G-baltymų jungimasis ir žmogaus abscisinės rūgšties receptoriaus lancl2 branduolinė translokacija | mokslinės ataskaitos

G-baltymų jungimasis ir žmogaus abscisinės rūgšties receptoriaus lancl2 branduolinė translokacija | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biochemija
  • Biofizika
  • Molekulinė biologija

Anotacija

Neseniai buvo įrodyta, kad abscisinės rūgšties (ABA), seniai žinomo, fitohormono, yra ir žmonėms, kur ji nukreipta įgimto imuninio atsako ląstelėms, mezenchiminėms ir hemopoetinėms kamieninėms ląstelėms bei ląstelėms, dalyvaujančioms reguliuojant sisteminę gliukozės homeostazę. LANCL2, periferinės membranos baltymas, yra žinduolių ABA receptorius. Parodome, kad N-galo glicino miristoilinimas sukelia LANCL2 lokalizaciją plazmos membranoje ir citoplazminėse membranos pūslelėse, kur jis sąveikauja su G i baltymo α subvienetu ir pradeda ABA signalizacijos kelią aktyvindamas adenilato ciklazę. Demokratinis LANCL2 metabolizavimas cheminėmis ar genetinėmis priemonėmis sukelia jo branduolio translokaciją. Natūralaus LANCL2 branduolio sodrinimą taip pat skatina gydymas ABA. Todėl žmogaus LANCL2 yra nepermembraninis G baltymų jungiklis, jautrus hormonų sukeltai branduolio translokacijai.

Įvadas

Žmogaus genomas koduoja tris skirtingus LANCL baltymus, LANCL1, LANCL2 ir LANCL3 1, turinčius didelę struktūrinę homologiją su lantionino sintetazės komponentu C - ciklaze, dalyvaujančia prokariotų 2 lantibiotikų sintezėje. Buvo pasiūlyta, kad LANCL3 yra pseudogenas 3 . Įtariama, kad LANCL1 gali būti susijęs su lantionino metabolitų metabolizmu centrinėje nervų sistemoje 4 . Įrodyta, kad LANCL2 yra žmogaus abscisinės rūgšties (ABA) 5, 6, 7, 8, 9, 10 receptoriai.

Įrodyta, kad ABA, seniai žinomo augalų hormono 11, 12, yra ir žinduoliuose, kur jis veikia keletą pagrindinių funkcijų skirtingų tipų ląstelėse 9, 10, 13, 14 . ABA elgiasi kaip priešuždegiminis įgimto imuninio atsako 7, 15, 16, 17 ląstelių moduliatorius, stimuliuoja žmogaus mezenchiminių ir hemopoetinių kamieninių ląstelių dauginimąsi 18, 19 ir dalyvauja kontroliuojant sisteminę gliukozės homeostazę 5, 20., 21, 22, 23, 24 .

LANCL2 tarpininkaujant žinduoliams, perduodantiems ABA, reikalingas kokliušo toksinui (PTX) jautrus G baltymas 5, dėl kurio padidėja tarpląstelinis Ca 2+ lygis ([Ca 2+ ] i ). Signalizacijos kelias pasroviui nuo ABA prisijungimo prie LANCL2 apima adenilato ciklazės (AC) aktyvaciją, po kurios eina cAMP perprodukcija, PKA katalizuojamas fosforilinimas ir plazmos prie membranos surišto ADP-ribosilo ciklazės CD38 stimuliacija, kuri paverčia NAD + į cADPR ir ADPR., dėl kurio padidėja tiek tarpląstelinio Ca 2+ patekimas, tiek kalcio sukeltas kalcio išsiskyrimas (CICR), tarpininkaujantis viduląstelinei Ca 2+ mobilizacijai, 5, 9, 15, 21 .

Keletas netiesioginių įrodymų linijų nurodo Gi kaip G baltymą sujungtą su LANCL2: i) ABA signalizacijos kelio jautrumas PTX žmogaus granulocituose ir insuliną atpalaiduojančiose ląstelėse 15, 21 ; ii) inozitolio 1, 4, 5-P3 (IP 3 ) kaupimasis žmogaus ląstelėse, bendrai transfekuotose su LANCL2 ir chimeriniu G baltymu, Gaq / i, stimuliuojant ABA 5, ir, iii) slopinant ABA. sukeltas cAMP padidėjimas ABA jautriose žmogaus ląstelėse padidėjus transduino, β-subvienetų šaliklio, ekspresijai 5 . Tačiau dar nėra pateiktas galutinis G baltymo, sujungto su LANCL2, pobūdis. Pavyzdžiui, G βγ vaidmuo kintamos srovės signalizacijoje yra nepaprastai sudėtingas, tai liudija ir kintamąjį aktyvinantis, ir slopinantis poveikis, susijęs su dideliu jungiamųjų receptorių nevienalytiškumu, ir įvairios su membranomis susijusios kintamos kintamos izoformos 25, 26 . Be to, LANCL2-G baltymų sujungimo mechanizmas, konkrečiai ar jis yra tiesioginis, ar tarpininkaujamas kitų baltymų, dar turi būti apibrėžtas.

Įdomu tai, kad LANCL2 nėra transmembraninis baltymas, kaip buvo prognozuojama silico iš jo sekos 27, 28, 29 ir patvirtintas in vitro stebint, kad jį galima pašalinti iš plazmos membranos nenaudojant ploviklių - atliekant lengvą cheminį apdorojimą 30 arba jos posttransliacinio N-galo miristoilinimo slopinimas 28 . Be to, nustatyta, kad nemiristoilintas LANCL2-GFP sulietas baltymas yra apribotas 28 branduoliu. Šis pastebėjimas kelia galimybę, kad jo hormono ligadas ABA gali paveikti LANCL2 prekybą tarp membranų ir branduolio.

Iš tiesų, naujausi atradimai leidžia suderinti ne transmembraninę LANCL2 lokalizaciją su jo hormono receptorių funkcija, nes buvo įrodyta, kad žmogaus anijonitas AE1 tarpininkauja ABA pernešimui per plazminę membraną 30 .

Čia mes ištyrėme neįprastus LANCL2 bruožus tarp G baltymų sujungtų gyvūnų hormonų receptorių (GPCR), naudodamiesi vietine mutageneze ir konokalinės fluorescencijos mikroskopija, fluorescencijos atkūrimu po fotobalinimo (FRAP) ir fotoaktyvacijos metodais. Buvo tiriama LANCL2 lokalizacija, tarpląstelinis mobilumas esant ABA ir jo sąveika su G i .

