Scn1a epilepsijos mutacijos sukūrimas klubų ląstelėse, naudojant talentų metodą | mokslinės ataskaitos

Scn1a epilepsijos mutacijos sukūrimas klubų ląstelėse, naudojant talentų metodą | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biochemija
  • Biotechnologijos
  • Neurologiniai sutrikimai
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2015 m. Birželio 30 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Žmogaus sukeltos pluripotentinės kamieninės ląstelės (iPSC) gali būti naudojamos suprasti patologinius žmogaus ligos mechanizmus. Šios ląstelės yra perspektyvus ląstelių pakaitinės terapijos šaltinis. Tačiau tokiems tyrimams reikia genetiškai apibrėžtų sąlygų. Tokios genetinės manipuliacijos gali būti atliekamos naudojant naujas transkripcijos aktyvatorius primenančius efektorinius branduolius (TALEN), kurie sukuria didelio efektyvumo ir tikslumo vietoje specifines dvigubos grandinės DNR pertraukas (DSB). Derindami TALEN ir iPSC metodus, sukūrėme dvi iPS ląstelių linijas, generuodami taškinę mutaciją A5768G SCN1A gene, kuris koduoja įtampos natrio kanalo Nav1.1 α subvienetą. Inžinerinis iPSC išlaikė daugiapotiškumą ir sėkmingai diferencijuojamas į normalių funkcinių charakteristikų neuronus. Abi ląstelių linijos skiriasi tik jautrumo epilepsijai variantu. Gebėjimas patikimai įdiegti ligas sukeliančias taškines mutacijas normaliose hiPS ląstelių linijose gali būti panaudotas kuriant žmogaus ląstelių modelį, tiriant epilepsijos mechanizmus ir atliekant vaistų patikrinimą.

Įvadas

Sunki kūdikių mikologinė epilepsija (SVV, taip pat vadinama Draveto sindromu) yra liga, turinti keletą sudėtingų simptomų, įskaitant sunkią, neginčijamą epilepsiją ir kartu pasireiškiančią ataksijos ir pažinimo sutrikimą. Paprastai MVĮ yra atsparus standartinei antikonvulsančiai farmakoterapijai 1 . Šios epilepsijos genetinė etiologija apima mutacijas natrio kanaluose; tokios mutacijos dažnai stebimos SCN1A gene, koduojančiame NaV1.1 natrio kanalo α1 subvienetą. Pacientams, sergantiems SMEI 2, 3, buvo nustatyti keli SCN1A mutacijų tipai, tokie kaip nesąmonė, rėmelio poslinkis ir missense mutacijos, esančios skirtingose ​​SCN1A geno vietose. Epilepsijos sindromų spektrą gali sukelti mutacijų vieta SCN1A gene. Nedidelis šio baltymo pažeidimas sukelia polinkį į karščiavimo priepuolius; vidutinis sutrikimas sukelia generalizuotą epilepsiją kartu su karščiavimo priepuoliais plius (GEFS +), o stiprus ar visiškas funkcijos praradimas sukelia MVĮ4. Tačiau tokie genotipo ir fenotipo ryšiai iki šiol buvo neįtikinami. Tyrimai, naudojant HEK293 ląsteles, ekspresuojančias žmogaus Nav1.1 kanalus, turinčius su MVĮ susijusias nesąmones ir missense mutacijas, parodė, kad šios mutacijos panaikino natrio kanalų funkciją ir susilpnino arba pašalino vidines natrio sroves. Dėl sumažėjusio natrio kiekio gali padidėti neuronų padidėjęs jautrumas ir sukelti epilepsijos priepuolius 5 . Tyrimai naudojant gyvūnų modelius atskleidė, kad Nav1.1 kanalai su funkcijų praradimo mutacijomis smarkiai sutrikdė natrio sroves GABAerginiuose inhibitoriuose tarpneuronuose. Šie pastebėjimai atitiko hipotezę, kad natrio srovės sumažėjimas gali sukelti padidėjusį tinkamumą MVĮ 6 . Be to, netiesinis natrio srovės praradimas Purkinje neuronuose gali sumažinti jų šaudymo greitį, sukeldamas ataksiją ir susijusius funkcinius trūkumus 7 . Norint suprasti MVĮ molekulinę patologiją, reikalingi papildomi tyrimai.

