodė, kad rekombinantinis laukinio tipo EGFR mAb parodė nuo dozės priklausomą jungtį su A431 ląstelėmis, panašų į Erbitux (1 paveikslas).

Image

Visų ląstelių ELISA. Laukinio tipo EGFR mAb parodė priklausomybę nuo dozės, priklausomai nuo dozės A431 ląstelių, panašų į Erbitux.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

N-glikano analizė atskleidė 7 dominuojančias N-glikano struktūras (smailės) N-glikano profilyje, kai tik 2 smailė ir 7 smailė turėjo pusiau skaldančius GlcNAc likučius 10, 11 . Taigi, tolesniam tyrimui buvo pasirinktas glikane modifikuotas EGFR mAb su padidintu 2 ir 7 smailių (bisec-EGFR mAb) kiekiu. Tipiški laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb N-glikano profiliai yra parodyti 2A – 2B paveiksle. Laukinio tipo EGFR mAb atitinkamuose Fab arba Fc fragmentuose nerasta pusiau skaldančio GlcNAc glikoformo (2A pav.). Kaip ir buvo galima tikėtis, bisec-EGFR mAb fragmentų Fab ir Fc fragmentuose (2B ir 2 smailės), palyginti su plačiojo tipo EGFR mAb, dramatiškai padidėjo (2 ir 7 smailės). N-glikano gausumo skirtumai tarp laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb parodyti 2C – 2E paveiksle. Pažymėtina, kad bisec-EGFR monokloninio antikūno Fc fragmente (2E pav.) Buvo aptiktas tik galaktozilintas glicano (2 smailės, 24%), o glikoformos buvo ir agalaktosilintos, ir bigalaktozilintos, bisec-glcNAc (2 smailė, 21%; 7 smailė, 7%, 21%). aptiktas nepažeistame antikūne (2C paveikslas) ir Fab fragmente (2D paveikslas).

Image

Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb deializuotas N-glikano profiliavimas. Laukinio tipo EGFR mAb (A) pusiau skaidomos GlcNAc glikoformos: agalakto šerdies α-1, 6-fukosilintas pusiau dvisparnis glikanas (NGA2FB, 2 smailė) ir bigalakto šerdies-α-1, 6-fukosilinto pusiau skaidomo dvidešimtmečio glikano. (NA2FB, 7 smailė) nerastas. Tačiau perpjautos GlcNAc kiekis dramatiškai padidėjo tiek Bisec-EGFR mAb (B) Fab, tiek Fc fragmentuose. N-glikano gausos skirtumai tarp laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb yra parodyti C – E ( b P <0, 05, c P <0, 01). Pažymėtina, kad bisec-EGFR mAb Fc buvo aptiktas tik agalaktozilintas divcizuojantis GlcNAc (2 smailė, E), tuo tarpu tiek agalaktosilinti, tiek bigalaktozilinti GlcNAc (2 smailė ir 7 smailė) buvo aptikti nepažeistame antikūnu (C) ir Fab fragmente ( D).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Bisec-EGFR mAb padidino ADCC

Ir laukinio tipo EGFR mAb, ir bisec-EGFR mAb veiksmingai sukėlė A431 ląstelių lizę efektoriaus: taikinio ląstelių (E: T) santykiu 5: 1 ir didesniu (3 paveikslas). Bisec-EGFR mAb parodė stipresnį lizės efektą net esant mažesniems E: T santykiams ( P <0, 05). Esant E: T santykiui 40: 1, bisec-EGFR mAb davė efektyvią specifinę lizę su maždaug tris kartus stipresniu efektu nei laukinio tipo EGFR mAb (89% vs 30%, P <0, 001). Rezultatai parodė, kad EGFR mAb, kuriame buvo didesnis pusiau skaldančios GlcNAc kiekis, ADCC aktyvumas buvo didesnis.

Image

Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb palyginimas ADCC. ADCC buvo įvertintas EGFR teigiamose A431 ląstelėse, esant skirtingiems efektoriaus ir taikinio ląstelių (E: T) santykiams. Palyginti su laukinio tipo EGFR mAb, bisec-EGFR mAb sąlygojo veiksmingą specifinę lizę esant mažesniam E: T santykiui ( P <0, 05). Tuo pačiu E: T santykiu (40: 1) bisec-EGFR mAb lėmė efektyvią specifinę lizę su maždaug tris kartus didesne lize nei tarpininkaujant laukinio tipo EGFR mAb (88% vs 30%, P <0, 001). ). b P <0, 05, c P <0, 01.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Bisec-EGFR mAb turėjo didesnį antiproliferacinį efektyvumą nei laukinio tipo EGFR mAb

