G1556s tipo tuberino variantas slopina naviko susidarymą gumbelinės sklerozės 2 mutantų (ekerių) žiurkėse, nepaisant to, kad trūksta mtor slopinimo | onkogenas

G1556s tipo tuberino variantas slopina naviko susidarymą gumbelinės sklerozės 2 mutantų (ekerių) žiurkėse, nepaisant to, kad trūksta mtor slopinimo | onkogenas

Anonim

Anotacija

Baklažanas, naviką slopinantis baltymas, kurį gamina gumbų sklerozės genas TSC2 , žemyn reguliuoja Rheb-mTOR-S6K kelią (mTOR ašis). Palyginus žmogaus tuberino mutacijų, tokių kaip G1556S, poveikį, galima daryti išvadą, kad kiaušidžių sklerozės patogenezėje taip pat gali dalyvauti kiti keliai nei mTOR ašis. Čia mes išbandome šią galimybę naudodamiesi žiurkės G1556S tipo mutacija (GSM) ir transgenine Eker ( Tsc2 mutantu) žiurkių sistema. Ląstelėms, ekspresuojančioms GSM-tuberiną, nepavyko sureguliuoti mTOR ašies. GSM-tuberinas turėjo pakitusią lokalizaciją, dėl kurios sumažėja gebėjimas sudaryti kompleksą su hamartinu, ir specifinis fosforilinimo būklės pokytis vietoje, rodantis skirtingą Akt reguliavimą. Po GSM-transgeninių (GSM-Tg) žiurkių buvo slopinami makroskopiniai inkstų navikai po gydymo N -metil- N -nitrozokarbamidu. Įdomu tai, kad žiurkėms su silpnesne GSM-Tg raiška buvo mikroskopiniai cistiniai ir ikivėžiniai pažeidimai, kurių dydis ir išplėtimas buvo riboti, nors jie turėjo hiperfosforilinimą ribosominiu baltymu S6. Šie rezultatai išryškina naują kelią, susijusį su tuberinu, kuris reguliuoja naviko slopinimą nepriklausomai nuo mTOR slopinamosios funkcijos. Tokio naujo kelio nustatymas duos aiškią reikšmę naujų terapinių taikinių generavimui gydant šiuos navikus.

Pagrindinis

Vamzdinė sklerozė (TSC) yra autosominis, dažniausiai paveldimas sutrikimas, kurio paplitimas yra 1/6000 (Gomez ir kt., 1999). Klinikiniai simptomai yra įvairūs: nuo centrinės nervų sistemos anomalijų (smegenų vamzdeliai, traukuliai, protinis atsilikimas) iki daugybinių įvairių organų hamartomų (inkstų ar kepenų angiomyolipoma, širdies rabdomioma, plaučių limfangioleiomyomatosis, tinklainės hamartoma, angiofibroma). Dviejų genų, TSC1 (hamartinas; 9q34) ir TSC2 (tuberinas; 16p13.3), mutacijos yra susijusios su šiais fenotipais, ir šie genai buvo paženklinti kaip naviko slopinimo genai.

Ekerio žiurkėms yra heterozigotinė Tsc2, žmogaus TSC2 homologo, mutacija ir iki 1 metų amžiaus išsivysto paveldimas inkstų vėžys (Eker ir Mossige, 1961; Hino ir kt., 1993a, 1994; Yeung ir kt., 1994; Kobayashi). et al., 1995). Homozigotinė mutacija yra embriono mirtina. Anksčiau mes sukūrėme transgenines Eker žiurkes, turinčias cDNR ir laukinio tipo (WT) žiurkių Tsc2 promotorius , ir įrodėme , kad transgenas (Tg) slopina tiek inksto kancerogenezę Ekerio heterozigotuose, tiek embrioninį letalumą homozigotose (Kobayashi et al., 1997). . Tyrimai, naudojantys Drosophila melanogasterį ir žinduolius, parodė, kad tuberino ir hamartino kompleksas sumažina Rheb-mTOR-S6K1 kelią (mTOR ašį) (Manning ir Cantley, 2003; Li ir kt., 2004; Martin ir Hall, 2005). Gyvūnų modelių ir TSC pacientų pažeidimai rodo hiperfosforilinimą ribosomų baltyme S6 (rpS6), kuris yra S6K1 substratas (Kenerson ir kt., 2002; Kwiatkowski ir kt., 2002). Remiantis šių tyrimų stebėjimais, buvo manoma, kad mTOR ašis atlieka pagrindinę navikogenezės funkciją, atsirandančią dėl Tsc1 / Tsc2 mutacijų, todėl buvo svarstoma terapijos, pagrįstos šios ašies slopinimu, galimybė. Iš pradžių mTOR buvo nustatyta kaip tikslinė rapamicino molekulė, ir tai rodo, kad šis junginys gali pasirodyti efektyvus. Mes nustatėme, kad iš pelių gautų Tsc2 - / - ląstelių tumorigeninį poveikį veiksmingai slopina gydymas rapamicinu (Kobayashi et al., 2003). Kitos grupės pranešė apie panašų poveikį, kai Ekerio žiurkės ar išmuštos pelės buvo gydomos rapamicinu, nors jose buvo keletas likusių navikų (Kenerson ir kt., 2005; Lee ir kt., 2005, 2006). Šie rezultatai rodo, kad rapamicinas gali sėkmingai gydyti, ir pradėti klinikiniai rapamicino tyrimai TSC sergantiems pacientams. Nors šių tyrimų rezultatų dar nėra, kyla susirūpinimas dėl rapamicino monoterapijos veiksmingumo ir galimo imuninę sistemą slopinančio didelių vaistų dozių poveikio (Easton and Houghton, 2006; Faivre ir kt., 2006; Franz ir kt.). 2006; Granville ir kt., 2006; Bissler ir kt., 2008; Davies ir kt., 2008). Abiejų susirūpinimą gali apeiti kuriant vaistus, veikiančius sinergiškai su rapamicinu ir kurie galėtų būti naudojami kombinuotai terapijai, arba alternatyvius vaistus, kurių taikiniai skiriasi nuo rapamicino. Taigi, norint nustatyti naujus molekulinius taikinius, pageidautina ištirti kelius, nepriklausomus nuo rapamicinui jautrios mTOR ašies.

