Genetinis neuronų įniršio trūkumas apsaugo nuo amžiaus sukelto sinapsinio pažeidimo | ląstelių mirtis ir liga

Genetinis neuronų įniršio trūkumas apsaugo nuo amžiaus sukelto sinapsinio pažeidimo | ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių signalizavimas
  • Pažintinis senėjimas
  • Neurodegeneracinės ligos
  • Patogenezė

Anotacija

Sinapsinė disfunkcija ir degeneracija yra ankstyvas patologinis senėjimo ir su amžiumi susijusių ligų, įskaitant Alzheimerio ligą (AD), požymis. Senėjimas yra susijęs su padidėjusiu pažengusių glikacijos galutinių produktų (AGE) generavimu ir nusėdimu, atsirandančiu dėl neensymatinių glikatinimo (arba oksidacijos) baltymų ir lipidų. Diabeto ir AD paveiktose smegenyse pagreitėja AGE formavimasis, prisidedantis prie ląstelių pasipiktinimo. Šiuo metu nežinoma, kiek AGE yra susiję su sinapsinės struktūros ir funkcijos pokyčiais. Čia analizuojamas AGE (RAGE) signalų neuroninių receptorių indėlis į AGE tarpininkaujantį sinapsinį pažeidimą, naudojant naujas transgenines neuronų RAGE išmušimo peles, specialiai skirtas priekinėms smegenims ir transgeninėms pelėms, išreiškiančioms neuronų dominantinį-neigiamą RAGE (DN-RAGE). AGE pridėjimas prie smegenų pjūvių, sutrikusios hipokampo ilgalaikė potencija (LTP). Taip pat hipokampo neuronų gydymas AGE reikšmingai sumažina sinapsių tankį. Tokį žalingą poveikį daugiausia panaikina genetinis RAGE išeikvojimas. Pažymėtina, kad pelių, turinčių neuronų RAGE trūkumą ar DN-RAGE, smegenų pjūviai yra atsparūs AGE sukeltam LTP deficitui. Be to, RAGE trūkumas arba DN-RAGE blokuoja AGS sukeltą p38 signalizacijos aktyvavimą. Visi šie duomenys rodo, kad neuronų RAGE funkcionuoja kaip signalo keitiklis AGE sukeltai sinapsinei disfunkcijai, taigi suteikia naujų įžvalgų apie mechanizmą, kuriuo AGEs – RAGE priklausomas signalizacijos kaskadas prisideda prie sinapsinės žalos per p38 MAP kinazės signalo perdavimo kelią. . Taigi RAGE blokada gali būti intervencijos, kuria siekiama užkirsti kelią pažintinio senėjimo ir su amžiumi susijusių neurodegeneracinių ligų progresavimui, plėtotės tikslas.

Pagrindinis

Pažangiosios glikikacijos galutiniai produktai (AGE) yra nevienalytės molekulių klasės nariai, modifikuojantys ląstelių funkcijas skirtingais mechanizmais, įskaitant jungimą ir signalo perdavimo modulio aktyvinimą. Baltymų ir lipidų nefermentinio gliukavimo (arba oksidacijos) produktai, AGE, prisideda prie normalaus senėjimo proceso ir, pagreitėjus, sukelia priežastinį poveikį kraujagyslių komplikacijoms, susijusioms su cukriniu diabetu ir keliomis neurodegeneracinėmis ligomis, įskaitant Alzheimerio (AD), Parkinsono, ir Huntingtono ligos. 1, 2, 3, 4, 5 pacientams, sergantiems cukriniu diabetu, nustatyta, kad cirkuliuojančių AGE koncentracija (serumo AGE koncentracija) yra 7, 2–22 mU / ml (atitinka 30–88 μ g / ml AGE-BSA), tai yra žymiai didesnis nei necukriniu diabetu sergančių pacientų (3 mln. ml / ml, atitinka 12 μ g / ml AGE-BSA). 6, 7, 8 Diabeto gyvūno modelyje smegenų AGE lygis taip pat padidėjo iki 5-6 μM (atitinka 325–390 μg / ml AGE-BSA). 9 Perteklinis AGE kaupimasis kenkia neuronams ir manoma, kad tai yra raktas į pažintinio nuosmukio normaliam senėjimui ir specifines lėtines senėjimo ligas patogenezę. Pavyzdžiui, naujausiame klinikiniame tyrime periferinis AGE lygis buvo susijęs su vyresnių suaugusiųjų, sergančių cukriniu diabetu ir be jo, pažinimo sumažėjimu. 10 Diabeto komplikacijos paveikia smegenis, padidindamos depresijos, demencijos ir AD riziką. Iš tikrųjų pacientams, sergantiems 2 tipo cukriniu diabetu, padidėja santykinė AD 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ir pagreitėjusios pažintinės disfunkcijos rizika.

Ilgaamžiški baltymai, tokie kaip β -amiloidinis peptidas (A β ) ir hiperfosforiluotas tau baltymas, kaupiantis AD smegenyse, yra labai jautrūs AGE modifikacijai. 19, 20, 21, 22 AGE modifikuotas A β arba tau baltymas sukelia padidėjusį oksidacinį stresą ir lėtinį uždegimą, pagreitindamas AD patologiją ir neuronų pasipiktinimą. 19, 20, 22, 23, 24, 25 Be to, dėl A β arba tau glikikacijos padidėja senatvės plokštelių arba neurofibrilinių raiščių agregacija ir susidaro vėliau, tai yra pagrindinis AD 19, 22 patologinis požymis , leidžiantis manyti, kad AGE modifikacija yra svarbi rizika. neurodegeneracinių ligų faktorius. 26 Nors padidėjęs AGE kaupimasis smegenyse, kaip pastebima senstant, sergant cukriniu diabetu ar neurodegeneracinėmis ligomis, pagreitina neuronų oksidacinį pažeidimą, prisidedantį prie sinapsinės disfunkcijos ir pažinimo blogėjimo, jo pagrindiniai mechanizmai nėra gerai suprantami.

