Funkcinė sąjunga tarp hippo-japo signalizacijos ir foxo1 tarpina oksidacinį streso atsaką | gamtos komunikacijos

Funkcinė sąjunga tarp hippo-japo signalizacijos ir foxo1 tarpina oksidacinį streso atsaką | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių signalizavimas
  • HIPPO signalizacija

Anotacija

Hippo kelias yra evoliuciškai konservuotas organų dydžio ir navikogenezės reguliatorius, kuris neigiamai reguliuoja ląstelių augimą ir išgyvenimą. Mes pranešame, kad Taip susijęs baltymas (YAP), galutinis hippo kelio veiksnys, sąveikauja su FoxO1 kardiomiocitų branduolyje, taip skatindamas išgyvenimą. YAP ir FoxO1 sudaro funkcinį kompleksą ant katalizatorių ir mangano superoksido dismutazės (MnSOD) antioksidantų genų promotorių ir skatina jų transkripciją. YAP inaktyvacija, sukelta Hippo aktyvacijos, slopina FoxO1 aktyvumą ir mažina antioksidantų genų ekspresiją, o tai rodo, kad Hippo signalizacija moduliuoja FoxO1 tarpininkaujamą antioksidantų atsaką. Kai nustatoma išemija / reperfuzija (I / R) širdyje, Hippo aktyvinimas antagonizuoja YAP-FoxO1, sukeldamas sustiprintą oksidacinio streso sukeltą ląstelių mirtį, nes sumažėja katalazės ir MnSOD reguliavimas. Atvirkščiai, YAP aktyvumo atkūrimas apsaugo nuo I / R traumų. Šie rezultatai leidžia manyti, kad YAP yra branduolinis FoxO1 faktorius, o Hippo kelias neigiamai veikia kardiomiocitų išgyvenimą, nes slopina YAP-FoxO1 funkciją.

Įvadas

Iš pradžių identifikuotas Drosophila melanogaster , Hippo kelias yra evoliuciškai konservuotas organų dydžio reguliatorius, kontroliuojantis tiek ląstelių dauginimąsi, tiek apoptozę 1 . Pagrindiniai žinduolių Hippo kelio komponentai yra sterilios į 20 panašios kinazės (Mst1 ir Mst2; D. hippo homologai), dideli naviko slopintuvai (Lats1 ir Lats2; karpos homologai) ir Taip susijęs baltymas (YAP) bei jo paralogos. baltymų transkripcijos koaktyvatorius su PDZ surišančiu motyvu (TAZ), transkripciniai koaktyvatoriai ir yorkie homologai. YAP / TAZ reguliuoja TEA domenų šeimos (TEAD), p73 ir Runx2 transkripcinį aktyvumą branduolyje, tokiu būdu kontroliuodamas augimą ir žūtį daugelyje ląstelių tipų 1 . Lats1 / 2 suaktyvinimas Mst1 / 2 skatina YAP / TAZ fosforilinimąsi ir branduolinio išmetimą / proteolitinį skilimą, taip neigiamai reguliuodamas YAP / TAZ.

Vis daugiau įrodymų rodo, kad hipopositromo kelio inaktyvavimas lemia nekontroliuojamą epitelio ir kamieninių ląstelių 2, 3 ir kamieninių ląstelių dauginimąsi bei onkogeninę transformaciją 4, 5, 6, kurios abi yra susijusios su YAP 2, 3 hiperaktyvumu. Hippo signalizavimas ir jo YAP reguliavimas keičia širdies dydį, ribodamas kardiomiocitų proliferaciją vaisiaus vystymosi metu 7, 8 . Naujausi įrodymai rodo, kad YAP aktyvavimas taip pat skatina miokardo regeneraciją po miokardo infarkto, skatindamas kardiomiocitų proliferaciją suaugusiųjų širdyse 9, o hippo komponentų, įskaitant Mst1 ir (arba) Lats2, aktyvinimas suaugusiojo širdyje skatina kardiomiocitų apoptozę 10, 11 . Pogimdyvinis YAP ištrynimas sukelia pelių širdies disfunkciją ir priešlaikinę mirtį 12, o tai rodo, kad priešakyje esantis Hippo kelias skatina ląstelių žūtį, o YAP skatina ląstelių išgyvenimą postmitozinėse širdyse. Reikia pažymėti, kad molekulinis mechanizmas, per kurį YAP skatina ląstelių išgyvenimą kardiomiocituose, nežinomas. Atsižvelgiant į tai, kad YAP veikia kaip transkripcinis faktorius, svarbu nustatyti transkripcijos faktorių (-ius), per kurį YAP skatina kardiomiocitų išgyvenimą pogimdyminėse širdyse.

Hippo signalizacijos kelias vaidina svarbų vaidmenį tarpininkaujant oksidacinio streso sukeltai ląstelių mirčiai. Pavyzdžiui, Mst1 tarpininkauja neuronų ląstelių mirčiai reaguojant į H 2 O 2 (nuoroda 13). Išemija / reperfuzija (I / R), kuri, kaip žinoma, gali sukelti miokardo pažeidimą ir širdies disfunkciją, sukelia padidėjusį reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) susidarymą ir kardiomiocitų mirtį per nuo Mst1 priklausomus mechanizmus 10 . Įdomu tai, kad YAP stimuliacija apsaugo nuo H 2 O 2 sukeltos kardiomiocitų mirties 12, o kai žeminamas YAP reguliavimas, tai rodo priežastinį YAP dalyvavimą kardiomiocitų išgyvenime oksidacinio streso metu. Tačiau molekulinis mechanizmas, per kurį YAP tarpininkauja kardiomiocitų išgyvenimui, dar turi būti išaiškintas.

FoxO1 priklauso transkripcijos veiksnių grupei, turinčiai konservuotą DNR surišimo domeną, vadinamą „šakutės galvute“ 14 . FoxO1 vaidina pagrindinį vaidmenį reguliuojant ląstelių ciklą, apoptozę, atrofiją, autofagiją ir energijos homeostazę 14, 15 . FoxO1 taip pat perduoda apsauginį poveikį nuo oksidacinio streso, reguliuodamas antioksidantų genus, įskaitant katalazę ir MnSOD 16, 17 . Dėl sąlyginio FoxO1 ištrynimo širdyje padidėja ląstelių žūtis ir sumažėja širdies veikla reaguojant į miokardo infarktą, o tai rodo, kad FoxO1 skatina kardiomiocitų išgyvenimą reaguojant į oksidacinius dirgiklius 18 . Tačiau signalizacijos kaskados, reguliuojančios FoxO1 aktyvumą I / R metu, dar nėra suprantamos.

Čia parodome, kad YAP su FoxO1 sudaro funkcinį kompleksą tarpininkaujant antioksidanto geno raiškai reaguojant į I / R širdyje. Hippo signalizacijos aktyvavimas slopina YAP-FoxO1 kompleksą ir skatina ląstelių žūtį reaguojant į oksidacinį stresą. Mūsų rezultatai rodo, kad FoxO1 veikia kaip YAP pasroviui nukreiptas kardiomiocitų išgyvenimas.

Rezultatai

YAP veikia kaip transkripcinis FoxO1 aktyvatorius

Anksčiau parodėme, kad sumažėjęs YAP reguliavimas sukelia padidėjusį ląstelių jautrumą ROS ir inkstuose sukelia kardiomiocitų mirtį 12 . Nuosekliai dėl YAP ištrynimo širdyje sukeltas ROS kaupimasis pelės širdyje (papildomas 1a, b pav.) Rodo, kad YAP dalyvauja redokso homeostazės reguliavime. FoxO1 transkripciniu būdu padidina antioksidantų genų reakciją į oksidacinį stresą ir apsaugo nuo ląstelių žūties 16, 17 . Atsižvelgiant į tai, kad Hippo-YAP signalizacija tarpina ląstelių mirtį reaguodama į oksidacinį stresą, mes iškėlėme hipotezę, kad FoxO1 gali funkciškai sąveikauti su Hippo keliu.