TSC pacientų analizė parodė, kad simptomų sunkumas skyrėsi atsižvelgiant į tam tikras žmogaus tuberino mutacijas (Niida ir kt., 1999). Taigi pacientams, kuriems yra tuberino mutacija N525S, būdingas fenotipas (žievės gumbai, subependiminės milžiniškų ląstelių astrocitomos, inkstų angiomyolipomos, širdies rabdomiomos), nepaisant to, kad mutavęs baltymas išlaiko savo Rheb-GAP aktyvumą ir slopina mTOR ašį (Nellist et. al., 2001, 2005; Shah ir Hunter, 2004). Priešingai, G1556S mutacija, esanti su Rheb-GAP susijusioje srityje, smarkiai veikia Rheb-GAP aktyvumą, tačiau sukelia palyginti lengvus klinikinius simptomus pacientams, kurių smegenys vaizduojamos normaliai, pažeidimai turi tik odą ir retkarčiais pasireiškia kitos hamartomos ( Mayer ir kt., 2004; Nellist ir kt., 2005). Šie variantai suteikia galimų užuominų, kaip atsegti įvairius mTOR ašies aspektus ir (arba) kitus nežinomus TSC patogenezės kelius. Čia mes panaudojome Tg-Eker žiurkių sistemą, norėdami išanalizuoti būdingą G1556S tipo mutacijos (GSM) poveikį in vivo ir nustatėme naują tuberino savybę, nepriklausančią nuo žinomos reguliavimo funkcijos mTOR ašyje.

Mes ištyrėme, ar žiurkių GSM-tuberinas HEK293T ląstelėse pakeitė komplekso formavimąsi su hamartinu. Kaip pranešta anksčiau (Mayer ir kt., 2004; Nellist ir kt., 2005), GSM-tuberino ekspresijos lygis ląstelių lizatuose buvo šiek tiek mažesnis nei WT-tuberino. Taigi, norėdami padidinti baltymo ekspresijos lygį, mes taip pat perkėlėme didesnį kiekį (1, 5 karto) GSM-tuberino ekspresijos plazmidės. Mes nustatėme, kad GSM-tuberinas pasižymi pastebimai sumažinta sąveika su hamartinu, net esant aukštesniam išraiškos lygiui (1a pav.). Kaip pranešta anksčiau, Y1571H tipo tuberino sąveika taip pat sumažėjo (Aicher ir kt., 2001). Priešingai, žiurkės tuberinas su N525S tipo mutacija (NSM-tuberinas) turėjo tą patį sąveikos aktyvumą kaip normalus tuberinas (1a pav.). Imunocitocheminė analizė, naudojant konokalinį lazerinį mikroskopą, atskleidė naujus kokybinius skirtumus tarp WT ir GSM tuberinų. HEK293T ląstelėse, ekspresuojančiose WT arba NSM tuberiną, baltymas buvo tipiškai pasiskirstęs citozolyje kaip keli perinukleariniu būdu susiję tankūs kūnai (PNDBs; papildomi paveikslai S1a ir b). Tačiau GSM-tuberinas retai sudarė PNDB. Vietoj to, dominuojantis modelis buvo homogeninis pasiskirstymas citozolyje be PNDB (Papildomas paveikslas S1c). Ląstelėse, kuriose buvo ekspresuojamas hamartinas, baltymų buvo tankiuose kūnuose, išsklaidytuose visame citozolyje (papildomas paveikslas S1d). Kai hamartinas buvo ekspresuojamas kartu su WT arba NSM tuberinu, abu baltymai buvo apriboti PNDB (1b paveikslas ir papildomas S1e paveikslas). Priešingai, hamartinas buvo difuziškai pasiskirstęs ląstelių, kurios kartu ekspresuoja GSM arba Y1571H tipo tuberiną, citozolyje (1c paveikslas ir papildoma S1f nuotrauka). Paaiškėjo, kad nei GSM, nei Y1571H tipo tuberinas negalėjo stabilizuoti hamartino PNDB. Apskritai, mūsų rezultatai rodo, kad sumažėjusi GSM-tuberino sąveika su hamartinu pirmiausia atsirado dėl GSM-tuberino lokalizacijos trūkumų.

