Geno pagrindu atlikto genomo asociacijos tyrimas nustatė liesos kūno masės 19p13.3 | mokslinės ataskaitos

Geno pagrindu atlikto genomo asociacijos tyrimas nustatė liesos kūno masės 19p13.3 | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Genetinis polinkis į ligas
  • Genomo asociacijų tyrimai

Anotacija

Liesa kūno masė (LBM) yra sudėtingas žmogaus sveikatos bruožas. Norėdami nustatyti genominius lokusus, pagrindžiančius LBM, mes atlikome genų pagrįstą liesos masės indekso (LMI) asociacijos tyrimą su 1000 nesusijusių kaukaziečių ir pakartojome 2283 nesusijusiais kaukaziečiais. Genų pagrindu atliktų asociacijų analizė išryškino reikšmingas trijų genų UQCR, TCF3 ir MBD3 asociacijas viename lokuse 19p13.3 (atradimas p = 6, 10 × 10 −5, 1, 65 × 10 −4 ir 1, 10 × 10 −4 ; replikacija p = 2, 21). × 10 –3, 1, 84 × 10 –3 ir 6, 95 × 10 –3 ; atitinkamai p = 2, 26 × 10 –6, 4, 86 ​​× 10 –6 ir 1, 15 × 10 –5 . Šie rezultatai, kartu su žinomu trijų genų funkciniu tinkamumu LMI, leido manyti, kad 19p13.3 sritis, kurioje yra UQCR, TCF3 ir MBD3 genai, yra naujas lokusas , lemiantis liesos masės kitimą.

Įvadas

Raumeninis audinys, kuriam būdinga liesa kūno masė (LBM), yra susijęs su žmogaus sveikata. Mažas LBM gali būti susijęs su įvairiomis sveikatos problemomis, tokiomis kaip sarkopenija, nutukimas ir padidėjęs mirtingumas 1, 2 . LBM yra genetiškai kontroliuojamas, jo paveldimumas viršija 50% 3, 4 . Ankstesniuose GWA tyrimuose buvo rasti nauji vieno nukleotido polimorfizmai (SNP) ir genai, susiję su LBM 5, 6, 7 . Tačiau didžioji dauguma LBM kandidato genų turi būti atskleisti. LBM gali būti tiksliai išmatuotas naudojant dvigubos energijos rentgeno spindulių absorptiometriją (DXA). Kūno liesos masės indeksas (LMI) dažnai naudojamas prognozuoti sarkopeniją 8, 9 .

Genominiai regionai gali turėti alelinį heterogeniškumą fenotipui, ty keli regiono variantai turi įtakos fenotipui kartu. Esant aleliniam heterogeniškumui, genų asociacijos testas gali pagerinti genetinės asociacijos analizės statistinę galią ir patikimumą, integruojant kelis SNP signalus į bendrą statistiką 10, 11 . Genų tyrimams buvo sukurta daugybė statistinių metodų, pavyzdžiui, „Versatile Gene-based Association Study“ (VEGAS) 12 . VEGAS sujungia kelių SNP genų srities p- vertes į genų skalę, tuo pačiu apskaičiuodamas sąsajos pusiausvyrą (LD), imituodamas genotipo duomenis iš daugiamatės normalios pasiskirstymo permutacijos tyrime. VEGAS yra efektyvus skaičiavimais, nes permutacijos modeliavimų skaičius yra adaptyvus. Jo veikimas yra panašus į kitų statistinių metodų 12, tačiau jis yra pranašesnis už kitus tam tikromis sąlygomis, nes atliekant permutaciją naudojamas didelis gyventojų atskaitos skydas. Todėl ji naudoja tik apibendrintą statistiką, o ne neapdorotus genotipo ir fenotipo duomenis, todėl ji tinkama didelės apimties metaanalizės rezultatų suvestinėms.