Rezultatai

N-galo miristoilinimo vaidmuo nepolitinio LANCL2 subkilulinėje lokalizacijoje

Palyginimas tarp trijų LANCL genų rodo, kad LANCL2 Met 19 yra suderintas su labai homologinio LANCL1 ir LANCL3 pradiniu metioninu (1 papildoma lentelė), kurie yra citozoliniai baltymai 27, 28, 29. Taigi LANCL2 transkripcija, pradedant Met 19, leistų gauti trumpesnį baltymą, neturintį miristoilinto glicino ir 18 aminorūgščių N-galo ruožo (LANCL2sh).

Papildomame 1 pav. Parodytas reprezentatyvus viso ilgio LANCL2 Western blot iš HeLa, HEK ir žmogaus adenokarcinomos ląstelių linijos MDA-MB-468 (MDA-468), atskleistas naudojant specifinį mAb (žr. Medžiagos ir metodai). Šioje ląstelių linijoje amplifikuojama 0, 9 Mb sritis, kurioje yra LANCL2 genas. LANCL2 per didelis ekspresija MDA-468 ląstelėse buvo užfiksuotas atliekant mikrotrauminio profilio analizę, atliekant RT-PGR ir išmatuojant [3H] ABA prisijungimą prie nepažeistų ląstelių, palyginti su MDA-MB-231 (krūties adenokarcinomos ląstelių linija, per daug neekspresuojanti LANCL2). ) 32 . B max vertės, apskaičiuotos remiantis atitinkamomis soties kreivėmis Scatchard grafiko analize, buvo atitinkamai 0, 70 pmol ABA / mg baltymo MDA-468 ir 0, 023 pmol ABA / mg baltymo MDA-231.

Landlingeris ir kt . 28 parodė, kad GFP sulietas LANCL2, ekspresuojamas žmogaus amniono epitelio ląstelėse, buvo susijęs su plazmos membrana; be to, miriotiliacijos slopinimas N-galo glicino mutacija arba ląstelių inkubavimas su specifiniu miristoilo transferazės inhibitoriumi 2-hidroksimiristine rūgštimi (HMA, nuoroda 33) lėmė branduolio sintezės baltymo lokalizaciją.

Tai, kad šiuose eksperimentuose per daug ekspresuotas LANCL2 buvo sulietas su GFP, leido įsitikinti, ar panašūs rezultatai gali būti stebimi naudojant nepažymėtą baltymą. Be to, konfokalinės fluorescencinės mikroskopijos būdu buvo ištirtas N-galinių 18 aminorūgščių vaidmuo subkląstelinėje LANCL2 lokalizacijoje, nes ši technika leidžia ištirti baltymų lokalizaciją gyvosiose ląstelėse realiu laiku ir su dideliu jautrumu.

Todėl HeLa ir HEK ląstelės buvo laikinai transfekuotos įvairiomis LANCL2 baltymo formomis: LANCL2 sulietas su EGFP (LANCL2-GFP), nepažymėtas LANCL2, G2A mutagenizuotas LANCL2 (LANCL2-G2A), G2A mutagenizuotas LANCL2 LANCL2 sujungtas su EGFP (EGFP) ), ir trumpasis LANCL2, sujungtas su EGFP (LANCL2sh-GFP) (1 papildoma lentelė).

Kaip parodyta konfokalinio mikroskopo eksperimentuose, parodytuose 1 pav., HeLa ląstelėse LANCL2-GFP buvo lokalizuotas kartu su miristoilintu plazminės membranos žymeniu (1A – C pav.), Gautas išreiškiant raudoną fluorescencinį baltymą, sulietą su miristoilinimu / palmitoilinimu. seka iš Lck tirozinkinazės (Molecular Probes, JAV). 1D pav. Nepažymėtas laukinio tipo LANCL2 buvo parodytas su specifiniu mAb 30, parodant LANCL2 lokalizaciją plazmos membranoje, taip pat neturint žymių.

Image

HeLa ( A – D, G – L ) arba HEK ( E, F ) ląstelės praėjus 48 valandoms po trumpalaikės transfekcijos skirtingai pažymėtomis LANCL2 formomis (1 papildoma lentelė). „HeLa“ ląstelės, kartu transfekuotos su ( A ) LANCL2-GFP ir su ( B ) „CellLight ™“ plazmos membranos-RFP, kurios parodė bendrą lokalizaciją plazmos membranos ir juxta-branduolinės membranos pūslelėse sujungimo skydelyje ( C ). ( D ) Plazmoje ir membranoje lokalizuota nepažymėta LANCL2 plazmoje buvo nustatyta naudojant monokloninius LANCL2 anti-žmogaus antikūnus (mAb). ( E ) HEK ląstelės, per daug ekspresuojančios LANCL2-GFP. Skirtingai nuo skydelio ( E ) membraninio baltymo lokalizacijos, tiek LANCL2-GFP ( F ), tiek nepažymėtas LANCL2 ( G skydelis, LANCL2 atskleidė su monokloniniu antikūniu) prarado membranos lokalizaciją po gydymo 1 mM miristoilo tranferazės inhibitoriaus HMA, todėl esant plačiai branduolinei vietai. Nemiristoilinama G2A mutantinė LANCL2 forma parodė panašų lokalizacijos modelį, ne tik sulydant su EGFP ( H ), bet ir dažant mAb (nepažymėti mutagenizuoti LANCL2, I ). Ir atvirkščiai, jei būtų pašalintos pirmosios 18 aminorūgščių, baltymas vis tiek neteko membranos lokalizacijos, bet pasikeitė į visiškai tirpų, laisvai difuzinį modelį ( L ).

Visas dydis

Norėdami ištirti deimiristoilinimo įtaką LANCL2 lokalizacijai, HEK ląstelės, pereinamuoju metu pernelyg išreiškiančios LANCL2-GFP, buvo inkubuotos be (kontrolė, 1E pav.) Arba su 1 mM HMA (1 pav. F) 33, 34 . Po 24 valandų dauguma baltymų HMA apdorotose ląstelėse buvo lokalizuoti branduolyje (1 pav. F), suderinus su ankstesniais rezultatais 28, bet ne branduoliuose, priešingai nei anksčiau buvo stebėta.

Branduolinė nemiristoilinto LANCL2 lokalizacija buvo patvirtinta HeLa, išreiškiančiame nepažymėtą LANCL2, apdorotą HMA ir nuspalvintu anti-LANCL2 monokloniniu antikūnu (1 pav. G), taip pat ląstelėse, ekspresuojančiose mutagenizuotą nemiristoilinamą LANCL2-G2A-GFP (pav. .1H) arba nepažymėtas LANCL2-G2A (1 pav. I).