Image

Hamartino ir tuberino variantų sąveikos nustatymas. a ) Bendrosios imunoprecipitacijos analizė. HEK293T ląstelės buvo dedamos į 6 šulinėlių plokšteles, padengtas kolagenu, esant 5 x 104 ląstelių / šulinio tankiui. Po 1 dienos apdengimo ląstelės kartu transfekuotos su HA pažymėto hamartino ir FLAG žymėto WT tuberino plazmidėmis arba jų variantais (GSM, NSM ir Y1571H tipo), naudojant FuGENE6 (Roche Diagnostics GmbH, Manheimas, Vokietija). pagal gamintojo instrukcijas. Po 2 dienų ląstelės buvo lizuojamos NP40 lizės buferiu (10 mM Tris-HCl (pH 7, 4), 150 mM NaCl, 0, 5 mM EDTA, 10 m M NaF, 1% NP40, 2 μg / ml aprotinino, 5). μg / ml leupeptino, 1 μg / ml pepstatino A, 1 m M Na 3 VO 4, 10 m M β-glicerofosfato, 10 m M Na 4 P 2 O 3 ) ir inkubuojami 30 min., švelniai maišant 4 ° C temperatūroje. gavyba. Tada ląstelių ekstraktai centrifuguojami 12 000 g 20 minučių 4 ° C temperatūroje, o supernatantas buvo surinktas kaip lizatas. Imuninis nusėdimas buvo atliktas naudojant monokloninį anti-HA agarozės konjugatą (Sigma, St Louis, MO, JAV) pagal gamintojo protokolą. Tada buvo atliktas imunoblotų nustatymas (IB), kaip aprašyta anksčiau (Sun ir kt., 2007), naudojant atitinkamus antikūnus prieš kiekvieną žymę (Sigma). GSM-tuberino atveju taip pat buvo atlikta transfekcija su 1, 5 karto didesniu plazmidės kiekiu (juosta GSMx1, 5). Norėdami sužinoti apie plazmidės sudarymą, žiūrėkite papildomą medžiagą ir metodus. ( b ir c ) Laikinai išreikšto WT- ( b ) arba GSM-tuberino ( c ) vaizdavimas lazeriu ir konfokaliu HEK293T ląstelėse. Ląstelės buvo dedamos į indą su stikliniu dugnu (Matsunami, Osaka, Japonija), kurio tankis yra 1 x 10 4 ląstelės / duobutėje, transfekuotos kaip a punkte. Praėjus 48 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo fiksuotos ir permeabilizuotos 2% paraformaldehidu ir 0, 1% Triton X-100 30 minučių 4 ° C temperatūroje. Tada jie buvo inkubuojami su pirminiais antikūnais per naktį 4 ° C temperatūroje, antriniais antikūnais („Alexa Fluor 488“ pažymėtais antivirusiniais IgG; „Alexa Fluor 568“ pažymėtais anti-triušiais IgG, „Invitrogen“, Carlsbad, CA, JAV) ir DNR dėme 4 ′., 6-diamidino-2-fenilindolio dihidrochloridas (DAPI, Invitrogen) 1 valandą kambario temperatūroje ir ištirtas naudojant LSM510 META lazerio konfokalinį mikroskopą (Carl Zeiss, Oberkochen, Vokietija). Atskirose plokštėse rodomi šie vaizdai: viršutinė kairė, DAPI (mėlyna); viršutinė dešinė, anti-FLAG (tuberinas, žalia); kairysis apatinis, anti-HA (hamartinas, raudonas); apatinė dešinė, sujungtas vaizdas.