Pažangaus glikacinio galutinio produkto (RAGE) receptorius pirmiausia buvo identifikuotas kaip AGE imunoglobulino super šeimos šeimos ląstelių paviršiaus receptoriai. 27, 28 Padidėjusi RAGE ekspresija įvyksta periferinės ir centrinės nervų sistemos neuroninėse ir neneuroninėse ląstelėse senstant, sergantiems cukriniu diabetu ir AD paveiktiems asmenims, kai RAGE ligadai yra sureguliuoti aukščiau. 29, 30 Nors buvo įrodyta, kad AGEs – RAGE sąveika prisideda prie ląstelių pasipiktinimo, susijusio su širdies ir kraujagyslių ligų patogeneze ir diabeto kraujagyslių komplikacijomis, 31, 32, 33 nėra žinoma apie AGE vaidmenį ir jo sąveiką su RAGE. sinapsinė disfunkcija. Norint suprasti mechanizmus, susijusius su AGE sukeliama sinapsine žala, reikia išspręsti šiuos klausimus: (1) Ar AGE keičia sinapsių struktūrą ir funkcijas? Jei taip, ar šie pokyčiai priklauso nuo RAGE signalizacijos? '; (2) „Ar RAGE blokavimas dėl genetinio išsekimo apsaugo nuo AGE sukeltų sinapsinių disfunkcijų ir praradimo?“; ir 3) „Kokį poveikį neuronų RAGE daro AGE sukeltos aberacinės sinapsinės funkcijos?“. Taigi svarbu įvertinti AGEs – RAGE sąveikos įtaką sinapsinei disfunkcijai ir ištirti mechanizmą, kuriuo grindžiamas nuo AGE – RAGE priklausantis signalo perdavimas, ir jo indėlį į sinapsinių pažeidimus.

Čia mes tiriame neuronų RAGE signalizaciją AGE sukeltame sinapsiniame pažeidime, naudodamiesi naujomis sąlyginėmis RAGE išmušimo pelėmis, nukreiptomis į žievės neuronus, taip pat transgeninėmis pelėmis, kurios per daug išreiškia RAGE mutantus, turinčius signalo transdukcijos trūkumą. Atsižvelgiant į tai, kad neuronų ir neneuronų ląstelės smegenyse gali prisidėti prie AGE sukelto ilgalaikio neuronų ir sinapsinio streso bei disfunkcijos, įvertinome visuotinio RAGE trynimo įtaką šioje aplinkoje ir toliau nubrėžėme mechanizmą, pagal kurį nuo RAGE priklausoma p38 MAP aktyvacija. kinazė sustiprina AGE įkvėptą sinapsinę žalą.

Rezultatai

Sąlyginių neuronų RAGE selektyvaus išmušimo (nRKO) pelių generavimas ir apibūdinimas

Mes sukūrėme pavyzdinę sistemą, kurioje neuronų RAGE raiška, ypač smegenų srityje, atsakingoje už mokymąsi ir atmintį, yra išbraukta, kad būtų galima įvertinti receptorių ir ligandų sąveikos pasekmes AGE turinčioje aplinkoje. Šiuo tikslu mes neseniai sukūrėme Cre rekombinazės RAGE nulines peles, vadinamas Tg nRKO pelėmis, kertančiomis neuronus ir regionus, kuriuose ribojamas Tg pelės, kurios ekspresuoja Cre rekombinazę visame priekiniame smegenyse, kontroliuodamos specifines priekinėms smegenims kalcio-kalmododulino priklausomybes. kinazės II (CAMKIIa, CK2) promotorius 34, kad generuotų neuronų RAGE deleciją visame hipokampe ir žievėje. Taikymo vektoriui ir RAGE / flox pelėms generuoti panaudojome dvi „Cre-loxP“ sistemas (atliko „Ozgen Inc.“, „Bentley DC“, WA, Australija). 1a paveiksle pavaizduotas taikymo vektorius, turintis 5 'homologinę grupę, 3' ​​homologinę grupę ir loxP grupę. Dvi „LoxP“ vietos, besiribojančios su RAGE 2–4 egzonais, leidžia pašalinti Cre tarpininkavimą, naudojant Cre rekombinazę (1b pav.). 2–4 egzonų ekscizija Cre rekombinaze sukelia pelės RAGE sekos kadrų poslinkio ir ankstyvojo sustabdymo kodoną, kuris blokuoja RAGE raišką. Pirmiausia pagaminome homozigotines RAGE floksuotų alelių peles ( RAGE flox / flox ); tada RAGE flokso / flokso pelės buvo sukryžmintos su neuronų tikslinėmis CK2 pelėmis, kad būtų gautos nRKO pelės ( RAGE flox / flox / CK2-Cre ), kurios vėliau buvo patikrintos atlikus uodegos DNR tyrimą su PGR amplifikacija, naudojant flokso pradmenis (700 bp) ir Cre. transgenas (300 bp) (2a paveikslas). Kortikos homogenatų imunoblotai su anti-RAGE antikūnais parodė reikšmingą RAGE ekspresijos lygio sumažėjimą NRKO pelių smegenų žievėje, palyginti su ne Tg pelėmis (∼ 80% sumažėjimas, palyginti su ne Tg smegenimis, P <0, 01) (2b paveikslas). Nepilnas RAGE ekspresijos slopinimas atsirado dėl smegenų homogenatų, kuriuose buvo neneuroninių ląstelių. Smegenėlių homogenizatoriuose RAGE raiškos lygis nepakito (2c paveikslas). Konfokalinė mikroskopija su dvigubu RAGE ir MAP2 imuniniu dažymu aiškiai parodė, kad nRKO pelių žievės (2d – e pav.) Ir hipokampo (2f pav.) MAP2 teigiamų neuronų RAGE signalo praktiškai nebuvo. Taip buvo patikrintas RAGE išeikvojimas žievės neuronuose. nRKO pelių smegenys.