Šiame tyrime mes pranešėme apie LMI geno pagrindu sukurtą GWAS, kad nustatytume genetinius lokusus, pagrindžiančius LBM variaciją. Į atradimo imtį buvo įtraukta 1000 nesusijusių kaukaziečių, kuriems buvo nustatytas geografinis Affymetrix 500 k geografinis matricas. Į replikacijos mėginį buvo įtraukti 2283 nesusiję kaukaziečių tiriamieji, genotipuoti naudojant Affymetrix SNP6.0 genotipo matricą. Abiejų mėginių genotipai buvo priskaičiuoti naudojant 1000 genomų projekto sekos nustatymo atskaitos grupę.

Medžiagos ir metodai

Etikos pareiškimas

Tyrimo dalyviai buvo verbuojami iš Omahos ir Kanzaso bei jų kaimyninių miestų. Tyrimą patvirtino Kreightono universiteto ir Misūrio-Kanzaso universiteto institucinės apžvalginės tarybos. Visi dalyviai prieš stodami į tyrimą pateikė rašytinius informuotus sutikimo dokumentus. Metodai, atlikti pagal patvirtintą tyrimo protokolą.

Dalykai

Atradimo pavyzdys

Atradimą sudarė 1000 nesusijusių kaukaziečių iš Europos protėvių, iš kurių 501 buvo vyrai ir 499 moterys. Mėginys buvo atsitiktinai parinktas iš didelio masto žmonių grupės, kurioje buvo daugiau kaip 6000 tiriamųjų. Įtraukimo ir neįtraukimo į bylas kriterijai buvo aprašyti ankstesniuose mūsų leidiniuose 13 .

Replikacijos pavyzdys

Replikacijos imtį sudarė 2283 nesusiję Europos protėvių subjektai. Buvo 556 tiriamieji vyrai ir 1727 moterys. Visi tiriamieji buvo sveiki asmenys, įdarbinti iš Vidurio Vakarų JAV. Tarp atradimo subjektų ir replikacijos grupių nebuvo sutapimo.

Fenotipų nustatymas

Visi tiriamieji užpildė struktūrizuotą klausimyną, apimantį gyvenimo būdą, ligos istoriją, šeimos duomenis, antropometrinius kintamuosius ir kt. Liesos ir riebalinės kūno masės (FBM) buvo matuojamos Hologic QDR 4500 W DXA skaitytuvu („Hologic Inc.“, Bedford, MA, JAV). ). Svoris buvo matuojamas lengvais drabužiais, remiantis kalibruota svarstyklių svarstykle. Aukštis buvo gautas naudojant kalibruotą stadionometrą. Liesos masės indeksas (LMI, kg / m 2 ) buvo apskaičiuotas kaip liesos masės ir 14 aukščio kvadrato santykis.

Genotipų nustatymas ir kokybės kontrolė

Genominė DNR buvo išgauta iš periferinio kraujo leukocitų, naudojant komercinį išskyrimo rinkinį („Gentra Systems“, Mineapolis, MN, JAV). Genotipas buvo atliktas, kaip aprašyta ankstesniame leidinyje 15 . Trumpai tariant, atradimų grupei buvo atliktas genotipas su „Affymetrix Mapping 250 K Nsp“ ir „Affymetrix Mapping 250 K Sty“ matricomis „Vanderbilt Microarray Shared Resource“ Vanderbilto universiteto medicinos centre (Našvilis, TN, JAV), naudojant standartinį protokolą, kurį rekomendavo gamintojas (Affymetrix, Inc., Santa Klara, Kalifornija, JAV). Kaukazo replikacijos kohorta buvo genotipizuota naudojant Affymetrix SNP 6.0 matricas pagal standartinį gamintojo protokolą.

Mes laikėmės griežtos kokybės kontrolės (QC) tvarkos. Buvo įtraukti pavyzdžiai, kurių mažiausias skambučių dažnis buvo 95%. Mes atsisakėme SNP, kurie nukrypo nuo Hardy-Weinbergo pusiausvyros ( p <0, 0001) ir tų, kurių mažesnis alelių dažnis (MAF) yra mažesnis nei 0, 01. Po QC atradimo mėginyje liko 379 319 SNP.