Visas dydis

GSM-tuberinas parodė greitesnį gelio mobilumą nei WT-tuberinas (2 paveikslas). Manoma, kad žmogaus G1556S-tuberinas, kurio gelio judrumas panašus, yra hipofosforilintas (Mayer ir kt., 2004). Taigi atlikome masės spektrometrijos (LC-ESI-MS / MS) analizę, kad ištirtume tikslią kiekvieno tuberino varianto fosforilinimo būklę. Mes nustatėme, kad serino liekana, atitinkanti žmogaus tuberino Ser939 (toliau fosforilinti likučiai aprašomi naudojant atitinkamus žmogaus tuberino skaičius paprastumui), parodė hipofosforilinimą GSM, bet ne NSM tuberinu (papildomas paveikslas S2a ir S1 lentelė) ). Ši liekana yra viena pagrindinių Akt fosforilinimo taikinių (Ser939 ir Thr1462) (Inoki ir kt., 2002; Manning ir kt., 2002). Toliau atlikome imunoblotų analizę, naudodami žmogaus tuberino Ser939 fosforilinimo specifinį antikūną, kuris taip pat kryžmiškai reaguoja su žiurkės tuberinu. Remiantis MS analizės rezultatais, imunoblotai parodė mažesnį GSM-tuberino fosforilinimo lygį (2 pav.). Fosfo-Akt (Ser473) kiekis reikšmingai nesiskyrė, o tai rodo, kad pakitusi fosforilinimo būsena atsirado dėl tuberino (pvz., Konformacijos) pokyčių, o ne dėl Akt kinazės aktyvumo. MS ir imunoblotų analizė parodė, kad įvairūs tuberinų tipai reikšmingai nesiskyrė nuo Thr1462 fosforilinimo (duomenys nepateikti). MS analizė taip pat parodė, kad Ser1132, priklausantis nedidelių nuo Akt priklausomų fosforilinimo vietų kategorijai (Inoki ir kt., 2002; Manning ir kt., 2002), buvo hiperfosforilintas GSM tuberinu, palyginti su WT ir NSM. -tuberinas (papildomas S2b paveikslas ir S1 lentelė). Deja, šiai vietai nėra specifinio fosforilinimo antikūno, užkertančio kelią ištirti jo fosforilinimo būklę imunoblotu. Mūsų rezultatai rodo, kad GSM skirtingai veikia jautrumą nuo Akt priklausomo fosforilinimo esant kelioms skirtingoms liekanoms. Tai atitinka ir, atrodo, paaiškinimą pastebėjimui, kad žmogaus G1556S-tuberinas nėra visiškai atsparus nuo Akt priklausomam fosforilinimui, kaip vyksta R611Q mutantiniame tuberine, tačiau pasižymi sumažėjusiu jautrumu (Mayer ir kt., 2004), tai yra hipofosforilinimas pagrindinėje vietoje ir hiperfosforilinimas mažojoje vietoje suteikia sumažintą, bet nepanaikintą fosforilinimą. Vietos, atitinkančios Ser939 ir Thr1462, yra išsaugotos Drosophila melanogaster kaip fosforilinimo taikiniai. Atvirkščiai, Ser1132 atitinkanti liekana yra išsaugota stuburiniuose gyvūnuose (pelėse, žiurkėse ir fugu ), bet ne Drosophila . Fosforilinimas dviejose pagrindinėse Akt-taikinio vietose neigiamai reguliuoja tuberino / hamartino sąveiką ir teigiamai reguliuoja mTOR ašį (Dan et al., 2002; Inoki et al., 2002; Manning et al., 2002). Palyginti mažai dėmesio buvo skiriama funkcijai, kurią gali turėti nedidelės Akt-taikinio vietos, slopindamos tuberino mTOR. Tačiau tai gali reikėti iš naujo apsvarstyti, jei šios nedidelės Akt tikslinės vietos reguliuoja tuberino funkciją kitaip nei pagrindinės Akt tikslinės vietos. Įdomu tai, kad Y1571H tipo tuberino fosforilinimo būsena buvo panaši į GSM-tuberino, ir tai rodo, kad šiems mutacijų sukeltiems funkciniams pokyčiams, susijusiems su hamartino surišimu ir (arba) slopinančiu mTOR ašį, gali būti naudojamas bendras mechanizmas (papildoma S1 lentelė). ). Apskritai, tuberino reguliavimas nuo Akt priklausomo fosforilinimo atrodo sudėtingesnis, nei manyta anksčiau, ir tai gali būti raktas norint išsiaiškinti naują, toliau aptariamą tuberino sukeliamą kelią.