Image

Tikslinė konstrukcinė kasetė. Scheminis strategijos, naudojamos sąlyginiam RAGE geno išmušimui, pavaizdavimas, iškirpiant pelės RAGE geno 2–4 egzonus. ( a ) Anotuotas (MacVector 9.5.3) lokusas, identifikuojantis regioną, kuriame taikoma homologinė rekombinacija. Taikymo vektorius buvo sudarytas iš trijų fragmentų: 5 'homologinės rankos, dviejų loxP vietų ir 3' homologijos rankos. PGK-neo atrankos kasetė įterpiama pasroviui nuo 1-ojo egzono. PGK-neo-kasetė yra apklijuota FRT vietomis, o 2–4 egzonai yra apklijuoti dviem „loxP“ vietomis. ( b ) RAGE flox / flox pelės buvo sukryžmintos su neuronų tikslinėmis CK2 pelėmis, kad būtų gautos nRKO pelės ( RAGE flox / flox / CK2-Cre ). Dvi „LoxP“ vietos, besiribojančios su RAGE 2–4 egzonais, kad būtų galima pašalinti Cre tarpininkavimą, naudojant Cre rekombinazę. 2–4 egzonų ekscizija Cre rekombinaze sukelia rėmelio poslinkio ir ankstyvojo sustabdymo kodono iš pelės RAGE seką, kad užblokuotų RAGE raišką

Visas dydis

Image

Transgeninių nRKO pelių, turinčių RAGE deleciją, apibūdinimas žievės neuronuose. ( a ) Transgeninės nRKO pelės buvo identifikuotos iš uodegos DNR remiantis PGR amplifikacija, naudojant pradmenis floksui (700 bp) viršutinėje plokštėje, o CK2-Cre (300 bp) apatinėje dalyje. 1 juosta rodo RAGE flox / flox (ne-Tg) peles su neigiamu Cre transgenu, o 2-3 juostos žymi nRKO peles, gabenamas tiek su floksu, tiek su Cre ( RAGE flox / flox / CK2-Cre ). ( b ir c ) ŽIV žievės homogenatų ( b ) ir smegenėlių ( c ) imuninis paėmimas iš nurodytų Tg pelių RAGE. Tubulinas buvo naudojamas kaip baltymų įkrovos kontrolė. ( d - f ) Reprezentatyvūs dvigubo RAGE ir MAP2 imuninio dažymo vaizdai žievėje ( d ir e ) ir hipokampe ( f ). Konfokalinės mikroskopijos vaizdai, rodantys RAGE deleciją žievės neuronuose, pažymėtuose teigiamu MAP2 kaip neuronų žymeniu. Padidinti dideli neuronų, gautų iš atitinkamų ląstelių, vaizdai yra parodyti skydelio ( e ) rėmelyje. Masto juosta = 50 μm

Visas dydis

Nɛ-karboksimetil-lizino (CML) imunocheminis apibūdinimas ruošiant AGE

Iš visų AGL formų LML yra pagrindinis gliukacijos produktas, apie kurį žinoma, kad jis yra stabilus ir palaipsniui kaupiasi in vivo senėjimo, AD ir su diabetu susijusių komplikacijų metu. 21, 35 Norėdami patikrinti, ar LML yra pagrindinis komponentas mūsų AGE preparate, mes paruošėme AGE, inkubuodami galvijų serumo albuminą (BSA) su gliukozės 6-fosfatu 6–8 savaites 37 ° C temperatūroje, tada atlikome imunocheminį apibūdinimą, naudodami monokloninį antikūnai, nukreipti į LML adduktus. Naudodami Coomassie mėlynos spalvos dažus greitai grįžtamam baltymų juostų dažymui gelyje, stebėjome BSA ir AGE modifikuoto BSA kogeneraciją atitinkamai esant ∼ 66 ir ∼ 70 kD (3a pav.). Glikuotų BSA molekulinės masės padidėjimas atsiranda dėl AGE modifikacijos, dėl kurios susidaro intramolekulinis kryžminis ryšys. Imunoblotiški to paties BSA ir AGE-BSA preparatai, naudojant specifinius CML antikūnus, parodė ryškų CML imunoreaktyvumą tik esant AGE, kas rodo, kad BSA buvo glikuotas. Priešingai, tokio imunoreaktyvumo BSA nebuvo be gliukozės 6-fosfato (3a pav.). Šie rezultatai rodo, kad LML yra pagrindinis mūsų AGE paruošimo komponentas, naudojamas visuose mūsų eksperimentuose.