Genotipo imputacija

Genotipo imputacija buvo taikoma tiek atradimo, tiek replikacijos mėginiams, kaip 1000 Genomų projekto sekų variantai buvo naudojami kaip atskaitos grupė (nuo 2010 m. Rugpjūčio mėn.). Į kontrolinį mėginį buvo įtraukti 283 Europos protėviai.

Išsami genotipo imputacijos proceso detalės buvo aprašytos anksčiau 16 . Trumpai tariant, prieš imputaciją buvo patikrinta sruogų orientacija tarp etaloninio skydo ir mėginio, o neatitikimai buvo pašalinti, keičiant tiriamąjį mėginį į atvirkštinę sruogą arba pašalinant SNP iš tiriamojo mėginio. Imputacija atlikta naudojant MINIMAC 17 . Tiriamųjų SNP kokybės kontrolė buvo taikoma pagal šiuos kriterijus: imputacija r 2 > 0, 5 ir MAF> 0, 01. SNP, neatitinkantys QC kriterijų, nebuvo įtraukti į vėlesnę asociacijų analizę.

SNP pagrįstų asociacijų analizė

Genetiškai pagrįstų asociacijų analizei mes naudojome VEGAS, kurioms kaip įvestis naudojamos atskiros SNP asociacijos p vertės. Todėl pirmiausia atlikome SNP pagrįstą asociacijų analizę, kad sugeneruotume asociacijos signalus. Gyventojų stratifikacijos problemos korekcijai mes panaudojome pagrindinį komponentų metodą 18 . Abiejuose mėginiuose kovariaciniai rodikliai, įskaitant lytį, amžių, 2 amžių, riebalų kūno masę (FBM) ir pirmuosius penkis pagrindinius komponentus 19, 20, išvestus iš viso genomo duomenų apie genotipą, buvo tikrinami siekiant reikšmingumo, naudojant laipsnišką tiesinės regresijos modelį, įdiegtą R funkcijos stepAIC. Neapdorotos KMI vertės buvo pakoreguotos reikšmingais kovariaciniais rodikliais (amžius, lytis ir FBM), o liekanos buvo normalizuotos atvirkštiniais standartinio normaliojo pasiskirstymo kvantitais.

Buvo tiriamos genetinės asociacijos tarp genotipuotų ir (arba) sąlygotų SNP ir normalizuotų fenotipų, taikant papildomą paveldėjimo būdą, naudojant MACH2QTL 21, 22, kuris fenotipą atitiko alelių dozavimu pagal tiesinės regresijos modelį.

Ryšio pusiausvyros (LD) matas r 2 buvo apskaičiuotas naudojant „Haploview 23“ . Norėdami ištirti galimą klaidinantį poveikį, kurį sukelia gyventojų stratifikacija, įvertinome genomo kontrolės infliacijos koeficientą ( λ ) 24 .

Genų tyrimas naudojant VEGAS

Buvo tiriamas genų asociacijos testas, siekiant nustatyti genus, susijusius su fenotipu. Tokiai analizei mes naudojome VEGAS metodą, kuris reikalauja įvesti LD struktūros informaciją ir atskiras SNP p vertes kaip 12 įvestį. SNP įtraukimo kriterijai buvo tokie patys kaip atskirų SNP testų. Tiksliau, mes reikalaujame, kad SNP įskaitymo tikslumas r 2 > 0, 5 ir MAF> 0, 01.

Meta-analizė

Reikšmingi genai, identifikuoti atradimo mėginyje, buvo pakartoti replikacijos mėginyje. Tada du genais pagrįsti asociacijos signalai buvo analizuojami kartu su Fišerio metodu. Tiksliau, Fišerio statistika buvo apskaičiuota taip:

Image

kur p 1 ir p 2 buvo dvi genų lygio p vertės. Pagal niekinę hipotezę, kad nėra jokio susiejimo, ši statistika maždaug atitinka chi-kvadrato pasiskirstymą su 4 laisvės laipsniais. Atminkite, kad Fišerio metodas visada galioja nepriklausomai nuo to, ar dviejų efektų dydžių kryptys yra suderintos.