Mes atlikome imunocitochemijos eksperimentus ir nustatėme, kad YAP ir FoxO1 yra lokalizuotos branduolyje (1a pav.). Naudodamiesi in situ artumo ligacijos tyrimu, mes taip pat pastebėjome, kad endogeniniai YAP ir FoxO1 fiziškai sąveikauja naujagimių kardiomiocitų branduoliuose in vitro ir suaugusiųjų kardiomiocituose pelės širdyje in vivo (1b pav. Ir papildomas 2a pav.). Bendro imunoprecipitacijos tyrimai patvirtino, kad endogeninis YAP susijęs su FoxO1 kardiomiocituose (1c pav.), O glutationo S- transferazės (GST) išsitraukimo tyrimai atskleidė, kad YAP tiesiogiai jungiasi su FoxO1 (1d pav.). YAP nuo dozės priklausomas stimuliuojamas FoxO1 transkripcijos aktyvumas, įvertintas naudojant FoxO1-luciferazės reporterio geną (FoxO1-luc), kurį varo trys kanoniniai FoxO1 atsako elementai (1e pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad YAP veikia kaip transkripcinis FoxO1 aktyvatorius. Kadangi FoxO1 ir FoxO3 širdies funkcijos sutampa, mes ištyrėme, ar YAP taip pat sąveikauja su FoxO3. Bendro imunoprecipitacijos tyrimai parodė, kad YAP nebuvo susijęs su FoxO3 (papildomas 2b pav.), Rodantis izoformos specifinę sąveiką tarp YAP ir FoxO1. Toliau mes ištyrėme, kuri YAP sritis yra būtina fizinei sąveikai su FoxO1 ir transkripcijai suaktyvinti. Ser 94 mutacija TEAD surišančioje vietoje su alaninu (S94A) žymiai sumažino sąveiką tarp YAP ir FoxO1 ir iš dalies susilpnino YAP tarpininkaujant FoxO1 aktyvaciją (papildomas 2c, d pav.). Nors N-galo YAP, neturėdamas transkripcijos aktyvavimo domeno, esančio C-terminale, neturėjo įtakos YAP surišimui (papildomas 2c pav.), Jis taip pat susilpnino YAP tarpininkaujantį FoxO1 aktyvavimą (papildomas 2d pav.). Kita vertus, WW domeno ištrynimas YAP (AWW) neturėjo įtakos nei FoxO1 surišimui, nei YAP tarpininkaujamam FoxO1 aktyvavimui (papildomas 2c, d pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad tiek TEAD rišanti vieta, tiek YAP C-terminalo transaktyvacijos domenas yra svarbūs YAP tarpininkaujant FoxO1.

Image

a ) Buvo ištirta FoxO1 ir YAP lokalizacija. Miocitai buvo nudažyti FoxO1 (raudona), YAP (žalia) ir DAPI (mėlyna). Svarstyklės, 10 μm. ( b ) Ląstelės buvo dažytos antibakteriniu antioksidaciniu anti-FoxO1 ir (arba) pelės anti-YAP antikūnu, o baltymų ir baltymų sąveika tarp FoxO1 ir YAP (raudoni taškai) buvo nustatyta naudojant antrinius artumo zondus, anti-Rabbit-PLUS ir anti-TAB. - Pelė-MINUS, naudojant „Duolink“ in situ PLA aptikimo rinkinį. Svarstyklės, 10 μm. ( c ) Naujagimių kardiomiocitų lizatai buvo paruošti ir imunoprecipiduoti naudojant FoxO1 antikūną arba kontrolinį IgG. Buvo tiriama FoxO1 ir YAP sąveika. Taip pat parodomi įvestų lizato kontrolinių elementų imunoblotai (5% įvestų medžiagų). ( d ) Tiesioginei YAP ir FoxO1 sąveikai buvo naudojami rekombinantiniai GST-YAP ir myc-FoxO1. ( e ) Kardiomiocitai buvo kartu transfekuoti su 1 μg FoxO1-luc vektoriaus ir nurodytais ekspresijos vektoriais. Po 48 val. Buvo išmatuotas luciferazės aktyvumas, parodant, kad YAP padidino FoxO1 transkripcijos aktyvumą (* P <0, 05, palyginti su tuščiu vektoriu, n = 3). ( f ) Lats2 ekspresija buvo slopinama, o Lats2 numušimas padidino FoxO1 aktyvumą. Kardiomiocitai buvo transfekuoti 1 μg FoxO1-luc vektoriaus. Po 6 valandų miocitai buvo persodinti nurodytu virusu ir buvo išmatuotas luciferazės aktyvumas (* P <0, 05, palyginti su LacZ ar sh-con, n = 3). Duomenys rodomi kaip vidurkiai ± sem P vertės buvo nustatytos naudojant nesuporuotų Studentų t- testą.

Visas dydis

„Lats2-YAP“ ašis reguliuoja „FoxO1“ aktyvumą

„Lats2“ fosforilindamas YAP prie Ser 127, skatina branduolio atskirtį ir citoplazminį YAP kaupimąsi, taip sukeldamas jo inaktyvaciją 19 . Norėdami išsiaiškinti, ar hippo signalizacijos kelias reguliuoja „FoxO1“ per YAP priklausomą mechanizmą, kardiomiocituose perregistravome arba Mst1, arba Lats2, nes Mst1 arba Lats2 aktyvacija sukelia stiprų hippo fenotipą širdyje 10, 11, būtent kardiomiocitų skatinimą. apoptozė ir kompensacinės hipertrofijos slopinimas. Dėl per didelio Mst1 ekspresijos pagerėjo „Lats2“ Ser 872 ir Thr 1041 fosforilinimas, nurodant visišką „Lats2“ aktyvaciją (nuoroda 20), taip pat YAP Ser 127 fosforilinimas (papildomas 3a pav.). „Lats2“ daugiausia lokalizuotas branduolyje (papildomas 3b, c pav.) Ir dėl „Lats2“ perdėto išraiškos sukeltas YAP branduolinis išskyrimas (papildomas 3d pav.), Kas rodo, kad „Lats2“ aktyvacijos pakanka, kad būtų slopinamas YAP aktyvumas kardiomiocituose. Liuciferazės tyrimai atskleidė, kad pernelyg didelis „Lats2“ ekspresija slopino „FoxO1“ transkripcinį aktyvumą, o „Lats2“ mažesnis reguliavimas padidino (1f pav.). FoxO1 transkripcinis aktyvumas visų pirma priklauso nuo daugelio aminorūgščių liekanų fosforilinimo būklės 14 . Norint atmesti galimybę, kad „Lats2“ reguliuoja „FoxO1“ aktyvumą tiesioginio fosforilinimo būdu, buvo atliktas in vitro kinazės tyrimas, naudojant substratą „myc“ pažymėtą „FoxO1“. Mes pastebėjome, kad FoxO1 nebuvo fosforilinamas esant konstituciškai aktyviajai „Lats2“ formai (papildomas 4a pav.). Svarbu tai, kad sumažėjęs YAP reguliavimas visiškai panaikino „FoxO1“ transkripcijos aktyvumo padidėjimą, stebimą vien „Lats2“ numušimo atveju (papildomas 4b, c pav.). Todėl šie duomenys leidžia manyti, kad FoxO1 transkripcinį aktyvumą reguliuoja „Lats2-YAP“ ašis. Kadangi FoxO1 fosforilinimas Thr 24 ir Ser 256, veikiantis Akt, sukelia 14-3-3 surišimą ir citozolinę FoxO1 translokaciją (nuorodos 21, 22), toliau mes ištyrėme, ar Lakt2 aktyvacijos sukelta FoxO1 transkripcinė inaktyvacija yra tarpininkaujama Akt. Kardiomiocituose per didelis Lats2 ekspresija nepaveikė nei Akt aktyvumo, įvertinto jo Ser 473 fosforilinimo lygiu, nei FoxO1 fosforilinimo lygio Thr 24 ir Ser 256 (papildomas 4d pav.). Nors per didelis YAP ekspresija sukėlė Akt aktyvaciją, mes nepastebėjome reikšmingų fosforilinto FoxO1 lygio pokyčių (papildomas 4e pav.), Rodantis, kad hipopos signalizacija reguliuoja FoxO1 per Akt nepriklausomus mechanizmus.