Image

Ilgalaikė potencija (AMP). a ) LML laipsnio nustatymas rengiant AGE. BSA baltymai (2 μg ) buvo inkubuojami su gliukozės 6-fosfatu 8 savaites 37 ° C temperatūroje, po to buvo tiriami SDS-PAGE. Baltymų juostas dažė Coomassie Blue (kairėje). Glikacija buvo nustatyta atlikus imunoblotus su LML antikūnais (dešinėje). 1 juosta, BSA; 2 juosta, AGE modifikuota BSA. ( b ) vien BSA neturėjo įtakos LTP. Įdėklai rodo reprezentatyvius fEPSP pėdsakus skiltelėse, apdorotose tirpikliu arba 100 μg / ml BSA, prieš stimuliavimą θ-sprogo (juoda linija) ir 1 valandos įrašo pabaigoje (pilka linija). c ) FEPSP šlaitų likutinė potencija, įvykusi per pastarąsias 5 minutes LTP įrašų. d ) BSA nepaveikė bazinio sinapsinio perdavimo (BST). ( e ) AGE poveikis LTP. Hipokampo skiltelės buvo perfuzuojamos AGE (50, 100 ir 200 μg / ml) arba BSA (100 μg / ml) 1 valandą, po to užrašytos LTP. N = 8–11 pjūvių nuo 3 iki 5 pelių. f ) FEPSP šlaitų likutinė potencija, įvykusi per pastarąsias 5 minutes LTP įrašų. ( g ) Hipokampinės sinapsių BST buvo užregistruota iš nurodytų pelių grupių

Visas dydis

Amžius blogina hipokampo ilgalaikę potenciją (LTP)

Norėdami nustatyti tiesioginį AGE poveikį sinapsinei funkcijai, mes ištyrėme sinapsinį pernešimą esant bazinėms sąlygoms ir LTP metu - tai sinapsinio plastiškumo forma, plačiai tiriama kaip ląstelinis sinapsinės funkcijos modelis hipokampo pjūviuose iš ne-Tg pelių, apdorotų AGE arba BSA kaip kontrolė. Su tirpikliu apdorotose skiltelėse vien BSA nepakeitė LTP (228, 8 ± 17, 04%, palyginti su 223, 0 ± 7, 95% BSA apdorotų skiltelių, P > 0, 05, 3b ir c paveikslai) ar bazinės sinapsinės transmisijos (BST), matuojant įvesties ir išvesties metu. matavimas (3d pav.). Gydymas AGE reikšmingai sumažino LTP priklausomai nuo koncentracijos (atitinkamai 180, 9 ± 15, 36%, 139, 1 ± 10, 42% ir 124, 9 ± 7, 96% 50, 100 ir 200 μg / ml AGE), palyginti su 220, 9 ± 20, 75% 100 μg. g / ml BSA, P <0, 01, 3e ir f pav. Tarp AGE ir BSA apdorotų pjūvių CA1 stratum radiatum reikšmingų lauko sužadinimo po sinapsinio potencialo (fEPSP) skirtumų nebuvo. Tai rodo, kad AGE neturėjo įtakos normaliai BST hipokampo sinapsėse (3g paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad AGE blogina ilgalaikį sinapsinį plastiškumą.

RAGE trūkumas gelbsti AGE sukeltą LTP deficitą

Norėdami tiesiogiai nustatyti RAGE įtaką AGE tarpininkaujamam LTP sumažinimui, pirmiausia užfiksavome LTP hipokampo pjūviuose nuo visuotinio RAGE išeikvojimo (RKO) ir pelėse, kurios nebuvo Tg, gydomose AGE. Mes nustatėme panašią RAGE trūkumų skiltelių potenciją, palyginti su ne Tg skiltelėmis, esant BSA (224, 3 ± 17, 81%, palyginti su 208, 8 ± 19, 50%, P > 0, 05, 4a ir e paveikslai). Tačiau RAGE deficitas iš esmės apsaugojo hipokampo pjūvius nuo LTP mažėjant AGE ekspozicijai (184, 5 ± 9, 73%, palyginti su 131, 1 ± 7, 53%, P <0, 01, 4a ir e paveikslai), kas rodo, kad RAGE trūkumas pagerina sinapsinį perdavimą. Kadangi RAGE yra išreikštas smegenų neuroninėse ir neneuroninėse ląstelėse, toliau mes ištyrėme neuronų RAGE indėlį į AGE tarpininkaujamą sinapsinę funkciją. Mažiausiai 60 min. AGE ir BSA gydėme neuronus iš nRKO pelių (turinčių RAGE išeikvojimą) hipokampo pjūvių žieves su AGE ir BSA, tada įrašėme LTP. Tiek nRKO, tiek ne Tg pelių pjūviai parodė panašų LTP esant BSA (240, 2 ± 9, 41%, palyginti su 208, 8 ± 19, 50%, P > 0, 05, 4b ir e paveikslai). Priešingai, nRKO skiltelės žymiai slopino AGP sukeltą LTP sumažėjimą, palyginti su ne Tg skiltelėmis (191, 6 ± 15, 55%, palyginti su 131, 1 ± 7, 53%, P <0, 01, 4b ir e paveikslai). Šie rezultatai rodo, kad sėkminga neuronų RAGE blokada apsaugo nuo AGE sutrikusios sinapsinės funkcijos.