Todėl nebuvo pastebėta jokių didelių lokalizacijos skirtumų tarp įvairių GFP pažymėtų ir nepažymėtų LANLC2 rekombinantinių formų (1 papildoma lentelė) tiek HeLa, tiek HEK ląstelėse. Tiksliau, nors per visą ilgį miristoilintas LANCL2 lokalizuotas plazmos membranoje ir citoplazminėse vietose (1A – E pav.), Miristoilo inkaro praradimas dėl cheminio (HMA) ar genetinio (G2A) slopinimo miristoilinimo paskatino abiejų branduolių lokalizaciją. GFP pažymėti (atitinkamai 1 pav. F, H) ir nepažymėti baltymai (atitinkamai 1 G pav., I).

Atitinkamai mes ištyrėme branduolių lokalizacijos signalų (NLS) buvimą LANCL2. „CNLS Mapper“, programinės įrangos NLS 35 numatytojas, atpažino dvi galimas NLS sekas LANCL2 N-galiniame regione, kurių rezultatas yra panašus 3, 6 / 10: monopartitinis NLS (T4-H12) ir dvipusis NLS (K7-G37). ). Iš tikrųjų, LANCL2-G2A-GFP daugiausia lokalizuotas branduolyje (1 pav. H), o apipjaustyta forma LANCL2sh-GFP, kuriai trūksta N-galinio peptido, kuriame yra NLS, parodė homogenišką pasiskirstymą ląstelėje (1 pav. L).

Miristoilinimo poveikis LANCL2 tarpląsteliniam mobilumui

Norėdami ištirti LANCL2 judrumą gyvose ląstelėse, mes panaudojome du skirtingus metodus, kuriems reikia naudoti fluorescenciškai pažymėtus baltymus: fluorescencijos atkūrimas po fotobalinimo (FRAP) ir fluorescencinis skilimas po fotoaktyvinimo (FDAP).

FRAP tiria pažymėto baltymo mobilumą analizuodamas fluorescencinio signalo atkūrimą konkrečiame dominančiame regione (IG) po nuolatinio fotobalinimo 36 . Tuo tikslu HeLa ląstelės buvo laikinai transfekuotos naudojant visą ilgį LANCL2-GFP arba apipjaustytą LANCL2sh-GFP formą, o FRAP eksperimentai buvo atlikti 48 valandas po transfekcijos. IG buvo atrinktos ląstelių citoplazminėje srityje, esančioje arti plazmos membranos, vengiant Golgi ir branduolinių sričių (2A pav.).

Image

( A ) Tipiškas FRAP eksperimentas. EGFP signalas „HeLa“ ląstelėse, kurios per daug išreiškia LANCL2-GFP (kairysis stulpelis) arba LANCL2sh-GFP (dešinėje), prieš (prePB) ir nurodytais laiko momentais po fotobalinimo (T0). Diagrama: vidutinio FRAP su sd, LANCL2-GFP (mėlyna) ir LANCL2sh-GFP (raudona pėdsakas) kinetika; vidutinės pusėjimo trukmės konstantos abscisėje nurodytos punktyrinėmis linijomis. ( B ) Tipinis FDAP eksperimentas. PAGFP signalas „HeLa“ ląstelėse, kurios per daug išreiškia LANCL2-PAGFP (kairysis stulpelis) arba LANCL2-G2A-PAGFP (dešinėje), prieš (prePA) ir skirtingais momentais po fotoaktyvacijos (T0). Diagrama: vidutinio FDAP, sd, LANCL2-PAGFP (mėlyna) ir LANCL2-G2A-PAGFP (raudona pėdsakas) kinetika; vidutinės pusėjimo trukmės konstantos abscisėje nurodytos punktyrinėmis linijomis.

Visas dydis

LANCL2-GFP apskaičiuotas vidutinis t ½ buvo žymiai didesnis nei LANCL2sh-GFP t ½ (atitinkamai 3, 9 ± 0, 9 s ir 1, 6 ± 0, 2 s LANCL2-GFP ir LANCL2sh-GFP, 2A pav., N = 20). ląstelės iš trijų skirtingų transfekcijos eksperimentų, p <0, 001).

Tada mes taip pat atlikome fotoaktyvinimo eksperimentus su LANCL2, sujungtu su fotoaktyvinamu GFP (PAGFP). Norėdami palyginti laukinio tipo LANCL2 mobilumą su mirogenizuojamu G2A mutagenizuotu LANCL2, mes laikinai išreiškėme LANCL2-PAGFP arba LANCL2-G2A-PAGFP HeLa ląstelėse ir fotoaktyvavome žiedinę citozolinę ROI, parinktą šalia plazmos membranos, ląstelių ląstelėse. panaši forma.

Vaizdai, gauti tuo pačiu metu po fotoaktyvinimo, aiškiai parodė, kad LANCL2-PAGFP fluorescencinis skilimas buvo daug lėtesnis nei LANCL2-G2A-PAGFP (2 pav. B), tai patvirtina paskaičiavus atsigavimo pusę (t ½ )., pritaikius vertes prie vienos fazės, skilimo kreivės 37 : LANCL2-PAGFP ir LANCL2-G2A-PAGFP t ½ vertės buvo atitinkamai 50 ± 30 s ir 3, 4 ± 0, 75 s (diagrama 2B pav.; = 34 ląstelės iš keturių skirtingų) transfekcijos eksperimentai, p <0, 001).

Be to, kaip parodyta papildomame 2 pav., LANCL2 yra pajėgi greitai paskleisti šoninę difuziją plazmos membranoje.

Šie stebėjimai kartu rodo, kad LANCL2 viso ilgio membranoje yra susijęs ir su citoplazma. Kai baltymų miristoilinimas buvo užkirstas kelią vieno taško mutacija, ryšys su ląstelių membranomis buvo prarastas, ką rodo greitesnė laisva difuzija ląstelės viduje.

LANCL2 dinamika po gydymo ABA

Faktas, kad nepažymėtas LANCL2 lokalizuotas ląstelės branduolyje, kai jis nėra miroetiliuotas (1G – I pav.), Leido ištirti, ar po jo prisijungimo prie ABA gali atsirasti baltymo branduolinis persikėlimas kaip jo signalizacijos kelio dalis. Norėdami ištirti, ar LANCL2 migravo į branduolį pridėjus ABA, mes panaudojome viso ilgio LANCL2 formą, sulietą su PAGFP; Išvada, kad LANCL2-GFP ir nepažymėtas LANCL2 savo branduolio lokalizacijoje elgėsi panašiai kaip G2A mutacija (atitinkamai, 1H pav., I pav.), buvo parodyta, kad GFP žymė reikšmingai nepakeitė vidinio LANCL2 gebėjimo migruoti į branduolys.