EGFR mAb antiproliferacinis aktyvumas yra susijęs su Fab fragmento prisijungimu prie EGFR. Kaip parodyta 4 paveiksle, tiek laukinio tipo EGFR mAb, tiek bisec-EGFR mAb parodė reikšmingą naviko ląstelių augimo slopinimą. 50% slopinamosios Erbitux, laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb koncentracijos vertės buvo 0, 162 (95% PI: 0, 143–0, 184), 0, 178 (95% PI: 0, 159–0, 20) ir 0, 119 (95). % PI: atitinkamai 0, 095–0, 150) mg / ml. Taigi bisec-EGFR mAb buvo maždaug 1, 36 karto stipresnis nei Erbitux, o laukinio tipo EGFR mAb stiprumas buvo panašus į teigiamo kontrolinio (Erbitux).

Image

Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb antiproliferacinis veiksmingumas. Tiek laukinio tipo EGFR mAb, tiek bisec-EGFR mAb parodė reikšmingą naviko ląstelių augimo slopinimą. Laukinio tipo EGFR mAb stiprumas buvo panašus į Erbitux. Bisec-EGFR mAb stiprumas buvo maždaug 1, 36 karto didesnis nei Erbitux.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Bisec-EGFR mAb pagerino afinitetą Fcy receptoriams

Laukinio tipo EGFR mAb, bisec-EGFR mAb ir Erbitux jungimosi su Fcy receptoriais aktyvumas (FcγRs, tiek slopinantys, tiek aktyvinantys FcγRs) buvo tiriami srauto citometrija. Visi EGFR monokloniniai antikūnai, sujungti su žmogaus FcγR, tokia afiniteto eilės tvarka: FcγRIa> FcγRIIIa-158V> FcγRIIIa-158F> FcγRIIa> FcγRIIb (5 paveikslas). Palyginti su laukinio tipo EGFR mAb, bisec-EGFR mAb parodė didesnį surišimo afinitetą su žmogaus FcyRa ( P = 0, 001, 5A pav.) Ir FcyRIIIa-158F ( P = 0, 013, 5B pav.). Bisec-EGFR mAb ir laukinio tipo EGFR mAb jungimosi afinitetai 158V (5C paveikslas), FcyRIIa (5D paveikslas) ir FcyRIIb (5E paveikslas) buvo panašūs.

Image

Laukinio tipo EGFR mAb ir bisec-EGFR mAb jungimosi prie FcyRa-teigiamų ir FcyRIIb-teigiamų ląstelių surišimas. Laukinio tipo EGFR mAb (violetinė linija), bisec-EGFR mAb (mėlyna linija) ir Erbitux (žalia linija) jungimosi afinitetas FcyR atžvilgiu buvo patikrintas srauto citometrija. Geltona linija žymi tuščiąjį valdiklį. EGFR monokloniniai antikūnai, sujungti su FcγR, tokia eilės tvarka: FcγRIa> FcγRIIIa-158V> FcγRIIIa-158F> FcγRIIa> FcγRIIb. Palyginti su laukinio tipo EGFR mAb, bisec-EGFR mAb parodė reikšmingai padidintą surišimo afinitetą FcyRa (A, P = 0, 001) ir FcyRIIIa-158F (B, P = 0, 013). Žmogaus FcyRIIIa-158V (C), FcyRIIa (D) ir FcyRIIb (E) surišimo afinitetai buvo palyginami tarp bisec-EGFR mAb ir laukinio tipo EGFR mAb.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Erbitux ir bisec-EGFR mAb α-Gal kiekybinis įvertinimas

Suskaidytas Erbitux ir bisec-EGFR mAb buvo analizuojami trimis egzemplioriais, o rezultatai buvo išmatuoti pagal kalibravimo kreivę (6 paveikslas). Α-Gal smailė buvo pastebėta maždaug 12 minučių sulaikymo laiko po suvirškinto Erbitux injekcijos (7A pav.). Nustatytas, kad α-Gal molinis santykis Erbitux molekulėje yra 2, 36 ± 0, 09: 1. Maždaug 12 minučių po injekcijos, vartojant bisec-EGFR mAb, nebuvo pastebėta jokio aptinkamo piko, o panašus rezultatas buvo nustatytas laukinio tipo EGFR mAb (duomenys nepateikti).