Genų lygio efekto krypties įvertinimas

Norėdami įvertinti dviejų genų lygio poveikio krypčių nuoseklumą, mes ištyrėme visų atskirų SNP poveikį gene ir pasiūlėme bendrą geno lygio poveikio krypties matavimą. Tada mes palyginome abiejų priemonių kryptis. Norėdami tai pasiekti, mes nustatėme, kad visi SNP efektai atradimo mėginyje yra teigiami, kad genų lygio z balas būtų įvertintas

Image

, kur

Image
yra teigiamas i -ojo SNP z-balas atradimo pavyzdyje. Jei nurodytas SNP z-balas yra neigiamas, tada etaloninis alelis ir alternatyvus aleliai pasikeis taip, kad z-balas pasikeis teigiamas. Pavyzdžiui, jei etaloninis alelis ir alternatyvusis alelis yra A ir G , o alelio A z-balas yra −1, 0, tada alelis G , kurio z balas yra 1, 0, pasikeis į etaloninį alelį.

Kai visi etaloniniai aleliai bus nustatyti remiantis atradimo mėginiu, mes apskaičiuosime replikacijos mėginio geno lygio z rezultatą taip:

Image
, kur
Image
yra etaloninio alelio z-balas i -ajame SNP. Jei z replikacija yra teigiama, tada ji turi tą pačią kryptį, kaip ir z atradimas , ir mes deklaruojame, kad abu genai yra nuoseklūs veiksmo kryptimi; priešingu atveju jie yra priešingi veiksmingumo krypčiai.

Rezultatai

Pagrindinės tiriamųjų, naudotų tiek atradimo, tiek replikacijos pavyzdžiuose, charakteristikos apibendrintos 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Atradimo pavyzdys

Naudodamiesi genotipų ir numanomais genotipais iš mūsų 1000 kaukaziečių tiriamųjų su GWAS duomenimis, mes išbandėme SNP ryšį su LMI. Bendras genominės kontrolės infliacijos koeficientas buvo 1, 05. Norėdami pakoreguoti galimą gyventojų stratifikaciją, pataisėme individualias p vertes pagal infliacijos koeficientą. SNP pagrįstų asociacijų rezultatų logaritminė kvantilė-kvantilė (QQ) yra pavaizduota 1 pav. 1 pav., Koreguojant genomo kontrolės metodą, populiacijos stratifikacijos įrodymų nepastebėta. Manhatano genomo asociacijos rezultatų brėžinio diagrama parodyta 2 pav. Nėra genomo reikšmingo asociacijos signalo.

Image

Visas dydis

Image

Visas dydis

Atlikdami individualius SNP pagrįstus testus, mes atlikome genų tyrimus, naudodami VEGAS programinę įrangą. Į atradimų pavyzdžių genų asociacijos testą įtraukta 17 511 genų. Bonferroni pataisa naudojama norint deklaruoti genomo reikšmingumo lygį (GWS, 0, 05 / 17, 511 = 2, 86 × 10 −6 ). Genų pagrįstų asociacijų rezultatų QQ diagrama parodyta 3 pav. Pasiskirstymo uodegoje pastebimas ryškus nuokrypis, reiškiantis tikrus asociacijos signalus. Genetinės asociacijos rezultatų Manhatano grafikas parodytas 4 pav.

Image

Visas dydis

Image

Visas dydis

Nė vienas iš genų nėra reikšmingas GWS lygyje. Esant mažiau griežtam 2 × 10 –4 ribų lygiui, yra 11 genų, kurie yra reikšmingi. Reikšmingiausias genas yra GATA4, esant 8p23, 1 (p = 2, 40 × 10 –5 ). Šie 11 genų yra išskirstyti į 6 skirtingas genomo sritis.

Replikacijos pavyzdys

11 siūlomų atradimo pavyzdžių, susijusių su genais, pakartojami replikacijos pavyzdyje. SNP ir genų asociacijų analizės replikacijos mėginyje yra tokios pačios, kaip ir atradimo pavyzdyje. Tik trys genai iš to paties lokuso 19p13.3 ( UQCR p = 2, 21 × 10 −3, TCF3 p = 1, 84 × 10 −3, MBD3 p = 6, 95 × 10 −3 ), o kiti 8 genai nėra reikšmingi.