Praėjus 48 valandoms po transfekcijos LANCL2-PAGFP, panašios formos ir dydžio HeLa ląstelės buvo fotoaktyvinamos 8 μm skersmens citoplazmos ROI su (be) (kontrolinės) kartu pridedant 5 μM ABA; fotoaktyvacijos ROI buvo pasirinkta arti plazmos membranos, 10–20 μm atstumu nuo artimiausios branduolinės membranos, tuo tarpu branduolinė ROI apėmė didžiąją dalį branduolio srities (3A pav.). LANCL2-PAGFP fluorescencinis signalas greitai pasiskirstė toliau nuo fotoaktyvuotos srities, lėtai didėja ir branduolio viduje; dinamika buvo užfiksuota 25 minutes, kai buvo pasiektas pastovios branduolinės fluorescencijos lygis (3B pav., kairysis skydelis).

Image

( A ) Nestativuotų HeLa ląstelių, perkeltų LANCL2-PAGFP, tipiniai vaizdai iškart po fotoaktyvacijos (T0), po 25 minučių ir šviesiame lauke. Nubrėžtos citozolinio fotoaktyvacijos (apvalios) ir branduolinės analizės (ovalios) IG; šviesaus lauko skydelyje (dešinėje) nurodyta kvadratinė IG, skirta fono fluorescencijos korekcijai. ( B ) Grafikai: vidutinės fluorescencijos padidėjimo laikui bėgant branduolinės ROI (kairėje) ir fluorescencijos skilimo fotoaktyvuotų citoplazminių ROI analizė (dešinėje). HeLa ląstelės buvo apdorotos (+ ABA, raudoni pėdsakai) arba ne (LANCL2-PAGFP, mėlyni pėdsakai) 5 μM ABA prieš pat fotoaktyvaciją.

Visas dydis

Praėjus 25 minutėms po fotoaktyvacijos, vidutinė branduolinės fluorescencijos reikšmė, palyginti su ikiaktyvinimo kadrais, ABA apdorotose ląstelėse buvo žymiai didesnė, palyginti su negydytomis kontrolinėmis medžiagomis (atitinkamai 4, 18 ± 1, 4 vs 2, 51 ± 0, 5, n = 22 ląstelės iš trijų). skirtingi transfekcijos eksperimentai, p = 0, 005).

Palyginti su LANCL2-PAGFP sodrinimu, kai nėra ABA, tik PAGFP, naudojamo kaip kontrolė, rodiklis kiekybiškai panašus padidėjo (branduolinės fluorescencijos plokštuma, palyginti su išankstinės stimuliacijos vertėmis, buvo 2, 2 ± 0, 3), tačiau reikšmingai skirtinga kinetika (t½ atitinkamai 2, 2 ± 0, 4 ir 6, 6 ± 1, 3 min. PAGFP ir LANCL2-PAGFP, atitinkamai p <0, 001; papildomas 3 pav.). Taigi, nežymus LANCL2-PAGFP branduolinės fluorescencijos padidėjimas nestimuliuojamose ląstelėse gali atsirasti dėl nedidelio nuo ABA nepriklausomos, spontaniškos LANCL2 branduolio migracijos, o ne dėl PAGFP pažymėto baltymo nespecifinio branduolinio importo 38 .

Naikinančios fluorescencijos analizė citoplazminėje fotoaktyvintoje IG parodė didesnį LANCL2 sumažėjimą apdorotame ABA nei negydytuose langeliuose: fluorescencijos verčių plokštuma, palyginti su pirmuoju fotoaktyvuotu kadru ir pritaikyta vienoje eksponentinėje kreivėje, buvo 0, 32 ± 0, 09. kontrolei ir 0, 22 ± 0, 076 ABA apdorotoms ląstelėms (n = 17 ląstelių, p <0, 001; 3B pav., dešinė skydinė dalis). Be to, fotoaktyvuotos citoplazminės IG fluorescencijos skilimas buvo greitesnis, vartojant ABA, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (kontrolinis pusinės eliminacijos laikas buvo 50 ± 30 s, o ABA apdorotų - 23 ± 13 s; n = 17 ląstelių, p = 0, 02).

Didesnis LANCL2 branduolio kiekis ABA apdorotose ląstelėse, sutinkant su didesniu ir greitesniu LANCL2 sumažėjimu citoplazminės fotoaktyvacijos srityje, rodo, kad ABA skatina LANCL2 migraciją į branduolį.

LANCL2 funkcijos lokalizacijos vaidmuo

Toliau mes ištyrėme LANCL2 nuo mirostiliacijos priklausomos membranos lokalizacijos vaidmenį ABA suvokime / signalizacijoje.

ABA prisijungimas prie LANCL2 galiausiai skatina AC, kurį sukelia γ subvienetų kompleksas, išsiskiriantis iš aktyvuoto G i -baltymo 5, stimuliavimą.

Norėdami nustatyti, ar LANCL2 tiesiogiai sąveikavo su G i -proteino α subvienetu, atlikome FRET eksperimentus, pažymėdami LANCL2 C donoro fluoro fosforu (EGFP) C gale (LANCL2-GFP) ir chimerinio α subvienetu. Gi baltymas, apie kurį žinoma, kad jį suaktyvina LANCL2 5, su akceptoriaus fluoroforu (TagRFP, G i -RFP). Kaip neigiamą, su membrana nesusijusią kontrolę, mes panaudojome EGFP pažymėtą tirpiąją trumpąją LANCL2 formą, LANCL2sh-GFP (1 papildoma lentelė).

Bendras LANCL2-GFP ir G i- RFP transfekcija HeLa ląstelėse sukūrė išmatuojamą FRET signalą, rodantį, kad donoras (EGFP) ir akceptorius (TagRFP) buvo pakankamai arti, kad būtų galima perduoti rezonanso energiją (4A – C pav.). Įdomu tai, kad FRET tarp LANCL2 ir G i α subvienetų buvo stebimas ne tik plazminėse membranose (atpažįstamas pagal jų intensyvų signalą prie ląstelių krašto ir analizuojamas rankiniu būdu nubrėžtomis ROI), bet ir tarpląstelinėse srityse: apskaičiuotas vidutinis tariamasis FRET efektyvumas. LANCL2-G i porai plazminės membranos IG (20 ± 7%) buvo panašus į FRET, apskaičiuotą sveikų ląstelių regionuose (20 ± 5%; n = 40 ląstelių penkiuose skirtinguose transfekcijos eksperimentuose, 4G pav.). Priešingai, sąveika buvo prarasta (FRET efektyvumas 1 ± 2%), kai G i- RFP buvo kartu transfekuojamas su tirpiu LANCL2sh-GFP (4G pav.).