Image

α-galaktozės standartinės kreivės pastatas. Aukštos kokybės anijonitinės chromatografijos impulsiniu amperometriniu aptikimu (HPAEC-PAD), α-galaktozės standartinė kreivė buvo sukurta nuosekliai praskiedus 100 mmol / L D-galaktozės pradinį tirpalą (Sigma). Suleidus D-galaktozės tirpalą, α-Gal smailė buvo laikoma maždaug 12 minučių sulaikymo metu.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę
Image

Erbitux ir bisec-EGFR mAb α-galaktozės analizė. Suskaidytas Erbitux ir bisec-EGFR mAb buvo analizuojami trimis egzemplioriais, o rezultatai buvo išmatuoti pagal standartinę kreivę. Α-Gal smailė buvo nustatyta suardytame Erbitux (A). Bisec-EGFR mAb nepastebėta α-Gal smailė (B).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Α-Gal smailės varianto sulaikymo trukmė, apytiksliai 12 min., Yra labai jautri mažiems natrio hidroksido koncentracijos pokyčiams ir ištirpusio anglies dioksido kiekiui iš oro, tačiau smailės plotas yra palyginti vienodas tarp skirtingų bandymų .

Diskusija

Terapinių antikūnų sukeltos efektorinės funkcijos labai priklauso nuo angliavandenių liekanos, sujungtos su antikūno baltymu. Todėl buvo sukurta keletas metodų, kaip racionaliai manipuliuoti šiais glikanais ir pagerinti antikūnų biologines funkcijas 13 .

GnT-III yra pagrindinis N-glikano biosintezės fermentas ir katalizuoja GlcNAc perkėlimą iš UDP-GlcNAc, glikozilo donoro, į šerdies β-mannozės liekaną N-sujungtuose oligosachariduose per β1 → 4 ryšį, dėl kurio susidaro perpjautos cukraus grandinės 14 . Pridėta „GlcNAc“ liekana yra vadinama pusiau skaldančia „GlcNAc“. Šios unikalios struktūros pridėjimas slopina kitų N- acetilgliukozaminilo transferazių, tokių kaip GnT-IV ir GnT-V, veikimą, kurios abi yra formuojamos daugiaantenrėms cukraus grandinėms 15 . Taigi, GnT-III yra kritinis fermentas, kuris buvo naudojamas pagerinti terapinių antikūnų funkciją.

Vis daugiau įrodymų rodo, kad N-sujungti oligosacharidai gali paveikti antikūnų molekulių tirpumą, klirenso greitį ir efektorines funkcijas 16 . GnT-III yra idealus fermentas, skirtas manipuliuoti išreikštų baltymų N-glikozilinimu, nes jis kontroliuoja glikozilinimo procesą, blokuodamas 1, 6-FucT, ManII ir GnT-II 17, 18 .

Ankstesni tyrimai parodė, kad per didelis GnTIII ekspresija CHO DG44 ląstelėse lemia ADCC sustiprinimą antineuroblastomos IgG1 18, anti-CD20 IgG1 19 ir antihumaninio interleukino 5 receptoriaus IgG1 20 . Norėdami dar labiau išsiaiškinti, kaip dalijantis GlcNAc vaidina EGFR mAb funkciją, mes viršijome GnTIII EGFR mAb gaminančioje ląstelių linijoje (CHO DG44), kuriai trūksta endogeninės GnTIII ekspresijos 21, ir patvirtinome, kad antikūnas, kuris skaido GlcNAc (bisec-EGFR mAb). sustiprintas ADCC, palyginti su antikūnu, nesudalijant GlcNAc (laukinio tipo EGFR mAb).

Tačiau visi ankstesni tyrimai buvo skirti tik nepažeisto IgG glikozilinimui. Atsižvelgdami į skirtingus IgG Fab ir Fc fragmentų oligosacharidų profilius, atskleistus kai kuriais atvejų kontrolės tyrimais 22, 23, mes taip pat išanalizavome antikūnų Fab ir Fc fragmentų N-glikano profilius. Tiek Bisec-EGFR mAb Fab, tiek Fc fragmentai parodė padidėjusį pusiau skaldantį GlcNAc kiekį, palyginti su laukinio tipo EGFR mAb, tačiau Fab ir Fc fragmentai turėjo skirtingą N-glikano profilį vienas nuo kito. Šis atradimas parodė vietos specifiškumą oligosacharidų grandinių pailgėjimui ant glikoproteino 22 ir gali paaiškinti, kodėl antikūnai, turintys didesnę pusiau skaidomą GlcNAc kiekį, turėjo didesnį ADCC aktyvumą. Pirma, sustiprėjęs poveikis gali būti padidėjęs Fc afinitetas Fcy receptoriams 24 . Antra, pagerėjęs ADCC aktyvumas taip pat gali atsirasti dėl geresnio specifinio Fab prisijungimo prie antigenams teigiamų ląstelių, o tai inicijuoja ADCC procesą ir tikslinių ląstelių lizę 25 .