Image

RAGE išeikvojimo poveikis AGE sukeltiems LTP sutrikimams. ( a - c ) LTP buvo užfiksuotas hipokampo skiltelėmis iš ne Tg, RKO ( a ), nRKO ( b ) ir DN-RAGE ( c ) pelių, po 1 valandos perfuzijos su BSA arba AGE (100 μg / ml). Vien RAGE trynimas nepakeitė LTP, esant BSA. Priešingai, LTP padidėjo RKO, nRKO ir DN-RAGE pelių gabaliukuose, palyginti su ne Tg griežinėliais, esant AGE. d ) Reprezentatyvūs fEPSP pėdsakai skiltelėse, apdorotose tirpikliu arba 100 μg / ml BSA, prieš stimuliuojant bu sprogstamąja juosta (juoda linija) ir po 1 valandos (pilka linija). e ) FEPSP šlaitų likutinė potencija, atsirandanti per pastarąsias 5 minutes LTP įrašų. f ) reikšmingų BST skirtumų tarp nurodytų grupių nebuvo. N = 8–11 pjūvių nuo 3 iki 5 pelių

Visas dydis

RAGE funkcionuoja kaip AGE ir A β signalo perdavimo receptorius, suaktyvinantis kelis pasrovės tarpląstelinius kelius. 27, 28 Taigi, mes įvertinome RAGE signalizacijos poveikį neuronuose AGE sukeltai LTP, naudodamiesi hipokampo pjūviais iš DN-RAGE pelių, išreiškiančių signalo transdukcijos trūkumą turinčius RAGE mutantus (kurie buvo nukreipti į neuronus, kad nustatytų RAGE priklausomą signalizavimą). Pažymėtina, kad DN-RAGE skiltelės buvo žymiai atsparios AGE sąlygotam LTP sumažėjimui, palyginti su ne Tg skiltelėmis (167, 0 ± 12, 66%, palyginti su 131, 1 ± 7, 53%, P <0, 01, 4c ir e paveikslai). 4d paveiksle pavaizduoti reprezentaciniai pėdsakai, paimti 1 min. Prieš (juoda linija) ir 60 min. Po LTP indukcijos (pilka linija). Pelių RAGE ar mutantų išstūmimas BST neturėjo įtakos (4f pav.). Šie rezultatai parodė, kad nuo RAGE priklausomas signalizavimas neuronuose prisideda prie AGE sukeltos sinapsinės funkcijos sutrikimo.

Mitogeno suaktyvintos baltymo kinazės 38 (MAPK p38) aktyvacija yra susijusi su AGE sukeltu sinapsės deficitu

Norėdami nustatyti, kurie molekuliniai žaidėjai turi AGE poveikį hipokampinės LTP, įvertinome p38 ir c-Jun N-galo kinazių (JNK) vaidmenį hipokampo pjūviuose veikiant AGE, nes šios kinazės suaktyvinamos (padidėja fosforilinimo lygis) keliose patologinėse patologijose. sąlygos ir sinapsinis plastiškumas; 36, 37, p38 yra pagrindinis RAGE tarpininkaujamo signalo perdavimo tarpininkas. 37 Naudodami antikūnus prieš p38 ir JNK fosforiluotų formų su hipokampo ekstraktais po AGE veikimą ir aukšto dažnio stimuliaciją, įvertinome šių dviejų kinazių aktyvaciją. Pridedant AGE prie ne Tg hipokampo pjūvių, žymiai padidėjo p38 fosforilinimas, palyginti su BSA pridėjimu, tačiau gydymas AGE neturėjo įtakos bendram p38 lygiui (5a pav.). Densitometrinė jungtinių imunoreaktyviųjų juostų analizė atskleidė reikšmingą p38 fosforilėjimo padidėjimą 1, 5–1, 7 karto, kai normalizuota iki bendro p38, palyginti su BSA gydytų kontrolinių grupių (5b paveikslas). Gydymas AGE neturėjo įtakos JNK fosforilinimui (5c paveikslas).

Image

AGE poveikis p38 aktyvacijai. Smegenų pjūviai buvo perfuzuojami BSA arba AGE (100 μg / ml) 1 valandą, po to imami imunoblotai fosforilinti ir suminis p38 ( a ir b ) arba JNK ( c ). a ) Smegenų homogenatų imunoblotai iš AGE arba BSA apdorotų skiltelių fosforilinti ir suminis p38. Tubulinas buvo naudojamas kaip neuronų baltymų įkrovos kontrolė. ( b ) Kombinuotų fosfo-p38 imunoreaktyviųjų juostų densitometrija bendro p38 atžvilgiu. c ) Fosfo-JNK imunoreaktyviųjų juostų densitometrija, palyginti su visu JNK, skiltelėse, apdorotose BSA arba AGE. Duomenys išreiškiami padidėjimu kartų, palyginti su kontroline BSA. Apatiniame skydelyje pateikiami nurodytų baltymų tipiški imunoblotai. N = 3–5 gydymo grupėje. ( d ) p38 inhibitoriaus (SB203580) poveikis AGE sukeltai p38 fosforilinimui. Fosfo-p38 imunoreaktyviųjų juostų, palyginti su visu p38, densitometrija ne Tg skiltelėse, perfuzijose su AGE su SB203580 arba be jo. Nurodyto baltymo reprezentatyvūs imunoblotai yra parodyti apatiniame skydelyje. ( e ) p38 inhibitoriaus (SB203580) poveikis AGE sukeltiems LTP trūkumams hipokampo skiltelėse. Pjautos buvo perfuzuojamos tirpikliu, AGE (100 μg / ml), SB203580 (1 μM ) arba AGE plius SB203580 1 h prieš LTP įrašymą. n = 8–11 skiltelių kiekvienoje gydymo grupėje. Viršutiniame skydelyje pateikiami reprezentatyvūs fEPSP pėdsakai pjaustytuose gabalėliuose su nurodytu apdorojimu prieš θ-sprogimo stimuliaciją (juoda linija) ir 1 valandos pabaigoje (pilka linija). f ) FEPSP šlaitų likutinė potencija, atsirandanti per pastarąsias 5 minutes per LTP įrašymą

Visas dydis

Norėdami toliau įvertinti p38 aktyvacijos poveikį AGE tarpininkaujantiems LTP pažeidimams, hipokampo skaidres perfuzijame su specifiniu p38 inhibitoriumi SB203580 kartu su AGE. Akivaizdu, kad SB203580 taikymas žymiai blokavo p38 fosforilinimo indukciją esant AGE, palyginti su gydymu vien AGE be p38 inhibitoriaus (SB203580) (5d pav.). Taigi, AGE sutrikusi hipokampo LTP buvo atkurta slopinant p38 su SB203580 perfuzija (5e ir f pav.). Šie rezultatai rodo, kad AGE tarpininkaujama p38 aktyvacija prisideda prie sinapsinės žalos.