Image

FRET analizė tarp LANCL2-GFP ( A – C ) arba LANCL2sh-GFP ( D – F ) ir Gi-RFP HeLa ląstelėse. Reprezentatyvūs sužadinto donoro (su GFP sulieti baltymai: A, D ), sužadinto akceptoriaus (G-RFP: B, E ) emisijos ir išmatuoto FRET efektyvumo ( C, F ) vaizdai yra parodyti „Leica“ programinės įrangos pseudo spalvomis. Viršutiniame skydelyje nubrėžtos plazmosmbrininės ROI, o apatinių skydelių - atitinkamai visos ląstelės ROI. ( G ) diagrama: vidutinis FRET efektyvumas tarp LANCL2 ir Gi baltymų reikšmingai nesiskyrė, apskaičiuojant plazmos membranose (LANCL2-G pm) arba tarpląsteliniuose skyriuose (LANCL2-G ląstelėje). Tarp tirpių LANCL2sh-GFP ir G baltymų (LANCL2sh-G) buvo išmatuotos nereikšmingos FRET vertės. ( H ) HeLa ląstelės buvo transfekuotos nepažymėtu LANCL2 (LANCL2), GFP pažymėtu LANCL2 (LANCL2-GFP) arba nepažymėtu mutagenizuotu G2A LANCL2 (LANCL2-G2A). Praėjus 48 valandoms nuo transfekcijos, ląstelės buvo paveiktos 5 μM ABA ir apdorotos, kad būtų galima išmatuoti [cAMP] i lygį po 30 s, kaip aprašyta 15 punkte . Rezultatai išreiškiami kaip pmol cAMP / 106 ląstelės, neapdorotose (šviesiai pilkos juostos) arba ABA stimuliuotos (tamsiai pilkos juostos). * p <0, 02, palyginti su kontrole, naudojant t testą.

Visas dydis

Pagal šiuos rezultatus galime daryti išvadą, kad sąveikai su chimerinio G i -baltymo α subvienetu reikalingas su membranomis susijęs, myristoilintas, LANCL2, artimas LANCL2 ir G i, esantis tiek plazmos membranoje, tiek viduląstelinėse membranose.

Tada palyginome išgryninto rekombinantinio LANCL2 (LANCL2-gst) ir jo sutrumpintos trumpos formos (LANCL2sh-gst) jungimosi su ABA savybes. Abi formos buvo atskirtos nuo GST etiketės (1 papildoma lentelė), pagamintos taip, kaip aprašyta 6 punkte, bet suskaidytos, nesant DTT - fiziologingesnės būklės, dėl kurios didesnis surišimo afinitetas, nei buvo pastebėta anksčiau. Iš tiesų, specifinis ir prisotinamas [3H] ABA prisijungimas įvyko prie abiejų baltymų, kurių afinitetas yra panašus (trijų skirtingų eksperimentų Kd reikšmės atitinkamai buvo 8, 9 ± 1 μM ir 10, 6 ± 1, 4 μM LANCL2 ir LANCL2sh).

Taigi, 18 aminorūgščių LANCL2 N-galo ruožas, į kurį įeina miristotiliacijos vieta, nėra būtinas ABA surišimui.

Galiausiai mes ištyrėme skirtingų LANCL2 formų gebėjimą suaktyvinti ABA signalizacijos kelią, išmatuodami cAMP tarpląstelinės koncentracijos padidėjimą transfekuotose HeLa ląstelėse, pridėjus ABA (kaip aprašyta 15 ).

HeLa ląstelės, perkeltos nepažymėtu LANCL2 arba LANCL2-GFP, arba nepažymėtu mutagenizuotu LANCL2 (LANCL2-G2A), buvo inkubuotos su 5 μM ABA, o [cAMP] i buvo išmatuotas po 30 s. [CAMP] i padidėjo HeLa ląstelėse, per daug išreiškiančiose nepažymėtą LANCL2 (165 ± 19%, palyginti su bazinėmis, nestimuliuotomis vertėmis, p <0, 02) arba LANCL2-GFP (170 ± 21%, p <0, 02). Atvirkščiai, [cAMP] i nebuvo reikšmingai modifikuotas, palyginti su bazinėmis vertėmis ląstelėse, perkeltose ne myristoylatable LANCL2-G2A (94 ± 17%, p = 0, 6), 4H pav.

Todėl LANCL2 miristoilinimas ir funkcinė sąveika tarp LANCL2 ir chimerinio G i α subvieneto (4H pav.) Yra būtini, norint suaktyvinti ABA sukeltą adenilato ciklazę. Abu reikalavimai turi būti tenkinami plazmos membranoje ir vidinėse citoplazmos membranose.

Priešingai, norint prisijungti prie ABA, LANCL2 nereikia sujungti su plazmos membrana, nes 18 N-galo aminorūgščių apipjaustymas tam didelės įtakos neturi. Šis pastebėjimas leidžia manyti, kad neristiliuotas ir tokiu būdu laisvai difunduojamas LANCL2 galėtų surišti ABA ir suaktyvinti kitus, nuo cAMP nepriklausomus, signalizacijos kelius.

Diskusija

Čia mes parodėme, kad N-galo glicino miristoilinimas sukelia LANCL2 lokalizaciją plazmos membranoje ir citoplazminėse membranos pūslelėse. Įdomu tai, kad pastaruoju metu buvo pateikti įrodymai apie nekanonines sub-ląstelines G baltymo aktyvavimo vietas: tai apima funkciškai aktyvaus GPCR 39, 40, 41 endosominę lokalizaciją ir GIV / Girdin baltymo, ne receptoriaus guanino nukleotidų mainų faktoriaus, sąveiką., su heterotrimeriniais G baltymais Golgi 42, 43 ir dar neapibrėžtose intraląstelinėse vietose 44 . N-miristoilinto LANCL2 efektyvumas jungiantis su Gi fiziškai ir funkciškai (padidėja FRET efektyvumas ir [cAMP] i, 4 pav.), Taip pat, kai yra susietos su vidinėmis membranos pūslelėmis, yra dar vienas G baltymo tarpininkaujamo signalo inicijavimo ne kanoninės tarpląstelinės vietos.

Branduolinės LANCL2 lokalizacijos radimas paveikus ląsteles ABA (3 pav.) Rodo galimą LANCL2 vaidmenį ABA sukeltose transkripcijos vietose. Iš tiesų, anksčiau buvo pastebėta, kad ABA stimuliuoja kelių citokinų, reguliuojančių žmogaus mezenchiminių ir hemopoetinių kamieninių ląstelių proliferaciją, transkripciją. 18, 19, o augaluose ABA sukeltos transkripto variacijos yra gerai žinomos 45 .