YAP-FoxO1 kompleksas tarpininkauja antioksidantų genų ekspresijai

Siekiant ištirti, ar YAP dalyvauja FoxO1 tarpininkaujant antioksidantų genų ekspresijai, buvo atliktas chromatino imunoprecipitacija (ChIP), naudojant FoxO1 ir YAP antikūnus H9C2 mioblastų ląstelėse. Katalazės ir MnSOD promotorių regionų žemėlapių sudarymas parodė, kad kiekvienas promotorius turi du konservuotus FoxO1 surišimo motyvus (2a pav.), Kurie abu yra reikalingi FoxO1 surišimui ir transkripcijos aktyvavimui reaguojant į oksidacinį stresą 16, 17 . Po ChIP su YAP antikūnu, PGR analizei buvo naudojami pradmenų rinkiniai, skirti aptikti FoxO1 DNR rišančias vietas abiejuose promotoriuose. Šie eksperimentai atskleidė, kad YAP buvo prie FoxO1 surišimo motyvų tiek katalazės, tiek MnSOD promotoriaus regionuose (2b pav.). Kaip ir tikėtasi, ChIP su FoxO1 antikūnais parodė, kad FoxO1 jungiasi prie tų pačių regionų. Siekiant patvirtinti, kad YAP yra kartu su FoxO1 ant katalizatorių ir MnSOD promotorių, buvo atlikti nuoseklūs ChIP. Pirmasis ChIP buvo atliktas naudojant FoxO1 antikūną, o antrasis ChIP buvo atliktas naudojant arba YAP, arba FoxO1 antikūną, naudojant chromatiną, išplautą iš pirmojo ChIP. Po antrojo ChIP, tiek YAP, tiek FoxO1 vis dar buvo sujungti su FoxO1 surišančiais motyvais FoxO1 – chromatino komplekse (2b pav.), Patvirtindami, kad YAP ir FoxO1 yra tose pačiose katalazės ir MnSOD promotoriaus vietose. Norint ištirti, ar YAP ir FoxO1 sudaro funkcinį kompleksą antioksidantų genų ekspresijai reguliuoti, buvo sukurtas luciferazės vektorius, kuriame yra minimalus katalizatoriaus promotoriaus regionas (catalase-luc), įskaitant vieną FoxO1 DNR rišančią vietą, esančią šalia transkripcijos pradžios vietos. . Bendras FoxO1 transfekavimas su katalaze-luc padidino luciferazės aktyvumą, tačiau šis sustiprinimas buvo visiškai panaikintas dėl YAP numušimo. YAP transfekcija kartu su katalaze-luc taip pat padidino luciferazės aktyvumą, kurį visiškai panaikino FoxO1 išeikvojimas (2c pav.). Šie rezultatai rodo, kad YAP yra svarbus FoxO1 faktorius ir reikalingas norint išlaikyti jo transkripcinį antioksidanto geno ekspresijos aktyvavimą.

Image

a ) Katalazės ir MnSOD promotoriai turi du potencialius FoxO1 DNR surišančius elementus, vadinamus DBE1 ir DBE2. ( b ) YAP ir FoxO1 jungimosi prie katalazės ir MnSOD promotorių ChIP analizė. Iš baltymų surištas chromatinas buvo paruoštas iš H9C2 mioblastų ir imuniniu būdu nusodintas YAP arba FoxO1 antikūnais. Atliekant nuoseklų ChIP, iš baltymų surištas chromatinas pirmiausia buvo imunoprecipituotas naudojant FoxO1 antikūną. Tada antrasis ChIP buvo atliktas chromatinui, išplaunamam iš pirmojo ChIP, imunoprecipicitavus jį YAP antikūnu. Normalus IgG buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Imuninę nusėdusią DNR buvo analizuojama PGR, naudojant pradmenis, apimančius kiekvieną DBE. Rezultatai atspindi trijų atskirų eksperimentų rezultatus. ( c ) Minimalus katalazės promotorius, kuriame yra FoxO1 DBE2, buvo klonuotas į luciferazės vektorių. Kardiomiocitai buvo kartu transfekuoti su katalazės-luc vektoriu ir nurodytais ekspresijos vektoriais. Po 6 h miocitai buvo persodinti nurodytu virusu ir po 72 h buvo išmatuotas luciferazės aktyvumas (* P <0, 05, palyginti su tuščiu vektoriu, # P <0, 05, palyginti su 20 ng FoxO1 ar YAP, Δ P <0, 05, palyginti su 50 ng FoxO1). arba YAP, n = 3). Duomenys rodomi kaip vidurkis ± sem. P vertės buvo nustatytos naudojant vienpusį ANOVA, po kurio sekė Newmano ir Keulso palyginimo testas.

Visas dydis

Hippo signalizacija slopina antioksidantų genų ekspresiją

Toliau mes ištyrėme Hippo signalizacijos kelio vaidmenį reguliuojant katalazės ir MnSOD ekspresiją nepažeistose ląstelėse, nes pakanka pernelyg didelės „Lats2“ ekspresijos, kad būtų slopinama FoxO1 tarpininkauta transkripcija (1f pav.). ChIP tyrimai atskleidė, kad per didelis Lats2 ekspresija žymiai sumažino YAP kiekį, esantį FoxO1 rišančiose vietose katalazės ir MnSOD promotoriaus regionuose (3a pav.). Be to, tiek katalazės, tiek MnSOD mRNR ir baltymų lygis sumažėjo dėl „Lats2“ perraiškos (3b pav., C). Kita vertus, sumažėjęs „Lats2“ reguliavimas padidino tiek katalazės, tiek MnSOD mRNR ir baltymų lygius (3b pav., C). Katalazės-luc aktyvumo padidėjimas, pastebėtas „Lats2“ knockdown ląstelėse, buvo visiškai panaikintas tuo pačiu metu sumažinant YAP arba FoxO1 reguliavimą (3d pav.). Šie duomenys rodo, kad Lats2-YAP-FoxO1 ryšys yra būtinas norint reguliuoti šių antioksidantų fermentų ekspresiją. Tiek katalazė, tiek MnSOD gali veiksmingai paversti superoksidą ir vandenilio peroksidą į vandenį, kad būtų išvengta ROS kaupimosi ir apsaugota nuo ląstelių mirties nuo oksidacinio streso. Lats2 slopinimas sumažino miocitų mirtį reaguojant į gydymą H 2 O 2, bet ne tada, kai ląstelės buvo kartu transdukuojamos su adenovirusu, turinčiu FoxO1 trumpų plaukų smeigtukų RNR (ad-sh-FoxO1) arba YAP trumpų plaukų segtukų RNR (ad-sh-YAP). (3e pav. Ir papildomas 4f pav.), Teigdami, kad „Lats2“ aktyvacija blokuoja antioksidantų gynybą ir sukelia ląstelių žūtį slopindama YAP-FoxO1. Visi šie duomenys rodo naujovišką mechanizmą, kurio metu hippo signalo aktyvacija reguliuoja ląstelių mirtį, slopindama FoxO1 tarpininkaujamą antioksidantinį atsaką oksidacinio streso metu.