RAGE trūkumas blokuoja AGE sukeltą p38 aktyvaciją

Norėdami nustatyti, ar RAGE yra pagrindinis AGE tarpininkaujamo p38 aktyvavimo vaidmuo, mes įvertinome RAGE delecijos poveikį AG38 sukeltam p38 fosforilinimui. RKO pelių gabaliukai parodė visiškai slopintą p38 aktyvaciją, kaip parodyta sumažėjusį p38 fosforilinimą, palyginti su ne Tg griežinėliais su AGE (6a ir b pav.). Be to, RAGE išeikvojimas, nukreiptas konkrečiai į žievės / hipokampo neuronus, arba į neuronus nukreipta RAGE mutanto, turinčio signalo perlaidą, ekspresija, panaikino AGE sukeltą p38 fosforilinimą. Kiekvieno visų fosforo-P38 imunoreaktyviųjų juostų, normalizuotų iki bendro p38, kiekybinis įvertinimas žymiai sumažino fosfo-p38 imunoreaktyviųjų juostų pjūvius iš RKO, nRKO ir DN-RAGE, palyginti su ne Tg skiltelėmis, apdorotomis AGE (6a ir b paveikslai). Šie duomenys rodo, kad RAGE trūkumas apsaugo nuo AGE sukeltos p38 aktyvacijos. P38 signalo transdukcijos aktyvacija yra AGEs – RAGE sąveikos su neuronais pasekmė, prisidedanti prie neuronų ir sinapsinių pasipiktinimo AGE praturtintoje aplinkoje.

Image

RAGE trūkumo įtaka AGE sukeltai p38 aktyvacijai. Hipokampo pjūviai iš nurodytų Tg pelių ir ne Tg pelių buvo perfuzuojami AGE 1 valandą, po to imami imunoblotas fosfo- ir viso-p38. a ) Fosforo ir bendro p38 imunoblotai su tubulinu, naudojami kaip baltymų įkrovos kontrolė. ( b ) Fosfo-p38 imunoreaktyviųjų juostų, normalizuotų bendru p38, densitometrija, naudojant NIH Image J programinę įrangą. N = 3–5 pelės kiekvienoje grupėje

Visas dydis

AGEs-RAGE sąveikos poveikis sinapsiniam tankiui

Norėdami nustatyti AGE sukeltų sinapsinių pažeidimų mastą AGE įkvėptuose neuronuose, pirmiausia išnagrinėjome AGE poveikį sinapsių tankiui. Sinapsės buvo identifikuotos kaip sinaptofizinas-teigiami klasteriai, prisitvirtinantys prie dendritų, pažymėtų MAP2 žymeniu. Presinapsinis baltymas - sinaptofizinas - įdarbinamas greitai ir priklauso nuo sinapsinio aktyvumo. 38 Praėjus dviem valandoms po AGE gydymo, sinaptofizino tankis hipokampo neuronuose nepakito, palyginti su BSA gydytais kontroliniais elementais, tuo tarpu hipokampo neuronai, veikiami AGE 48 valandas, parodė, kad sinaptofizino teigiamas klasteris sumažėjo 50–60% (7a pav.). Svarbu tai, kad RAGE stokojantys neuronai iš esmės panaikino AGE sukeltą sinapsinio tankio sumažėjimą (7b paveikslas). Šie duomenys rodo, kad RAGE išeikvojimas gelbsti dėl AGE sukeltos sinapsės.

Image

RAGE trūkumo poveikis AGE sukeltiems sinapsių nuostoliams. a ) Ne Tg neuronai buvo gydomi 100 μg / ml AGE arba BSA 2 ir 48 valandas, po to imuniniu būdu padengti sinaptofizinu ir MAP2. Teigiamai sumažėjo AGE gydomų ląstelių teigiamų sinaftofizino grupių skaičius mikronuose dendritų, palyginti su BSA. ( b ) RAGE trūkumu pasižymintys neuronai daugiausia apsaugojo AGE sukeltą sinaptofizino teigiamų klasterių praradimą, palyginti su ne-Tg neuronais, esant AGE. Apatiniame skydelyje pateikiami reprezentatyvūs sinapsinio dažymo vaizdai. Sinapsės buvo vizualizuotos dažant sinaptofizinu (žalia) ir dendritai - dažant MAP2 (raudona). Masto juosta = 50 μm

Visas dydis

Diskusija

Be savo sugebėjimo tiesiogiai pakeisti tikslinių baltymų struktūrą ir funkcijas ląstelėse, dėl kurių pažeidžiamos ląstelės ar audiniai, nauji įrodymai taip pat parodė AGE kaip signalinį ligandą, sąveikaujantį su RAGE; AGE sukelia signalo perdavimo pokyčius, kurie neigiamai veikia daugelį periferinių organų. 39, 40, 41 Nors AGE kaupimasis padidėja žievės neuronuose, hipokampo piramidiniuose neuronuose, astrocituose ir kitose glijos ląstelėse senstant ir AD smegenyse, 4, 42, 43, AGEs ir RAGE sąveikos tiesioginis poveikis smegenų funkcijai, ypač sinapsinės struktūros ir funkcijos pokyčiai, beveik nežinomi. Naudodami mūsų naują transgeninio pelės modelį su neuronų RAGE signalizacijos išraiška ir neturėdami neuronų RAGE priekinėje smegenų dalyje, vertindami sinapsinį perdavimo ir plastiškumą (beveik kiekviena smegenų funkcija atspindi sinapsinę transmisiją), mes pateikiame įtikinamų įrodymų, pagrindžiančių pagrindinį neuronų AGE vaidmenį. RAGE sąveika suaktyvinus MAPK P38, hipokampo plastiškumo deficitą ir sinapsinę žalą.