TALEN technologija yra galingas genomo inžinerijos įrankis, kurį galima panaudoti gyvoms ląstelėms išskirti unikalias genomo sekas. TALEN sistemą sudaro du komponentai 8 ; vienas komponentas yra į transkripcijos aktyvatorių panašus (TAL) efektorius, kuris yra virusinių Xanthomonas genties augalų patogeninių bakterijų virulencijos veiksnys. Natūrali TAL efektorių funkcija yra paversti šeimininko genomo reguliavimo tinklus po jų perkėlimo į šeimininko ląsteles per III tipo bakterijų sekrecijos sistemą ir surišti efektoriams specifines sekas. Antrasis komponentas yra „FokI“ nukleazė, galinti efektyviai skaidyti DNR, kad būtų sudarytos tikslinės DNR dvigubų grandžių pertraukos (DSB) in vivo genomo redagavimui 9 . Kadangi dimerinis FokI skaido DNR, šios TAL efektorinės nukleazės (TALEN) funkcionuoja poromis, sukurdamos DSB. Šie DSB yra taisomi ląstelių nehomologinio galo sujungimo (NHEJ) arba homologinės rekombinacijos (HR) keliais, kurie sukelia tikslingą genų sutrikimą, įskaitant mažus intarpus ar delecijas (InDel). Tačiau norint atlikti homologinę rekombinaciją (HR), reikalingas homologinis DNR segmentas kaip šablonas DNR DSB pataisymui; tokios homologinės sekos gali būti naudojamos genų įterpimui ar pakeitimui 10, 11 . Todėl TALEN technologija yra tvirta ir greitai paskirta DNR taikymo platforma biologinių sistemų analizei ir inžinerijai.

Neurodegeneracinių ligų tyrimai buvo sutrikdyti dėl ribotos eksperimentinės galimybės patekti į ligos paveiktus žmogaus nervų sistemos audinius 12 . Žmogaus sukeltų pliuripotencinių kamieninių ląstelių (hiPSC) technologija, leidžianti epigenetiškai perprogramuoti žmogaus somatines ląsteles į pluipotencinę būseną, o po to diferencijuoti į ligai svarbius ląstelių tipus ir audinius; ši technologija suteikia prieigą prie praktiškai neriboto skaičiaus pacientui būdingų ląstelių, kad būtų galima modeliuoti neurologinius sutrikimus in vitro. Specialių pacientams skirtų IPSC, turinčių su liga susijusių genetinių pakitimų, karta rodo didelę pažangą atliekant pagrindinius biomedicininius šios srities tyrimus 13, 14, 15 . Tokių tyrimų metu paciento su liga susijusios ląstelės lyginamos su normalių asmenų ląstelėmis. Tačiau tokie palyginimai turi svarbių įspėjimų. Neurodegeneracinės ligos paprastai pasireiškia vėlyvu amžiumi, ilgu latentiniu periodu, lėtai progresuojančiais ląstelių ir patologiniais pokyčiais in vivo 16 ir subtiliais fenotipais in vitro. Be to, sunku priskirti skirtumus tarp paciento gaunamų ir normalių ląstelių linijų su liga susijusiam pažeidimui, nes abi ląstelių linijos turi skirtingą genetinį pagrindą. Todėl atskirti subtilius su liga susijusius fonotipinius pokyčius nuo nenuspėjamų su fonu susijusių variacijų išlieka sudėtinga.

Norėdami sukurti genetiškai apibrėžtą eksperimentinę sistemą MVĮ patologijai tirti, mes sukūrėme indukuotas pluripotencines kamienines ląsteles (iPSC) iš asmenų, turinčių normalų genotipą 17, odos fibroblastų; šios ląstelės buvo pavadintos „Nor“. Tada mes panaudojome TALEN technologiją norėdami generuoti A5768G taško mutaciją „Nor iPSC“ SCN1A gene, kad gautume dirbtinę paciento ląstelių liniją (AP). Todėl vienintelis skirtumas tarp normalių (Nor) ir dirbtinių paciento (AP) ląstelių linijų yra dominantis liga sukeliantis genetinis pažeidimas; šios ląstelių linijos gali būti naudojamos išsiaiškinti epilepsijos patogenezę ir ištirti terapinius būdus.

Rezultatai

TALEN efektyvumas ir donorų vektorių kūrimas

Siekėme, kad epilepsiją sukelianti A5768G mutacija būtų įvesta į Nav1.1 α subvieneto endogeninį lokalumą normaliose iPS ląstelėse (Nor), kurios buvo perprogramuotos iš normalaus žmogaus odos fibroblastų. Pastebėjome, kad SCN1A sukurti TALEN pjaustymo efektyvumas normalioje iPS ląstelių linijoje, neatrenkant vaistų, buvo 7, 14% (papildoma S2 lentelė). TALEN DNR sekos parodytos papildomame S1 paveiksle. Vienų ląstelių kolonijų patikrinimui po elektroporacijos mes panaudojome vaisto atranka pagrįstą strategiją. Sukūrėme tikslinį donoro vektorių, kuriame yra „loxP“ briaunota PGK-neomicino kasetė, taip pat 5′- ir 3′-homologinės rankos, turinčios maždaug 1300 bp sekos homologijos, kertančios TALEN nukreiptą vietą (papildomas paveikslas S2). 5′-homologijos grupėje buvo A5768G mutacija, kuri buvo amplifikuota iš smulkiosios lyties pacientų, sergančių genomu, DNR. Siekiant užkirsti kelią tikslinio geno ekspresijai, G418 atsparumo genas (Neo) buvo įterptas į gretimą introną, maždaug 40 bazių pasroviui nuo paskutinio SCN1A geno egzono, kuris koduoja Nav1.1 α subvienetą (1 paveikslas).