Image

Tuberinų variantų fosforilinimo būklė. HEK293 ląstelės buvo transfekuotos plazmidėmis, turinčiomis FLAG pažymėtą WT tuberiną arba variantus (GSM arba NSM), naudojant FuGENE6. Po 48 h transfekcijos buvo gauti ląstelių lizatai, kaip aprašyta 1 paveiksle, ir imuninis nusodinimas atliktas naudojant anti-FLAG M2 afinitetinį gelį (Sigma) pagal gamintojo instrukcijas. Imunoblotai (IB) buvo atlikti naudojant anti-tuberino (C18; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-phospho (S939) -tuberin (Epitomics, Burlingame, CA, USA) arba anti-phospho (Ser473) -Akt antikūnus. (D9E; ląstelių signalizacijos technologija, Beverly, MA, JAV). GSM-tuberino atveju taip pat buvo atlikta transfekcija dvigubai didesniu ekspresijos plazmidės kiekiu (juosta GSMx2).

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme tuberino variantų poveikį mTOR ašiai. WT ir NSM tuberinas parodė S6K ir S6 fosforilinimo slopinimą, tačiau ląstelės su GSM tuberinu neslopino fosforilinimo tokiu pat laipsniu, kaip ir ląstelės, neturinčios egzogeninio tuberino (3a pav.). Net tada, kai ląstelės buvo transfekuotos dvigubai didesniu kiekiu GSM tuberino nei WT arba NSM tuberinu, S6K ir S6 fosforilinimas nebuvo slopinamas (3a paveikslas; juosta, GSM × 2). Kito eksperimento metu, naudojant MKOC1-277 ( Tsc2 - / - ) ląsteles (Kobayashi et al., 2003), fosfo-rpS6 taip pat buvo visiškai slopinamas ląstelėse, ekspresuojančiose WT arba NSM tuberiną, palyginti su kitomis Tsc2 - / - ląstelėmis, neturinčiomis egzogeninių. tuberinas (3b ir c paveikslai). Tačiau ląstelės, ekspresuojančios GSM-tuberiną, išlaikė sureguliuotą fosfo-rpS6 būseną (3d pav.). Šiame eksperimente vėl buvo pastebėtas GSM-tuberino nesugebėjimas formuoti PNDB (3b – d pav.). Iš šių analizių darome išvadą, kad žiurkės GSM tuberinas pasižymėjo tomis pačiomis savybėmis, kaip ir jo atitikmuo žmonėms. Ypač svarbus buvo mTOR slopinamojo aktyvumo praradimas per GSM, kurio negalėjo išgelbėti padidinta išraiška. Šie rezultatai, kaip ir imunocitocheminės analizės rezultatai, rodo, kad PNT gali susidaryti mTOR slopinantis kompleksas.

Image

Tuberino variantų poveikis mTOR ašiai. ( a ) Rheb sukeltas S6K ir S6 fosforilinimas ląstelėse, ekspresuojančiose kiekvieną tuberino variantą. HEK293 ląstelės buvo kartu transfekuotos su HA-hamartino, HA-Rheb plazmidėmis (žr. Papildomą medžiagą ir metodus) ir kiekvienu iš FLAG-tuberino variantų, kaip aprašyta 1 paveiksle. Po 48 h transfekcijos ląstelės buvo lizuojamos SDS- PAGE mėginio buferis ir baltymų koncentracija buvo nustatyti naudojant DC baltymų tyrimo rinkinį (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, JAV). Pirmiausia lizatai buvo ištirti, ar nėra transfekuotų plazmidžių ekspresijos, atlikus imunoblotus (IB) su žymės antikūnais. Rodomas tik FLAG (tuberino) rezultatas. MTOR ašies būsena buvo ištirta naudojant anti-fosfo (Thr389) -p70 S6 kinazę (108D2, Cell Signaling Tech.), Anti-p70 S6 kinazę (C-18, Santa Cruz Biotech.), Anti-fosfo (Ser235 / 236). ) -S6 ribosomų baltymas (Cell Signaling Tech.) Arba anti-S6 ribosomų baltymo antikūnas (Cell Signaling Tech.). GSM-tuberino atveju taip pat buvo atlikta transfekcija dvigubai didesniu plazmidės kiekiu (juosta GSMx2). Juosta (-) rodo tuščią tuberino ekspresijos plazmidės kontrolę. ( b - d ) S6 fosforilinimas Tsc2 turinčiose ląstelėse, ekspresuojančiose kiekvieną tuberino variantą. MKOC1-277 ląstelės buvo kultivuojamos RPMI1640 terpėje, papildytoje 10% FBS ir antibiotikais (Kobayashi et al., 2003). ŽYMĖJIMA pažymėti WT- ( b ), NSM- ( c ) ir GSM-tuberinas ( d ) buvo laikinai ekspresuojami MKOC1-277 ( Tsc2 - / - ) ląstelėse. Netiesioginis imunofluorescencinis dažymas buvo atliktas, kaip aprašyta 1 paveiksle, naudojant pirminius antikūnus prieš FLAG žymę ir fosfo-ribosominį baltymą S6 (Ser 235/236). DAPI buvo naudojamas branduoliams dažyti. Skydeliai rodo šiuos vaizdus: viršutinė kairė, DAPI (mėlyna); viršutinė dešinė, anti-FLAG (tuberinas, žalia); kairysis apatinis, anti-fosfo-rpS6 (raudonas); apatinė dešinė, sujungtas vaizdas.