Atlikdami Fab tarpininkautų ląstelių antiproliferacijos tyrimą, mes nustatėme, kad bisec-EGFR mAb stiprumas buvo 50% didesnis nei laukinio tipo EGFR mAb. Tuo tarpu lyginamasis Fc receptorių jungimosi aktyvumo tyrimas atskleidė, kad bisec-EGFR mAb turėjo didesnį surišimo afinitetą suaktyvintiems žmogaus Fcy receptoriams (daugiausia FcRIa ir 158F-FcRIIIa) nei laukinio tipo EGFR mAb. Visi šie duomenys leidžia manyti, kad dalijantis GlcNAc modifikuotas antikūnas turi didesnį afinitetą tiek aktyvuotoms FcR, tiek EGFR ekspresuojančioms ląstelėms.

Didžioji dalis pastaruoju metu parduodamų terapinių antikūnų yra gaminami CHO ląstelėse, iš dalies dėl šių ląstelių gebėjimo gaminti norimus savybes turinčius baltymus, įskaitant „žmonėms panašius“ glikozilinimo profilius. Specifinės glikano struktūros gali neigiamai paveikti antikūnų saugos profilį. Pvz., Galutinis galaktozės-α-1, 3-galaktozės (α-Gal) antigenas gali reaguoti su cirkuliuojančiais anti-α-Gal antikūnais, kurių yra daugumoje asmenų, ir sukelti anafilaksinį atsaką 26 . Dabar suprantama, kad pelių ląstelių linijos, tokios kaip NS0 arba SP2 / 0, turi būtiną biosintetinį mechanizmą baltymams, turintiems α-Gal epitopus 27, 28, 29, gaminti. Tačiau visuotinai pripažįstama, kad CHO ląstelėms trūksta biosintetinės įrangos glikoproteinų sintezei su α-Gal antigenais 30 . Kai kurie pranešimai atskleidė, kad CHO ląstelės negamina α-1, 3-galaktoziltransferazės 31 ir jų glikozilinimo schema skiriasi nuo Erbitux šeimininko ląstelių linijos Sp2 / 0 modelio. Tačiau iš kitų grupių duomenų nustatyta, kad yra N-acetil-laktozaminido 3-α-galaktoziltransferazės-1 32, kuris yra atsakingas už α-Gal epitopo sintezę, CHO ortologas. Šios grupės taip pat nustatė, kad galinio α-Gal kiekis CHO klonuose svyravo nuo 0 iki 404 pikomolio 1 mg baltymo; todėl ląstelių linijos parinkimas be α-Gal ekspresijos yra svarbus gaminant CHO gautus terapinius antikūnus.

Šiame tyrime mes sukūrėme ir kiekybiškai įvertinome α-Gal koncentraciją bisec-EGFR mAb, naudodami HPAEC-PAD (didelio efektyvumo anijonų mainų chromatografiją, impulsinę amperometrinę aptikimą). Remdamiesi ankstesne ataskaita 33, mes nustatėme, kad Erbitux turi α-Gal epitopą (2, 36 ± 0, 09 μmol / μmol Erbitux), tuo tarpu bisec-EGFR mAb, kurį ištyrėme, neparodė akivaizdžios α-Gal smailės. Nors specifiniai α-Gal lygiai, reikalingi anafilaksinėms reakcijoms sukelti, dar nėra aiškūs, faktas, kad pacientuose yra daug cirkuliuojančių anti-α-Gal antikūnų 9, rodo, kad kontroliuojant α-Gal epitopo lygį EGFR mAb vystymosi metu turi teigiamą poveikį narkotikų saugai. Klinikinių tyrimų metu būtų galima gauti daugiau įrodymų, kaip išvengti padidėjusio jautrumo reakcijai į α-Gal epitopą.

Apibendrinant, mes modifikavome EGFR mAb gliko struktūrą padidindami pusiau skaldančio glikano gausą. Šis bisec-EGFR mAb parodė aukštesnį ADCC ir žemesnį α-Gal lygį nei patvirtintas terapinis antikūnas (Erbitux). Be to, glikano modifikuotas antikūnas parodė didesnį prisijungimą prie FcyRa ir FcyRIIIa-158F. Šie rezultatai rodo, kad anti-EGFR antikūnų glikointegracija galėtų optimizuoti jų veiklą ir sumažinti jų šalutinį poveikį (pvz., Padidėjusį jautrumą). Norint patvirtinti padidėjusį gliko inžinerijos būdu sukurto antikūno veiksmingumą, reikės patvirtinimo in vivo . Šis tyrimas gali pateikti naują, alternatyvią metodiką inžinerinių terapinių monokloninių antikūnų gamybai.

Autoriaus indėlis

Tyrimą sukūrė Chang-hong YI, Can-ping RUAN ir Chun-fang GAO; Chang-hong YI, Xin-yun XU, Yun-peng ZHAO ir Meng FANG atliko tyrimus; Jun JI, Hao WANG ir Xing GU išanalizavo duomenis; Straipsnį parašė Chang-hong YI ir Chun-fang GAO.