Image

„Nor“ nurodo pradinius normalius iPSC. Donoro plazmidėse buvo Neo, atsparumo G418 genas, skirtas vaistų patikrai. „+ Nor“ reiškia įprastus iPSC po genų įdėjimo į „Neo“ kasetę. „Dirbtinis pacientas“ nurodo ląsteles, gautas pritaikius geną ir sukėlus vaisto kasetės eksciziją.

Visas dydis

Efektyvus su liga susijusių mutacijų įvedimas ir neomicinui atsparios kasetės pašalinimas

Norint generuoti mutacijas normaliose iPS ląstelėse (Nor), nukreipimo donoras, turintis A5768G mutaciją ir 2 TALEN poras, buvo elektroporuotas į iPSC linijas. Po skaidymo TALENs ir po to homologinės rekombinacijos su donoro šablonu, epilepsiją sukelianti A5768G mutacija donore turi būti įvesta į endogeninį ląstelės linijos vietą. Gavome 103 vienaląsčius klonus po elektroporacijos ir 23 klonus po G418 atrankos. Norėdami nustatyti teisingai nukreiptus klonus, mes sukūrėme dvi poras PGR pradmenų: viena pora (F 0 / R 0 ) buvo panaudota fragmentui, turinčiam su liga susijusią mutaciją, sustiprinti, o kita pora (R1 ′ / F 2 ′). buvo naudojamas vaistų atrankos kasetei sustiprinti. Naudodamiesi pirmąja pradmenų pora (F 0 / R 0 ), mes visada gaudavome 1100 bp produktą, nepriklausomai nuo to, ar seka turėjo mutaciją. Tada mutacijos buvimas buvo tiriamas sekos būdu (2a / 2b / 2c paveikslas). Naudojant antrąją pradmenų porą (R1 ′ / F 2 ′), teisingai nukreiptas genomas (+ Nor) duotų 2000 bp amplikoną, kuriame yra įterptas Neo genas (2d pav.). O sekos rezultatas parodytas papildomame S3 paveiksle. Tolesnė genomo DNR PGR analizė ir sekos nustatymas atskleidė, kad 1 iš 23 G418 atsparių klonų buvo epilepsijai reikšminga mutacija tiksliniame genomo lokuse. Atlikus taikymą, selekcinė kasetė (Neo) ląstelių linijose (+ Nor) buvo iškirpta įvedant Cre rekombinazę ekspresuojančią plazmidę, kad būtų išvengta nepageidaujamo rezistentiškos vaistų atsparumo kasetės genomo poveikio. Norėdami patvirtinti, kad kasetė buvo iškirpta, mes ištraukėme vienaląsčių klonų genominę DNR ir išanalizavome DNR naudodami PGR, naudodami pradmenis R1 '/ F2', po to atlikdami gelinę elektroforezę (2d paveikslas). Ši analizė parodė, kad vaisto atsparumo kasetė buvo išpjaustyta 2 iš 91 klonų. Šią ląstelių liniją pavadinome „dirbtinio paciento“ (AP) ląstelių linija.

Image

Efektyvus su liga susijusių mutacijų įvedimas ir neomicinui atsparios kasetės pašalinimas Atitinkamai normalių iPSC (Nor) ir į geną nukreiptų ląstelių linijos (+ Nor) genomo SCN1A lokuso sekos analizės parodytos a ir ( b). Bazė, paryškinta šešėliu, yra su liga susijusi mutacija, nurodoma raudonomis rodyklėmis. „Nor“ ir „+ Nor“ BLAST analizė parodyta c punkte. Raudona rodyklė rodo įvestą mutaciją. d) Neo PGR produktų, gautų naudojant pradmenis R1 ′ / F2 ′ DNR gelio elektroforezė, gauta iš DNR iš normalios ląstelių linijos (Nor), į geną nukreiptos ląstelių linijos (+ Nor) ir „dirbtinio paciento“ ląstelių linijos ( AP) pašalinus „Neo“ kasetę. Viso ilgio gelis parodytas papildomame S4 ​​paveiksle.