Image

( a ) ChIP analizė in vivo YAP prisijungimo prie katalazės ir MnSOD promotorių. H9C2 mioblastai buvo transdukuoti nurodytu adenovirusu 48 valandas. Buvo paruoštas baltymas, susijęs su chromatinu, ir imunoprecipifuotas IgG ir YAP antikūnais. Santykinis promotorių užimtumas buvo palygintas su įvesties signalu (* P <0, 05 palyginti su LacZ, n = 3). ( b, c ) sumažėjo „Lats2“ raiška, o „Lats2“ numušimas padidino katalazės ir MnSOD baltymų bei mRNR lygį. Kardiomiocitai buvo persodinti nurodytu adenovirusu. ( b ) Katalazės ir MnSOD mRNR lygis buvo ištirtas kiekybiniu RT – PGR. Santykinis kopijų skaičius buvo normalizuotas naudojant β-aktiną (* P <0, 05 palyginti su LacZ arba sh-con, # P <0, 01 palyginti su LacZ, n = 4). c ) Lizatai buvo naudojami katalazės, MnSOD ir α-tubulino imunoblotų analizei. Rezultatai atspindi trijų atskirų eksperimentų rezultatus. ( d ) Kardiomiocitai buvo transfekuoti katalazės-luc vektoriu. Po 6 h miocitai buvo persodinti nurodytu virusu ir po 72 h buvo išmatuotas luciferazės aktyvumas (* P <0, 05, palyginti su sh-con / sh-Lats2 (-), # P <0, 05, palyginti su sh-con / sh-Lats2). (+), n = 3). e ) Dėl nepakankamo „Lats2“ reguliavimo išvengta H 2 O 2 sukeltų ląstelių mirties. Kardiomiocitai, persodinti nurodytu adenovirusu, buvo gydomi 100 μM H 2 O 2 ir tirtos TUNEL teigiamos ląstelės (* P <0, 05 palyginti su sh-con / sh-Lats2 (-), # P <0, 05 palyginti su sh-con / sh -Lats2 (+), n = 4). Duomenys parodomi kaip vidurkiai ± sem P vertės buvo nustatytos naudojant nesuporuotą Studentų t- testą arba vienpusį ANOVA, po kurio sekė Newmano – Keulso palyginimo testas.

Visas dydis

Hippo aktyvacija padidina oksidacinį stresą in vivo

Toliau siekėme toliau įvertinti savo pastebėjimų fiziologinius padarinius. Reperfuzijos sužalojimas įvyksta, kai kraujo tiekimas atnaujinamas po išemijos laikotarpio ir sukelia ląstelių mirtį bei disfunkciją kritiniuose organuose, įskaitant širdį ir smegenis 23 . Reperfuzijos žalą daugiausia sukelia oksidacinis stresas 23 . Įrodyta, kad priešakyje esantis hippo kelio kinazė Mst1 sumažina širdies ir raumenų sužalojimus ir sušvelnina neuronų ląstelių mirtį 10, 13 . Imunobloto rezultatai atskleidė, kad I / R stipriai skatina Mst1, Lats2 ir YAP fosforilinimąsi (4a pav.), Kas rodo, kad Hippo signalizacija yra aktyvuota širdies ir vaizdo įrašų I / R metu. Po I / R laukinio tipo (WT) pelėms buvo nustatytas padidėjęs YAP fosforilinimas serume 127 ir sumažėjęs YAP kiekis branduolinėje frakcijoje, kurių poveikis buvo visiškai susilpnintas dominuojančių-neigiamų lat2 transgeninių pelių (Tg-DN-Lats2) pelėse. (4a, b pav.), Kuriame Lats2 kinazės aktyvumas yra visiškai slopinamas 11, rodo, kad endogeninis Lats2 tarpininkauja Ser 127 fosforilinimui ir YAP inaktyvavimui reaguojant į I / R. Katalazės ir MnSOD baltymų kiekis reikšmingai sumažėjo WT pelėse, bet ne Tg-DN-Lats2, tai rodo, kad Hippo aktyvinimas sumažino antioksidantų geno ekspresiją I / R metu in vivo (4c pav.). Bendras širdies homogenatų antioksidacinis pajėgumas po I / R taip pat dramatiškai sumažėjo WT pelėms, bet ne Tg-DN-Lats2 pelėms (4d pav.). Toliau mes ištyrėme oksidacinio streso sukeltos žalos laipsnį, esant I / R. Audinių mėginiai buvo dažomi anti-8-hidroksi-2′-deoksiguanozino (8-OHdG) antikūnais, kurie yra oksidacinio DNR pažeidimo žymeklis. Imunohistochemijos rezultatai parodė, kad Tg-DN-Lats2 pelėms buvo mažesnis ROS sukeltas DNR pažeidimas nei WT pelėms po I / R (papildomas 5a pav.). Be to, miokardo oksiduoto glutationo ir redukuoto glutationo (GSSG / GSH) santykis, tarpląstelinio redokso būklės rodiklis, žymiai padidėjo WT pelėms, bet ne Tg-DN-Lats2 pelėms (papildomas 5b pav.). Miokardo infarkto / rizikos zonos (AAR) dydis, rodantis nekrozinių ląstelių žūtį, taip pat apoptozės TUNEL (galutinio dezoksinukleotidiltransferazės dUTP slapyvardžio pabaigos žymėjimas) skaičius - Tg-DN- teigiamos ląstelės buvo žymiai mažesnės. Lats2 nei WT pelėms (papildomas 6a, b pav.). Be to, tas pats fenotipas pastebėtas pelių modeliuose, iš kurių širdžiai būdinga lata2 (Lats2-CKO) delecija (papildomas 7a, b pav.). Toliau vertindami širdies I / R sužalojimus, naudodamiesi ex vivo modeliais, pastebėjome panašų Tg-DN-Lats2 pelių infarkto dydžio sumažėjimą (papildomas 8a pav.), Kurį lydėjo pagerėjusi funkcija reperfuzijos atsigavimo fazėje, kaip įvertinta. kairiojo skilvelio (LV) sukurtas slėgis (papildomas 8b pav.). Apibendrinant, šie duomenys suteikia tvirtų įrodymų, kad Hippo signalizacijos suaktyvinimas sukelia oksidacinį streso sukeltą sužalojimą I / R metu.

Image

a ) tipiniai imunoblotai, rodantys, kad I / R suaktyvino hippo signalizaciją. Paliktos WT pelės 45 minutes buvo išemijos šalinamos, po to - 2 valandas pakartotinės infuzijos. Implantų analizei atlikti p-Lats2 (T1041 ir S872), Lats2, p-Mst1 (Thr183) ir Mst1 implantai buvo naudojami apgamo ir išeminio ploto mėginiuose. Dešinėje, Tg-DN-Lats2 ir kontrolinėse WT pelėse 45 minutes buvo išemija, po to - 2 valandos reperfuzijos. Implantų analizei p-YAP (S127), YAP, Lats2 ir GAPDH nustatyti buvo naudojami apgamo ir išeminės srities mėginiai. Tg-DN-Lats2 sumažino YAP fosforilinimo pagerėjimą I / R metu, patvirtindama, kad Lats2 aktyvacija buvo slopinama. ( b ) Tg-DN-Lats2 ir kontrolinės WT pelės buvo paveiktos išemijos 45 minutes, po to 2 valandas reperfuzijos. Buvo paruoštos širdies homogenatų citozolinės ir branduolinės frakcijos, kurioms atlikta p-YAP (S127), YAP, Lats2, GAPDH ir lamino A / C imunoblotinė analizė (SE, trumpa ekspozicija; LE, ilga ekspozicija). ( c, d ) „Lats2“ suaktyvinimas sumažino antioksidacinių baltymų kiekį ir padidino oksidacinį stresą, esant I / R. Tg-DN-Lats2 ir kontrolinės WT pelės 45 minutes buvo išemijos priežastys, po to 24 valandas reperfuzija. c ) Katalazės, MnSOD ir α-tubulino imunoblotų analizei atlikti buvo naudojami apgamo ir išeminio ploto mėginiai. ( d ) Buvo ištirtas miokardo antioksidacinis pajėgumas (* P <0, 05, palyginti su WT / fiktyviu, # P <0, 05, palyginti su WT / I / R, n = 4). Duomenys pateikiami kaip vidutinės ± sem P vertės, kurios buvo nustatytos naudojant vienpusį ANOVA, po kurio sekė Newmano – Keulso palyginimo testas.