Visas dydis

Norėdami ištirti GSM-tuberino funkciją in vivo, naudodamiesi transgenine Eker žiurkių sistema (Kobayashi ir kt., 1997; Momose ir kt., 2002), mes sukūrėme TGS, kad būtų galima ekspresuoti GSM-tuberiną (GSM-Tg) (papildomas paveikslas). S3a). Įvedę GSM-Tg, gavome penkias transgenines žiurkes, kurios įkūrė, ir dar penkias, turinčias WT-Tg (papildomas S3b paveikslas ir duomenys nepateikti). Gyvūnai buvo naudojami nustatant dvi nepriklausomas linijas, kurios parodė stabilų gemalo linijų perdavimą (4a, b paveikslai ir papildomas S3c paveikslas). Lyginome auglių slopinamąją GSM-Tg ir WT-Tg funkciją žiurkėms Tsc2 + / Eker, naudojant transplacentinį ENU gydymą (Hino ir kt., 1993b; Kobayashi ir kt., 1997; Momose ir kt., 2002). Ne kontrolinės Tg turinčios Tsc2 + / Eker žiurkės buvo naudojamos kaip kontrolė ir joms išsivysto daugialypė inkstų karcinoma abipusiai 6 ar 10 savaičių amžiuje (4c paveikslas ir papildoma S2 lentelė, Tg (-); n = 14). Kaip pranešta anksčiau, WT-Tg įvedimas visiškai slopino ENU sukeltas inkstų karcinomas (4c paveikslas ir papildoma S2 lentelė, WT; n = 6) (Kobayashi ir kt., 1997; Momose ir kt., 2002). Keista, kad inkstų karcinomos buvo visiškai nuslopintos linijoje, turinčioje GSM-Tg (4c paveikslas ir papildoma S2 lentelė, GSM; n = 6). Šie rezultatai leidžia manyti, kad tuberinas gali veikti kaip naviko slopiklis net ir praradus jo slopinamąjį aktyvumą mTOR ašyje. Tolesnė analizė atskleidė, kad kitoje GSM-Tg linijoje, kuriai būdingas silpnesnis išraiškos lygis, remiantis šiaurinės dėmės analize (4b paveikslas, „Weaker-GSM“; n = 8), buvo intriguojantis fenotipas. Nors navikas buvo slopinamas šioje transgeninėje linijoje (4c paveikslas ir papildoma S2 lentelė), žiurkėms buvo nustatyti keli maži cistiniai ir ikivėžiniai pažeidimai hiperfosforilinant rpS6 (4d paveikslas). Nepaisant to, šie pažeidimai buvo minimalūs, palyginti su Tg neigiamomis žiurkėmis. Ypač buvo įdomu, kad net esant silpnam išraiškos lygiui, GSM-Tg, nepaisant hiper-aktyvuotos rpS6 būklės, gali daryti akivaizdų ribojantį poveikį cistogenezei ir naviko išplėtimui. Navikams slopinanti GSM-tuberino funkcija domina lengvus TSC simptomus pacientams, kuriems nustatyta G1556S mutacija. Viena tikėtina hipotezė yra tai, kad tuberinas, be mTOR slopinimo, atlieka ir kitą funkciją, kuriai įtakos neturi GSM, ir yra svarbi auglių slopinimui transgeninėse žiurkėse. Ši spėjama funkcija gali būti išsaugota ir susijusi su patogeneze žmonėms. Kitas galimas paaiškinimas yra tas, kad likusio mTOR slopinančio GSM-tuberino aktyvumo pakanka augliogenezei slopinti. Tačiau tai mažai tikėtina, nes mTOR slopinimo nepavyko pasiekti padidinus GSM-tuberino ekspresijos lygį in vitro , nors negalima visiškai atmesti galimybės.