Visas dydis

Nor iPSC apibūdinimas po manipuliavimo genais

Pirmiausia mes ištyrėme, ar dirbtiniai pacientų iPSC buvo daugialypiai galingi. Imunofluorescencinis dažymas (3a / b / c / d / e / f paveikslas) parodė pluripotencialui būdingų baltymų žymenų Nanog ir TRA-1-81 raišką tiek Nor, tiek AP iPSC. Teratomos buvo sugeneruotos švirkščiant „Nor“ ir „AP“ iPSC į imunodeficitines peles; Trijų vystymosi gemalų sluoksnių dažymas HE (3g / h / i / j / k / l / m / n) parodė, kad abiejų ląstelių linijų suformuotos teratomos turėjo normalią struktūrą. Šios analizės parodė, kad „dirbtinio paciento“ ląstelių linija (AP) išlaikė plutipotencinę būseną. Specifiškumas, ty nepageidaujamų mutacijų nebuvimas yra būtinas bet kokiam genų redagavimo metodui. Norėdami ištirti TALEN skilimo specifiškumą, mes panaudojome e-PGR, norėdami ištirti galimas žmogaus genomo galimas netaikomas vietas. Mes atrinkome dešimt genominių vietų, kurios buvo homologiškos suprojektuotai TALEN atpažinimo sekai (1 lentelė). Mes sukūrėme pradmenis visoms 10 galimų netaikomų vietų, tada amplifikavome šias sritis iš genominės DNR, ekstrahuotos iš „dirbtinio paciento“ iPSC. DNR sekos analizė atskleidė mutacijų nebuvimą šiose numatomose ne tikslinėse vietose. Šie duomenys rodo, kad TALEN yra labai specifiški jų taikymo sekoms.

Image

„Nor iPSC“ apibūdinimas atlikus genų manipuliacijas „Nor“ iPS ląstelių (a / b / c) ir „AP“ iPS ląstelių (d / e / f) imunofluorescencinis dažymas atskleidė pluripotencialui būdingų žymenų Nanog (raudona) ir TRA-1-81 (žalia) in vitro. NOD-SCID pelių teratomos atkarpų dažymas hematoksilinu ir eozinu buvo gautas iš „Nor“ (g / h / i / j) ir „AP“ ląstelių linijų (k / l / m / n).

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Nor iPSC diferenciacija į neuronus po manipuliavimo genais

Naudodami TALEN technologiją, mes įvedėme A5768G mutaciją ląstelių linijoje „Nor“. Norėdami patikrinti, ar šis genetinis manipuliavimas nesutrikdė Nav1.1 α subvieneto ekspresijos, mes panaudojome embriono kūno (EB) pagrįstą protokolą, norėdami sukelti tėvų (Nor) ir tikslinių (AP) iPSC linijų neuroninę diferenciaciją, kaip aprašyta skyriuje Metodai. . Imunofluorescencinė dažymo analizė parodė, kad neuronams būdingi žymenys TuJ1 ir Map2 buvo ekspresuojami neuronuose, gautuose iš tėvų ir tikslinių iPSC linijų (4a / b / c / d / e / f paveikslas). Atlikus vaisto atsparumo kasetės iškirpimą Cre tarpininkavimu, buvo atlikta RT-PGR analizė, naudojant Nav1.1 α subvienetui būdingus pradmenis; ši analizė patvirtino, kad manipuliavimas genu neturėjo įtakos Nav1.1 α subvieneto ekspresijai tikslinėje ląstelių linijoje (4g paveikslas). Norėdami dar labiau apibūdinti neuronus, atlikome elektrofiziologinius įrašus, naudodami neuronus, gautus atitinkamai iš tėvų „Nor“ ir „AP“ ląstelių linijos. Išanalizavus pleistrų spaustukų įrašus, paaiškėjo, kad neuronai formavo funkcines sinapses su miniatiūrinėmis sužadinamosiomis po sinapsinėmis srovėmis (PSC) (5a pav.). Neuronai turėjo savaiminį veikimo potencialą ir sukėlė veiksmų potencialą po injekcijos žingsnio srovių (5b, c pav.). Be to, neuronai rodė natrio ir kalio kanalų aktyvumą generuodami į vidinę įtampą nukreiptas natrio sroves ir į išorę nukreiptas kalio sroves (5d paveikslas, e). „Dirbtinių pacientų“ ląstelių linijos analizė (6 pav.) Atskleidė panašias neuronų charakteristikas, taip pat natrio ir kalio kanalų aktyvumą, palyginti su normalia ląstelių linija, ir tai rodo sėkmingą diferenciaciją į funkcinius neuronus. Be to, diferencijuoti neuronai gali sudaryti integruotą neuronų grandinę in vitro.

Image

Diferencijuotų neuronų apibūdinimas Neuronams būdingų žymenų β-tubulino (raudonas) ir su mikrotubuliais susijusio baltymo 2 (žalias) imunofluorescencinis dažymas neuronuose, išsiskiriančiuose iš „Nor“ (a / b / c) ir „AP“ (d) / e / f) ląstelės. Skalė yra 100 μm. (g) RT-PGR neuronų analizė parodė, kad manipuliavimas genu nesutrikdė Nav1.1 kanalo ekspresijos. „NC“ rodo neigiamą kontrolinį IPSC. „Beta-aktinas“ buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė (PC). „Nor“ reiškia neuronus, išsiskiriančius iš normalių iPSC, o „AP“ - „dirbtinio paciento“ neuronus, gautus atlikus manipuliavimą genu. Viso ilgio gelis parodytas papildomame S5 paveiksle.