Visas dydis

YAP-FoxO1 komplekso slopinimas sukelia I / R žalą

Jei YAP-FoxO1 komplekso aktyvumas yra būtinas tarpininkaujant ląstelių išgyvenimui I / R metu, šio komplekso slopinimas turėtų panaikinti apsauginį poveikį Tg-DN-Lats2 pelėms, o šio komplekso reaktyvinimas turėtų išgelbėti WT peles nuo I / R traumų. Norint patikrinti šią hipotezę, į LV buvo įšvirkštas „ad-sh-FoxO1“ ir po 5 dienų buvo atliktas įvestis / įvestis. Adenoviruso injekcijos efektyvumą patvirtino pelių, švirkštų Ad-LacZ, visos širdies β-galaktozidazės dažymas (papildomas 6c pav.). „Ad-sh-FoxO1“ injekcijos efektyvumas buvo patvirtintas imunoblotu (papildomas 6d pav.). Palyginti su kontrolinio shRNR adenoviruso (ad-sh-con) injekcijomis, ad-sh-FoxO1 injekcija žymiai padidino Tg-DN-Lats2 pelių infarkto dydį iki tokio paties lygio kaip WT pelėms (5a pav.). „FoxO1“ numušimas taip pat žymiai padidino Tg-DN-Lats2 apoptozę reaguojant į I / R (5b pav.). Kadangi YAP turi tiesioginį teigiamą poveikį FoxO1 tarpininkaujamo antioksidanto atsako reguliavimui, taip pat buvo tiriama, ar egzogeninė YAP ekspresija galėtų išgelbėti I / R sukeltus miokardo pažeidimus. Adenovirusas, turintis WT YAP, arba konstituciškai aktyvuotas YAP mutantas (S127A), buvo įšvirkšti į miokardą prieš 3 dienas prieš I / R (papildomas 6e pav.) Ir ištirtas infarkto dydis. Palyginti su LacZ injekcijomis, tiek WT, tiek S127A YAP reikšmingai susilpnino I / R sukeltą katalazės ir MnSOD reguliavimą (5c pav.), Tačiau nepaveikė endotelio azoto oksido sintazės (eNOS) aktyvumo (papildomas 6f pav.). Be to, injekcija adenoviruso, turinčio WT arba S127A YAP, sumažino miokardo infarkto dydį ir kardiomiocitų apoptozę reaguojant į I / R (5d pav., E), rodo, kad YAP-FoxO1 atstatymas apsaugo nuo ląstelių žūties reaguojant į oksidacinį stresą, kurį sukelia Aš / R.

Image

( a, b ) Išgrynintas adenovirusas (1x109 opu) buvo švirkščiamas tiesiogine Tg-DN-Lats2 ir WT pelių į LV laisvą sieną (dvi vietos, 25 μl kiekvienoje vietoje) injekcijomis. I / R operacija buvo atlikta praėjus 5 dienoms po injekcijos. Pelėms 45 minutes buvo išemija, po to - 24 valandos reperfuzijos. a ) Bendras LV audinių pjūvių vaizdas po Alcian blue ir trifeniltetrazolio chlorido dažymo rodo, kad ad-sh-FoxO1 injekcija panaikino apsaugą, stebėtą Tg-DN-Lats2 pelėms. Buvo atliktas kiekybinis miokardo infarkto ploto / AAR (% infarkto dydžio / AAR) matavimas (* P <0, 05, palyginti su WT / sh-con, # P <0, 05, palyginti su Tg-DN-Lats2 / sh-FoxO1, n = 8). Svarstyklės, 1 mm. b ) LV miokardo skyriai buvo dažomi TUNEL. TUNEL teigiamų miocitų skaičius buvo išreikštas procentais nuo visų branduolių, aptiktų DAPI dažant (* P <0, 05, palyginti su WT / sh-con, # P <0, 05, palyginti su Tg-DN-Lats2 / sh-FoxO1, n = 5–). 8). ( c - e ) Išgrynintas adenovirusas (1 × 10 9 opu) buvo suleistas tiesiogine injekcija į laisvosios dalelės sienelę (dvi vietos, po 25 μl kiekvienoje vietoje). I / R operacija buvo atlikta praėjus 3 dienoms po injekcijos. Pelėms buvo taikoma 30 minučių išemija, po to - 24 valandos reperfuzijos. c ) Katalazės, MnSOD ir GAPDH imunoblotų analizei atlikti buvo naudojami apgamo ir išeminio ploto mėginiai. FLAG taip pat buvo naudojamas tiriant egzogeninę YAP geno raišką. Parodyta katalazės ir MnSOD densitometrinių matavimų statistinė analizė (* P <0, 05 palyginti su LacZ / fiktyvus, # P <0, 05 palyginti su LacZ / I / R, n = 5). d ) Bendras LV audinių pjūvių vaizdas po Alcian blue ir trifeniltetrazolio chlorido dažymo rodo, kad YAP arba YAP S127A injekcijos sumažino infarkto plotą. Buvo atliktas kiekybinis miokardo infarkto ploto / AAR (% infarkto dydžio / AAR) matavimas (* P <0, 05, palyginti su LacZ, n = 8). Svarstyklės, 1 mm. e ) LV miokardo skyriai buvo dažomi TUNEL. TUNEL teigiamų miocitų skaičius buvo išreikštas procentais nuo visų branduolių, aptiktų DAPI dažant (* P <0, 05, palyginti su LacZ, n = 5–6). Duomenys pateikiami kaip vidutinės ± sem P vertės, kurios buvo nustatytos naudojant vienpusį ANOVA, po kurio sekė Newmano – Keulso palyginimo testas.

Visas dydis

Diskusija

Mūsų rezultatai rodo, kad tarp Hippo-YAP signalizacijos kelio ir FoxO1 yra kryžminis pokalbis, reguliuojant ląstelių mirtį reaguojant į oksidacinį stresą (6 pav.). Mes išsiaiškinome, kad YAP yra naujas FoxO1 koaktyvatorius ir kad YAP-FoxO1 kompleksas jungiasi prie katalazės ir MnSOD promotorių - žingsnį, būtiną šių antioksidantų genų ekspresijai. Hippo kelio aktyvinimas I / R metu slopina YAP-FoxO1 kompleksą ir slopina FoxO1 tikslinių genų ekspresiją, taip padidindamas oksidacinį stresą ir skatindamas kardiomocitų ląstelių žūtį.

Image

Kardiomiocituose YAP ir FoxO1 sudaro funkcinį kompleksą, kuris tarpininkauja katalazės ir MnSOD ekspresijai. Reaguodama į I / R, hippo signalo perdavimo kaskados suaktyvinimas sukelia YAP inaktyvaciją, kuri sukelia antioksidantų geno slopinimą, ROS kaupimąsi ir ląstelių žūtį.

Visas dydis

FoxO1 aktyvumą reguliuoja posttransliacinės modifikacijos, įskaitant fosforilinimą ir acetilinimą 15 . Akt fosforilina FoxO1 Thr 24 ir Ser 256 vietose, tokiu būdu skatindamas FoxO1 branduolinį išėjimą. Tačiau per didelis „Lats2“ ekspresija sukelia YAP branduolinį atskirtį, nepaveikdamas nei Akt aktyvumo, nei FoxO1 fosforilinimo prie Thr 24 / Ser 256 (papildomi 3d ir 4d pav.). Anksčiau mes parodėme, kad per didelis YAP ekspresija naujagimių kardiomiocituose skatina Akt aktyvaciją, taip užkertant kelią kardiomiocitų mirčiai 12 . Tačiau to nepadarė FoxO1 fosforilinimas Akt vietose. Šie rezultatai leidžia manyti, kad FoxO1 reguliuojamas YAP ir nepriklauso nuo Akt tarpininkaujamo fosforilinimo.