Pirmiausia mes parodėme žalingą AGE poveikį sinapsinei struktūrai ir funkcijai. Pridedant AGE reikšmingai sumažėjo sinapsinis plastiškumas, nes sumažėjo LTP ir sinapsių morfologija. LTP yra svarbus ilgalaikis sinapsinis plastiškumas ir pakitusi sinapsinė morfologija (sinapsinis praradimas), o tai greičiausiai prisideda prie mokymosi ir atminties stokos, pastebimos su amžiumi susijusio pažinimo nuosmukio metu. Senėjimui būdingas anatominis ir funkcinis daugelio organų sistemų nuosmukis. AGE randama serume ir kaupiasi audinyje senstant; 5, 44, 45, šis kaupimasis paspartėja esant patologinėms būklėms, tokioms kaip diabetas ir neurodegeneracinės ligos, įskaitant AD. Nustatyta, kad vyresnio amžiaus suaugusių asmenų žievės neuronuose padidėja AGE ir jie teigiamai koreliuoja su pažinimo sutrikimo sunkumu. 46 AGE koncentracija serume reikšmingai padidėjo pacientams, sergantiems cukriniu diabetu (lygi 30–88 μg / ml AGE-BSA, palyginti su 12 μg / ml AGE-BSA, necukriniams pacientams). 6, 7, 8. Ankstesni mūsų tyrimai parodė, kad AGE albuminas (1 μM , lygus 66, 5 μg / ml) sukėlė oksidacinį stresą ir transkripcijos faktoriaus NF-kB suaktyvinimą in vitro ir in vivo . Šis procesas apima AGE jungimąsi. baltymų RAGE. Pabrėžtina, kad RAGE antikūnai blokavo AGE sukeltą ląstelių perturbaciją ir oksidatoriaus stresą. Taigi padidėjęs AGE ir jų receptorių (RAGE) kiekis vaidina svarbų vaidmenį AGE tarpininkaujant ląstelių pasipiktinimui, vykstant su amžiumi susijusių procesų ir diabeto patogenezei. Šiame tyrime naudojama AGE koncentracija koreliuoja su žmogaus ligos patologine būkle.

Mūsų tyrime perfuzija su AGE hipokampo skiltelėmis sutrikdė LTP priklausomai nuo koncentracijos - tai atitiko žiurkių modelyje pastebėtus duomenis, kad egzogeninis AGE gydymas stereotaksinėmis injekcijomis į smegenis sukėlė sinapses ir atminties sutrikimus. 48 Tačiau neuronų RAGE poveikis AGE sukeltiems sinapsių pažeidimams nėra aiškus. Atsižvelgiant į tai, kad diabeto ir AD sergančių asmenų smegenyse spartėja AGE formavimasis ir kaupimasis, AGEs ir RAGE sąveika gali būti svarbus taikinys ieškant agentų, stabdančių ligos pagreitėjimą ar paūmėjimą, susijusius su diabetu ir AD susijusių pažintinių nuosmukių ir demencijos atvejais.

Toliau, naudodamiesi genetiniu RAGE išeikvojančios pelės modeliu, mes ištyrėme nuo RAGE priklausančio signalizacijos poveikį AGE inspiruotai sinapsinei žalai. Amžiaus perfuzijos sukeltą LTP sumažėjimą gali sukelti įvairūs veiksniai; pavyzdžiui, viena priežastis yra AGE jungimasis prie RAGE receptorių, kita priežastis yra baltymų kryžminio susiejimo sukeltas ląstelių gedimas. Genetinis RAGE trynimas suteikia mums galimybę nustatyti AGEs-RAGE sąveiką AGE sukeltiems sinapsiniams sutrikimams. Mes užfiksavome normalius LTP rodmenis smegenų skiltelėse su mūsų globaliomis RAGE nulinėmis pelėmis, kurios buvo gydomos nešikliu, palyginti su ne transgeniškais pakratų draugais, ir tai rodo, kad genetinis RAGE trynimas reikšmingai nekeičia sinapsinių struktūrų, svarbių LTP indukcijai ir ekspresijai normaliomis fiziologinėmis sąlygomis. Pabrėžtina, kad RAGE trūkumas apsaugo nuo AGE sukeltų LTP trūkumų. Panašiai mūsų duomenys rodo apsauginį RAGE išeikvojimą AGE sukeltiems sinapsės nuostoliams. Nors mūsų rezultatai neatmetė kitokio AGE poveikio, pvz., Baltymų sukryžminimo, mes aiškiai parodėme, kad AGEs-RAGE sąveika yra susijusi su AGE sukeltu sinapsiniu pažeidimu.