Visas dydis

Image

Elektrofiziologinės neuronų, atskirtų nuo normalių IPSC (a), charakteristikos rodo visos ląstelės neuronų įrašą, kuriame buvo aptiktos spontaniškos miniatiūrinės sužadinamosios post-sinapsinės srovės (PSC). (b) rodo savaiminio veikimo potencialus (AP) be srovės įpurškimo. c) nurodo sukeltus veikimo potencialus, užfiksuotus suleidus pakopos sroves (nuo –20 iki 50 pA). (d) rodo rodyklėmis parodytas natrio sroves nuo įtampos, užfiksuotas atlikus depoliarizacijos įtampos pakopas (nuo –80 iki 80 mV). e) nurodo kalio sroves, kurių įtaka įtampa nustatyta pagal depolarizacijos įtampos pakopas (nuo –80 iki 80 mV).

Visas dydis

Image

Elektrofiziologinės neuronų charakteristikos, atskirtos nuo „dirbtinio paciento“ IPSC (a), rodo visos ląstelės neuronų įrašą, kuriame buvo aptiktos spontaniškos miniatiūrinės sužadinamosios post-sinapsinės srovės (PSC). (b) rodo savaiminio veikimo potencialą (AP) be srovės įpurškimo. c) nurodo sukeltus veikimo potencialus, užfiksuotus suleidus pakopos sroves (nuo –20 iki 50 pA). (d) rodo rodyklėmis parodytas natrio sroves nuo įtampos, užfiksuotas atlikus depoliarizacijos įtampos pakopas (nuo –80 iki 80 mV). e) nurodo kalio sroves, kurių įtaka įtampa nustatyta pagal depolarizacijos įtampos pakopas (nuo –80 iki 80 mV).

Visas dydis

Diskusija

Neurodegeneracinės ligos SMEI patologiniam mechanizmui tirti naudojami keli metodai, tokie kaip transgeniniai gyvūnų modeliai ir išaugintos žmogaus ląstelės. Kadangi trūksta iš paciento kilusių, ligai svarbių ląstelių tipų ir audinių, šie metodai tik iš dalies pakartoja pacientų pastebėtus molekulinius ir ląstelinius pokyčius. IPSC plėtra suteikia naują požiūrį į šios problemos sprendimą. Esminis iPSC technologijos naudojimo apribojimas yra nesugebėjimas atlikti eksperimentų genetiškai apibrėžtomis sąlygomis. Genų taikymas, kurį sąlygoja tradicinė homologinė rekombinacija hiPSC, paprastai yra sunkus ir neveiksmingas. Šiame tyrime mes sukūrėme TALEN, turinčius labai specifinį skilimo aktyvumą žmogaus iPS ląstelėse. Naudodamiesi TALEN technologija, mes įvedėme su epilepsija susijusią A5768G mutaciją į įprastą hiPSC. Gautos „dirbtinio paciento“ iPS ląstelių linijos išliko stabiliai daugialypės ir galėjo sėkmingai diferencijuotis į normalių funkcinių savybių neuronus. Be to, TALEN nesukūrė tikslinių mutacijų, o tai yra būtina tolesniam jų taikymui. Todėl TALEN technologija yra efektyvus ir efektyvus metodas genų manipuliavimui, siekiant įvesti ligas sukeliančias mutacijas žmogaus pluripotencinėse kamieninėse ląstelėse.

Naudojant TALEN technologiją, sutrumpėja plazmidės susidarymo laikas. Remdamiesi ankstesniais tyrimais, sutrumpinome eksperimentinės schemos trukmę iki maždaug 2–3 savaičių su vėlesne vaistų patikra. HiPSC išgyvenamumas yra prastas, ypač po elektroporacijos. Norėdami skatinti išgyvenimą, ląstelės buvo dedamos kartu ant 12 ar 6 šulinėlių indų. Augant vaistams atspariems klonams, kolonijos suskaidomos, kad gautų pavienes ląsteles, kurios maždaug po 2 savaičių išaugo į vienaląsčius klonus. Vykdydami savo projektą, mes dengėme ląsteles tiesiai ant 96 šulinėlių indų ir įsitikinome, kad viena ląstelė po skylės išgyvens po elektroporacijos. Mes optimizavome sąlygas išgyvenimui skatinti. Pirmiausia „panaudotos“ ląstelių terpės buvo surinktos prieš elektroporaciją trečią ir ketvirtą dieną po praėjimo, kai klono aprėptis siekė 40–70%. Tada negyvos ląstelės buvo pašalintos centrifuguojant, o supernatantas filtruojamas su 0, 22 μm filtro membrana. Supernatantą ir šviežią terpę (mTesR) sumaišėme santykiu 1: 3–1: 5, kad gautume „adaptyvią terpę“. „Adaptyvioji terpė“ ir apoptozės inhibitoriaus ((ROCK) inhibitorius, Y27632) buvo naudojamos pirmąsias 7 dienas po elektroporacijos. Likusieji klonai buvo tikrinami atrenkant G418 ateinančias 6–10 dienų, kol jie galės praeiti. Šiuo laikotarpiu vaisto koncentracija buvo laipsniškai didinama iki 100 µg / ml kiekvieną dieną. Tada genomo DNR buvo išgauta tolesnei analizei. Šis procesas yra lengvas ir efektyvus.