„Sirt1“ atliktas FoxOs decetilinimas taip pat skatina ląstelių išgyvenimą streso metu 24 . Anksčiau mes parodėme, kad „Sirt1“ deacetiliuoja „FoxO1“ ir palengvina jo branduolio persikėlimą, tokiu būdu sukeldamas apsauginį poveikį nuo širdies ir raumenų traumos I / R 25 . Čia parodyta, kad Mst1 ir Lats2 suaktyvinimas reaguojant į I / R sukelia YAP branduolinį išėjimą, tokiu būdu neigiamai paveikdamas FoxO1 taikinių genų, įskaitant katalazę ir MnSOD, transkripciją, net jei FoxO1 yra branduolyje. Taigi, nors FoxO1 aktyvumas yra reguliuojamas keliais mechanizmais, endogeninio YAP branduolio lokalizacija atrodo esminė FoxO1 transkripcijos aktyvacijai reaguojant į I / R, ir tai kritiškai reguliuoja Hippo kelias.

Įrodyta, kad Mst1 fosforilina FoxO3, sukeldamas FoxO3 branduolinį translokaciją (nuoroda 13) 13, tačiau slopina jo didelio afiniteto DNR jungtį 26, kas rodo, kad šis hipipos kelio aukštupio komponentas gali slopinti FoxO3 nepriklausomai nuo YAP. Tačiau čia parodome, kad YAP, vienas iš Hippo kelio galinių efektorių, taip pat tiesiogiai kontroliuoja FoxO1. Taigi FoxOs aktyvumą gali dviem būdais reguliuoti Hippo kelio komponentai; būtent, Mst1 aktyvinimas ir iš to išplaukiantis YAP slopinimas neigiamai veikia transkripciją per FoxOs. Šiuo metu vis dar nežinoma, ar FoxO reguliavimas tiek aukščiau, tiek pasroviuose esančiuose Hippo kelio komponentuose yra būdingas dirgikliui, ar koordinuoja kardiomiocitų mirtį ir išgyvenimą.

FoxOs transkripcinį aktyvumą taip pat reguliuoja transkripciniai faktoriai. Pavyzdžiui, β-katenino ir FoxO3 sąveika yra svarbi siekiant užkirsti kelią oksidaciniam pažeidimui vėžio ląstelių linijose ir kontroliuoti Caenorhabditis elegans gyvenimo trukmę ir senėjimo procesą 27 . Hepatocituose peroksisomų proliferatoriaus suaktyvintas receptoriaus γ koaktyvatorius 1 sąveikauja su FoxO1 ir stimuliuoja tikslinio geno ekspresiją, kad kontroliuotų gliukozės homeostazę 28 . Čia parodome, kad YAP-FoxO1 sąveika yra būtina norint tarpininkauti antioksidantų genų ekspresijai kardiomiocituose. Kelių transkripcijos reguliatorių buvimas gali leisti „FoxOs“ griežtai kontroliuoti specifinių tikslinių genų rinkinių ekspresiją koordinuotai ir pagal stimulą.

TAZ turi ∼ 50% aminorūgščių sekos panašumą su YAP. Tiek YAP, tiek TAZ neigiamai reguliuoja Hippo kelias, jungiasi prie bendrų transkripcijos veiksnių, įskaitant Runx šeimą ir TEAD, ir turi nereikalingą vaidmenį keliuose biologiniuose įvykiuose, įskaitant navikogenezę 29, 30, 31 . Širdyje YAP ir TAZ tarpininkauja embriono širdies augimui ir pogimdyviniam miocitų išgyvenimui. 8, 9, 12 . Tai, kad tiek YAP, tiek TAZ sąveikauja su TBX5, T-dėžutės transkripcijos veiksniu, rodo, kad YAP ir TAZ širdies vystymosi metu gali vaidinti sutampančius vaidmenis 32 . Tačiau jie taip pat turi nepersidengiančias funkcijas. Pavyzdžiui, sunkus širdies disfunkcija atsiranda dėl αMHC-Cre (α miozino sunkiosios grandinės-Cre rekombinazės) inicijuotos širdžiai būdingos YAP, bet ne TAZ 9 ištrynimo. Kita vertus, genetinis TAZ ištrynimas skatina inkstų cistų vystymąsi 33 . Kadangi žemas YAP reguliavimas slopina FoxO1 tarpininkaujamą transkripciją, spėjame, kad TAZ negali kompensuoti YAP nebuvimo kardiomiocituose.

Vienas pagrindinių labai dauginančių ląstelių bruožas yra nuolat sustiprinta ROS karta 34, 35 . Norėdami įveikti ROS prieš mirtį nukreiptus veiksmus, vėžinės ląstelės sukuria adaptyvius mechanizmus 36, 37, 38, kurie padeda dalijamosioms ląstelėms išvengti priešlaikinio senėjimo ir apoptozės, taip pat suteikia vėžinėms ląstelėms atsparumą vaistams 35 . Šakninės galvutės transkripcijos veiksniai reguliuoja tiek išgyvenamumo genus, tiek priešlaikinį senėjimą 27, 38, kas rodo galimą FoxOs svarbą naviko vystymosi ir progresavimo metu. Be to, vis daugiau įrodymų rodo, kad Hippo kelias veikia naviko slopinėją daugelyje organų. Nustatyta, kad dėl kelių vėžio atvejų hipopozės signalizacijos kelyje prarandamos funkcijos mutacijos ir padidėja YAP aktyvumas 1 . Taigi kyla pagunda spėlioti, ar antioksidantų genų reguliavimas per YAP-FoxO1 kelią gali būti kritinis mechanizmas, per kurį Hippo kelias reguliuoja navikogenezę.

Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo naują ryšį tarp Hippo kelio ir FoxO1 per YAP. Kadangi Hippo kelias ir FoxOs turi daug svarbių funkcijų, įskaitant augimo, mirties ir išgyvenimo ląstelėse reguliavimą bei organizmo atsparumo stresui ir gyvenimo trukmės reguliavimą, spėjame, kad YAP ir FoxO1 sąveika yra suartėjimo taškas, leidžiantis ląstelėms. ir organizmai, norėdami tiksliai valdyti svarbias ląstelių funkcijas per signalus iš šių dviejų pagrindinių signalizacijos kelių.

Metodai

Transgeninės pelės

Širdies specifinių dominuojančių-neigiamų lat2 transgeninių pelių generavimas FVB fone (Tg-DN-Lats2) 11, transgeninių pelių, turinčių užfiksuotą Yap1 alelį 39 C57BL / 6 fone, ir transgeninių pelių, turinčių užfiksuotą lats2 alelį 40 C57BL fone. / 6 fonas buvo aprašytas anksčiau. Širdies ištrynimas buvo pasiektas kryžminant su α-MHC-Cre rekombinazės transgeninėmis pelėmis. Pelės patinai, kurių amžius buvo 12–16 savaičių, buvo naudojami in vivo adenoviruso injekcijoms ir (arba) I / R operacijai. Visus gyvūnų protokolus patvirtino Naujojo Džersio medicinos mokyklos, Rutgerso biomedicinos ir sveikatos mokslų instituto gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

I / R operacija in vivo

I / R buvo pasiektas susiejant kairiojo vainikinės arterijos (LAD) priekinę mažėjančią šaką, naudojant 8-0 proleno siūlę, o silicio vamzdeliai (1 mm OD) dedami LAD viršuje, 2 mm žemiau krašto tarp kairiosios kairės. prieširdyje ir LV. Išemija buvo patvirtinta elektrokardiogramos (EKG) pokyčiu (ST pakilimas). Po 45 minučių uždengimo FVB fono pelėms ir 20–30 minučių C57BL / 6J fono pelėms, silicio vamzdeliai buvo pašalinti, kad būtų atlikta reperfuzija, o šonkaulių tarpas ir raumenys uždaryti. Praėjus 24 valandoms po reperfuzijos, buvo ištirtas miokardo infarktas. Išeminiam AAR atskirti, Alciano mėlynasis dažiklis (1%) buvo perfuzuotas į aortą ir vainikines arterijas. Širdys buvo išpjautos, o LV buvo supjaustytos į 1 mm storio skerspjūvius. Tada širdies skyriai buvo inkubuojami su 1% trifeniltetrazolio chlorido tirpalu 37 ° C temperatūroje 15 min. Infarkto plotas (blyškus), AAR (ne mėlynas) ir bendras LV plotas iš abiejų kiekvienos sekcijos pusių buvo matuojamas naudojant „Adobe Photoshop“ („Adobe Systems Inc.“), o gautos vertės buvo suvestinės. Infarkto ploto procentinė dalis ir kiekvieno pjūvio AAR buvo padauginta iš pjūvio svorio, o tada sudėti iš visų pjūvių. AAR / LV ir infarkto plotas / AAR buvo išreikšti procentais 25 .