Image

In vivo GSM-Tg analizė. a ) Genotipo patvirtinimas. Endogeninio Tsc2 PCR genotipas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau (Fukuda ir kt., 1998), išskyrus 3MFJ2 pradmens (5′-CTATGGCCACATGTGACCAA-3 ′) naudojimą vietoje 3MFJ grunto. Tgs PGR genotipui nustatyti buvo naudojami RTSC68 (5′-TGAGTCCAATAAGCCCATCC-3 ′, į priekį, exon34) ir RTSC10 (5′-CAAAGTCATTGCCCAGGTG-3 ′, atvirkštiniai, exon 37) pradmenys. Parodomi kontrolinės žiurkės [(-) ir + / +] bei GSM-Tg žiurkės (GSM ir + / Eker) Tg (kairė viršutinė dalis) ir endogeninių Tsc2 (kairė apatinė) ir (+) + rezultatai. Nurodoma endogeninio laukinio tipo Tsc2 alelio (Wt) ir gemalinės linijos mutanto Tsc2 alelio padėtis Eker žiurkėje (Eker). Dešiniajame skydelyje parodytas amplifikuoto Tg specifinio PGR fragmento sekos analizės rezultatas. G1556S tipo mutacijos vieta pažymėta brūkšniu. Gruntai ir PGR sąlygos aprašyti papildomose medžiagose ir metoduose. b ) GSM-Tg išraiškos lygių s Northern-blot analizė. Bendros RNR iš inkstų buvo išskirtos naudojant TRIZOL reagentą pagal gamintojo protokolą (Invitrogen). Dešimt mikrogramų visos RNR buvo tiriama šiauriniu būdu. Hibridizacija buvo atlikta naudojant arba Tsc2 cDNR zondą, arba zondą, kuriame yra papildomas SV40 poli-A signalas, skirtas Tg specifiniams transkriptams. Juostos: (-), ne transgeninė kontrolė; GSM, du jaunikliai iš pirmosios eilės; Silpnesnis GSM, du šuniukai iš antros linijos. c ) ENG sukeltos inkstų kancerogenezės slopinimas Tg. ENU buvo skiriamas transplacentiniu būdu 15-ą embriono dieną (80 mg / kg nėščios žiurkės kūno svorio), o palikuonys buvo paaukoti 10 savaičių amžiaus (Momose ir kt., 2002). Reprezentatyvūs inkstų vaizdai iš netogeninių (ne Tg) ir transgeninių (WT-Tg, GSM-Tg ir GSM-Tg su silpnu ekspresijos lygiu) Ekerio heterozigotai. d ) fosfo-S6 baltymo imunohistochemija (IHC). Inkstų audiniai buvo fiksuojami 10% buferiniu formalinu, įterpiami į parafiną ir pjaustomi. Mėginiai buvo parafinuoti, iš anksto pašildyti 10 mM natrio citrato buferiu (pH 6, 0) mikrobangų krosnelėje ir 10 minučių iš anksto apdoroti 3% H2O2 tirpalu. Blokavimas buvo atliekamas naudojant 5% normalaus ožkos serumo skalbimo buferyje (1% BSA, Tris buferiniu tirpalu, 0, 1% Tween 20, 0, 07% NaN 3 ). Tada mėginiai buvo inkubuojami su pagrindiniu antikūnu prieš fosfo (Ser235 / 236) -S6 ribosomų baltymą (skiedimas 1/200 skalbimo buferyje) per naktį 4 ° C temperatūroje. Antikūnų surišimas buvo aptiktas naudojant Envision sistemą (DAKO, Glostrup, Danija) ir 3, 3′-diaminobenzidine tetrahidrochloridą (DAB; Dojindo, Kumamoto, Japonija) kaip peroksidazės substratą, po kurio buvo padengtas dažymas hematoksilinu. Parodyti trys reprezentatyvūs ir nepriklausomi inkstų pavyzdžiai iš kiekvienos grupės. Mastelio juosta 500 μm.