Šis metodas žymiai pašalino genetinį foninį triukšmą. Tai palengvino tikslią su liga susijusių padarinių diskriminaciją. Tačiau SMEI patogenezė yra labai sudėtinga. Skirtingi patologiniai mechanizmai gali būti bendro epilepsijos fenotipo pagrindas. Manoma, kad padidėjusi neuronų tinklo būklė, sukelianti traukulius SVV, atsiranda pakitus normaliai sužadinamųjų glutamaterinių neuronų ir slopinamųjų GABAerginių neuronų pusiausvyrai. Šiame tyrime diferenciacija buvo gauta mišrius neuronus, įskaitant glutamaterginius ir GABAerginius neuronus. Neuronai buvo užregistruoti išankstiniam identifikavimui. Su liga susiję elektrofiziologiniai fenotipai yra sudėtingesni ir reikalauja papildomų tyrimų, išskiriant skirtingus neuronų tipus. Patologiniams mechanizmams tirti naudojami keli metodai, tokie kaip ląstelių, naudojamų užfiksuoti pleistro spaustuku, žymėjimas biocitinu ir vėlesnis apibūdinimas imunohistochemine analize 18 . Ligos modelių sukūrimas reiškia didelę pažangą atliekant pagrindinius biomedicininius tyrimus ir atliekant plataus masto narkotikų patikrą. Pelių modeliai palengvino genetiškai pakoreguotų iš ligos, specifiškai iPSC, gautų ląstelių generavimą, kad būtų galima gydyti ligą, sudarant sąlygas tolesniems tyrimams 19 . Tačiau norint atlikti „iPSC“ technologijos potencialą naudojant hiPSC pagrįstą ląstelių pakeitimo terapiją, reikalingi papildomi tyrimai.

Metodai

Ląstelių kultūra ir TALEN ir donoro vektoriaus konstravimas

Įprasti iPSC (Nor) buvo auginami MG (Sigma, kat. Nr. 354277), dengtose 6 šulinėlių plokštelėse su mTESR terpe (Sigma, kat. Nr. 05850). Ląstelės buvo praeinamos kas 4–6 dienas dispaze (0, 001 g / ml, Sigma). SCN1A TALEN buvo sukonstruoti taip, kaip aprašyta anksčiau 20 . Donoro vektorius buvo sukonstruotas taip, kaip aprašyta tekste.

TALEN efektyvumas

Norėdami patikrinti suprojektuotų TALEN skilimo aktyvumą, normalūs iPSC (Nor) buvo transfekuoti dviem TALEN plazmidėmis elektroporacijos būdu. Ląstelės buvo sodinamos į MG dengtas 6 duobučių plokšteles, kuriose buvo mTESR terpė, 3–4 dienas. Ląstelių genominė DNR buvo išgauta. Tikslinė sritis buvo amplifikuota PGR, naudojant pradmenis Fs / Rs (papildoma S1 lentelė), klonuota į pMD-18T vektorių (TaKaRa, kat. 6011) ir paeiliui tiriama indel mutacijų dažnis.