Metaanalizuojant atradimo ir replikacijos pavyzdžius Fišerio metodu, UQCR signalas pasiekia GWS lygį (atradimas p = 6, 10 × 10 −5, replikacija p = 2, 21 × 10 −3, kartu p = 2, 26 × 10–6 ), o TCF3 ir MBD3 signalai yra artimi GWS lygiui ( TCF3 kartu p = 4, 86 ​​× 10 –6, MBD3 kartu p = 1, 15 × 10 –5 ).

Derinant įrodymus tiek iš atradimo, tiek iš replikacijos pavyzdžių, trys genai ( UQCR, TCF3 ir MBD3 ) iš vieno lokuso 19p13.3 yra įtikinamai susieti su LMI, pritaikius riebalų masę. Pagrindiniai rezultatai išvardyti 2 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Šie trys genai yra atskirti ne daugiau kaip 170 kb. Jų išbandyti regionai sutampa. SNP šiame lokuse yra padalijama į kelis haplotipo blokus. Regioninė LD struktūra ir asociacijos signalai parodyti 5 pav.

Image

Visas dydis

Genų lygio efekto krypties įvertinimas

Įvertinome genų lygio poveikio krypčių nuoseklumą tarp atradimo ir replikacijos mėginių. Kiekviename tyrime mes pasiūlėme geno lygio efekto krypties matavimą ir tada palyginome abi matavimo priemones. Rezultatai pateikti 2 lentelėje. Atradimų pavyzdžio z balai pagal apibrėžimą visada yra teigiami. Iš lentelės aišku, kad replikacijos mėginio z balai visais atvejais taip pat yra teigiami, tai reiškia, kad abu tyrimai yra nuoseklūs visų trijų įvertintų genų atžvilgiu.

Diskusija

Šiame tyrime mes atlikome viso genomo asociacijos tyrimą su 1000 nesusijusių Kaukazo asmenų ir pakartojome 2283 nesusijusiais Kaukazo asmenimis. Derindami tiek atradimo, tiek replikacijos mėginio duomenis, mes nustatėme tris genus UQCR, TCF3 ir MBD3, esančius 19p13.3, kurie buvo susieti su LMI.

Genų tankis 19-ojoje chromosomoje yra didžiausias iš visų žmogaus chromosomų, daugiau nei dvigubai didesnis už vidutinį genomo lygį. Tankiai išdėstytos pasikartojančių DNR sekų genų šeimos reiškia, kad tai yra biologinės ir evoliucinės reikšmės chromosoma 25, 26 .

UQCR geno produktas yra ubichinolio-citochromo c reduktazės kompleksas, dar vadinamas mitochondrijų III kompleksu. Jis veikia kaip mitochondrijų kvėpavimo grandinės dalis. Tai taip pat gali veikti kaip geležies sieros baltymą rišantis veiksnys. Mitochondrijų kompleksą III sudaro vienas mitochondrijų užkoduotas subvienetas (MT-CYB) ir dešimt branduolinių kodų subvienetų. Kompleksas yra vidinėje mitochondrijų membranoje ir vaidina svarbų vaidmenį biocheminėje ATP sintezėje. Jis funkcionuoja katalizuodamas elektronus, kad iš sukcinatų ir nikotinamidų adenino dinukleotidų sujungtos dehidrogenazės būtų perkeltos į mitochondrijų užkoduotą citochromą b. Jis taip pat naudoja energiją protonų perkėlimui per membraną 27 . Nustatytas izoliuoto III komplekso trūkumas pacientams, kuriems yra tiek vaikų, tiek ir suaugusiųjų neuromuskuliniai ir neneuromuskuliniai sutrikimai 28 .

TCF3 (3 transkripcijos faktorius) genas koduoja du pagrindinius spiralės-kilpos-spiralės (HLH) transkripcijos faktorius E12 (sinonimai - imunoglobulino transkripcijos faktorius-1 (ITF1)) ir E47 (transkripcijos faktorius-3 (TCF-3)) 29 . Manoma, kad šie du veiksniai veikia reguliuodami ląstelių augimą, diferencijuodami raumenų ląsteles ir įsipareigodami. Mechanizmas yra tas, kad jie veikia kaip linijinės specifinių HLH baltymų, tokių kaip miogeniniai veiksniai, mioblastų nustatymas (Myod) ir miogeninas (Myog), 30 dimerizacijos partneriai.