„Langendorff“ perfuzuotas pelės širdies modelis, turintis visuotinį I / R modelį

Pelės širdelės buvo sumontuotos ant Langendorff tipo izoliuotos širdies perfuzijos sistemos ir pakartotinai perfuzuotos koronarinių arterijų su 37 ° C deguonies turinčiu Krebs – Henseleit bikarbonato buferiu (120 mM NaCl, 17 mM gliukozės, 25 mM NaHCO 3, 5, 9 mM KCl, 1, 2 mM). MgCl2, 2, 5 mM CaCl2 ir 0, 5 mM EDTA), pH 7, 4, esant pastoviam slėgiui 80 mm Hg. Balionas, pripildytas vandens, buvo įvestas į LV per mitralinio vožtuvo angą ir prijungtas prie slėgio keitiklio plastikiniu vamzdžiu, užpildytu vandeniu. LV slėgis ir LV dP / dt buvo užfiksuoti juostiniu diagramų registratoriumi (Astro-Med, Inc.). Perfuzijos metu, nustatant baliono tūrį kietųjų dalelių tūryje, žemutinis diastolinis slėgis buvo nustatytas 4–10 mm Hg, o tūris viso eksperimento metu buvo pastovus. Po 30 min. Pusiausvyros periodo širdis buvo paveikta 30 minučių visuotinės išemijos (37 ° C temperatūroje) ir 60 minučių reperfuzija 25 .

Ląstelių kultūros

H9C2 mioblastų ląstelės ir „Cos7“ ląstelės („American Type Culture Collection“) buvo kultivuojamos 37 ° C temperatūroje DMEM / F-12 (Life Technologies, Inc.) su 10% FBS. Pirminės skilvelių kardiomiocitų kultūros buvo paruoštos iš vienadienių Crl: (WI) BR-Wistar žiurkių (Harlan Laboratories). Kardiomiocitų turtinga frakcija buvo gauta centrifuguojant per nenutrūkstamą Percollo gradientą. Ląstelės buvo auginamos pilnoje terpėje, kurioje yra DMEM / F-12, pridėtame 5% arklio serumo, 4 μg ml −1 transferino, 0, 7 ng ml −1 natrio selenito (Life Technologies, Inc.) ir 2 g l −1 galvijų serumo albumino ( V frakcija), 3 mM piruvato rūgšties, 15 mM HEPES, 100 μM askorbo rūgšties, 100 μg ml −1 ampicilino, 5 μg ml −1 linolio rūgšties ir 100 μM 5-brom-2′-deoksiuridino (Sigma). 24 val. Prieš bet kurį eksperimentą miocitai buvo pakeisti į terpę, kurioje nėra serumo.

Plazmidės

Žinduolių YAP ekspresijos vektorius (pHA-YAP) buvo sukurtas įterpiant YAP cDNR į pcDNA3-HA, kuriame yra DNR fragmentas, koduojantis HA (5′-GGATCCTACCCATACGATGTTCCGGATTACGCTAGTCTCTAGTCGAC-3 ′; YPYDVPDYASL įterptas žemyn; YPYDVPDYASL). „pcDNA3“. Vietos nukreipta mutagenezė buvo atlikta siekiant sukurti pHA-YAP (S94A), naudojant „QuikChange“ mutagenezės rinkinį (Agilent Technologies). Išraiškos vektorius YAP su išbrauktu WW domenu (pHA-YAPAWW) buvo sugeneruotas PGR. YAP ekspresijos vektorius su N-galo fragmentu (pHA-YAP N-terminalas) buvo sugeneruotas įterpiant YAP cDNR iš 1-316 aminorūgšties į pcDNA3-HA.

Adenoviruso konstrukcijos

Aprašytas Adenovirusas, turintis Lats2 ir Mst1 11 . Adenovirusai, turintys LaR2 (Ad-sh-Lats2), FoxO1 (Ad-sh-FoxO1) ir YAP (Ad-sh-YAP), turinčius shRNR, buvo generuojami taip, kaip aprašyta anksčiau, naudojant šias plaukus formuojančias oligos. 2 latui: 5′-GCAGGTTCTTCGACGACAATTCAAGAGATTGTCGTCGAAGAACCTGCCTTTTTT-3 ′; „FoxO1“: 5′-CGCCAAACTCACTACACCATTTCAAGAGAATGGTGTAGTGAGTTTGGCTTTTTT-3 ′; YAP: 5′-GGTCAGAGATACTTCTTAATTCAAGAGATTAAGAAGTATCTCTGACCTTTTTT-3 ′. Plaukų segtuko kilpos seka yra pabraukta. In vivo injekcijai naudojami adenovirusai buvo išgryninti naudojant Adeno-X Maxi gryninimo rinkinį (Clontech).

Antikūnai

Antikūnai, naudojami imunoblotams, buvo įsigyti iš nurodytų kompanijų: katalazė (skiedimas santykiu 1: 3000, Nr. Ab1877) (Abcam), p-Akt (Ser473) (skiedimas santykiu 1: 2000, Nr. 9272), Akt (1: 2000 skiedimas, Nr. 9271), „p-eNOS“ („Ser1177“) (1: 1 000 skiedimas, Nr. 9571), „eNOS“ (1: 1 000 skiedimas, Nr. 9586), „p-FoxO1“ („Thr24“, „Ser256“) (1: 1 000 skiedimas, Nr. 9464 ir 9461), „FoxO3“ (1: 1 000 skiedimas, Nr. 9467), GAPDH (1: 3 000 skiedimas, Nr. 2118), „Histone H3“ (skiedimas santykiu 1: 500, Nr. 9715), A / C „Lamin“ (1: 5 000). dilution, no. 4777), p-Mst1 (Thr183) (1:1, 000 dilution, no. 3681), p-YAP (Ser127) (1:1, 000 dilution, no. 4911), YAP (1:2, 000 dilution, no. 4912) (Cell Signaling Technology), FoxO1 (1:2, 000 dilution, no. 1874-1) (Epitomics), α-tubulin (1:5, 000 dilution, no. T-6199), FLAG (1:2, 000 dilution, no. F3165) (Sigma), MnSOD (1:3, 000 dilution, no. 611580), Mst1 (1:2, 000 dilution, no. 611052) (BD Biosciences), and Lats2 (1:1, 000 dilution, nos. ab54073 and A300-479A) (Abcam and Bethyl Laboratories). The p-Lats2 (S872 and T1041) (1:500 dilution) antibodies were generated as described 41 .

Imunobloto analizė

Heart homogenates or cell lysates were prepared using RIPA buffer containing 50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% deoxycholic acid, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF, 0.5 mM 4-(2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride, 0.5 μg ml −1 aprotinin, and 0.5 μg ml −1 leupeptin. Equal amounts of protein (10–20 μg) were subjected to 10–15% SDS–PAGE. The nuclear and cytosolic fractions were prepared with NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Pierce). After proteins were transferred to a PVDF membrane, immunoblots were probed with the indicated antibodies. Full scans of all western blots and gels are supplied in Supplementary Fig. 9.

Imuninis nusėdimas

Heart homogenates or cell lysates were prepared using a lysis buffer containing 50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 and 1 mM EDTA. The lysates were incubated with protein A agarose-immobilized antibody for 2 h at 4 °C. After immunoprecipitation, the immunocomplexes were washed with lysis buffer three times and eluted with 2 × SDS sample buffer.