Homologinis rekombinacija pagrįstas SCN1A taikymas hiPSC, naudojant TALEN

hiPSC (Nor) buvo kultivuojami Rho kinazės (ROCK) inhibitoriuje (Sigma, Y-27632, Cat.No.Y0503) 24 valandas prieš elektroporaciją. Ląstelės buvo surinktos naudojant Accutase (Sigma, kat. Nr. A6964-100 ml) 7–15 min., O 8 × 105 ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos 100 μl Nucleofector® tirpale (Lonza) kambario temperatūroje. Iš viso 1–5 µg donoro plazmidžių ir 5–10 µg kiekvienos TALEN koduojančios plazmidės buvo panaudotos ląstelių elektroporavimui naudojant žmogaus kamieninių ląstelių „Nucleofector® Kit Kit“ (Lonza, kat. Nr. PVP-5022). Elektroporacijai mes panaudojome A23 procedūrą „Amaxa Nucleofector 11“ įrenginyje (Lonza). Buvo naudojamos žmogaus kamieninių ląstelių „Nucleofector® Kit 2“ kiuvetės. Po to vienkartinės ląstelės buvo dedamos ant matrigeliu padengtų 96 šulinėlių plokštelių, kuriose buvo mTESR terpė, papildyta ROCK inhibitoriumi, pirmas 7 dienas, o vienos ląstelės kolonijos buvo išplėstos po G418 atrankos (100 µg / ml) 13–17 dienų. Genominė DNR buvo išgauta naudojant „TIANamp Genomic DNA Kit“ (Tiangen, kat. Nr. DP304-02). Maždaug 200 ng DNR buvo naudojama kaip įvestis kiekvienam PGR naudojant F0 / R0 pradmenis ir fermentą KOD-Plus-Neo (ToYoBo, kodas: KOD-401). PGR produktai buvo sekuojami, kad būtų patikrinta su liga susijusi taškinė mutacija.

Neo kasetės pašalinimas laikinai išreiškiant Cre rekombinazę

Genu manipuliuotos Nor (+ Nor) iPSC (8x105) ląstelės buvo elektroporuojamos plazmidėmis, ekspresuojančiomis Cre rekombinazę (10 µg), kaip aprašyta anksčiau. Vienos ląstelės kolonijos buvo parinktos praėjus 10–14 dienų po elektroporacijos, norint išgauti genominę DNR. Neo kasetės ekscizija buvo patikrinta seką PGR naudojant R1 ′ / F2 ′ pradmenis.

Imunocitochemija

Ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu PBS ir imuniškai užterštos naudojant standartinius protokolus. Antikūnai prieš „Nanog“ (triušio mAb, kat. Nr. 4903s, ląstelių signalizavimas) ir TRA-1-81 (pelės mAb, Nr. 4745s, ląstelių signalizacija) buvo naudojami norint patikrinti iPSC daugiafunkciškumą po genų redagavimo. Antikūnai, naudojami neuronams, gautiems iš iPSC, identifikuoti, buvo III klasės β-tubulinas (TuJ, triušio mAb, kat.AB15708, Millipore) ir su mikrotubuliais susijęs 2 baltymas (2 žemėlapis, pelės mAb, kat. AB34918, Millipore). ). Ląstelės buvo inkubuojamos 4 ° C temperatūroje per naktį pagrindiniuose antikūnuose, kurie buvo praskiesti 10% ožkos serumu ir 0, 3% Triton X-100 PBS. Naudoti praskiedimai buvo 1: 800 (Nanog), 1: 1000 (TRA-1-81), 1: 400 (žemėlapis) ir 1: 200 (TuJ1). Tada ląstelės buvo apdorotos antriniu antikūnu (ožkos ir pelės „Alexa 555“, 1: 200, „Cell Signaling Technology“, kat. Nr. 4409 ir (arba) „Alexa Fluor® 594“ ožkos ir anti-triušio „Alexa 488“, 1: 200, ląstelių signalizacijos technologija)., Kat. Nr. 4412), praskiestą tame pačiame tirpale pirminiais antikūnais 60 minučių kambario temperatūroje. Tada ląstelės buvo dažytos DAPI tirpalu (praskiestu PBS santykiu 1: 1000) 10 minučių. Tarp šių etapų ląstelės buvo tris kartus praplaunamos 0, 5% Tween PBS.

Teratomos analizė

IPSC suskaidytos į pavienes ląsteles Accutase (7–15 min.), Surenkamos centrifuguojant, pakartotinai suspenduojamos 200 µl MG (2 × 106 ląstelių) ir įšvirkščiamos po oda į pažeistos NOD-SCID pelių dešinę užpakalinę koją (SLAC LABORATORY). GYVŪNAS, Šanchajus, Kinija). Navikai paprastai išsivystė per 8 savaites ir gyvūnai buvo paaukojami anksčiau nei naviko dydis viršijo 1, 5 cm skersmens. Teratomos buvo išskirtos paaukojus peles, pritvirtintos formaline ir įterptos į parafiną. Atlikus pjūvį, teratomos buvo diagnozuotos remiantis hematoksilino ir eozino (HE) dažymu ir buvo stebimos naudojant LEICA DMI6000B (Leica Microsystems GmbH) apverstą fluorescencinį mikroskopą.