Vis dar neatsakytas klausimas yra tas, ar branduolio importui reikalingas natūraliosios LANCL2 demiristoilinimas (pvz., Naudojant specifinius fermentus ar ribotą proteolizę, nukreiptą į N-galą), ir ar pats ABA surišimas gali paskatinti demiristoilinimą. Kol kas nepavyko nustatyti nė vienos deimiristoilintos LANCL2 formos, kurią vis dėlto būtų galima išvengti aptikimo dėl kelių priežasčių (pvz., Dėl trumpalaikio branduolio klirenso dėl trumpalaikio pobūdžio arba žemo specifiškumo antimyristoilo inkaro antikūno).

Faktai, kad LANCL2 yra tarpląstelinis ląstelė ir kad jo hormono ligadas ABA yra anijonas esant fiziologinėms pH reikšmėms ir todėl nesugeba pasiskirstyti po membranos lipidų dvisluoksnį sluoksnį, reiškia, kad, norint, kad tarpląstelinė ABA galėtų pasiekti savo receptorių, reikalingas transmembraninis pernešimas. Iš tiesų neseniai įrodyta, kad ABA antplūdis įvyksta per transmembraninį bikarbonato / chlorido 1 šilumokaitį (AE1, 3 juostos baltymas) eritrocituose 30 . Be to, dvikryptis ABA pernešimas per plazmos membraną taip pat gali palaikyti paracrininius mechanizmus, jau pastebėtus šio hormono 9, 10, 17, 18, 19, 21, 22 pagrindu, remiantis ABA išsiskyrimu iš vienos ląstelės ir jo suvokimu / signalizavimu kaimyninė ląstelė. Bet kokiu atveju faktas, kad ABA patenka į ląsteles per transmembraninį transporterį, yra išskirtinis tarp gyvūnų hidrofilinių hormonų, kurie jungiasi su tarpląsteliniu integruotų membranų receptorių domenu.

Apibendrinant, šis tyrimas išryškina kai kuriuos nekanoninius žinduolių ABA receptorių bruožus: i) LANCL2 yra sujungtas su membranomis, bet nėra vientisas membraninis baltymas, kurio miristoilinimas leidžia prisijungti prie G i baltymo ir suaktyvinti adenilato ciklazę; ii) po ABA surišančio LANCL2 gali persikelti į branduolį, mūsų žiniomis, precedento neturintį pobūdį, susijusį su membranos jungimu, sujungtu su G baltymu, receptoriui.

Įvairus LANCL2 tarpląstelinis elgesys gali lemti atsirandantį LANCL2 46 daugiafunkcionalumą, ląstelių taikinių heterogeniškumą ir ABA stimuliuojamo reguliavimo efekto šiose ląstelėse pleiotropiją, paveikdamas pagrindines sistemines funkcijas 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 47 .

Šie rezultatai praplečia mūsų žinias apie hormonų receptorių-G baltymų sąveikos su gyvūnais mechanizmus, pateikdami pirmąjį su transmembraniniu G baltymu sujungtą receptorių, galintį sukelti hormonų sukeltą branduolio translokaciją. Taigi atrodo, kad LANCL2 vienareikšmiškai turi du pagrindinius bruožus (G baltymo jungimąsi ir branduolio translokaciją), kurie kiekviena būdinga skirtingoms gyvūnų hormonų receptorių šeimai, ty atitinkamai peptidų ir steroidinių hormonų receptoriams.

Išsaugojimas ABA kaip streso hormono, reguliuojančio ląstelių reakciją į aplinkos dirgiklius augaluose, apatiniuose Metazojos (kempinės ir hidroidai ) 48, 49 ir žinduoliuose, rodo jo kilmę kaip bendrą gyvūnų ir augalų pirmtaką. Ši senovės evoliucijos šaknis iš tikrųjų gali priskirti šį hormoną savo kategorijai, palyginti su kitais gyvūnų hormonais.

Medžiagos ir metodai

Reagentai ir antikūnai

Pelės monokloninis antikūnas prieš žmogaus LANCL2 (LANCL2 mAb) buvo pagamintas dr. C. Fresia iš Molekulinės biotechnologijos centro (MBC), Turine (Italija), kaip aprašyta anksčiau 30 . Pirminis antikūnas - žmogaus vinkulinas - buvo savotiška E. Turco (MBC, Turinas) dovana. HRP konjuguoti antriniai antikūnai buvo iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Santa Krusas, CA); „Alexa-488“ konjuguoti buvo iš „Thermo Fisher Scientific“ (NY, JAV). 2-hidroksimiristinė rūgštis (HMA), audinių auginimo terpės ir papildai buvo įsigyti iš „Sigma-Aldrich“ (Milanas, Italija). HMA, ištirpinta chloroforme ir išdžiovinta N2, buvo resuspenduota 10 mM koncentracijos 1% BSA be riebalų rūgščių HBSS, per naktį purtant 33, 34 .

Ląstelių kultūros ir transfekcija

HeLa, HEK-293, MDA-MB-468, MDA-MB-239 ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje Eagle pilnoje ląstelių kultūros terpėje (DMEM su 10% vaisiaus vaisiaus serumo, 50 V / ml penicilino, 50 μg / ml streptomicino). Ląstelės buvo sėjamos 15 000 / cm 2 greičiu ant 25 mm stiklinio dangtelio Menzel-Glaser N1.5 (Tecnovetro SRL, Monza, Italija), ant 8 šulinėlių apvalių stiklinių stiklinių (Lab-Tek, Nunc, Thermo Fisher Scientific, NY, JAV). ) arba ant 35 mm Petri lėkštelių 24 valandas prieš transfekciją ir palaikomos drėgnoje 5% CO 2 atmosferoje 37 ° C temperatūroje.

Ląstelės buvo transfekuotos kalcio fosfato metodu 50, į šviežią pilną terpę įpilant 10% tūrio transfekcijos reagento, sudaryto iš Hepes buferinio druskos tirpalo, 100 mM CaCl2 ir 30 μg / ml DNR, neturinčios endotoksinų (paruošto naudojant EndoFree Plasmid Midi Kit)., QIAGEN, laikydamiesi gamintojo nurodymų). Terpė buvo pakeista po 12–16 val.