Miogeninės specifikacijos ir diferenciacijos procesus reguliuoja miogeninių pagrindinių HLH transkripcijos veiksnių grupė, apimanti Myod, Myog, 5 myogeninį faktorių (Myf5) ir 6 myogeninį faktorių (Myf6) 31 . Šie heterodimerai sukuria sudėtingą kelią (papildomas 1 pav.), Vedantį į raumenims būdingų kritinių genų ekspresiją. Jie taip pat skatina pirmtakų ląsteles (mioblastus) vystytis į daugiadumbles ir diferencijuotas raumenų ląsteles (myotubes) 32 .

MBD3 (metilą rišantis 3) genas, užkoduotas baltymas, yra „NuRD“ - kelių subvienetų komplekso, susidedančio iš Hdac1 (histono deacetilazė1), Hdac2, Rbbp7 ir Rbbp4, subvienetų, turinčių nukleozomų pertvarkymo ir histono deacetilazės aktyvumų, dalis33. I klasės histono deacetilazė Hdac1 yra susijusi su MyoD. Jis gali deacetiliuoti „MyoD“ ir blokuoti pastarojo funkciją pradedant miogeninę programą diferenciacijos sąlygomis 34 . Skirtingose ​​raumenų ląstelėse sumažėjęs HDAC1 lygis yra susijęs su padidėjusiu MyoD acetiliacijos lygiu, kuris stimuliuoja transkripciją 35 .

Nepaisant galimo jų svarbos liesos masės vystymuisi, mažai tikėtina, kad visi trys identifikuoti genai yra priežastiniai. Taip yra todėl, kad šie genai identifikuojami statistinio susiejimo, o ne biologinio patvirtinimo būdu. Statistinei asociacijai įtakos turi LD struktūra ir paprastai ji vadinama netiesioginiu genų žemėlapiu. Šie trys genai turi sutampančius tiriamuosius regionus ir jie turi aukštą LD lygį.

Norėdami išsamiau ištirti jų galimą priežastinį vaidmenį, mes panaudojome neseniai sukurtą metodą „PrediXcan“, kad išanalizuotume tris identifikuotus genus 36 . Trumpai tariant, „PrediXcan“ metodas impulsuoja neprižiūrimus GWAS mėginių genų ekspresijos lygius ir tiria sąsają tarp implicitinių genų ekspresijų ir bruožo. Deja, nė vienas iš trijų identifikuotų genų nėra reikšmingas PrediXcan metodu (p> 0, 05). Mes supratome, kad „PrediXcan“ metodas priklauso nuo SNP eQTL efekto analizuojamam genui. Norėdami įvertinti, ar nėra „eQTL“ efekto, per „Haploreg 37“ ieškojome GTEx duomenų rinkinių ir nustatėme, kad analizuotų SNP eQTL efektai yra labai riboti. Pavyzdžiui, iš 34 SNP, naudojamų UQCR geno signalui apskaičiuoti, nė vienas neturi eQTL aktyvumo jo išraiškai. Priežastinių genų nustatymas vis dar laukia tolesnių funkcinių tyrimų.

Apibendrinant, mes nustatėme 19p13.3 sritį, kurioje yra UQCR, TCF3 ir MBD3 genai, kurie buvo reikšmingai susiję su LMI Kaukazo populiacijoje. Šie rezultatai kartu su žinomomis trijų su LBM susijusių genų funkcijomis patvirtina, kad 19p13.3 sritis, kurioje yra UQCR TCF3 ir MBD3 genai, yra naujas lokusas, kuriuo grindžiamas žmogaus LBM.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Ran, S. et al . Genų pagrindu sudaryto genomo asociacijos tyrimas nustatė liesos kūno masės 19p13.3. Mokslas. Rep. 7, 45025; „doi“: 10.1038 / srep45025 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.