Visas dydis

Žiurkės, sukėlusios heterozigotinį poveikį Tsc2 ir turinčios WT-Tg, sukūrė homozigotinius Tsc2 mutantų palikuonis ( Tsc2 Eker / Eker ) greičiu, atitinkančiu numatomą Mendelio santykį ( 7/64 = 10, 9%). Priešingai, mums pavyko gauti tik 2 homozigotus iš 88 palikuonių (2, 3%) panašiu kryžiumi, bet su tėvais, nešančiais GSM-Tg. Taigi atrodo, kad GSM-Tg gebėjimas išgelbėti homozigotinius Tsc2 Eker / Eker mutantų embrionus, palyginti su WT-Tg. Mes taip pat auginome fibroblastus iš kiekvieno iš Eker homozigotų, kuriuos išgelbėjo GSM-Tg, ir patvirtinome, kad būdingi GSM tuberino bruožai, kalbant apie mTOR slopinimą ir S939 fosforilinimą, taip pat buvo in vivo (papildomas paveikslas S4). Nors GSM tuberinas išlaiko savo auglį slopinančią funkciją, jam gali būti sunku slopinti embriono mirtingumą Tsc2 mutantų homozigotuose. Kadangi mTOR atlieka pagrindinę funkciją koordinuojant ląstelių metabolizmą, ląstelių augimą ir ląstelių dauginimąsi (Astrinidis ir Henske, 2005; Guertin ir Sabatini, 2007), jo disreguliacija gali turėti sunkesnį ardantį poveikį įvairiems embriono vystymosi aspektams. Gali būti, kad išgelbėtus šuniukus veikia nežinoma grįžtamojo ryšio sistema, kad būtų išvengta mirtinų defektų, kuriuos vystymosi metu sukelia Tsc2 trūkumas . Jei toks grįžtamojo ryšio mechanizmas egzistuoja, tada jo išsiaiškinimas taip pat bus svarbus mūsų supratimui apie naviko slopinimo mechanizmą. Pažymėtina, kad vienas iš „ Tsc2 Eker“ / „Eker“ mutantų, turinčių GSM-Tg, staiga mirė neturėdamas akivaizdžių priežasčių. Galimas numanomas grįžtamojo ryšio mechanizmas gali būti nepakankamas normaliai sveikatai palaikyti vėlesniais Tsc2 Eker / Eker mutantinių žiurkių suaugusiųjų gyvenimo etapais.

Panašu, kad šio tyrimo rezultatai patvirtina dar vieną kelią, be mTOR ašies, turinčios naviko slopinimo funkciją. Buvo pranešta, kad monoterapinis rapamicino paskyrimas gyvūnams, kuriems trūksta Tsc2 (pelėms su išmušama ir Ekerio žiurkėms) su nustatytu naviku, paskatino naviko regresiją, tačiau esant likutiniam navikui arba nepavykus išnaikinti mikroskopinių ikivėžinių pažeidimų (Kenerson et al., 2005; Lee ir kt., 2005, 2006). Šie rezultatai taip pat rodo, kad, be mTOR ašies, egzistuoja ir antrasis kelias, susijęs su tuberinu, nors kyla susirūpinimas dėl vaistų atsparumo rapamicinui. Čia panaudota transgeninė sistema leido ištirti šį spėjamą kelią be akivaizdžių galimo atsparumo vaistams padarinių. MTOR kelias atlieka svarbią funkciją vykstant Tsc2 naviko progresavimui, tačiau jo indėlis į ankstyvus tumorigeninius reiškinius nėra toks tikras (Kenerson et al., 2005). Tai, kad rapamicinas sumažėjo, bet negailėjo tam tikrų pažeidimų, ir buvo neveiksmingas slopinant pirmtakų pažeidimus, gali parodyti, kad rapamicinui jautrus kelias vėlesnėse stadijose turi reikšmingesnę funkciją. Nepaisant rpS6 būklės padidėjimo, pasiūlytas naujas būdas gali apriboti navikų plėtrą ir gali būti svarbus ankstesniuose navikogenezės etapuose. Vertinant kartu, įrodymai rodo, kad gydymo būdai gali parodyti stadijos specifiškumą ir darbo pasidalijimą bei (arba) darbo koordinavimą Tsc2 turinčių navikų atveju. Klinikinių rapamicino klinikinių tyrimų, skirtų gydyti vėžį, apžvalgos rodo, kad dauguma navikų tipų nereaguoja į vieno veiksnio gydymą rapamicino dariniais (Easton ir Houghton, 2006; Faivre ir kt., 2006; Granville ir kt., 2006). Atsižvelgiant į tai, reikia skubiai išaiškinti šio naujo kelio, kaip tolesnio tikslo, mechanizmą derinant gydymą rapamicinu ir (arba) kitais prieinamais junginiais (Fabian ir kt., 2005; Dancey ir Chen, 2006; O'Reilly). et al., 2006).

Naudodamiesi transgenine Eker žiurkių sistema, mes gavome naujus in vivo duomenis, rodančius, kad yra anksčiau nežinomas kelias ir koks yra tuberino reguliavimo elgesys. Naujasis būdas parodė tuberino sukeltą naviko slopintuvo funkciją mūsų sistemoje ir bus kitų mūsų tyrimų dėmesys; šis kelias gali būti kandidatas į TSC ir vėžio terapiją. Buvo pranešta apie kitas žmogaus TSC2 mutacijas, susijusias su švelnesniais fenotipais (Jansen ir kt., 2006). Šios mutacijos taip pat gali pateikti įkalčių, padėsiančių išsiaiškinti TSC patogenezę. Mūsų transgeninė Eker žiurkių sistema taip pat galėtų būti panaudota tuberino, paveikto tokiomis mutacijomis, funkcinei analizei in vivo .

Papildoma informacija

„Powerpoint“ failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma medžiaga

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)