Imunocitochemija

Neonatal cardiomyocytes in four-well chambers were washed with phosphate-buffered saline (PBS) three times, fixed with 4% paraformaldehyde for 15 min, permeabilized in 0.3% Triton X-100 for 10 min and blocked with 3% bovine serum albumin for 1 h at room temperature. The following primary antibodies were used: Lats2 (1:200 dilution, no. ab54073) (Abcam), FoxO1 (1:100 dilution, no. 1874-1) (Epitomics), YAP (1:100 dilution, H00010413-M01) (Abnova) and α-actinin (1:400 dilution, A7811) (Sigma). Alexa Fluor 488 Dye- or Alexa Fluor 594 Dye-conjugated secondary antibody (Invitrogen) was used for detecting indirect fluorescence. Slides were mounted using a reagent containing 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vectashield) (Vector Laboratories Inc.).

In situ PLA

Neonatal cardiomyocytes were fixed, permeabilized and blocked as described as above. Heart sections were deparaffinized with xylene, rehydrated in graded alcohol concentrations, briefly washed in water and then antigen-unmasked using citrate buffer and blocked in 5% goat serum in PBST for 1 h. In situ PLA experiments were performed as described previously 42, 43 . Incubation with primary antibodies (Rabbit FoxO1 and Mouse YAP in blocking solution) was performed at room temperature for 2 h. Cells or heart sections were washed for three times for 5 min in PBS plus 0.1% Tween 20. The protein–protein interaction between FoxO1 and YAP was detected with secondary proximity probes (Rabbit-PLUS and Mouse-MINUS) (Olink Biosciences AB). The secondary proximity probes were incubated for 1 h at 37 °C. Cells were washed once for 5 min in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) plus 0.1% Tween 20 at 37 °C, then twice for 5 min in PBS plus 0.1% Tween 20. All subsequent steps were performed according to the Duolink proximity ligation assay detection kit protocol (Olink Biosciences AB).

Immunohistochemistry for 8-OHdG staining

Anti-8-OHdG antibody (Oxis International Inc.) was diluted to 7.5 μg ml −1 in PBS and applied to tissue sections for 2 h at room temperature. The immunohistochemistry experiment was performed using the ImmunoCruz staining system (streptavidin–biotin peroxidase method; Santa Cruz Biotechnology), and sections were counterstained with hematoxylin.

X-gal staining

Heart tissues were fixed for 1 h in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) supplemented with 5 mM EGTA, 2 mM MgCl 2 and 0.2% glutaraldehyde (Sigma). Fixed samples were washed three times for 15 min with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) supplemented with 2 mM MgCl 2, 0.01% Na deoxycholate and 0.02% NP-40 and then incubated in staining buffer containing 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3), 2 mM MgCl 2, 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 0.01% Na deoxycholate, 0.02% NP-40 and X-gal at a final concentration of 1 mg ml −1 overnight at 37 °C.

Detection of oxidative stress

Fresh heart tissues were dissected and incubated in a Krebs/HEPES buffer containing 5 μM lucigenin. After 15 min of equilibration, counts were obtained every minute for the next 5 min in a luminometer. The O 2 level was presented as chemiluminescence units normalized by tissue weight. For H 2 O 2 production, heart sections were incubated with Amplex Red (10 μM) for 30 min at 37 °C. The Amplex assay was performed according to the supplier's protocol (Molecular Probes).

Tissue homogenates were prepared using 5% metaphosphoric acid. The tissue level of GSSG/GSH was determined using the Bioxytech GSH/GSSG-412 kit (Oxis International Inc.). The antioxidant capacity of heart homogenates was determined using an antioxidant assay kit according to the supplier's instructions (Cayman Chemical).

RT–PCR and quantitative PCR

Total RNA was isolated from neonatal cardiomyocytes using TRIzol (Invitrogen) and first-strand cDNA was synthesized using the ThermoScript RT-PCR system (Invitrogen). Quantitative PCR was carried out using a DNA Engine Opticon 2 system (Bio-Rad) and iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Catalase and MnSOD mRNA levels were analysed using specific primers. Values were standardized using β-actin.

Quantitative PCR primers: catalase: forward: 5′-CCTCCTCGTTCAAGATGTGGTTT-3′, reverse: 5′-CCTTTGCCTTGGAGTATCTGGTAATA-3′; MnSOD: forward: 5′-CAACTCAGGTTGCTCTTCA-3′, reverse: 5′-CGACCTTGCTCCTTATTGA-3′; β-actin forward: 5′-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3′, reverse: 5′-ACCAGAGGCATACAGGGACAA-3′.

CellTiter-Blue assay

Cell viability was measured by CellTiter-Blue (CTB) assays (Promega). In brief, cardiomyocytes (1 × 10 5 per 100 μl) were seeded onto 96-well dishes. After 24 h, the cells were transduced with the indicated adenovirus. After transduction, myocytes were incubated with or without H 2 O 2 treatment. Viable cell numbers were measured by the CTB assay. The CTB assays were performed according to the supplier's protocol.

Transient transfection and luciferase assays

Cells were plated on 12-well plates and transfected with 1 μg of the indicated luciferase vectors using Fugene 6. Total DNA quantity was kept constant. Six hours after transfection, the cells were washed and transduced with the indicated adenovirus. The cells were lysed with Passive Lysis Buffer, and the transcriptional activity was determined using a luciferase assay system (Promega).

In vitro kinase assay

Active Lats2 recombinant protein (10 ng) (Signal Chem) was incubated with 1 μg myc-FoxO1 recombinant protein (OriGene) in a kinase assay buffer containing 25 mM MOPS (pH 7.2), 12.5 mM β-glycerolphosphate, 25 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 2 mM EDTA and 0.25 mM DTT. The reaction was initiated by adding [γ- 32 P] ATP (PerkinElmer) and was incubated for 30 min at 30 °C. The reaction was terminated by the addition of 2 × SDS sample buffer. Samples were separated by SDS–PAGE and the dried gel was subjected to autoradiography.

ChIP and sequential ChIP

H9C2 myoblasts were treated with 1% formaldehyde for 10 min to cross-link proteins and chromatin. The reaction was stopped by adding 0.125 M glycine for 5 min. Cells were washed with cold PBS twice. Cells were then resuspended in 1 ml ChIP lysis buffer (20 mM Tris–HCl (pH 8.0), 85 mM KCl, 0.5% NP-40) for 10 min at 4 °C and centrifuged at 5, 000 rpm to pellet the nuclei. The cell nuclei were resuspended in 400 μl nuclei lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA and 1% SDS) and then subjected to sonication five times for 30 s with 30 s intervals. Purified chromatin was analysed on a 1% agarose gel to determine the shearing efficiency. As a control, normal IgG was used as a replacement for YAP or FoxO1 antibody (Santa Cruz Biotechnology). For sequential ChIP, sheared chromatin was first immunoprecipitated with FoxO1, followed by elution and a second immunoprecipitation using the YAP antibody. The ChIP procedure was performed as in the supplier's protocol (Active Motif).

ChIP-PCR primers: Catalase promoter-DBE1: forward: 5′-GGTGGACTATTGACAGTGTTGGG-3′, reverse: 5′-CGCCATCCAGTTATTTACTCAGG-3′; catalase promoter-DBE2: forward: 5′-ACCAAATAAATAAGCAAAGTGAG-3′, reverse: 5′-GAAACTCTAGAAGGGACAGGATT-3′; MnSOD promoter-DBE1: forward: 5′-TCATGGCCACTATGCCTCAA-3′, reverse: 5′-TCTCAGCTGTGTCCTCTTCC-3′; MnSOD promoter-DBE2: forward: 5′-CCTCTTGTTTATTACATCAAGATTG-3′, reverse: 5′-CTGGTTGTCAACTTGACTATATC-3′.

Statistinė analizė

All values are expressed as mean±sem Statistical analysis between groups was conducted by unpaired Student's t -test or one-way analysis of variance (ANOVA) followed by a Newman–Keuls comparison test. Values of P <0.05 were considered to be significant.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary Figures 1-9

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.