Kadangi RAGE yra išreikštas neuronuose ir neneuroninėse ląstelėse (ty gliutinėse, endotelio ląstelėse ir kraujo-smegenų barjero pericituose), 49, 50 rezultatai, gauti iš pasaulinio RAGE nokauto pelių, neapibrėžia, kuris ląstelių tipas (-ai) yra (yra) svarbūs senstant amžiui sinapsiniam plastiškumui. Todėl sukūrėme transgenines peles su nRKO ir RAGE mutantu, kuriam trūksta signalo (DN-RAGE), ypač priekiniame smegenyse, įskaitant hipokampą, siekiant išspręsti klausimą, ar neuronų RAGE aktyvumas lemia AGE sukeltą hipokampinę LTP. sumažinimas. Iš tiesų, mūsų išvados aiškiai parodė, kad nRKO ir DN-RAGE smegenų pjūviai iš esmės yra atsparūs LTP sutrikdymui, veikiant AGE, ir tai reiškia neuronų RAGE įsitraukimą į mechanizmus, pagrindžiančius AGE sukeltą sinapsinę disfunkciją. Be to, įvedant neuroninį DN-RAGE ar RAGE trūkumą žievės neuronuose (nRKO), nepavyko visiškai išvengti AGE sutrikusios LTP, palyginti su perfuzija su BSA. Šie rezultatai rodo, kad neneuroninis RAGE (ty RAGE ekspresija mikrogliazose, astrocituose ar endotelio ląstelėse) gali būti susijęs su AGE sukeltomis sinapsinėmis disfunkcijomis. Ateityje reikės atlikti tyrimus, kad būtų ištirtas neneuroninio RAGE vaidmuo sinapsiniam nepakankamumui, kurį sukelia AGE. Nepaisant to, mūsų tyrimai nusako mechanizmus, susijusius su neuronų RAGE sukeltu signalo perdavimu, AGE sukeltai sinapsinei disfunkcijai ir degeneracijai. Neuronai yra jautrūs AGE įžeidimams dėl tiesioginės AGEs – RAGE sąveikos, prisidedant prie sinapsinės disfunkcijos ir degeneracijos.

Galiausiai, mūsų rezultatai rodo, kad MAPK P38 signalizacijos kelias yra labai svarbus AGEs-RAGE sukeltiems sinapsiniams pažeidimams. AGE sukeltas LTP sumažėjimas buvo sušvelnintas DN-RAGE skiltelėse, turinčiose signalo transdukcijos trūkumą turinčius RAGE mutantus, rodančius nuo RAGE priklausomo signalo indėlį į AGE sukeltą sinapsinį sutrikimą. Signalizacijos kaskados, suaktyvintos po ligando ir RAGE sąveikos, apima p21ra, tarpląstelinio signalo reguliuojamos kinazės 1/2 (ERK1 / 2), p38 ir JNK, Rho GTPazių, fosfoinositol-3 kinazės, GSK-3 β ir JAK / kelius. STAT (signalo keitiklis ir transkripcijos aktyvatorius). 51, 52 Įvairių baltymų kinazės kaskadų aktyvinimas gali būti pagrindinis RAGE aktyvavimo tikslas kontroliuojant sinapsinį plastiškumą. 37, 53

Visų pirma mes apsvarstėme galimą dviejų skirtingų kinazių, JNK ir p38, įsitraukimą į LTP slopinimą, remdamiesi ankstesniu tyrimu, kuris parodė, kad p38 ir JNK aktyvacija reikalinga LTP slopinimui, kurį sukelia A β- RAGE sąveika. 37, 54 hipokampo pjūviai, perfuzuoti su AGE, parodė padidėjusį p38 aktyvumą, tačiau JNK pokyčių nebuvo, tai rodo p38 aktyvacijos dalyvavimą p38 signalizavime ir AGE sukeltą sinapsinio plastiškumo deficitą. Iš tiesų, pridėjus p38 inhibitorių, buvo išvengta AGE sukeltos p38 aktyvacijos ir LTP susilpnėjimo. Atkreipkite dėmesį, kad RAGE išeikvojimas blokavo p38 fosforilinimo indukciją ir atstatė sinapsinio plastiškumo ir tankio defektus, susijusius su AGE. Mūsų rezultatai rodo, kad neuronų AGE ir RAGE sąveika suaktyvina p38 MAK kinazę, o tai savo ruožtu sukelia sinapsinę disfunkciją.

We further observed that if AGEs level remained chronically high, synapses become structurally damaged. Using hippocampal neuronal cultures, we showed that short-term AGEs exposure (for 2 h treatment) barely affected synaptic structure, whereas long-term treatment of AGEs (for 48 h) caused significant changes in synaptic density. Importantly, RAGE deletion rescues AGE-induced synapse loss. These data indicate that neuronal AGEs–RAGE interaction has functional (long-term plasticity) as well as structural effects on synapses, which may be important in the learning and memory deficit present in age-related dementia and age-associated neurodegenerative disease.

In summary, we provide substantial evidence of the protective effect of RAGE depletion on AGE-induced alterations in synaptic plasticity and density. Genetic depletion of RAGE and RAGE signaling in cortical neurons blocks AGE-mediated activation of p38 MAP kinase signal transduction with LTP deficits. We propose that AGEs-RAGE-dependent activation of p38 MAP kinase is responsible for AGE-induced synaptic damage. Blockade of AGEs-RAGE axis may protect against the impaired cognitive function in aged subjects with and without neurodegenerative diseases, including those with diabetes and AD.

Žodynas

aCSF

artificial cerebrospinal fluid

AD

Alzheimerio liga

AGEs

advanced glycation endproducts

CK2

calcium-calmodulin-dependent kinase II

CML

Nɛ-carboxymethyl-lysine

DN-RAGE

dominant-negative RAGE

fEPSP

field-excitatory post-synaptic potential

JNK

c-Jun N-galo kinazė

LTP

long-term potentiation

nRKO

neuronal RAGE selective knockout

p38 MAPK

p38 mitogen-activated protein kinase

RAGE

receptor for advanced glycation endproduct

RKO

global RAGE knockout