Paruoštas naudoti „CellLight ®“ plazminės membranos-RFP konstruktas (molekuliniai zondai, „Thermo Fisher Scientific“, Waltham, MA, JAV) buvo perneštas į ląsteles praėjus 24 valandoms po LANCL2-GFP transfekcijos, naudojant „BacMam 2.0“ technologiją; jis buvo gautas ekspresuojant raudoną fluorescencinį baltymą (RFP), sulietą su miristoilinimo / palmitoilinimo seka iš Lck tirozinkinazės, užtikrinant tikslų ir specifinį nukreipimą į ląstelės plazminę membraną.

Vakarų botas

Western blot analizė buvo atlikta standartiniais metodais, kaip aprašyta anksčiau 28 : 5–50 μg skirtingų ląstelių lizatų (1% SDS, 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 1: 200 proteazės inhibitorių kokteilis, Sigma-Aldrich). 10% poliakrilamido gelis.

Rekombinantiniai baltymai ir [3H] ABA surišimas

Rekombinantinių baltymų ekspresija ir gryninimas buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau 5 . Panaudotos BL21 (DE) E. coli ląstelės buvo auginamos Luria – Bertani terpėje (Difco, BD Italia, Roma, Italija).

LANCL2-gst arba LANCL2sh-gst (1 papildoma lentelė) išsiskyrimas buvo pasiektas naudojant „PreScission Protease“ („GE Healthcare“), inkubuojant su GSH-Sefaroze susietą sulietą baltymą 16 h 4 ° C temperatūroje, vadovaujantis gamintojo instrukcijomis, tačiau be DTT: proteazės skilimas paliko 9 aminorūgštis baltymo N-gale, atsižvelgiant į Mw skaičiavimus.

Norėdami palyginti specifinį [3H] ABA jungimąsi su rekombinantiniu LANCL2-gst ir LANCL2sh-gst, pagamintu E. coli , atlikome, kaip aprašyta anksčiau 6 punkte .

[3H] ABA surišimo į nepaliestas MDA-MB-468 ir MDA-MB-231 ląsteles eksperimentai buvo atlikti, kaip anksčiau aprašyta 15 punkte .

Imunofluorescencija ir fluoroforai

HeLa arba HEK-293 ląstelės 24 valandas prieš transfekciją, 2-HMA apdorojimą ar fiksavimą buvo auginamos 18 arba 25 mm skersmens apvalkaluose, anksčiau padengtuose poli-L-lizinu (Sigma-Aldrich). Mėginiai buvo apdoroti fiksuoti RT 10 minučių para-formaldehidu (4% PBS), po to permeabilizuoti 8 minutes 0, 1% Triton X100, 10 minučių užblokuoti 3% BSA, 1 valandą inkubuoti anti-LANCL2 mAb 5 μg / ml 3% BSA ir 30 minučių nudažomas 10 μg / ml Alexa Fluor 488 antriniu antikūnu („Thermo Scientific“). Montavimo terpė buvo Mowiol + 2, 5% DABCO (Sigma-Aldrich).

Gyvai analizei ląstelės buvo palaikomos visiškai DMEM be fenolio raudonojo, papildyto 20 mM Hepes.

Naudotų fluoroforų sužadinimo / emisijos maksimumai buvo šie: „Alexa 488 495/519“, „EGFP 488/507“, „PAGFP 504/517“, „TagRFP“ ir „CellLight ® -RFP 555/584“.

Lokalizacijos vaizdai buvo gauti naudojant „Leica TCS SP2“ konfokalinį mikroskopą („Leica Microsystem“, Heidelbergas, Vokietija), aprūpintą argono / He-Ne lazerio šaltiniais ir Leica HCX PL APO CS 63.0 X N.A1.40 alyvos objektyvu.

Norėdami atmesti galimybę, kad EGFP sintezė gali paveikti tarpląstelinį pasiskirstymą, mes apdorojome HeLa ląsteles, kurios per daug ekspresuoja nepažymėtą LANCL2, N-miristoilo transferazės inhibitoriaus 2-hidroksimiristine rūgštimi (HMA), tada baltymą dažėme specifiniu anti-LANCL2 mAb; kaip papildomą kontrolę, siekdami užtikrinti, kad HMA gydymas 51, 52 negalėjo sukelti ląstelėje esančių morfologinių pokyčių, turinčių įtakos LANCL2 lokalizacijai, mes panaudojome mutagenizuotą LANCL2 formą, turinčią G2A mutaciją (todėl nėra jautrią mirostiliacijai), sulietą su EGFP.

cDNR konstrukcijos

cDNR, koduojanti žmogaus LANCL2, buvo subklonuotas iš anksčiau turimų konstrukcijų 6 į šį ekspresijos vektorių: pEGFP-N, pcDNA3.1 +, pPAGFP-N1, pGEX-6P-1. Kai jie buvo suderinami, subklonavimui buvo naudojamos restrikcijos fermento vietos; priešingu atveju ir sutrumpintoms LANCL2 formoms (LANCL2sh-gst, LANCL2sh-GFP) buvo sukurti specifiniai pradmenys, turintys norimas restrikcijos fermento vietas PCR amplifikacijai iš plazmidės (TibMolBiol, Genova, Italija). G2A specifinė mutagenezė buvo gauta naudojant „QuickChange Lighting Site-Directed Mutagenezė Kit“ (Agilent Technologies; Santa Clara, CA), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis, pritaikytomis atitinkamame / analogiškame / tinkamame vektoriuje.

EGFP ir PAGFP žymės buvo sulietos LANCL2 baltymų formų C gale.

EGFP koduojančioje seka turėjo A207K mutaciją, kad pašalintų galimą EGFP fragmento 53 dimerizaciją.

Chimerinio G i baltymo α subvienetas buvo subklonuotas į pTagRFP-C („Evrogen“, Maskva, Rusija), tokiu būdu gaunant N-galą, susijungiantį su TagRFP monomeriniu baltymu.

Visos cDNR konstrukcijos (1 papildoma lentelė) buvo patvirtintos sekos nustatymu (TibMolBiol).

FRAP ir fotoaktyvinimo eksperimentai

„HeLa“ ląstelės buvo laikinai transfekuotos LANCL2-GFP arba LANCL2sh-GFP FRAP eksperimentams arba su LANCL2-PAGFP arba LANCL2-G2A-PAGFP FDAP eksperimentams ir apdorotos 48 valandas po transfekcijos. Vaizdai buvo gauti naudojant „Nikon A1“ konfokalinį mikroskopą („Nikon Corporation“, Tokijas, Japonija), aprūpintą 60 X PlanApo aliejaus panardinimo objektyvu (NA 1.40). Visi vaizdai, pataisyti atsižvelgiant į fluorescencinį foną, buvo išanalizuoti naudojant ImageJ 1.48v (Wayne Rasband, Nat. Inst. Of Health, JAV), o gauti duomenys gauti naudojant „Excel“ programinę įrangą (Microsoft).