Neuronų diferenciacija

IPSC buvo diferencijuojami į neuronus, kaip aprašyta anksčiau 21 . Šis neuronų konversijos metodas apima embriono kūno žingsnį. Įprasti iPSC buvo pasalinami naudojant dispazę (Sigma), o ląstelių gumulėliai buvo kultivuojami tiektuvo ląstelėse (Cyagen, kat. Nr. MUIEF-01002), kurios diena anksčiau buvo pasėtos EB kultūrinėje terpėje, kurioje yra F12 / DMEM (gyvenimo technologija), papildyta 20% KSR (Life Technologies), 1% glutinmax (gyvybės technologija), 1% NEAA (gyvybės technologija), 0, 1% β-merkaptoetanolio (gyvybės technologija), 5 μM TGF-β RI kinazės inhibitorius VI ir 5 μM Dorsomorphin. Šis laiko taškas buvo apibrėžtas kaip diferenciacijos nulio diena. Ketvirtą dieną terpė buvo pakeista į N2 terpę, kurioje yra F12 / DMEM, papildyta 1% N2 (gyvybės technologija), 1% NEAA (gyvybės technologija); 2 μg / ml heparino. Šeštą dieną EB buvo surinkti ir išlyginti ant MG dengtų plokštelių N2 terpėje. Neuronų rozetės pasirodė praėjus 10–12 dienų po inkubacijos. Šešioliktą dieną rozetės buvo renkamos ir dedamos ant MG dengtų plokštelių N2 terpėje. Septynioliktą dieną N2 terpė buvo pakeista neuronų diferencijavimo terpe, kurioje yra F12 / DMEM, papildyta 1% N2 (gyvybės technologija), 2% B27 (gyvybės technologija), 1 ng / ml BDNF (Peprotech), 1 ng / ml GDNF. (peprotech) ir 1 μmol cAMP (Sigma). Ląstelės buvo kultivuojamos neuronų diferenciacijos terpėje daugiau nei 2 savaites, kad būtų visiškai subręsta.

Elektrofiziologija

Elektrofiziologiniai eksperimentai buvo atlikti su subrendusiais neuronais, gautais iš normalių iPSC. Norėdami išmatuoti įtampa suaktyvintas natrio / kalio sroves ir veikimo potencialus, buvo atlikti įrašai iš visos ląstelės, naudojant fiksatorių, esant įtampai arba srovei. Elektrofiziologiniams signalams registruoti buvo naudojamas „Axopatch 200B“ stiprintuvas („Axon Instruments“, JAV). Duomenys buvo gauti ir išanalizuoti naudojant „Clampfit 10.2“ programinę įrangą (Molecular Devices, JAV). Borosilikatinio stiklo pipečių atsparumas buvo 4–8 MΩ, kai jos buvo užpildytos tirpalu, kurio sudėtyje yra šie (mM): 140 kalio metansulfonatas, 10 HEPES, 5 NaCl, 1 CaCl2, 0, 2 EGTA, 3 ATP-Na 2, 0, 4 GTP-Na 2., pH 7, 2 (sureguliuotas KOH). Vonios tirpale buvo šie (mM): 127 NaCl, 3 KCl, 1 MgSO4, 26 NaHCO3, 1, 25 NaH2P04, 10D-gliukozė, 2CaCl2, pH 7, 4 (sureguliuotas NaOH). Ląstelės, padengtos dangteliais, buvo dedamos į panardinamą registravimo kamerą ir buvo nuolatos perfuzuojamos vonios tirpalu, išbalansuotu 95% O2 ir 5% CO 2 . Visi elektrofiziologiniai eksperimentai buvo atlikti kambario temperatūroje.

RT-PGR analizė

36 dieną po diferenciacijos RNR buvo išgauta iš neuronų. RNR buvo atvirkščiai perrašyta į cDNR naudojant „Prime Script TM RT“ reagentų rinkinį (TAKARA, Cat.DRR037S). Tada PGR buvo atlikta naudojant Nav1.1 α subvieneto specifinius pradmenis.

TALEN tikslinė analizė

Norėdami nustatyti galimas SCN1A TALEN netaikomas vietas, mes panaudojome e-PGR (www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/e-pcr) žmogaus genomo sekai nuskaityti. Į tikslinių vietų nustatymo kriterijus buvo įtraukta iki 2 bp nesutapimų, 2 bp spragų ir <300 bp tarpiklio sekos tarp dviejų numanomų surišimo vietų. Identifikuoti galimi tiksliniai regionai buvo amplifikuoti PGR, naudojant šabloną naudojant „dirbtinio paciento“ iPSC genomo DNR, ir seka nustatoma siekiant bet kokio poveikio, taikomo už tikslo ribų (pradmenų F1 / R1, F2 / R2, F4 / R4, F5 / R5, F6 / R6, F7 / R7, F8 / R8, F9 / R9, F10 / R10 yra išvardyti S1 papildomoje lentelėje).

Etikos pareiškimas

Kinijos mokslų akademijos ir etikos komitetas Guangdžou biomedicinos ir sveikatos institute patvirtino eksperimentus, įskaitant bet kokią svarbią informaciją. Visi eksperimentai buvo atlikti laikantis atitinkamų gairių ir taisyklių.

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    SCN1A epilepsijos mutacijos generavimas hiPS ląstelėse naudojant TALEN metodą

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.