Atliekant FRAP eksperimentus, EGFP fluorescencinė emisija buvo išbalinta 6 μm skersmens ROI 0, 12 s, naudojant 405 nm lazerio liniją, priartinant prie ROI, kad būtų kuo labiau sumažinta fotobalinimo trukmė 54 . Fluorescencijos atkūrimas buvo stebimas 120 s, imant mėginį 488 nm Argon Laser linija.

Kiekvienu laiko momentu buvo ištirta vidutinė išbalintos ROI fluorescencijos vertė (F t ), kaip aprašyta 37, 55 : kiekviena IG F t buvo normalizuota IG, kuriai netaikomas fotobalinimas, F t, kad būtų koreguota dėl EGFP fotobalinimo dėl vaizdavimo procedūra. Iš fotobalinimo pataisytos F t vertės buvo atimtos iš pirmųjų balinimo po fotobalinimo verčių ir normalizuotos pagal vidutinę fluorescencijos vertę, išmatuotą prieš fotobalinimą.

Fluorescencijos atkūrimo pėdsakai buvo pritaikyti viena eksponentine lygtimi („GraphPad Prism“, versija 5.01, skirta „Windows“, Kalifornija, JAV):

Image

kuri leido apskaičiuoti pusės laiko konstantą (t ½ ), laikas, per kurį fluorescencija atsistato iki 50% asimptoto (plokščiakalnio) intensyvumo (F max ), kaip t ½ = τ * ln2.

Kiekvienai eksperimento sąlygai visos kreivės buvo suvestinės ir skirtingų populiacijų t ½ vertės buvo palygintos naudojant Studento t-testą.

Buvo išanalizuota skirtingo dydžio IG, gavus panašius rezultatus.

Fotoaktyvinimas buvo atliktas sudominant PAGFP su 405 nm lazerio linija 8 μm skersmens ROI viduje 0, 063 s. Fluorescencinis skilimas fotoaktyvintoje srityje buvo vaizduojamas 3 minutes greitai difunduojančiam LANCL2-G2A-PAGFP ir 25 min. - LANCL2-PAGFP, naudojant 488 nm lazerio liniją.

Kaip kontrolę mes panaudojome PFA fiksuotas HeLa ląsteles, ekspresuojančias LANCL2-PAGFP, kad stebėtume galimą PAGFP fotobalinimą per stebėjimo laiką.

Fiksuotose ląstelėse nei mūsų ląstelių fotoaktyvacijos, nei fiksuotų ląstelių fotoaktyvacijos metu, nei fiksuotų ląstelių, nei ROI, balinimo nepastebėta.

Po fotoaktyvacijos buvo pakoreguota vidutinė IG fluorescencijos vertė (F t ) kiekvienu laiko momentu, atsižvelgiant į fluorescenciją, išmatuotą prieš fotoaktyvaciją; tada jis buvo normalizuotas iki F t0, kur t0 yra pirmasis kadras po fotoaktyvinimo.

Duomenys buvo sujungti su viena eksponentinio skilimo lygtimi, remiantis

Image

kur F t∞ yra normalizuota fluorescencijos vertė begaliniu laiku. Kiekvienos eksperimentinės būklės pusinės eliminacijos laikas (t ½ ) buvo vidutinis ir skirtingos populiacijos buvo palygintos naudojant Studento t-testą.

FRET vaizdavimas ir analizė

Fluorescencinis (arba Förster) rezonanso energijos perdavimas (FRET) leidžia ištirti baltymų sąveiką, išmatuoti neradiacinį energijos pernešimą iš sužadintos būsenos ar fluoroforo (donoro) į kitą fluoroforą (akceptorių) per atstumą, palyginamą su dydžiu. baltymų 56, 57 . Kaip teigiama neinvaziniu sensibilizuotos emisijos (SE) metodu, taikomu gyviesiems bandiniams, po donoro sužadinimo FRET lemia donoro emisijos sumažėjimą kartu padidinant akceptorių emisiją dėl dipolinės molekulių sąveikos 58 .

EGFP ir TagRFP pažymėtų baltymų raiška HeLa ląstelėse, išaugintose 8 šulinėlių apvalkalų stikliniuose stikluose (Lab-Tek, Nunc, Thermo Scientific), buvo parodyta praėjus 2 dienoms po transfekcijos konfokaline mikroskopija, naudojant Leica TCS SP5 AOBS (Leica Microsystem, Heidelbergas, Vokietija). ) su alyvos panardinimo objektyvu 63x / 1, 4 NA. Šviesos rinkimo konfigūracija buvo optimizuota atsižvelgiant į pasirinktų fluorochromų derinį, spektrinius langus parinkus „Leica SP5“ skenavimo galvutės akustinio-optinio pluošto skirstytuvu.

Vaizdams gauti buvo naudojamas „Leica“ LAS AF programinės įrangos paketas. FRET efektyvumas (FE) buvo matuojamas naudojant jautriosios emisijos metodą 57 . Trumpai tariant, matavimai buvo atlikti aptikant donoro, FRET ir akceptoriaus fluorescencinius signalus sekos skenavimo būdu, gautu naudojant Leica Microsystem “FRET SE Wizard” programinę įrangą. Tas pats procesas buvo taikomas tik donorams ir tik akceptoriams skirtiems etaloniniams mėginiams ląstelėse, parinktose taip, kad vizualiai parodytų fluorescencijos intensyvumą. Iš gautų vaizdų mes apskaičiavome kalibravimo koeficientus, reikalingus sužadinimo ir išmetamųjų teršalų šalinimui koreguoti.

Kiekviename eksperimente 8–15 ląstelių FE buvo apskaičiuotas plazmos membraną reprezentuojančiose ląstelėse arba visos ląstelės, įskaitant ROI, pagal FE = (B - βA - γC) / C, kur A, B, C yra donoro, FRET ir akceptoriaus emisijos bei β ir γ yra kalibravimo koeficientai, pataisantys atitinkamai donoro ir akceptoriaus kryžminį sužadinimą.

Statistinė analizė

Duomenys buvo lyginti naudojant nesuporuotą Studento testą. Nustatyta statistinė reikšmė, kai P vertė buvo <0, 05. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant „GraphPad Prism Software“ arba „Microsoft Excel“ programinę įrangą.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Fresia, C. et al . G-baltymų jungimasis ir žmogaus abscisinės rūgšties receptoriaus LANCL2 branduolinė translokacija. Mokslas. Rep. 6, 26658; „doi“: 10.1038 / srep26658 (2016).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.